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CN111218498A - 一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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CN111218498A
CN111218498A CN201911252049.5A CN201911252049A CN111218498A CN 111218498 A CN111218498 A CN 111218498A CN 201911252049 A CN201911252049 A CN 201911252049A CN 111218498 A CN111218498 A CN 111218498A
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CN
China
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nucleic acid
microspheres
molecules
detection
acid molecule
Prior art date
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Application number
CN201911252049.5A
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English (en)
Inventor
陈忠垒
程鹏
张敏超
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Caike Suzhou Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Caike Suzhou Biotechnology Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
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Abstract

本发明提供一种无扩增的核酸分子检测试剂盒，所述试剂盒包括：表面标记有捕获分子的编码微球、检测分子和杂交缓冲液；所述捕获分子为与目标核酸分子互补配对的核苷酸链或肽核酸分子；所述检测分子为偶联有催化剂、并且与目标核酸分子互补配对的单核苷酸或核苷酸链。所述核酸分子检测试剂盒在未被扩增的痕量核酸分子上连接催化剂，利用微反应器的原理将催化剂的浓度最大程度地放大，以催化溶液中的大量反应物反应以实现信号的放大，达到使用扩增方法检测时的超高灵敏度，同时所述试剂盒检测时受环境污染较小，还可以实现多目标物的同时检测，检测结果准确可靠。

Description

一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域。具体涉及一种核酸分子检测试剂盒及其使用方法，尤其涉及一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
分子诊断是利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性(即机体自身的基因)或外源性(如病毒、细菌等)生物分子和分子体系的存在、结构或表达调控变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。核酸扩增技术在分子诊断领域中应用范围最广。
相比于传统的临床诊断方法，分子诊断可以弥补传统临床诊断方法的某些缺陷，比如，分子诊断能直接揭示病原体的存在，能客观反映病原体在人体内感染及活动情况，可以作为临床治疗中的一个有效监控手段。另外采用分子诊断还可以检测到常规检测方法难以检测到的病原体，例如可以克服酶免检测技术中从感染到抗体产生的窗口期问题。
因此，以PCR技术为代表的分子诊断技术得到日益广泛的应用。目前商业化的分子诊断主要基于PCR扩增技术及不同的检测技术结合，具体来说通常包括：将少量的细菌或病毒的DNA分子有选择性的大量复制或将病毒的RNA分子逆转录后的DNA有选择性的大量复制，通过设计好的引物将特定的核酸序列复制并修饰好以进行检测。常见的检测方式包括二代基因测序、扩增时的实时荧光检测、毛细管电泳(一代测序)、流式荧光检测和基因杂交芯片等方法。
然而PCR扩增技术实现分子诊断的方法存在一些问题，例如：RNA逆转录耗时长且影响PCR扩增结构；DNA扩增耗时长，对设备的要求高，需要精确控制温度；特异性扩增有偏见，扩增易失败，且部分检测项目对试剂稳定性要求较高；极易出现交叉污染，现有的临床分子检验还需要高度熟练的操作人员，同时对场地要求高，其中PCR临床诊断还必须将样品处理、扩增和检测在分隔的房间内进行，而且为了避免污染前期投入较高，而且污染后难以清理，整个实验室会有长时间假阳性问题；难以做多指标检测，样品要求高。
为了解决PCR扩增中的污染问题，现有技术中以赛沛的GeneXpert和梅里埃的filmarray为代表，将每个样本都用一个一次性的一体化封闭试剂盒检测。试剂盒通过微流控流路设计集成了核酸核酸提取、逆转录、扩增、检测等所有的步骤，他们之间相互隔离且只能单向流通。这种一体化设计提高了分析速度，从样品到结果的时间缩短到一个小时以内。但配套的设备一次只能处理1-2个试剂盒，一台设备一天的样本通量只有10个左右，远不能满足临床需求。而且一体化试剂盒设计复杂精密，制造成本高。一体化解决方案因为其低通量和高成本无法完全解决临床分子诊断中PCR扩增的污染问题。
因此，迫切需要研发一种无需扩增、同时检测灵敏度较高、检测结果准确可靠的高通量、低成本的核酸分子检测方法。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法，所述试剂盒在检测目标核酸分子时，不需要经过PCR扩增，避免了PCR技术导致的耗时且易失败等现象，同时所述试剂盒能够将待测目标分子的信号进行放大，达到扩增检测的超高灵敏度。为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种无扩增的核酸分子检测试剂盒，所述试剂盒包括：
表面标记有捕获分子的编码微球、检测分子和杂交缓冲液；所述捕获分子为与目标核酸分子互补配对的核苷酸链或肽核酸分子；所述检测分子为偶联有催化剂、并且与目标核酸分子互补配对的单核苷酸或核苷酸链。
本发明提供的核酸分子检测试剂盒，利用带有捕获分子的编码微球特异性地结合目标核酸分子，同时利用检测分子与目标核酸分子的结合特异性，形成“微球-捕获分子-目标分子-检测分子-催化剂”的复合结构。
作为本发明一种优选的技术方案，所述编码微球为至少两种发光材料编码的微球。
优选地，所述发光材料选自有机荧光分子、无机荧光分子或量子点中的任意一种或两种以上的组合。
优选地，所述微球中包含磁性纳米颗粒。
优选地，所述编码微球的表面经过化学修饰。
优选地，所述编码微球的制备方法包括如下步骤：将至少两种发光材料和微球混合在高分子材料中，通过多重耦合的物理场将高分子溶液分散在水相中形成均一的液滴，之后通过交联聚合反应将功能材料(例如发光材料、磁性纳米颗粒等)包裹在所述液滴中得到所述编码微球。
本发明中，所述编码微球的制备方法具体包括如下步骤：
(1)编码：以至少两种荧光强度信号作为编码以方便仪器进行识别，并配有编码识别号，从而在同一个样品处理的溶液中对所有编号识别的样品进行处理后还可依据编号进行分析。
以两种荧光编码为例，机器可以识别荧光A和荧光B各6个强度，若荧光A和荧光B强度均为1，可将此编码微球编号为A1B1，依此类推可编码A1B2，A1B3，...，A6B6，则编码一共可达6×6＝36种。通过多重荧光编码的设置，还能够实现多指标检测和高通量测序。
(2)微球合成：将至少两种荧光材料(有机荧光分子、无机荧光分子或量子点)与磁性纳米颗粒混合在需要合成的多种(不同分子量、不同官能团)高分子材料中，通过多重耦合的物理场将高分子溶液分散在水相中形成均一的液滴(或称之为“微反应集团”)，之后通过交联及聚合反应将荧光材料和磁性纳米颗粒等包裹掩埋在高分子液滴中。
(3)表面化学修饰：在制备微球时，可以在反应溶液中添加有反应活性的寡聚高分子，所述寡聚高分子通过微小相分离暴露在微球表面，利用暴露出来的寡聚高分子，可以对所述微球进行进一步表面化学修饰反应，使微球表面能够对核酸分子非特异性亲和力弱，同时特异性偶联反应活性强且密度高。
(4)将目标核酸分子(DNA或RNA等)的保守区识别出后，设计长短适度的捕获分子，针对不同应用，捕获分子可设计为单链DNA或肽核酸分子，并在捕获分子的末端(3’或5’端)共价连接可反应的化学官能团，之后反应到微球表面，同一个编号的微球只针对一种目标核酸分子，但可偶联与同一目标核酸分子多个保守区或不同区域的互补配对的多种捕获分子，通过此步骤可实现核酸特异性抓取。
通过此方法制备得到的编码微球可在不同反应条件(如有机相、高温)下耐受，最终可实现可控的特异性核酸分子探针连接在微球表面。
本发明中，对于单位点突变的检测，可使用设计好的肽核酸分子作为捕获分子抓取目标核酸分子，在突变位点的肽核酸PNA分子留空，在抓取后使用突变位点的互补碱基进行配对，这一单核苷酸的末端偶联有催化反应物。
针对片段的检测，可使用单链DNA固定在微球上作为捕获分子结合部分目标核酸分子，再使用游离单链DNA分子作为检测分子结合在目标分子的其他位置，这一游离的检测分子末端偶联有催化反应物。
优选地，所述催化剂为半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶中的任意一种或两种以上的组合。
将成功捕获目标核酸分子并且形成“微球-捕获分子-目标分子-检测分子-催化剂”的复合微球导入微流控芯片中，在反应底物中通过末端带有的催化剂分子催化溶液的反应，利用一个催化剂分子能够催化多个数量级的反应底物分子，从而实现信号的有效放大。以半乳糖苷酶为催化剂为例，使用试卤灵beta-D-吡喃半乳糖苷，二氢荧光素-二-beta-D-吡喃半乳糖苷作为反应底物，半乳糖苷酶催化下能够催化反应发生并且实现信号放大。
优选地，所述杂交缓冲液为所述杂交缓冲液包括摩尔浓度为20-80mM(例如可以是20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM或80mM等)的柠檬酸钠和500-800mM(例如可以是500mM、550mM、600mM、650mM、700mM、750mM或800mM等)的氯化钠。
优选地，所述杂交缓冲液的pH为6.8-7.4，例如可以是6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3或7.4等
作为本发明一种优选的技术方案，所述核酸分子检测试剂盒还包括微孔板芯片，所述微孔板芯片采用注塑生产法或MEMS法进行加工。其中MEMS制造工艺是纳米至毫米尺度微结构加工工艺的通称。
将复合微球构导入微孔板芯片中进行催化反应，复合微球都存在于单独的微孔中，即使复合结构上只有一个催化剂分子，其浓度也提高了多个数量级，因此在不使用核酸扩增技术的情况下就能够实现信号的放大，使检测具有超高的灵敏度。
优选地，所述微孔板芯片上单个微孔的体积为(20-100)×10-15L，例如可以是20×10-15L、30×10-15L、40×10-15L、50×10-15L、60×10-15L、70×10-15L、80×10-15L、90×10-15L或100×10-15L等。
本发明中，微孔板芯片上微孔的密度决定了所采集的数据量及检测动态范围。密排的微孔需要光学检测能清晰分辨，并保证每一个微孔中只有一个或没有微球。同时，微孔板芯片可使用一次性的微孔板或可重复使用的微孔板芯片；一次性使用的微孔板芯片采用注塑生产，非一次性的微孔板芯片可通过芯片MEMS(Micro-Electro-Mechanical System)方法进行加工。
第二方面，一种如第一方面所述的核酸分子检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将含有目标分子的样品、表面标记有捕获分子的编码微球、检测分子和杂交缓冲液混合，得到复合微球和/或未与目标分子结合的微球；
(2)将所述复合微球和/或未与目标分子结合的微球导入微孔板芯片中反应，而后施加外界刺激检测编码信号并分析，得到目标分子的检测结果。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(1)中所述混合于无扩增核酸分子诊断设备中进行。
优选地，所述表面标记有捕获分子的编码微球结合一个或不结合所述目标核酸分子。
如需进行极低浓度的单分子检测，则需要调整微球与目标分子的比例，依据泊松分布进行优化，使一个微球上只抓取一个或不抓取目标分子。
优选地，所述复合微球为与目标分子和检测分子结合的表面标记有捕获分子的编码微球。所述复合微球为“微球-捕获分子-目标分子-检测分子-催化剂”的复合结构。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(2)中将所述复合微球导入所述微孔板芯片的方法选自重力沉降、磁力沉降或电场诱导沉降中的任意一种或两种以上的组合，优选为电场诱导沉降。
为了保证高效快捷地将微球与微孔一一配对组装，可采用以下几种方法：
(1)重力沉降：利用微球密度大于水的特性，重力可使微球自然沉入微孔中；
(2)磁力沉降：由于微球可包裹磁性材料，可使用磁力将微球操纵入微孔中；
(3)电场诱导沉降：由于微球的介电常数与溶液相差极大，可通过施加非匀强交变电场产生介电泳力将微球推入微孔中，在反应检测结束后，可通过调整电场频率改变力的方向将微球推出微孔从而实现微孔重复使用。
优选地，所述微孔板芯片上单个微孔中含有一个或不含所述复合微球和/或未与目标分子结合的微球。
优选地，检测时所述微孔板芯片上的微孔使用油相和/或高分子薄膜进行封闭。
优选地，步骤(2)中所述施加外界刺激的方法为使用至少两种波长的荧光进行近场激发。
本发明中若采用传统的化学发光催化方式，为了达到不扩增的单分子灵敏度，需要将催化剂的浓度最大程度地放大。所以，本发明中采用微反应器的方式将每一个复合微球结构放置在一个微孔中，微孔的体积在50×10-15L左右，之后使用油相或高分子薄膜等封锁住每一个微孔，这样每一个微球复合结构都在一个单独的小体积中，即使复合结构上只有一个催化剂分子浓度也提高了多个数量级，足够催化单个微孔发光。
作为本发明一种优选的技术方案，所述无扩增核酸分子诊断设备包括基于微球的样品处理部分和基于微孔板的检测部分。
优选地，所述基于微球的样品处理部分包括样品提取模块、液体转移模块、混合模块、磁吸模块、液体预存模块和液路清洗模块。
本发明中，所述无扩增核酸分子诊断设备的样品提取模块是用来将生物样本裂解，将释放到溶液中的核酸分子(DNA或者RNA)采用自动磁颗粒法或一次性硅胶柱的方式进行核酸提取，将核酸分子非特异性地捕获到磁性微球上，将微球磁性分离并清洗后用水将微球表面的核酸分子洗脱，获得纯净的核酸溶液；液体转移模块是将连有探针的微球，待测的样品溶液，检测探针，催化剂和催化剂底液等试剂转移至混合模块；混合模块中连有待测分子的微球与检测分子(序列)进行杂交；磁吸模块可以通过富集作用来洗涤捕获有待测目标分子以及检测分子的微球；液体预存模块用于存放缓冲液等反应溶液；液路清洗模块清洗液路防止交叉污染。
优选地，步骤(1)中所述混合于无扩增核酸分子诊断设备的混合模块中进行。
优选地，所述基于微孔板的检测部分包括液路控制模块、多色荧光激发模块、前散射成像模块、荧光发射滤光模块、磁吸模块和交变电场控制模块。
其中，液路控制模块用以导入含有复合微球的溶液进入放有微孔板的夹具中，同时将微孔板表面进行油封；多色荧光激发模块用以激发多重荧光编码微球以及底物分子通过催化剂作用释放出来的荧光物质；通过前散射成像模块得到低背景的导入微球后的微孔板荧光照片；荧光发射滤光模块用以区分编码微球以及微孔亮度变化(底物分子通过催化剂作用释放出来的荧光物质的浓度及其变化)；磁吸模块和交变电场模块用以帮助微球导入或导出微孔。
优选地，所述无扩增核酸分子诊断设备还包括自动控制模块和图像自动识别分析模块。
优选地，所述图像自动识别分析模块识别所述微孔板芯片中微孔的亮度。
所述无扩增核酸分子诊断设备的所有模块均通过底层程序自动控制，软件集成图像自动识别分析模块，系统自动识别每一个微孔中的亮度并得到微孔亮度的分布，自动判断每个微孔中是否有反应发生，每一个反应对应的微球编号。通过亮度分析得到模拟信号的动态检测范围，通过同一编号微球有反应发生的个数作为数字信号的动态检测范围。
作为本发明一种优选的技术方案，所述核酸分子检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)在无扩增核酸分子诊断设备的混合模块将含有目标分子的样品、表面标记有捕获分子的编码微球、检测分子和杂交缓冲液混合，所述表面标记有捕获分子的编码微球结合一个或不结合所述目标核酸分子，得到复合微球和/或未与目标分子结合的微球；
(2)将所述复合微球和/或未与目标分子结合的微球通过电场诱导沉降的方法导入所述微孔板芯片中，所述微孔板芯片上单个微孔中含有一个或不含所述复合微球/或未与目标分子结合的编码微球，反应后使用至少两种波长的荧光进行近场激发，检测所述复合微球/或未与目标分子结合的编码微球的编码信号并利用无扩增核酸分子诊断设备的分析模块进行分析，得到目标分子的检测结果。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供的无扩增核酸分子检测试剂盒，在未被扩增的痕量核酸分子上连接催化剂，利用微反应器的原理将催化剂的浓度最大程度地放大，以催化溶液中的大量反应物反应以实现信号的放大，达到使用扩增方法检测时的超高灵敏度；
(2)本发明中，使用多种发光材料的进行标记的编码微球，可以实现同时检测多种核酸分子的目的，对样品的量要求较少，使分子诊断更加高效快捷；所述检测试剂盒配合无扩增核酸分子诊断设备使用，一方面可以避免外界操作环境的交叉污染，另一方面，可以实现从样品的预处理及分析的全过程，其分析结果的准确度明显提高，检测结果更加可靠。
附图说明
图1为无扩增核酸分子诊断设备拍摄的含有荧光编码微球的微孔板芯片照片。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，荧光编码微球合成可以使用如下方法合成：
将甲基丙烯酸、苯乙烯单体、聚甲基丙烯酸甲酯和交联剂(二乙烯基苯)混合在氯仿中作为高分子溶液，取4.5mL高分子溶液加入0.5mL罗丹明和0.5mL荧光素和90mg纳米磁颗粒，之后将其置于两个有300mL去离子水和十二烷基硫酸钠的反应器中，得到乳液。
在承载乳液的容器的两侧分别设置超声波发生器(超声脉冲50uJ，100uJ)及传感器(4MHz，6dB带宽，4.4MHz，聚焦长度10.5cm)，通过传感器的实时反馈闭环控制超声波对微球乳液中的Fe3O4磁性纳米颗粒进行调制，以磁共振成像装置原理，磁性颗粒对超声波段吸收并保持极性朝向被外加超声波的场诱导，为了保持诱导进行的调制效率，传感器通过Fe3O4磁性纳米颗粒特定的吸收波谱及时调解超声脉冲的能量从而可控调解Fe3O4磁性纳米颗粒的朝向，得到功能性颗粒均匀分布、偶极方向一致的液滴；
将溶液均匀分散为10μm的液滴，在溶液中加入引发剂偶氮二异丁腈并加热进行聚合交联反应，24小时之后，每个液滴中的氯仿缓慢溶于水中并挥发，单体聚合并交联，最终形成荧光编码微球。
实施例1
本实施例提供一种可以同时检测样本中的甲型流感病毒核酸分子和乙型流感病毒核酸分子的无扩增核酸分子检测试剂盒。具体制备方法及使用方法包括如下步骤：
取两份荧光编码微球，微球1使用甲型流感病毒核酸分子的互补单链DNA分子(捕获分子1)进行标记，微球2使用乙型流感病毒核酸分子的互补单链DNA分子(捕获分子2)进行标记。具体步骤为：
以微球1为例，将1mg微球1在1mL PBS缓冲液中分散，加入5mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和5mg Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，混匀并维持搅拌10分钟，之后加入3’端有氨基的甲型流感病毒核酸互补单链DNA分子，之后加入10％BSA作为封闭剂，搅拌30分钟，之后通过磁性分离洗涤微球1，最终分散在杂交缓冲液(50mM柠檬酸钠，pH 7.2，750mM NaCl)中得到捕获分子1标记的荧光微球1，捕获分子2标记的荧光微球2的制备方法同上。
将含有1×109拷贝/微升的甲型流感病毒和1×109拷贝/微升乙型流感病毒培养液的全部核酸利用磁颗粒方法进行提取，最终洗脱在水中。具体步骤为：在200μL病毒培养液中加入130μL裂解液(50mM Tris，pH 8.0，4M盐酸胍，1mM EDTA，1％Triton-X100)，10μL蛋白酶K(20mg/mL)，55℃水浴10分钟；每个样品中加入150μL异丙醇后，混合吹打均匀后加入500μg表面带有羟基的二氧化硅磁珠；静置五分钟后将磁珠在磁力架上吸附，用移液枪移去上层清液，用70％乙醇洗涤磁珠，50μL水洗脱。
之后加入偶连了寡聚核苷酸探针的1mg/mL的荧光微球1和荧光微球2等体积混合，得到溶液0.2mL，加入0.2mL杂交缓冲液(50mM柠檬酸钠，pH 7.2，750mM NaCl)和0.2mL的偶联有生物素的核酸探针，所述生物素分子被链霉亲和素特异性识别，所述核酸探针可以特异性结合甲型流感病毒核酸分子或乙型流感病毒核酸分子，均匀混合5分钟，之后磁吸并洗涤，再加入0.2mL的链霉亲和素-beta-半乳糖苷酶共轭连接在核酸探针上作为检测分子，均匀混合5分钟，之后磁吸并洗涤，再将磁珠分散到100μM二氢荧光素-二-beta-D-吡喃半乳糖苷溶液中。
检测：将微球复合结构通过微流体加入有微孔板芯片的反应器中，加10MHz交流电，微球被推入微孔中，之后用硅油将微孔表面封闭，反应2分钟后，使用488nm波长光激发，滤光片1(512nm透射，20nm带宽)拍照，滤光片2(570nm透射，30nm带宽)拍照，再使用532nm波长光激发，滤光片3(615nm透射，30nm带宽)拍照，流入乙醇后再流入清洗液，改变交流电频率至10kHz，之后流入清洗液，清洗反应器。
图1为无扩增核酸分子诊断设备在488nm波长光激发滤光片1拍照时得到的含有荧光编码微球1的微孔板照片。由图1可知，捕获了甲流病毒核酸的荧光微球1均匀的落到了微孔里，每个微孔中只有一个微球而且被限制在了微孔中，微球上带有的标记酶放大了荧光信号并被前散射成像模块检测到。
数据处理和浓度测定：图像处理软件首先识别所有磁珠，根据滤光片1和滤光片2下荧光的强度将荧光微球进行分类(荧光微球1和荧光微球2)，因为病毒RNA未经扩增浓度很低，大部分磁珠不能捕获相应RNA形成复合微球并被链霉亲和素-beta-半乳糖苷酶共轭标记，无相应的荧光信号。剩余磁珠只能捕获一个或少数几个目标RNA形成夹心复合物并被链霉亲和素-beta-半乳糖苷酶共轭标记，有相应的荧光信号。
检测到产生化学信号的磁珠占总磁珠的比例值(fon)与标记酶分子的总数和磁珠总数的比例值(AEB，Average Enzyme per Bead)之间遵从泊松分布(AEB＝-ln(1-fon))。将AEB值和待测物浓度值进行线性拟合绘制校准曲线后，用相同的方法测试未知样品，得到的信号值用内插法带入标准曲线即测得未知样品中待测物的浓度，所得浓度为105拷贝/微升(一般为104-107拷贝/微升)。
灵敏度分析和特异性分析：将已知浓度(拷贝数)的甲型流感病毒核酸和乙型流感病毒核酸分别阶梯稀释并进行上述测试，并绘制标准曲线。背景值加上三倍背景值反复测量后标准偏差在标准曲线上对应的浓度(拷贝数)即为本方法的灵敏度(检出限)；特异性分析显示磁珠1因为偶连甲型流感病毒核酸特异性的捕获探针，检测不到乙型流感病毒的核酸，同理磁珠2也检测不到甲型流感病毒的核酸。
实施例2
本实施例提供一种可以同时检测样本中血清样本中的miRNA miR-122和miR-129的无扩增核酸分子检测试剂盒。具体制备方法及使用方法包括如下步骤：
取两份荧光编码微球，微球1使用miRNA miR-122的互补肽核酸分子(捕获分子1)进行标记，微球2使用miRNA miR-129的互补肽核酸分子(捕获分子2)进行标记。具体步骤为：
以微球1为例，将1mg微球1在1mL PBS缓冲液中分散，加入5mg EDC和5mg Sulfo-NHS，混匀并维持搅拌10分钟，之后加入3’端有氨基的miR-122互补单链肽核酸分子，之后加入10％BSA作为封闭剂，搅拌30分钟，之后通过磁性分离洗涤微球1，最终分散在杂交缓冲液(50mM柠檬酸钠，pH 7.2，750mM NaCl)中得到捕获分子1标记的荧光微球1，捕获分子2标记的荧光微球2的制备方法同上。
在掺杂miR-122和miR-129标品的血清中加入含有4M尿素的溶液使miRNA分散在溶液中，之后加入荧光微球1和荧光微球2的1:1混合溶液，加入0.2mL杂交缓冲液和0.2mL的偶联有生物素的核酸探针，均匀混合5分钟，之后磁吸并洗涤。再加入0.2mL的链霉亲和素-beta-半乳糖苷酶共轭，均匀混合5分钟，之后磁吸并洗涤。
检测：将微球复合结构通过微流体加入有微孔板芯片的反应器中，加10MHz交流电，微球被推入微孔中，之后用硅油将微孔表面封闭，反应2分钟后，使用488nm波长光激发，滤光片1拍照，滤光片2拍照，再使用532nm波长光激发，滤光片3拍照，流入乙醇后再流入清洗液，改变交流电频率至10kHz，之后流入清洗液，清洗反应器。
数据处理和浓度测定：图像处理软件首先识别所有磁珠，根据滤光片1和滤光片2下荧光的强度将磁珠分类。因为miRNA未经扩增浓度很低，大部分磁珠不能捕获相应RNA形成夹心复合物并被链霉亲和素-beta-半乳糖苷酶共轭标记，无相应的荧光信号。剩余微球只能捕获一个或少数几个目标RNA形成复合微球并被链霉亲和素-beta-半乳糖苷酶共轭标记，有相应的荧光信号。
检测到产生化学信号的磁珠占总磁珠的比例值(fon)与标记酶分子的总数和磁珠总数的比例值(AEB，Average Enzyme per Bead)之间遵从泊松分布(AEB＝-ln(1-fon))。将AEB值和待测物浓度值进行线性拟合绘制校准曲线后，用相同的方法测试未知样品，得到的信号值用内插法带入标准曲线即测得未知样品中待测物的浓度，miRNA的浓度在1×104拷贝/微升。
灵敏度分析和特异性分析：将已知浓度(拷贝数)的miR-122和miR-129分别阶梯稀释并进行上述测试，并绘制标准曲线。背景值加上三倍背景值反复测量后标准偏差在标准曲线上对应的浓度(拷贝数)即为本方法的灵敏度(检出限)；特异性分析显示磁珠1因为偶连miR-122特异性的捕获探针，检测不到miR-129，同理磁珠2也检测不到miR-122。
综上所述，本发明提供的无扩增核酸分子检测试剂盒，在检测病毒核酸分子时，利用2×106-1×109拷贝/微升的病毒培养液进行提取后，或直接检测不经过提取的miRNA，最终可检测出浓度为1×104-107拷贝/微升，检测病毒核酸的灵敏度可达3×103拷贝/微升，检测miRNA的灵敏度可达1.2×103拷贝/微升，说明本发明中利用微反应器的原理实现待测目标分子信号的放大，达到使用扩增方法检测时的超高灵敏度，配合无扩增核酸分子诊断设备，其检测步骤简单，检测结果准确可靠。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种无扩增的核酸分子检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
表面标记有捕获分子的编码微球、检测分子和杂交缓冲液；
所述捕获分子为与目标核酸分子互补配对的核苷酸链或肽核酸分子；
所述检测分子为偶联有催化剂、并且与目标核酸分子互补配对的单核苷酸或核苷酸链。
2.根据权利要求1所述的核酸分子检测试剂盒，其特征在于，所述编码微球为至少两种发光材料编码的微球；
优选地，所述发光材料选自有机荧光分子、无机荧光分子或量子点中的任意一种或两种以上的组合；
优选地，所述微球中包含磁性纳米颗粒；
优选地，所述编码微球的表面经过化学修饰。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分子检测试剂盒，其特征在于，所述编码微球的制备方法包括如下步骤：
将至少两种发光材料和微球混合在高分子材料中，通过多重耦合的物理场将高分子溶液分散在水相中形成均一的液滴，之后通过交联聚合反应将发光材料与磁性纳米颗粒包裹在所述液滴中得到所述编码微球。
4.根据权利要求1-3任一项所述的核酸分子检测试剂盒，其特征在于，所述催化剂选自半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶中的任意一种或两种以上的组合；
优选地，所述杂交缓冲液包括摩尔浓度为20-80mM的柠檬酸钠和500-800mM的氯化钠；
优选地，所述杂交缓冲液的pH为6.8-7.4；
优选地，所述核酸分子检测试剂盒还包括微孔板芯片；
优选地，所述微孔板芯片上单个微孔的体积为(20-100)×10-15L。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的核酸分子检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将含有目标核酸分子的样品、表面标记有捕获分子的编码微球、检测分子和杂交缓冲液混合，得到复合微球和/或未与目标分子结合的微球；
(2)将所述复合微球和/或未与目标分子结合的微球导入微孔板芯片中反应，而后施加外界刺激检测编码信号并分析，得到目标分子的检测结果。
6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合于无扩增核酸分子诊断设备中进行；
优选地，所述表面标记有捕获分子的编码微球结合一个或不结合所述目标核酸分子，所述微孔板芯片上单个微孔中含有一个或不含所述复合微球和/或未与目标分子结合的微球；
优选地，所述复合微球为与目标分子和检测分子结合的表面标记有捕获分子的编码微球。
7.根据权利要求5或6所述的使用方法，其特征在于，步骤(2)中将所述复合微球导入所述微孔板芯片的方法选自重力沉降、磁力沉降或电场诱导沉降中的任意一种或两种以上的组合；
优选地，步骤(2)中所述施加外界刺激的方法为使用至少两种波长的荧光进行近场激发。
8.根据权利要求5-7任一项所述的使用方法，其特征在于，所述无扩增核酸分子诊断设备包括基于微球的样品处理部分和基于微孔板的检测部分；
优选地，所述基于微球的样品处理部分包括样品提取模块、液体转移模块、混合模块、磁吸模块、液体预存模块和液路清洗模块；
优选地，所述基于微孔板的检测部分包括液路控制模块、多色荧光激发模块、前散射成像模块、荧光发射滤光模块、磁吸模块和交变电场控制模块。
9.根据权利要求5-8任一项所述的使用方法，其特征在于，所述无扩增核酸分子诊断设备还包括图像自动识别分析模块，所述图像自动识别分析模块识别所述微孔板芯片中微孔的亮度。
10.根据权利要求5-9任一项所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：
(1)在无扩增核酸分子诊断设备的混合模块将含有目标分子的样品、表面标记有捕获分子的编码微球、检测分子和杂交缓冲液混合，所述表面标记有捕获分子的编码微球结合一个或不结合所述目标核酸分子，得到复合微球和/或未与目标分子结合的微球；
(2)将所述复合微球和/或未与目标分子结合的微球通过电场诱导沉降的方法导入所述微孔板芯片中，所述微孔板芯片上单个微孔中含有一个或不含所述复合微球/或未与目标分子结合的编码微球，反应后使用至少两种波长的荧光进行近场激发，检测所述复合微球/或未与目标分子结合的编码微球的编码信号并利用无扩增核酸分子诊断设备的分析模块进行分析，得到目标分子的检测结果。
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