[go: up one dir, main page]

CN115354070A - 一种基于微球检测核酸的方法 - Google Patents

一种基于微球检测核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115354070A
CN115354070A CN202211279079.7A CN202211279079A CN115354070A CN 115354070 A CN115354070 A CN 115354070A CN 202211279079 A CN202211279079 A CN 202211279079A CN 115354070 A CN115354070 A CN 115354070A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
hybridization
amplification
probe
microspheres
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211279079.7A
Other languages
English (en)
Inventor
不公告发明人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Weibo Gene Technology Tianjin Co ltd
Original Assignee
Weibo Gene Technology Tianjin Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Weibo Gene Technology Tianjin Co ltd filed Critical Weibo Gene Technology Tianjin Co ltd
Priority to CN202211279079.7A priority Critical patent/CN115354070A/zh
Publication of CN115354070A publication Critical patent/CN115354070A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种基于微球检测核酸的方法，其包括提供来源于生物样品的核酸片段；使微球偶联物在杂交缓冲液中与核酸片段接触并反应，从而得到结合体；将结合体进行扩增检测，其中微球偶联物中微球通过连接臂与探针共价连接。本发明的方法能够对低丰度目标序列杂交捕获，与常规杂交捕获过程相比，本发明能够在半小时就可以快速完成，显著缩短了检测流程和时间。同时本发明的方法可以提高检测的稳定性，多次重复实验均可以稳定检出低丰度目标序列，有效避免了漏检和假阴性，获得目标区域核酸序列信息可用于后续精准基因分型和突变分析。

Description

一种基于微球检测核酸的方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体地涉及一种基于微球检测核酸的方法。
背景技术
基于二代测序的目标区域捕获方法在科研和临床检测领域已被广泛应用。利用探针捕获并富集目标区域用于二代测序技术由于需要很少的测序数据量，因此能够降低检测成本以及数据分析过程中的计算工作量与计算时间，与全基因组测序相比，仅需相对较低的成本即可获得超高深度的测序数据。
杂交捕获的原理是通过人为设计探针与目标区段部分或者全部互补将目标区段捕获，未设计探针区段的片段则会被洗脱丢弃，之后通过变性将探针和被捕获的片段分开进行二代测序文库构建。
根据探针的状态不同，杂交捕获又分为固态杂交和液态杂交。固态杂交在芯片上设置探针，通过探针将目标区段捕获。液态杂交是将探针置于液相中，现有的探针携带生物素，当杂交完成后，通过磁珠可以将探针吸附，随后将未被捕获的片段丢弃，再通过变性将探针和目标片段分开，然后利用磁珠将所有空探针吸附丢弃，捕获完成。
目前杂交捕获的缺点之一是特异性较差，微球表面非特异性吸附容易捕获非目标区段，导致特异性下降。其次，常规杂交捕获需要过夜或是杂交捕获过程在4小时以上，导致实验过程较长。因此，目前仍需要一种用于低丰度核酸的检测方法，在大大缩短杂交捕获时间的同时，避免漏检和假阴性，从而通过测序获得目标区域核酸序列信息，以进行后续精准基因分型和突变分析。
发明内容
针对现有技术中存在的至少部分问题，发明人进行了深入研究，提出一种基于微球检测核酸的方法。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种基于微球检测核酸的方法，其至少包括以下步骤：
(1) 提供来源于生物样品的核酸片段；
(2) 使微球偶联物在杂交缓冲液中与所述核酸片段接触并杂交，从而得到结合体；
(3) 将所述结合体进行扩增检测；
其中，所述微球偶联物中微球通过连接臂与第一探针共价连接。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于微球检测核酸的方法，其中，步骤(2)中杂交时间为10-60min。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于微球检测核酸的方法，其中，所述连接臂具有下式结构：
Figure 614123DEST_PATH_IMAGE001
，其中m、n各自分别为1-10的整数。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于微球检测核酸的方法，其中，进一步包括使用清洗缓冲液清洗所述结合体，以保留与所述探针杂交的核酸片段。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于微球检测核酸的方法，其中，所述微球表面具有硅氧烷基团，且所述硅氧烷基团通过Si-C键与所述连接臂的一端共价连接，通过Si-O键与微球表面共价连接，所述硅氧烷基团包含Si-O(CH2)xCH3，其中x为0-5的自然数。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于微球检测核酸的方法，其中，所述探针5’端含磷酸基团，且通过所述磷酸基团使所述探针与连接臂的一端共价连接。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于微球检测核酸的方法，其中，所述缓冲液包括：20x SSPE、10x Denhardt’s solution、10mM EDTA、0.2% SDS、0.1% Tween 20、Cot-1 DNA 5ug、20U RNase抑制剂、杂交增强液。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于微球检测核酸的方法，其中，所述扩增检测包括：
使所述结合体在磁珠上通过PCR扩增加上完整测序接头构建成为测序用文库，然后所得的文库进行高通量测序，或者
将所述结合体在磁珠上与引物组进行热变性，得到第一反应体系，配制第二反应体系，加入所得的第一反应体系进行等温扩增，所述第二反应体系包括：Bst聚合酶缓冲液、Bst聚合酶、dNTP Mix、MgSO4，或者
将所述结合体在磁珠上与荧光定量PCR引物和第二探针进行扩增，根据荧光信号的变化，实时检测扩增中的扩增产物量的变化并进行定量。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于微球检测核酸的方法，其中，热变性温度为95-99℃，热变性时间为4-6分钟；
等温扩增温度为65-70℃，等温扩增时间为0.5-1小时；
荧光定量PCR反应程序为90-98℃，4-7分钟；90-98℃，10-20秒；55-65℃，20-40秒，25-50个循环。
本发明的第二方面，提供一种试剂盒，其包括：
I. 微球偶联物，其包括第一探针和与其通过连接臂连接的微球；
II. 杂交缓冲液，其包括：20x SSPE、10x Denhardt’s solution、10mM EDTA、0.2%SDS、0.1% Tween 20、Cot-1 DNA 5ug、20U RNase抑制剂、杂交增强液；
III.清洗液，其包括：0.1x SSC、0.1% SDS、0.1% Tween 20；
可选地，进一步包括等温扩增试剂、等温扩增引物或引物组、荧光定量扩增试剂、荧光定量扩增引物、高通量测序扩增试剂和高通量测序接头引物。
本发明的技术效果包括但不限于：
(1) 通过纳米磁珠捕获试剂在临床样本总核酸构建的二代文库中，对低丰度目标序列杂交捕获，采用了优化后的杂交试剂方案和纳米级磁珠的特性，使得常规需要过夜或4小时以上的杂交捕获过程在半小时就可以快速完成，显著缩短了检测流程和时间，并且杂交效果与常规过夜杂交一致。纳米磁珠的表面修饰设计和偶联方式显著降低非目标核酸背景的吸附，可以显著提高信噪比，优化低丰度目标检测下限；由于现有链酶亲和素磁珠表面修饰蛋白分子导致非特异性吸附背景高，且探针结合热稳定性上也低于本发明的纳米磁珠系统。
(2) 通过杂交捕获，将目标核酸序列进行富集减少取样时的偏差，提高检测的稳定性，多次重复实验均可以稳定检出低丰度目标序列，有效避免了漏检和假阴性；同时通过测序，可以获得目标区域核酸序列信息，用于后续精准基因分型和突变分析。
(3) 杂交捕获探针设计，对目标区域全覆盖并增加了GC含量偏离区域的探针覆盖度，可以提高低丰度目标序列整体的捕获效率和均一性。
(4) 本发明的纳米磁珠对后续酶反应有很好的兼容性，不影响酶的活性或扩增反应产物检测，不需要从磁珠上洗脱目标序列再进行扩增，避免了过度损耗低拷贝目标序列和检测偏差，可以实现捕获后直接磁珠上文库扩增用于测序。
(5) 本发明的方法能够对低丰度目标序列杂交捕获，与常规杂交捕获过程相比，本发明实现了快速富集和快速检测，同时解决的常规等温扩增灵敏度不够和非特异扩增严重的问题，有效避免了假阳性和假阳性问题，本发明的方法比常规等温扩增技术的检测灵敏度高一到两个数量级。
(6) 本发明能够显著缩短检测流程和时间。同时本发明的方法降低非目标核酸背景对检测灵敏度和特异性的干扰，显著提高信噪比，避免损耗和偏差，直接进行磁珠上实时荧光定量PCR检测，从而有效减少检测时间和实验偏差。
附图说明
图1为链酶亲和素磁珠和本发明的微球的背景吸附比较实验。
图2为实施例2新冠病毒N基因目标区域探针与等温扩增区设计位置分布图。
图3为实施例3新冠病毒N基因目标区域探针与PCR扩增区设计位置分布图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明提供一种基于微球检测核酸的方法，其包括以下步骤：
(1) 提供来源于生物样品的核酸片段；
(2) 使探针-微球偶联物在适于杂交的条件下与所述核酸片段接触并反应，从而得到结合体；
(3) 将所述结合体进行扩增检测。
下面详细说明各步骤。
提供来源于生物样品的核酸片段
本发明的步骤(1)为得到捕获用片段的步骤，本发明的捕获用片段的长度一般控制在250-500bp。本发明中，捕获用片段可通过DNA打断方式进行。此类方式在本领域是已知的，例如通过超声处理、机械打断或通过酶切等。由于超声处理和机械打断相对而言会损失较多的DNA，因此在起始DNA含量较少（例如，低至50ng）的情况下，优选用酶切的方法使DNA片段化。
本发明中，生物样品不限定，其实例包括但不限于组织样品或流体样品。组织样品包括体细胞样品，流体样品包括血液或其成分例如血浆、血清等。生物样品可以是任何哺乳动物来源的样品，优选为来源于人的样品。
本发明中，来源于生物样品的核酸为从生物样品直接提取的DNA，或从生物样品提取的RNA。DNA可以是从生物样品直接分离得到的脱氧核糖核酸，也可以是从生物样品分离得到的核糖核酸(例如，mRNA)经逆转录得到的脱氧核糖核酸，即cDNA。此处的逆转录可以是天然条件下的逆转录，也可以是人为控制的逆转录。
本发明中，探针-微球偶联物中微球通过连接臂与探针共价连接。优选地，所述连接臂具有下式结构：-(CH2)m-五元环-(CH2)n-，其中m和n各自独立地为1-10的整数，优选为2-8的整数，进一步优选2-5的整数，还优选1-3的整数。进一步优选地，所述连接臂结构如下所示：
Figure 427358DEST_PATH_IMAGE002
。
在某些实施方案中，所述偶联物通过下述步骤制备得到：
a. 提供羟基改性的微球，所述微球包括四氧化三铁纳米颗粒；
b. 使步骤a中的微球与含氧硅烷交联；
c. 提供5’端具有C≡(CH2)a-基团修饰的探针；
d. 将b中的得到的微球与c中的探针在催化剂的存在反应，得到所述偶联物。
在步骤a中，羟基改性的微球优选通过下述方法进行制备：将铁盐，例如氯化铁与强碱，例如氢氧化钠或氢氧化钾溶于有机溶剂，置于反应釜加热至200-300℃，优选220-260℃制备四氧化三铁纳米颗粒。将制备的纳米颗粒分散混匀到无水乙醇中，加入20-38%，优选25-30%的氨水混匀，逐滴加入硅烷偶联剂，硅烷偶联剂的实例包括但不限于C4-C16，优选C6-C10的含氧硅烷，其包括但不限于正硅酸乙酯，制备得到300nm直径覆盖二氧化硅外壳的超顺磁性纳米微球。
在步骤b中，使得到的超顺磁性纳米微球在有机溶剂中与含有至少一个取代基的含氧硅烷交联，优选地，所述取代基为-(CH2)b=N+=N-，其中b为1-4的整数，还优选为2-3的整数。交联时间为36-96h，还优选36-48h。
在本发明的步骤c中，提供5’端具有C≡(CH2)a-基团修饰的探针，其中a为1-6的整数，优选为2-5的整数。在某些实施方案中，修饰基团为乙炔基团，其修饰探针的方法是本领域已知的，对此不特别限定。
在本发明的步骤d中，将b中的得到的微球与c中的探针在催化剂的存在有机溶剂中反应，得到所述偶联物。优选地，所述催化剂为铜(II)-TBTA络合物催化剂，探针的浓度不特别限定，可以根据捕获目标拷贝数，适当调整炔基修饰探针的终浓度，以控制表面修饰覆盖合适的探针密度，微球表面的偶联探针不足或过量都会影响杂交捕获效率。
杂交捕获步骤
本发明的步骤(2)为使探针-微球偶联物在适于杂交的条件下与所述核酸片段接触并反应，从而得到结合体，偶联物包含至少一条探针或根据本发明探针组的多条探针的组合。
在适于杂交的条件下与捕获用片段接触并反应，从而得到结合体的步骤，即捕获步骤。这里的接触并反应是指一段探针或探针组合的序列，当其与捕获用片段序列比对时，一条序列的5'端与另一条序列的3'端配对，互补配对不需要完美配对，稳定的双链可以包含错配或者是不配对的碱基。这里的“互补”可以是指两条核酸序列通过氢键发生序列特异性的结合，它们的嘌呤和/或嘧啶碱基依据沃森-克里克法则形成双链核酸复合体，也可以是核酸序列及修饰的核酸序列与另一段序列依据沃森-克里克法则形成核酸双链。
本发明中，探针组合为由多条探针组成的集合。探针组合中探针的数量不限定，可根据需要而变化。一般而言，探针的数量为50以上，优选100以上，更优选200以上。在具体实施方案中，进行探针或探针组合杂交捕获过程的杂交条件为优化后的杂交条件，从而能够提高捕获效率，并且大大缩短检测流程和时间。本发明中，杂交缓冲液包括：20x SSPE、10xDenhardt’s solution、10mM EDTA、0.2% SDS、0.1% Tween 20、Cot-1 DNA 5ug、20U RNase抑制剂、杂交增强液(hybridization enhancer)，上述缓冲液能够确保快速杂交。
本发明进一步提供用于杂交捕获目的片段的杂交体系，其包括上述杂交缓冲液，并且所述杂交缓冲液与待测核酸片段的体积比为1-2:1，优选为1.4-1.8:1。优选地，杂交程序包括：62-68℃孵育10-45分钟，优选63-66℃孵育20-40分钟，期间震荡混匀。
在进行本发明的扩增检测之前进一步包括使用清洗缓冲液清洗所述结合体的步骤，以保留与所述探针杂交的核酸片段。进行缓冲液清洗的洗脱条件和体系为优化后的条件和体系，从而在另一方面大大缩短检测流程和时间。在具体实施方案中，清洗液主要成分包括：0.1x SSC、0.1% SDS、0.1% Tween 20。杂交体系与清洗液体系的体积比1:10-15，优选为1:11-13。本发明的清洗液为双去污剂体系，能够大大提升清洗效率，可将传统方法多达9次的洗涤次数减少至例如2次。
在某些实施方案中，将杂交富集后的微球与接头连接构建测序用文库，使用通用引物进行扩增，扩增优选使用PCR扩增。与常规构建文库和PCR扩增不同的是，本发明中不需要使探针分离以得到的捕获片段作为目标序列，因此缩短实验流程和时间，但同时提高检出的准确性、灵敏度和特异性。
在某些实施方案中，使所述结合体在磁珠上通过PCR扩增加上完整测序接头构建成为测序用文库，然后所得的文库进行高通量测序。构建文库可采用本领域常规操作，例如使用文库构建试剂盒进行文库构建。根据本发明方法制备的捕获文库适用于多种高通量测序平台，包括但不限于二代和三代测序平台，例如Roche/454 FLX、Illumina/Hiseq、Miseq、NextSeq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等。
在某些实施方案中，将杂交富集后的微球与引物组进行热变性，得到第一反应体系。与常规PCR扩增不同的是，本发明中不需要使探针分离以得到的捕获片段作为目标序列，因此缩短实验流程和时间，但同时提高检出的准确性、灵敏度和特异性。
本发明中，首先将携带目的序列的磁珠与引物组进行热变性，本发明的引物和探针针对新冠病毒核衣壳蛋白N基因位点进行设计，优选地，探针捕获区域在等温扩增的扩增区域之外上下游100-250bp区域范围，进行热变性温度为95-99℃，优选96-98℃；热变性时间为4-6分钟。
热变性反应结束后，得到第一反应体系，并将该反应体系维持在62-68℃，优选64-66℃。
本发明中，进一步包括配制第二反应体系的步骤，第二反应体系包括：2.5ul Bst聚合酶缓冲液，1ul Bst聚合酶，3.5-7ul dNTP Mix，1.5-3ul MgSO4 (100 mM)，补水至25ul。加入所得的第一反应体系进行等温扩增，等温扩增的温度为65-70℃，还优选为65-69℃，等温扩增时间为0.5-1小时，还优选50-60分钟。然后在78-82℃，2-7分钟终止反应。反应体系以及等温扩增不同程度的影响扩增产物的产量和稳定性。
在某些实施方案中，将杂交富集后的微球在磁珠上与荧光定量PCR引物和探针进行扩增。与常规PCR扩增不同的是，本发明中不需要使探针分离以得到的捕获片段作为目标序列，因此缩短实验流程和时间，但同时提高检出的准确性、灵敏度和特异性。
本发明的引物和探针针对新冠病毒核衣壳蛋白N基因位点进行设计，优选地，探针捕获区域在实时荧光定量PCR的扩增区域之外上下游100-250bp区域范围。
本发明的扩增检测步骤中，荧光定量PCR反应程序为90-98℃，4-7分钟；90-98℃，10-20秒；55-65℃，20-40秒，25-50个循环。优选地，荧光定量PCR反应程序为94-96℃，5-6分钟；92-97℃，12-18秒；58-62℃，25-35秒，28-40个循环。
本发明中，荧光定量PCR体系包括：荧光定量PCR体系包括：Hifair® V EnzymeMix、2×Hifair® V MP Buffer、引物、模板、Nuclease-free Water。上述反应体系以及扩增不同程度的影响扩增产物的产量和稳定性。
试剂盒
本发明进一步提供试剂盒，其至少为用于高通量测序、实时荧光定量PCR或等温扩增的核酸检测，其包括：
I. 探针，其与偶联物共价偶联；
II. 杂交缓冲液，其包括：20x SSPE、10x Denhardt’s solution、10mM EDTA、0.2%SDS、0.1% Tween 20、Cot-1 DNA 5ug、20U RNase抑制剂、杂交增强液；
III.清洗液，其包括：0.1x SSC、0.1% SDS、0.1% Tween 20；
进一步包括高通量测序、实时荧光定量PCR或等温扩增的试剂和接头引物。
在某些实施方案中，等温扩增试剂包括Bst聚合酶缓冲液、Bst聚合酶、dNTP Mix、MgSO4；荧光定量扩增试剂和引物相关的扩增试剂包括Hifair® V Enzyme Mix、2×Hifair® V MP Buffer、引物、模板、Nuclease-free Water。
除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，寡核苷酸)可设置于容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。本文所述的任何组合或试剂可为试剂盒中的组分。
应用
本发明进一步提供根据本发明所述的探针组合，或所述的试剂盒在目标序列杂交捕获、高通量测序、低丰度核酸检测、核酸精准分析分型以及突变检测中的应用。
实施例1
本实施例以新冠病毒（SARS-CoV-2）全基因组捕获测序为例示出了本发明的核酸检测方法，具体如下：
1、材料与方法
1.1 材料
修饰单链DNA（ssDNA）探针的设计
以新冠病毒全基因组序列（NC_045512.2）的全基因组区域（除了3’的重复序列区域）进行杂交捕获探针设计，设计5’端己炔修饰标记长度120nt单链DNA探针，并对GC含量偏离的区域（小于30%或大于65%）进行探针覆盖密度的调整，对GC含量低于30%的探针捕获区域上下游补充探针，增加局部探针密度以保证捕获效率和覆盖度，对GC含量严重偏高大于65%的区域进行探针平移到侧翼GC在40-60%的区域内进行探针设计，以提高整体基因组覆盖均一性。
1.2 纳米微球制备与偶联捕获探针
将0.5克氯化铁和0.2克氢氧化钠溶于15毫升乙二醇混匀，加入50ml反应釜加热至240℃，孵育5小时制备成四氧化三铁纳米颗粒。用磁力架分离去除上清，用乙醇洗涤并冷冻干燥。
将上一步制备的纳米颗粒分散混匀到500毫升无水乙醇中，加入28%氨水5毫升混匀，逐滴加入300微升TEOS并高速搅拌混匀持续5小时，通过优化反应条件和孵育时间，控制并制备300nm直径覆盖二氧化硅外壳的超顺磁性纳米微球，用异丙醇洗涤并真空干燥。
将上一步制备300nm级磁性微球加入5毫升四氢呋喃中并超声分散，逐滴加入3-(叠氮基丙基)三乙氧基硅烷，持续震动孵育48小时，用异丙醇洗涤并真空干燥。
将20微升5’-己炔基修饰单链DNA探针与修饰的纳米微球混合，加入5微升三乙基乙酸铵缓冲液和10微升DMSO混合均匀，加入铜(II)-TBTA络合物催化剂，4℃孵育过夜。根据捕获目标拷贝数，适当调整修饰的探针终浓度，以控制表面修饰覆盖合适的探针密度，微球表面的偶联探针不足或过量都会影响杂交捕获效率。
1.3 病毒标准品全基因组文库稀释与模拟临床样品文库制备
将病毒标准品全基因组二代测序文库进行扩增，参考真实临床样本病毒拷贝数范围，混合一定比例人gDNA文库制备成模拟临床样本，进行qPCR病毒拷贝数定量和直接二代测序，确定模拟样本文库中低丰度病毒序列检出率和基因组覆盖度。
2. 实验流程
2.1 纳米磁珠杂交捕获和文库扩增
1) 捕获磁珠平衡至室温，杂交缓冲液和清洗液用恒温混匀仪的温度设为65℃预热。杂交缓冲液主要成分包括：20x SSPE、10x Denhardt’s solution、10mM EDTA、0.2%SDS、0.1% Tween 20、Cot-1 DNA 5ug、20U RNase抑制剂、杂交增强液；清洗液主要成分包括：0.1x SSC、0.1% SDS、0.1% Tween 20。
按下表配置杂交体系，并在65℃预热，
杂交体系 体积（μl）
杂交缓冲液 25
模拟临床文库 15
共计 40
2) 将纳米磁珠颠倒混匀，每个反应取50ul磁珠加入1.5ml离心管A中，置于磁力架上，静置2-5分钟，待磁珠保存液上清澄清后弃掉。
3) 将配制好的杂交体系加入步骤2)的磁珠离心管A中，轻柔震荡混匀后置于提前设置好的65℃恒温混匀仪中，65℃杂交孵育30分钟，每隔5分钟震荡混匀一次。吸取500ul杂交清洗液于离心管B中，放置于65℃恒温混匀仪中预热。
4) 待杂交完成后，将离心管A置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。吸取离心管B中的500ul杂交清洗液加到离心管A中，吹打混匀或涡旋混匀，使磁珠充分重悬，立即置于65℃恒温混匀仪孵育5分钟。重复一次洗涤操作，弃去上清并保证无液体残留。
5) 向富集后的纳米磁珠中加入等温扩增反应体系并重悬。
2.2 纳米磁珠上重扩增和测序分析
将经过杂交富集的纳米磁珠杂交产物用接头通用引物进行PCR重扩增并进行二代测序，测序深度1Gb/样品，经过与新冠病毒全基因组序列（NC_045512.2）比对分析，发现经过富集和去背景后低拷贝目标（-1000拷贝/500ng文库1和文库2）可以检出病毒序列，而捕获前文库直接二代测序检出病毒序列为0，显著提高检测灵敏度下限；在中等拷贝目标（-104拷贝/500ng文库）模拟样品文库3的测试中，经过富集和测序可以获得病毒86%的全基因组覆盖，比无捕获直接测序获得的病毒序列数提高34倍，基因组覆盖度由6%提升到86%，体现出灵敏度和特异性比常规宏基因组测序的显著提高（参见下表1）。
表1-纳米磁珠杂交捕获前后测序结果比较分析
模拟临床样品文库 qPCR检测拷贝数 捕获前检出目标序列数 捕获前目标基因组覆盖度 捕获后检出目标序列数 捕获后目标基因组覆盖度
1 1,242 0 0% 14 3.17%
2 1,558 0 0% 10 2.11%
3 26,608 34 6.12% 1,116 86.01%
3、结论
3.1 通过以上实验发现，经过纳米磁珠杂交捕获后样本的检测下限比直接二代测序的灵敏度显著提高，特异性和目标区域覆盖度也比单独二代测序检测更优（见表1）。该设计可以有效避免低丰度目标的漏检问题，通过对非目标背景核酸的洗涤降噪，可以进一步提高信噪比，保证从临床样本中更稳定的检测低丰度目标核酸。
3.2 本设计中纳米磁珠可以进行富集后直接在磁珠上进行后续文库扩增, 纳米磁珠的设计和偶联方式对后续酶反应没有影响，缩短了检测流程也防止了更多的中间处理对低丰度目标造成的损耗。
3.3 该设计通过制备纳米磁珠并通过偶联探针，降低表面非特异性吸附，调整优化杂交捕获试剂和条件，可以实现半小时内完成目标捕获，比常规杂交流程（4小时以上或过夜）显著缩短。
实施例2
本实施例以新冠病毒（SARS-CoV-2）N基因检测为例示出了本发明的核酸检测方法，具体如下：
1、材料与方法
1.1 材料
修饰单链DNA（ssDNA）探针的设计
以新冠病毒全基因组序列（NC_045512.2）的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）N基因区域进行杂交捕获探针设计（包括N-1、2、3、4、5，图1黑色标注区域），设计5’端己炔修饰标记长度120nt单链DNA探针，探针捕获区域在等温扩增的扩增区域（图1标注区域）之外上下游-200bp区域范围，为提对高低丰度目标片段捕获效率，增加局部区域探针密度，相邻探针序列间有50%重叠，同时探针组捕获区和等温扩增区域位置上无交集，有效捕获目标序列的同时维持了扩增区域的单链状态，避免因为序列互补竞争导致在磁珠上进行等温扩增效率低下，另外，捕获探针组序列不会与等温扩增引物有任何互补结合导致的扩增效率问题，进一步确保目标核酸检测的准确性（图2）。
1.2 纳米微球制备与偶联捕获探针
将0.5克氯化铁和0.2克氢氧化钠溶于15毫升乙二醇混匀，加入50ml反应釜加热至240℃，孵育5小时制备成四氧化三铁纳米颗粒。用磁力架分离去除上清，用乙醇洗涤并冷冻干燥。
将上一步制备的纳米颗粒分散混匀到500毫升无水乙醇中，加入28%氨水5毫升混匀，逐滴加入300微升TEOS并高速搅拌混匀持续5小时，通过优化反应条件和孵育时间，控制并制备300nm直径覆盖二氧化硅外壳的超顺磁性纳米微球，用异丙醇洗涤并真空干燥。
将上一步制备300nm级磁性微球加入5毫升四氢呋喃中并超声分散，逐滴加入3-(叠氮基丙基)三乙氧基硅烷，持续震动孵育48小时，用异丙醇洗涤并真空干燥。
将20微升5’-己炔基修饰单链DNA探针与修饰的纳米微球混合，加入5微升三乙基乙酸铵缓冲液和10微升DMSO混合均匀，加入铜(II)-TBTA络合物催化剂，4℃孵育过夜。根据捕获目标拷贝数，适当调整修饰的探针终浓度，以控制表面修饰覆盖合适的探针密度，微球表面的偶联探针不足或过量都会影响杂交捕获效率。
1.3 新冠病毒核衣壳蛋白N基因等温扩增引物探针
本发明的探针序列基于新冠病毒新冠病毒（SARS-CoV-2）核衣壳蛋白N基因的位点而设计。
1.4 新冠病毒N基因目标区域质粒梯度稀释与模拟样品制备
将N基因的目标序列片段转化入pUC57-K载体，形成含有N基因目标片段的质粒标准品进行扩增和定量。将质粒标准品按照拷贝数依次进行梯度稀释，拷贝数梯度从10^6拷贝/5ul 10倍梯度稀释到1拷贝/5ul，共7个梯度，以及一个阴性对照组，每个梯度质粒分别投入100ng或500ng的人gDNA背景，分别用于模拟临床的液体活检样本或组织样本，将模拟DNA样品用超声随机打断到平均300bp；将片段化的模拟DNA样品加入450ul咽拭子裂解液制备成模拟临床裂解液样品。
1.5 等温扩增试剂和体系
等温扩增反应体系1的配制：本发明针对纳米磁珠上富集目标DNA进行扩增，将捕获后纳米磁珠与引物组进行热变性，体系1包括：1-2ul FIP引物和BIP引物（20uM），0.5ulF3引物和B3引物（10uM），1-2ul LF引物和LB引物（10uM），5ul DNA样品。混匀离心，98℃ 5分钟，打开核酸二级结构后，维持在65℃。
Figure 144909DEST_PATH_IMAGE003
等温扩增反应体系2的配制：2.5ul Bst聚合酶缓冲液，1ul Bst聚合酶，3.5-7uldNTP Mix，1.5-3ul MgSO4 (100 mM)，补水至25ul。混匀离心，加入到反应体系1中，67℃孵育0.5-1小时，80℃ 5分钟终止反应。用琼脂糖凝胶电泳对恒温扩增反应产物进行检测，出现LAMP扩增条带的样本定为阳性（+），没有出现扩增条带定为阴性（-）。
Figure 650977DEST_PATH_IMAGE004
1.6等温扩增最适温度优化
根据表1和表2的体系，对环介导等温扩增反应的最适温度进行测试，分别测试60-70℃，反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳进行判断，根据产量和稳定性，确定67℃为该反应体系最适温度。
2. 实验流程
2.1无纳米磁珠捕获的等温扩增方法
将拷贝数梯度从含有10^6拷贝/5ul到1拷贝/5ul的目标DNA在100ng或500ng人源基因组背景下的模拟DNA样本，与阴性对照（0拷贝目标DNA在100或500ng人源基因组DNA背景中）进行等温扩增，反应程序为：95℃ 5分钟，67℃孵育1小时，80℃ 5分钟终止反应，4度持续。
实验发现在1和10拷贝的稀释梯度，无论是否添加背景DNA，均无扩增信号检出。所以根据实验结果，不进行磁珠富集的等温扩增检测下限为100拷贝/反应（参见下表）。
模拟DNA样本等温扩增电泳检测结果
Figure 336036DEST_PATH_IMAGE005
2.2 纳米磁珠杂交捕获+等温扩增方法
1) 捕获磁珠平衡至室温，杂交缓冲液和清洗液用恒温混匀仪的温度设为65℃预热。杂交缓冲液主要成分包括：20x SSPE、10x Denhardt’s solution、10mM EDTA、0.2%SDS、0.1% Tween 20、Cot-1 DNA 5ug、20U RNase抑制剂、杂交增强液；清洗液主要成分包括：0.1x SSC、0.1% SDS、0.1% Tween 20。
按下表配置杂交体系，并在65℃预热，
Figure 687383DEST_PATH_IMAGE006
2) 将纳米磁珠颠倒混匀，每个反应取40ul磁珠加入1.5ml离心管A中，标记样本名，置于磁力架上，静置2-5分钟，待磁珠保存液上清澄清后弃掉。
3) 将配制好的杂交体系加入步骤2)的磁珠离心管A中，轻柔震荡混匀后置于提前设置好的65℃恒温混匀仪中，65℃杂交孵育30分钟，每隔5分钟震荡混匀一次。吸取500ul杂交清洗液于离心管B中，放置于65℃恒温混匀仪中预热。
4) 待杂交完成后，将离心管A置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。吸取离心管B中的500ul杂交清洗液加到离心管A中，吹打混匀或涡旋混匀，使磁珠充分重悬，立即置于65℃恒温混匀仪孵育5分钟。重复一次洗涤操作，弃去上清并保证无液体残留。
5) 向富集后的纳米磁珠中加入等温扩增反应体系并重悬。
2.3 纳米磁珠上等温扩增
将经过杂交富集的纳米磁珠样品进行等温扩增，反应体系与反应条件同前，发现经过富集和去背景后，检测下限可以稳定检出10拷贝/反应的目标核酸，1拷贝/反应样品在0或100ng人源背景干扰下也被检出，但是500ng背景干扰下无检出，整体检测灵敏度比常规等温扩增检测灵敏度提升一到两个数量级（见下表）。
纳米磁珠杂交捕获后的等温扩增电泳检测结果
Figure 774288DEST_PATH_IMAGE007
3、结论
3.1 通过以上实验发现，经过纳米磁珠杂交捕获后样本的检测下限可以达到10拷贝，甚至1拷贝，比直接等温扩增的灵敏度提高一到两个数量级，特异性和重复性也比单独等温扩增检测更优。该设计可以有效避免低丰度目标的漏检问题，通过对非目标背景核酸的洗涤降噪，可以进一步提高信噪比，保证从临床样本中更稳定的检测低丰度目标核酸。
3.2 使用链酶亲和素磁珠替换纳米磁珠，进行相同捕获流程和磁珠上等温扩增流程，发现磁珠上等温扩增反应受到抑制并无电泳条带检出，证明市售或商化链酶亲和素磁珠对后续检测Bst酶反应有抑制，不适合做直接磁珠上等温扩增，必须要先洗脱捕获目标核酸再进行后续检测，而洗脱步骤会进一步造成低丰度目标核酸的损耗。本发明中纳米磁珠可以进行富集后直接在磁珠上进行等温扩增，纳米磁珠的设计和偶联方式对后续酶反应没有影响，缩短了检测流程也防止了更多的中间处理对低丰度目标造成的损耗。
3.3 本发明通过制备纳米磁珠并偶联探针，调整杂交捕获试剂和条件，大大缩短实验流程，不再需要做核酸提取和核酸洗脱等步骤，可以实现直接在临床样本裂解液中富集目标核酸，并直接进行磁珠上等温扩增快速检测。
实施例3
本实施例以新冠病毒（SARS-CoV-2）N基因检测为例示出了本发明的核酸检测方法，具体如下：
1、材料与方法
1.1 材料
修饰单链DNA（ssDNA）探针的设计
以新冠病毒全基因组序列（NC_045512.2）的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）N基因区域进行杂交捕获探针设计（包括N-1、2、3、4、5、6、7，图3黑色标注区域），设计5’端己炔修饰标记长度120nt单链DNA探针，探针捕获区域在实时荧光定量PCR的扩增区域（图3标注区域）之外上下游~200bp区域范围，为提对高低丰度目标片段捕获效率，增加局部区域探针密度，相邻探针序列间有50%重叠，同时探针组捕获区和PCR扩增区域位置上无交集，有效捕获目标序列的同时保证了PCR扩增区域的单链状态，避免因为序列互补竞争导致在磁珠上进行PCR扩增效率低下，另外，捕获探针组序列不会与PCR引物和荧光探针序列有任何互补结合，也确保目标核酸检测的准确性（图3）。
1.2 纳米微球制备与偶联捕获探针
将0.5克氯化铁和0.2克氢氧化钠溶于15毫升乙二醇混匀，加入50ml反应釜加热至240℃，孵育5小时制备成四氧化三铁纳米颗粒。用磁力架分离去除上清，用乙醇洗涤并冷冻干燥。
将上一步制备的纳米颗粒分散混匀到500毫升无水乙醇中，加入28%氨水5毫升混匀，逐滴加入300微升TEOS并高速搅拌混匀持续5小时，通过优化反应条件和孵育时间，控制并制备300nm直径覆盖二氧化硅外壳的超顺磁性纳米微球，用异丙醇洗涤并真空干燥。
将上一步制备300nm级磁性微球加入5毫升四氢呋喃中并超声分散，逐滴加入3-(叠氮基丙基)三乙氧基硅烷，持续震动孵育48小时，用异丙醇洗涤并真空干燥。
将20微升5’-己炔基修饰单链DNA探针与修饰的纳米微球混合，加入5微升三乙基乙酸铵缓冲液和10微升DMSO混合均匀，加入铜(II)-TBTA络合物催化剂，4℃孵育过夜。根据捕获目标拷贝数，适当调整修饰的探针终浓度，以控制表面修饰覆盖合适的探针密度，微球表面的偶联探针不足或过量都会影响杂交捕获效率。
本发明的探针序列基于新冠病毒新冠病毒（SARS-CoV-2）核衣壳蛋白N基因位点而设计。
1.3 新冠病毒N基因目标区域质粒梯度稀释与模拟样品制备
将N基因的目标序列片段转化入pUC57-K载体，形成含有N基因目标片段的质粒标准品进行扩增和定量。将质粒标准品按照拷贝数依次进行梯度稀释，拷贝数梯度从10^6拷贝/5ul 10倍梯度稀释到1拷贝/5ul，共7个梯度，以及一个阴性对照组，每个梯度质粒分别投入100ng或500ng的人gDNA背景，分别用于模拟临床的液体活检样本或组织样本，将模拟DNA样品用超声随机打断到平均300bp；将片段化的模拟DNA样品加入450ul咽拭子裂解液制备成模拟临床裂解液样品。
1.4 实时荧光定量PCR试剂和体系
Figure 451257DEST_PATH_IMAGE008
2. 实验流程
2.1无纳米磁珠捕获的实时荧光定量PCR方法
将拷贝数梯度从含有10^6拷贝/5ul到1拷贝/5ul 的目标DNA在100ng或500ng人源基因组背景下的模拟DNA样本，与阴性对照（0拷贝目标DNA在100或500ng人源基因组DNA背景中）进行实时荧光定量PCR，反应程序为：95度5分钟；进入循环95度15秒，60度30秒（收集荧光），45个循环；4度持续。
实验发现在1和10拷贝的稀释梯度，无论是否添加背景DNA，均无信号检出或Ct值大于40，已超出qPCR检测范围。所以根据实验结果，不进行磁珠富集的qPCR检测下限为100拷贝/反应（下表）。
模拟DNA样本qPCR实际检测拷贝数
Figure 607301DEST_PATH_IMAGE009
2.2 纳米磁珠杂交捕获+实时荧光定量PCR方法
1) 捕获磁珠平衡至室温，杂交缓冲液和清洗液用恒温混匀仪的温度设为65℃预热。杂交缓冲液主要成分包括：20x SSPE、10x Denhardt’s solution、10mM EDTA、0.2%SDS、0.1% Tween 20、Cot-1 DNA 5ug、20U RNase抑制剂、杂交增强液；清洗液主要成分包括：0.1x SSC、0.1% SDS。
按下表配置杂交体系，并在65℃预热，
Figure 762338DEST_PATH_IMAGE010
2) 将纳米磁珠颠倒混匀，每个反应取40ul磁珠加入1.5ml离心管A中，标记样本名，置于磁力架上，静置2-5分钟，待磁珠保存液上清澄清后弃掉。
3) 将配制好的杂交体系加入步骤2)的磁珠离心管A中，轻柔震荡混匀后置于提前设置好的65℃恒温混匀仪中，65℃杂交孵育30分钟，每隔5分钟震荡混匀一次。吸取500ul杂交清洗液于离心管B中，放置于65℃恒温混匀仪中预热。
4) 待杂交完成后，将离心管A置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。吸取离心管B中的500ul杂交清洗液加到离心管A中，吹打混匀或涡旋混匀，使磁珠充分重悬，立即置于65℃恒温混匀仪孵育5分钟。重复一次洗涤操作，弃去上清并保证无液体残留。
5) 向富集后的纳米磁珠中加入qPCR反应体系并重悬。
2.3 纳米磁珠上实时荧光定量PCR
将经过杂交富集的纳米磁珠样品进行实时荧光定量PCR，反应体系与反应条件同前，发现经过富集和去背景后，检测下限可以稳定检出10拷贝/反应的目标核酸，比常规qPCR检测灵敏度提升一到两个数量级。部分样品在1拷贝目标DNA的稀释梯度也有信号检出（见下表）。
纳米磁珠杂交捕获后的qPCR实际检测拷贝数
Figure 969329DEST_PATH_IMAGE011
3、结论
3.1 通过以上实验发现，经过纳米磁珠杂交捕获后样本的检测下限可以达到10拷贝，甚至1拷贝，比直接qPCR的灵敏度提高一到两个数量级，特异性和重复性也比单独qPCR检测更优。该设计可以有效避免低丰度目标的漏检问题，通过对非目标背景核酸的洗涤降噪，可以进一步提高信噪比，保证从临床样本中更稳定的检测低丰度目标核酸。
3.2 使用链酶亲和素磁珠替换纳米磁珠，进行相同捕获流程和磁珠上qPCR流程，发现磁珠上qPCR反应受到抑制并无正常荧光信号检出，证明市售或商化链酶亲和素磁珠对后续检测酶反应和荧光信号收集有抑制，不适合做直接磁珠上qPCR扩增，必须要先洗脱捕获目标核酸再进行后续检测，而洗脱步骤会进一步造成低丰度目标核酸的损耗。本发明中纳米磁珠可以进行富集后直接在磁珠上进行qPCR，纳米磁珠的设计和偶联方式对后续酶反应和荧光信号收集没有影响，缩短了检测流程也防止了更多的中间处理对低丰度目标造成的损耗。
3.3 本发明通过制备纳米磁珠并偶联探针，调整杂交捕获试剂和条件，大大缩短实验流程，不再需要做核酸提取和核酸洗脱等步骤，可以实现直接在临床样本裂解液中富集目标核酸，并直接进行磁珠上qPCR快速检测。
实施例4
本实施例进一步探究了不同类型磁珠的结合力，包括市售的生物素-亲和素磁珠以及通过羧基-氨基微球或磁珠的结合力。
生物素-链酶亲和素的热变性解绑定温度范围从75℃开始到112℃完全变性失去结合能力，而羧基和氨基形成的肽键热稳定，受到缓冲液酸碱度和还原剂比例等物化环境影响较大，在80-100℃容易发生不同程度的断裂。而本发明通过叠氮和炔基形成的叠氮炔环加成共价键连接，经测定其热分解温度超过350℃，有非常好的热稳定性，保证了更高效的探针捕获效率，也有效防止探针和捕获目标在后续磁珠上扩增检测过程中因高温加热和热循环发生结合断裂和脱落的概率。
实施例5
本实施例探究了链酶亲和素磁珠和本发明的微球的背景吸附比较实验。结果如图1所示，其中NP表示纳米磁珠，PT1表示患者1，PT2表示患者2，将得到的文库进行混库处理，以降低文库偏好性。图1示出了使用高灵敏度芯片（100-1000pg/ul）和Qubit浓度定量（0.2-100ng）的捕获后PCR（30个循环）后的生物分析仪结果。背景吸附比较实验可以看到链酶亲和素磁珠捕获到大量非特异背景，而偶联和没有偶联探针的纳米磁珠，几乎没有非特异性吸附背景。证明磁珠本身和偶联了探针的磁珠的非特异性吸附远远低于链酶亲和素磁珠。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (10)

1.一种基于微球检测核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 提供来源于生物样品的核酸片段；
(2) 使微球偶联物在杂交缓冲液中与所述核酸片段接触并杂交，从而得到结合体；
(3) 将所述结合体进行扩增检测；
其中，所述微球偶联物中微球通过连接臂与第一探针共价连接。
2.根据权利要求1所述的基于微球检测核酸的方法，其特征在于，步骤(2)中杂交时间为10-60min。
3.根据权利要求2所述的基于微球检测核酸的方法，其特征在于，所述连接臂具有下式结构：
Figure 123696DEST_PATH_IMAGE001
，其中m、n各自分别为1-10的整数。
4.根据权利要求3所述的基于微球检测核酸的方法，其特征在于，进一步包括使用清洗缓冲液清洗所述结合体，以保留与所述探针杂交的核酸片段。
5.根据权利要求4所述的基于微球检测核酸的方法，其特征在于，所述微球表面具有硅氧烷基团，且所述硅氧烷基团通过Si-C键与所述连接臂的一端共价连接，通过Si-O键与微球表面共价连接，所述硅氧烷基团包含Si-O(CH2)xCH3，其中x为0-5的自然数。
6.根据权利要求5所述的基于微球检测核酸的方法，其特征在于，所述探针5’端含磷酸基团，且通过所述磷酸基团使所述探针与连接臂的一端共价连接。
7.根据权利要求6所述的基于微球检测核酸的方法，其特征在于，所述缓冲液包括：20xSSPE、10x Denhardt’s solution、10mM EDTA、0.2% SDS、0.1% Tween 20、Cot-1 DNA 5ug、20U RNase抑制剂、杂交增强液。
8.根据权利要求7所述的基于微球检测核酸的方法，其特征在于，所述扩增检测包括：
使所述结合体在磁珠上通过PCR扩增加上完整测序接头构建成为测序用文库，然后所得的文库进行高通量测序，或者
将所述结合体在磁珠上与引物组进行热变性，得到第一反应体系，配制第二反应体系，加入所得的第一反应体系进行等温扩增，所述第二反应体系包括：Bst聚合酶缓冲液、Bst聚合酶、dNTP Mix、MgSO4，或者
将所述结合体在磁珠上与荧光定量PCR引物和第二探针进行扩增，根据荧光信号的变化，实时检测扩增中的扩增产物量的变化并进行定量。
9.根据权利要求8所述的基于微球检测核酸的方法，其特征在于，热变性温度为95-99℃，热变性时间为4-6分钟；
等温扩增温度为65-70℃，等温扩增时间为0.5-1小时；
荧光定量PCR反应程序为90-98℃，4-7分钟；90-98℃，10-20秒；55-65℃，20-40秒，25-50个循环。
10.试剂盒，其特征在于，包括：
I. 微球偶联物，其包括第一探针和与其通过连接臂连接的微球；
II. 杂交缓冲液，其包括：20x SSPE、10x Denhardt’s solution、10mM EDTA、0.2%SDS、0.1% Tween 20、Cot-1 DNA 5ug、20U RNase抑制剂、杂交增强液；
III.清洗液，其包括：0.1x SSC、0.1% SDS、0.1% Tween 20；
进一步包括等温扩增试剂、等温扩增引物、荧光定量扩增试剂、荧光定量扩增引物、高通量测序扩增试剂和高通量测序接头引物。
CN202211279079.7A 2022-10-19 2022-10-19 一种基于微球检测核酸的方法 Pending CN115354070A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211279079.7A CN115354070A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 一种基于微球检测核酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211279079.7A CN115354070A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 一种基于微球检测核酸的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115354070A true CN115354070A (zh) 2022-11-18

Family

ID=84008278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211279079.7A Pending CN115354070A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 一种基于微球检测核酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115354070A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114645073A (zh) * 2022-02-24 2022-06-21 万子健生物技术(上海)有限公司 一种包被有多条探针的微球及其制备方法、应用
WO2024055479A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 上海伯杰医疗科技股份有限公司 用于核酸扩增的微球制剂、扩增方法及在联合检测中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101819838A (zh) * 2010-03-02 2010-09-01 中国科学院上海应用物理研究所 炔基修饰磁纳米粒子模块、氨基酸类化合物修饰的磁纳米粒子，及制备方法和用途
CN109490523A (zh) * 2018-10-22 2019-03-19 北京纳晶生物科技有限公司 用于标记的纳米材料、核酸探针及核酸与纳米材料偶联的方法
CN110129413A (zh) * 2019-04-22 2019-08-16 南京求臻基因科技有限公司 一种选择性捕获和纯化microRNA的纳米磁性颗粒及其制备方法和应用
CN111218498A (zh) * 2019-12-09 2020-06-02 彩科(苏州)生物科技有限公司 一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法
CN112159835A (zh) * 2020-09-30 2021-01-01 北京吉检医疗科技有限公司 一种通过探针捕获富集核酸的方法
CN112226489A (zh) * 2020-10-21 2021-01-15 深圳百纳心致生命科学有限公司 一种基于磁珠靶向富集目标基因的核酸提取方法及其应用
CN114923886A (zh) * 2022-04-29 2022-08-19 湖南超亟检测技术有限责任公司 一种基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101819838A (zh) * 2010-03-02 2010-09-01 中国科学院上海应用物理研究所 炔基修饰磁纳米粒子模块、氨基酸类化合物修饰的磁纳米粒子，及制备方法和用途
CN109490523A (zh) * 2018-10-22 2019-03-19 北京纳晶生物科技有限公司 用于标记的纳米材料、核酸探针及核酸与纳米材料偶联的方法
CN110129413A (zh) * 2019-04-22 2019-08-16 南京求臻基因科技有限公司 一种选择性捕获和纯化microRNA的纳米磁性颗粒及其制备方法和应用
CN111218498A (zh) * 2019-12-09 2020-06-02 彩科(苏州)生物科技有限公司 一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法
CN112159835A (zh) * 2020-09-30 2021-01-01 北京吉检医疗科技有限公司 一种通过探针捕获富集核酸的方法
CN112226489A (zh) * 2020-10-21 2021-01-15 深圳百纳心致生命科学有限公司 一种基于磁珠靶向富集目标基因的核酸提取方法及其应用
CN114923886A (zh) * 2022-04-29 2022-08-19 湖南超亟检测技术有限责任公司 一种基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDER SCHATZ等: "Cu(II)-Azabis(oxazoline)-Complexes Immobilized on Superparamagnetic Magnetite@Silica-Nanoparticles: A Highly Selective and Recyclable Catalyst for the Kinetic Resolution of 1,2-Diols", 《ADV. FUNCT. MATER.》 *
CONGLI TANG等: "Application of magnetic nanoparticles in nucleic acid detection", 《JOURNAL OF NANOBIOTECHNOLOGY》 *
FERESHTE DAMAVANDI等: "Enrichment of low abundance DNA/RNA by oligonucleotide-clicked iron oxide nanoparticles", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
何晓晓等: "超顺磁性 DNA 纳米富集器应用于", 《高等学校化学学报》 *
高巍等: "磁性Fe3O4@SiO2@N3多层纳米复合粒子的制备", 《广州化工》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114645073A (zh) * 2022-02-24 2022-06-21 万子健生物技术(上海)有限公司 一种包被有多条探针的微球及其制备方法、应用
WO2024055479A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 上海伯杰医疗科技股份有限公司 用于核酸扩增的微球制剂、扩增方法及在联合检测中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111118226B (zh) 一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒
CN115354070A (zh) 一种基于微球检测核酸的方法
CN108517567B (zh) 用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法
CN110669823B (zh) 一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法
CN113046475B (zh) 一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒
CN107828856B (zh) 一种pcr-lf技术检测碳青霉烯类耐药基因kpc和ndm的引物组合物及其应用
CN113637781B (zh) 猪易感相关致病菌检测的lamp引物组及基于此的试剂盒和lamp芯片和应用
WO2023216707A1 (zh) Nk细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒
CN110904272A (zh) 一种同时检测多种病原微生物的引物探针组合、试剂盒以及方法
CN112961943A (zh) 用于检测SARS-CoV-2的引物探针组合产品
CN110872610A (zh) 构建靶序列的测序文库的方法
CN111363842A (zh) 用于快速检测烟曲霉的序列、试剂盒、方法及应用
CN112813200B (zh) 核酸极短pcr扩增的方法、检测方法及应用
CN111926394B (zh) 基于宏基因组学的建库方法和检测试剂盒
CN113462759A (zh) 基于多重扩增和探针捕获的组合对单链dna序列富集测序的方法及在突变检测中的应用
JP2021104046A (ja) ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中検体から核酸を単離する方法
WO2023108865A1 (zh) 用于检测线粒体环基因突变的引物对、试剂盒及检测方法
CN117106874A (zh) 一种基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法及试剂盒
CN112760422A (zh) 一种基于荧光rma法多重检测禽流感病毒h5、h7、h9亚型的引物探针组及试剂盒
CN115058493B (zh) 一种用于多重核酸检测的dna探针、crispr-反向点杂交核酸检测系统及应用
CN118581096B (zh) 一种核酸适配体及其制备方法和应用
CN117965800B (zh) 基于qpcr的烟曲霉、耶氏肺孢子菌及新生隐球菌检测的组合物和试剂盒
CN114921535B (zh) 一种rna长片段靶向测序方法
CN102191329A (zh) 检测重度抑郁关联基因的试剂盒及其制备方法
CN118996009A (zh) 一种基于纳米孔测序的腺病毒分型快速鉴定试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination