CN115300531A - 一种副干酪乳杆菌jy062组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种副干酪乳杆菌JY062组合物，包括副干酪乳杆菌JY062（Lactobacillus paracasei JY062）和副干酪乳杆菌JY062的胞外多糖；所述副干酪乳杆菌JY062的含量不低于10⁹CFU/mL；所述外多糖的浓度不低于30mg/mL。本发明还公开了一种副干酪乳杆菌JY062组合物的制备方法。本发明还公开了一种副干酪乳杆菌JY062组合物在制备增强肠道免疫活性保健品和功能食品中的应用；及其在制备改善肠黏膜屏障损伤药物、保健品和功能食品中的应用。本发明具有显著的增强肠道免疫活性、通过NF‑κB信号通路改善肠黏膜屏障损伤的功能。

Description

一种副干酪乳杆菌JY062组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种副干酪乳杆菌JY062组合物及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术

乳酸菌被归属为一般认为是安全的食品级细菌，且大多数乳酸菌被归属为益生菌，副干酪乳杆菌是近年来研究较多的一种益生菌，它属于乳杆菌属，广泛存在于传统的发酵乳制品和人类胃肠道中，且能有效的黏附和定殖在肠道黏膜层，调控肠道微环境稳态中肠道菌群、上皮细胞和免疫因子，进行免疫调节，维持肠道稳态；而乳酸菌重要代谢产物-胞外多糖是乳酸菌以紧密结合的荚膜或松散附着的黏液层形式分泌的、在生长代谢过程中分泌到细胞壁外并常渗于培养基中的一类糖类化合物，在其和宿主肠道细胞互作过程中主要通过改善肠黏膜的黏附、调节肠道微生态平衡以及为肠道供能的方式，对机体肠道发挥了重要的调节作用，乳酸菌的益生功能一方面是EPS在起作用，另一方面是通过益生菌本身的代谢作用来实现的。

合生元是由益生菌和益生元组成的，通过促进益生菌在宿主肠道内定殖增殖，同时发挥益生菌的生理活性和益生元的促生长作用，研究表明，其在改善免疫应答、缓解肠道炎症、减少氧化应激、维持肠上皮细胞屏障功能、调节短链脂肪酸水平、改善肠道菌群结构等方面发挥了重要作用。

NF-κB/Rel蛋白家族包括五个成员：c-Rel，RelA(p65)，RelB，NF-κB1(p50/p105)和NF-κB2(p52/p100)，它们以同源或异源二聚体的形式存在，NF-κB1二聚体蛋白p65/p50(最为常见)和NF-κB二聚体蛋白RelB/p52。在机体处于静息状态下时，NF-κB在细胞质中与其抑制性蛋白I-κB(inhibit NF-κB)结合而呈现出非活性状态；而当机体受到外界刺激时，I-κB的激酶(inhibitor of NF-κB kinase，IKK)会使NF-κB的抑制因子I-κB磷酸化，导致I-κB降解，NF-κB从I-κB复合物中释放，与I-κB分离，游离的NF-κB将从细胞质进入细胞核，与特异性的结合位点结合，调控其靶基因的转录，使NF-κB信号通路激活。NF-κB系统既可维持正常肠上皮内环境的稳态，在黏膜免疫应答中起着核心作用；又可介导病原特异性应答，对黏膜屏障来说是一把双刃剑。

肠道通透性的增加导致有害菌进入黏膜内层，黏液蛋白的分泌量大幅度减少，肠上皮细胞大量凋亡，引起肠道局部环境紊乱。紧密连接是连接肠上皮细胞之间的最主要方式，其位于肠上皮细胞顶层及外侧膜的边界，是一种由跨膜蛋白和细胞质蛋白组成的高度多样化的结构。咬合蛋白Occludin、闭合蛋白Claudin、和闭合小环蛋白(ZO-1、ZO-2、ZO-3)作为最重要的3种紧密连接蛋白，是组成肠道黏膜屏障完整性，决定肠道通透性的重要蛋白分子。肠道内分泌的黏液，主要由杯状细胞分泌的黏蛋白(Mucin)构成，并在在肠腔内部形成黏液层，其中Mucin2是构成黏液层的主要物质。已有大量研究表明，能够通过阻止肠道通透性的增加，刺激杯状细胞分泌黏蛋白，增加小鼠黏液层的厚度改善屏障功能；上调肠上皮细胞黏蛋白MUC2、紧密连接蛋白Claudin-3、ZO-1和E-cadherin的表达来恢复肠道黏膜屏障的完整性。

因此，发明一种副干酪乳杆菌JY062组合物及其制备方法和应用，对实现精准干预乳酸菌及其代谢活性物质在调控宿主肠道健康方面的功能作用具有现实意义，同时为开发益生菌及潜在益生元功能制剂提供理论依据。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种副干酪乳杆菌JY062组合物，组合物由乳酸菌(即副干酪乳杆菌JY062)和胞外多糖组成。

同时，本发明提供一种副干酪乳杆菌JY062组合物的制备方法，由该法获得的组合物具有显著的增强肠道免疫活性、通过NF-κB信号通路改善肠黏膜屏障损伤的功能。

同时，本发明提供一种副干酪乳杆菌JY062组合物在制备增强肠道免疫活性药物、保健品和功能食品中的应用。

同时，本发明提供一种副干酪乳杆菌JY062组合物在制备改善肠黏膜屏障损伤药物、保健品和功能食品中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种副干酪乳杆菌JY062组合物，包括副干酪乳杆菌JY062(Lactobacillusparacasei JY062)和副干酪乳杆菌JY062的胞外多糖；所述副干酪乳杆菌JY062的含量不低于10⁹CFU/mL；所述外多糖的浓度不低于30mg/mL。

一种副干酪乳杆菌JY062组合物的制备方法，所述包括以下步骤：

步骤一，将副干酪乳杆菌JY062按5％接种量接入灭菌的MRS液体培养基中，初始浓度为1.5×10⁹CFU/mL；

步骤二，利用优化后的复合碳源MRS液体培养基，复合碳源等量添加；以34℃在发酵罐中以100rpm/min进行培养25h，发酵过程中补充20％w/v的氨水；在发酵12h后开始补充MRS液体培养基100mL/30min，直至结束，收集菌液；

步骤三，将菌液离心，取上清液一，此步骤重复二次；

步骤四，取上清液一，将体积浓缩至原体积1/3，获得培养基；

步骤五，将培养基灭酶活，冷却至室温后收集上清液二；

步骤六，将上清液二除蛋白，离心后获得上清液三；

步骤七，将上清液三醇沉，离心后取沉淀；

步骤八，将沉淀重悬于去离子水中，得多糖溶液，多糖溶液置于MD34透析袋中，截留分子量为：8KD-14KD，放在去离子水在4℃中进行透析48h，每隔8h更换一次去离子水；

步骤九，将透析后的多糖上清液倒入平板中，置于-80℃冰箱预冻过夜后进行冷冻干燥24h，冻干后得到胞外多糖。

步骤一中，MRS液体培养基的成分为：10g/L蛋白胨、8g/L牛肉粉、4g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、2g/L柠檬酸氢二铵、2g/L磷酸氢二钾、5g/L乙酸钠、0.2g/L硫酸镁、0.04g/L硫酸锰和1g/L Tween-80；将上述成分52.24g溶于1000mL蒸馏水中，玻璃棒搅拌，121℃，15min，高压灭菌，获得MRS液体培养基。

步骤二中，优化后的复合碳源MRS液体培养基的成分为：10g/L蛋白胨、8g/L牛肉粉、4g/L酵母粉、2g/L柠檬酸氢二铵、2g/L磷酸氢二钾、5g/L乙酸钠、0.2g/L硫酸镁、0.04g/L硫酸锰和1g/L Tween-80、3.33g/L果糖、3.33g/L甘露糖、3.33g/L海藻糖、3.33g/L葡萄糖、3.33g/L半乳糖和3.33g/L乳糖；将上述成分52.24g溶于1000mL蒸馏水中，玻璃棒搅拌，121℃，15min，高压灭菌，获得优化后的复合碳源MRS液体培养基。

离心工艺为：在10000r/min，4℃条件下离心15min。

步骤五中，灭酶活的工艺为：在沸水中加热10min。

步骤六中，除蛋白的工艺为：将80％w/v的三氯乙酸添加到上清液二中至终浓度为10％w/v，然后搅拌5min，并在4℃条件下静置10h，10000r/min，4℃条件下离心15min除蛋白。

步骤七中，醇沉工艺为：上清液三中添加2-3倍体积的无水乙醇，使其终浓度为70％，4℃条件下静置过夜，10000r/min，4℃条件下离心15min。

一种副干酪乳杆菌JY062组合物在制备增强肠道免疫活性保健品和功能食品中的应用。

一种副干酪乳杆菌JY062组合物在制备改善肠黏膜屏障损伤药物、保健品和功能食品中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明根据合生元免疫调节相关研究结果，提供了一种具有肠道免疫调节作用的组合物，通过免疫荧光染色法评估结肠巨噬细胞的亚型及分布情况；流式细胞术检测小鼠脾脏及外周血中Th17和Treg细胞含量；ELISA检测7种免疫相关基因和3种免疫球蛋白。本发明克服了现有的副干酪乳杆菌及其产生的胞外多糖免疫调节功能评价的不足，可以客观评价副干酪乳杆菌JY062及其产生的胞外多糖对宿主的肠道免疫屏障调节作用；揭示副干酪乳杆菌JY062及其产生的胞外多糖二者协同下调控肠道免疫的深层机制。

同时，本发明提供了一种通过NF-κB信号通路改善肠黏膜屏障损伤功能的组合物，通过HE染色反映小鼠结肠组织损伤情况，RT-PCR结合Western Blot方式测定结肠NF-κB信号通路的活性，RT-PCR结合免疫组织化学法测定结肠紧密连接蛋白和黏蛋白的表达量。本发明深入挖掘具有预防肠道黏膜损伤的功能，分析肠道黏膜免疫的潜在机制，为开发具有改善肠黏膜屏障损伤功能的合生元提供理论基础，一定程度上能够弥补目前现有应用层面的不足。

附图说明

图1为小鼠结肠免疫相关基因含量；其中，a：TNF-α；b：IFN-γ；c：IL-1β；d：IL-6；e：TGF-β；

图2为小鼠血清免疫球蛋白含量；其中，a：IgA；b：IgG；c：IgM；

图3为小鼠脾脏和外周血中Treg细胞的数量变化；

图4为小鼠脾脏和外周血中Th17细胞的数量变化；

图5为小鼠结肠Th17细胞相关的特异性细胞因子IL-17含量；

图6为小鼠结肠Treg细胞相关的特异性细胞因子IL-10含量；

图7为小鼠结肠巨噬细胞的亚型及分布情况；其中，a：M1型；

图8为小鼠结肠巨噬细胞的亚型及分布情况；其中，b：M2型；

图9为小鼠结肠组织病理学观察；其中，a：HE染色；b：组织学损伤评分；

图10为TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关基因mRNA相对表达量；其中，a：NF-κBp65；b：MyD88；c：IκB；d：TLR4；

图11为TLR4/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白表达量；其中，a：NF-κB p65；b：p-NF-κB p65；c：MyD88；d：IκB；e：p-IκB；f：TLR4；

图12为小鼠结肠组织紧密连接蛋白和黏蛋白mRNA相对表达量；其中，a：Claudin-1；b：Claudin-2；c：Occludin；d：ZO-1；e：MUC2；

图13为小鼠结肠组织紧密连接蛋白和黏蛋白免疫组化染色图；

图14为鼠结肠组织紧密连接蛋白和黏蛋白平均光密度值；其中，a：Claudin-1；b：Claudin-2；c：Occludin；d：ZO-1；e：MUC2。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

本发明中，副干酪乳杆菌JY062的拉丁名为Lactobacillus paracasei JY062，保藏于东北农业大学乳品重点实验室，分离自西藏传统发酵乳制品，本发明中的副干酪乳杆菌JY062的现有技术来源为：一株高产胞外多糖降血糖副干酪乳杆菌JY062(TD062)的黏附性与耐受性评价[J].中国乳品工业，2022，50(4)。

张宇，姜毓君，党芳芳，等.副干酪乳杆菌TD062对Ⅱ型糖尿病小鼠的降糖作用[J].中国食品学报，2020，v.20(05):112-118。

公众可以从东北农业大学获得。

实施例1

一种副干酪乳杆菌JY062组合物，包括副干酪乳杆菌JY062(Lactobacillusparacasei JY062)和副干酪乳杆菌JY062的胞外多糖；所述副干酪乳杆菌JY062的含量为10⁹CFU/mL；所述外多糖的浓度为30mg/mL。

一种副干酪乳杆菌JY062组合物的制备方法，所述包括以下步骤：

(1)将副干酪乳杆菌JY062按5％接种量接入灭菌的MRS液体培养基中，初始浓度为1.5×109CFU/mL。

(2)利用优化后的复合碳源MRS液体培养基，复合碳源等量添加。以34℃在发酵罐中以100rpm/min进行培养25h，(发酵过程中及时补充20％(w/v)的氨水；在发酵12h后开始补充MRS液体培养基，直至结束)，收集菌液。

(3)将菌液在10000r/min，4℃条件下离心15min，取上清液，此步骤重复二次。

(4)取上清液，在旋转蒸发仪中进行浓缩，将体积浓缩至原体积1/3。

(5)将培养基在沸水中加热10min灭酶活，冷却至室温后收集上清液。

(6)将80％(w/v)的三氯乙酸添加到上清液中至终浓度为10％(w/v)然后搅拌5min，并在4℃条件下静置10h，10000r/min，4℃条件下离心15min除蛋白，取上清液。

(7)上清液中添加2-3倍体积的无水乙醇，使其终浓度为70％，4℃条件下静置过夜，10000r/min，4℃条件下离心15min，取沉淀。

(8)将沉淀重悬于去离子水中，多糖溶液置于MD34透析袋中(截留分子量为：8KD-14KD)，放在去离子水在4℃中进行透析48h，每隔8h更换一次去离子水。

(9)将透析后的多糖上清液倒入平板中，置于-80℃冰箱预冻过夜后进行冷冻干燥24h。冻干后得到胞外多糖。

本实施例获得的副干酪乳杆菌JY062组合物在制备增强肠道免疫活性药物、保健品和功能食品中的应用。

增强免疫活性为调节免疫相关基因含量，抑制促炎因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6)的过度分泌，提升抗炎因子(TGF-β)的水平。

增强免疫活性为降低免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)的含量，使其含量恢复至正常水平。

增强免疫活性为减少Th17细胞的数量及其相关的特异性细胞因子IL-17含量，增加Treg细胞的数量及其相关的特异性细胞因子IL-10含量。

增强免疫活性为调节M1/M2型巨噬细胞平衡，抑制结肠巨噬细胞向M1型极化，促进结肠巨噬细胞向M2型极化。

所述组合物为功能性食品或保健品。

试验动物选用8周龄，体重25-30g的雄性C57BL/6J，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。

动物分组：试验动物选用60只8周龄，体重25-30g的雄性C57BL/6J，基础饲料适应性喂养1周后适应环境，随机分为5组(n＝12)，分别为空白对照组(Control，NC)、模型组(3％DSS)、单菌组(10⁹CFU/mL，JY062)、单糖组(600mg/kg，EPS)、糖菌复合组(10⁹CFU/mL+600mg/kg，JEC)，采用苦味酸编号。空白对照组的小鼠在整个实验过程中(1-21d)正常饮食、自由饮水，干预组(JY062、EPS、JEC)在整个实验周期(8-21d)内每天定时灌胃，灌胃剂量200μL。灌胃一周后在建模期即(15-21d)，除空白对照组，其余组加入3％DSS水溶液诱导。

一、ELISA法测定体内免疫相关基因：

从-80℃冰箱取出结肠组织(试验周期完成后，处死，取结肠组织放于-80℃冰箱)50-100mg，预冷无菌PBS作为匀浆介质，按照结肠组织重量：匀浆介质体积为1:9的比例，迅速加入PBS，组织研磨器将结肠组织快速研磨成匀浆，直至没有明显肉眼可见的组织小块，获得10％的组织匀浆液。将10％的组织匀浆液完全转移至全新的离心管内，离心(4℃，12000rpm，10min)收集上清，离心可重复两次，参考酶联免疫试剂盒说明书，采用竞争法，检测结肠组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和TGF-β的含量。

二、ELISA法测定体内免疫球蛋白含量：

小鼠眼球摘除取血法，眼球充血后夹取眼球收集眼部血液于1.5mL无菌离心管中。小鼠眼周血冰上放置2h，使得血清充分析出，离心(4℃，12000rpm，10min)后取上层血清，冰上解冻同时ELISA试剂盒提前室温放置30min，按试剂盒说明书进行具体操作，采用多功能酶标仪在492nm波长处测定吸光度，按要求绘制标准曲线(以标准品浓度为横坐标，A492nm为纵坐标)，计算血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的含量。

三、ELISA法测定体内Th17和Treg细胞相关的特异性细胞因子含量：

从-80℃冰箱取出结肠组织50-100mg，预冷无菌PBS作为匀浆介质，按照结肠组织重量：匀浆介质体积为1:9的比例，迅速加入PBS，组织研磨器将结肠组织快速研磨成匀浆，直至没有明显肉眼可见的组织小块，获得10％的组织匀浆液。将10％的组织匀浆液完全转移至全新的离心管内，离心(4℃，12000rpm，10min)收集上清，离心可重复两次，参考酶联免疫试剂盒说明书，采用竞争法，检测结肠组织中IL-17和IL-10的含量。

四、流式细胞术检测小鼠脾脏及外周血中Th17和Treg细胞含量：

小鼠眼球摘除取血法，将血液收集至抗凝管中；加入1×红细胞裂解液，血液轻轻吹打混匀，裂解后4℃离心(600g，10min)，弃上清，直至红细胞裂解完全；加入PBS重悬后4℃离心(600g，10min)，洗涤1次，加入适量1×PBS，每管100uL；按照1.25：100体积比例加入PE/Cyanine7 anti-mouse CD3、0.5：100体积比例加入FITC anti-mouse CD4、5：100体积比例加入APC/Cyanine7anti-mouse CD25表面抗体，4℃避光30min；加入PBS重悬后4℃离心(600g，10min)后破核。本实施例中，离心操作中涉及的，600g中的g代表转速，可以和rpm进行换算。

取出眼球后，脱颈法处死小鼠，解剖并迅速用镊子将脾脏分离出来放入5mL EP管中，剪碎；加入胶原酶IV，恒温振荡箱消化(37℃，25min，100rpm)；待组织液混浊呈拉丝状，加FBS终止消化；过滤并研磨后加入PBS冲洗，4℃离心(600g，10min)，弃上清，加1×红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解2min；弃上清；加入PBS重悬后4℃离心(600g，10min)，洗涤1次，加入适量1×PBS，每管100uL；按照1.25：100体积比例加入PE/Cyanine7 anti-mouse CD3、0.5：100体积比例加入FITC anti-mouse CD4、5：100体积比例加入APC/Cyanine7anti-mouse CD25，4℃避光30min；加入PBS重悬后4℃离心(600g，10min)后破核。

每管中加True-Nuclear^TM1×Fix Concentrate，漩涡震荡并在室温避光孵育55min；每管加True-Nuclear^TM1×Perm Buffer，室温离心(400g，5min)后弃上清，此步骤重复两次；加True-Nuclear^TM1×Perm Buffer重悬，按照1.25：100体积比例加入APC anti-mouse IL-17RB、5：100体积比例加入PE anti-mouse FOXP3，室温避光孵育30min；加True-Nuclear^TM1×Perm Buffer，室温离心(400g，5min)后弃上清；加细胞染色缓冲液，室温离心(400g，5min)后弃上清；加细胞染色缓冲液重悬，Agilent流式细胞仪进行上机检测Treg细胞及Th17细胞的水平。

五、免疫荧光染色法评估结肠巨噬细胞的亚型及分布情况：

包埋切片后的结肠组织经二甲苯脱蜡至水、修复抗原、免疫组化笔画出组织圈、3％BSA血清封闭、加一抗4℃孵育过夜(CD68、CD86、CD206)、加与一抗相应种属的二抗(HRP酶标记)覆盖组织室温孵育20min、加TSA试剂、DAPI复染细胞核、封片，最后在荧光显微镜下观察并拍照记录。

六、结果与分析：

由图1可以看出，对比NC组，DSS组小鼠结肠组织中促炎细胞因子(TNF-α，IFN-γ，IL-6和IL-1β)水平均有显著增加，TGF-β水平显著降低(P<0.0001)；与DSS组对比，JEC复合物组的TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-6水平均有不同程度的下降(P<0.0001、P<0.001、P<0.05)，而抗炎细胞因子TGF-β水平显著升高(P<0.0001)。肠道免疫调节功能的紊乱，其中促炎因子TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-1β是反应其严重程度的关键指标，JEC复合物可以有效调节小鼠细胞因子的水平，维持结肠组织中促炎因子和抗炎因子的平衡，缓解小鼠炎症，增强了小鼠肠内抵抗力。

由图2可以看出，对比NC组，DSS组小鼠血清中IgG、IgM、IgA水平显著增加(P<0.0001)。对比DSS组，JEC复合物组IgG、IgM水平不同程度的降低(P<0.0001、P<0.001)。免疫球蛋白的水平反映了B细胞反应的活跃程度，对B细胞免疫的激发和维持有重要的调控作用，JEC复合物可缓解血清IgG、IgM、IgA水平的异常表达，表明其具有免疫调节功能，纠正肠黏膜免疫功能紊乱。

由图3(为各组脾脏和外周血中的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞图)可以看出，脾脏和外周血中DSS组的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞水平最低，分别为14.08％、1.17％，由此还可以看出不同免疫器官中Treg细胞含量也有所差距。与DSS组对比，JEC复合物可不同程度提高脾脏和外周血中Treg细胞水平(P<0.001，P<0.0001)，分别为38.23％、5.87％。JEC复合物干预后的脾脏Treg细胞含量较DSS组增加近3倍，而外周血增加近5倍。表明JEC复合物可以促进Treg细胞分化。

由图4(各组脾脏和外周血中的CD3+CD4+IL-17+Th17细胞图)可以看出，脾脏和外周血中DSS组的IL-17+CD4+Th17细胞水平最高，分别为18.83％、24.34％，区别于Treg细胞，Th17细胞在不同免疫器官中含量差距并不是很大。与DSS组对比，JEC复合物可下调脾脏和外周血中Th17细胞水平(P<0.01)，分别为7.40％、17.27％。JEC复合物干预后的脾脏Th17细胞含量较DSS组降低2.5倍，而外周血降低近1.5倍，且外周血中Th17细胞含量接近于NC组(14.58％)。Th17和Treg之间的平衡对免疫稳态至关重要，且Th17和Treg在分化过程中可进行相互转化，根据以上结果可表明JEC复合物可以抑制Th17细胞分化，进而维持免疫稳态。

由图5可以看出，ELISA检测小鼠结肠Treg细胞相关的特异性细胞因子IL-10含量，对比NC组，DSS组小鼠结肠组织中IL-10水平均有显著降低(P<0.0001)，对比DSS组，JEC复合物组IL-10含量显著升高(P<0.0001)，其含量为242.863pg/mL，甚至NC组IL-10含量(为233.027pg/mL)。Treg细胞主要分泌的特异性抑炎细胞因子IL-10，在抑制炎症反应以及抑制自身免疫性疾病方面发挥重要作用。

由图6可以看出，ELISA检测小鼠结肠Th17细胞相关的特异性细胞因子IL-17含量，对比NC组，DSS组小鼠结肠组织中IL-17水平均有显著升高(P<0.0001)，对比DSS组，JEC复合物组IL-17含量显著降低(P<0.0001)，其含量为29.0067pg/mL，接近于NC组IL-17含量(为35.18pg/mL)。Th17细胞分泌的特异性细胞因子IL-17，参与介导组织炎症以及诱发自身免疫性疾病。

由图7～图8可以看出，JEC复合物可抑制结肠巨噬细胞向M1型极化，而促进了结肠巨噬细胞向M2型极化。CD86代表的M1巨噬细胞的共定位平均光密度值从659.281(DSS组)降低到421.199(JEC复合物组)；CD206代表的M2巨噬细胞的共定位平均光密度值从350.794(DSS组)上调至648.394(JEC复合物组)。巨噬细胞是先天免疫的重要成员，作为机体重要的免疫细胞，具有很强的可塑性，在维持机体稳态过程中发挥着举足轻重的作用，M1巨噬细胞已被证明可以破坏上皮屏障的完整性。综上所述，JEC复合物可以通过调节结肠巨噬细胞的亚型和分布来调节炎症反应。

实施例2

本实施例的组合物及其制备方法同实施例1。

本实施例获得的副干酪乳杆菌JY062组合物在制备改善肠黏膜屏障损伤药物、保健品和功能食品中的应用。

本实施例的组合物调控的NF-κB信号通路为TLR4/MyD88/NF-κB信号通路。

所调控的信号通路相关基因为NF-κB p65，p-NF-κB p65，MyD88，IκB，p-IκB和TLR4。

改善肠黏膜屏障损伤功能包上调IκB蛋白表达量和mRNA表达量，下调NF-κB p65，p-NF-κB p65，MyD88，p-IκB，TLR4蛋白表达量和NF-κB p65，MyD88，TLR4mRNA表达量。

改善肠黏膜屏障损伤功能包括改善粘膜层上皮细胞脱落和肠道通透性增加现象，杯状细胞数量增多，组织学损伤评分提高，改善小鼠结肠黏膜组织结构的损伤。

改善肠黏膜屏障损伤功能包括调节紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-2、Occludin、ZO-1和黏蛋白MUC2mRNA表达水平和平均光密度值。

改善肠黏膜屏障损伤功能包括Claudin-1、Occludin、ZO-1、MUC2mRNA表达量和平均光密度值增加，Claudin-2mRNA表达量和平均光密度值降低。

副干酪乳杆菌及其胞外多糖在制备改善肠黏膜屏障损伤功能药物中的应用。

副干酪乳杆菌及其胞外多糖在制备改善肠黏膜屏障损伤功能保健品中的应用。

副干酪乳杆菌及其胞外多糖在制备改善肠黏膜屏障损伤功能食品中的应用。

所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂中的任意一种。

所述保健品的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂中的任意一种。

所述食品的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂中的任意一种。

试验动物选用8周龄，体重25-30g的雄性C57BL/6J，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。

动物分组：试验动物选用60只8周龄，体重25-30g的雄性C57BL/6J，基础饲料适应性喂养1周后适应环境，随机分为5组(n＝12)，分别为空白对照组(Control，NC)、模型组(3％DSS)、单菌组(10⁹CFU/mL，JY062)、单糖组(600mg/kg，EPS)、糖菌复合组(10⁹CFU/mL+600mg/kg，JEC)，采用苦味酸编号。空白对照组的小鼠在整个实验过程中(1-21d)正常饮食、自由饮水，干预组(JY062、EPS、JEC)在整个实验周期(8-21d)内每天定时灌胃，灌胃剂量200μL。灌胃一周后在建模期即(15-21d)，除空白对照组，其余组加入3％DSS水溶液诱导。

一、小鼠结肠组织病理学观察：

采用苏木精-伊红法(HE染色)对结肠组织(结肠组织的获得方法为：取出眼球后，脱颈法处死小鼠，腹部用75％酒精消毒，无菌环境打开腹腔，找到盲肠末端，末端与小鼠肛门分离，取出完整的结肠组织)病理学变化进行测定，取4％多聚甲醛固定后的小鼠结肠组织，经过洗涤切割修整，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片机组织切片(厚约4μm薄片)，载玻片固定后置于60℃烤片机中1h初步脱蜡，HE染色(具体操作如下表1)，在光学显微镜下观察结肠组织形态学变化并拍照，对照片中各组结肠组织的病理损伤情况进行评分，主要从四个方面：炎性细胞浸润情况、隐窝形态和病变范围，具体评分标准如表2所示：

表1HE染色步骤

表2结肠组织病理学评分标准

最终评分为各项分数叠加。

二、Real-time RT-PCR检测紧密连接蛋白和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的mRNA表达量：

(1)小鼠结肠组织总RNA的提取：

从-80℃冰箱取出结肠组织100mg，预冷无菌PBS作为匀浆介质，按照组织重量：匀浆介质体积为1:9的比例，迅速加入PBS，在严格灭菌的研钵中充分研磨，直至没有明显肉眼可见的组织小块，获得10％的组织匀浆液。

取制作好的小鼠结肠组织匀浆，按照Simply P总RNA提取试剂的方法提取小鼠结肠组织总RNA，提取完毕后用1.5mLRnase-free离心管收集RNA，由于RNA易受环境等因素干扰，提取后应尽快进行后续实验，如不能立即使用需放置在冰盒上用封口膜封口，标注好姓名、时间后放置在-80℃冰箱暂存；实验超净台提前用氯仿擦拭消毒，所用器具用DEPC水处理，提取RNA时全程避光在冰盒上操作。具体的操作步骤同上，用NanoDrop测定OD₂₆₀、OD₂₈₀以及OD₂₆₀/OD₂₈₀值，测定RNA的纯度和浓度。

(2)反转录cDNA合成：

利用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒，将提取质量合格的总RNA反转录为cDNA，按照试剂盒中的试剂盒规定的用量配制反转录体系，具体反应体系见表3：

表3试剂盒的试剂名称和用量表

利用7000PCR扩增仪进行反转录，使用需前预热机器，反转录所得cDNA置于-20℃保存，用于后续试验，具体反转录反应条件见表4：

表4反转录反应条件

(3)RT-PCR反应

选取Claudin-1、Occludin、ZO-1、MUC2、Claudin-2、NF-κB p65、MyD88、IκB、TLR4等多个基因，作为目标基因用于RT-PCR研究，β-actin作为内参基因；在NCBI上查找所需基因的信息，利用Primer 5.0软件来设计各个基因特异性引物，PCR引物均由上海生工技术有限公司合成，具体基因和引物序列见表5。

表5小鼠引物信息

调整cDNA的浓度至合适范围，利用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real-time)试剂盒将反转录的获得cDNA进行Real-time RT-PCR反应，每组别设置3次平行试验，具体反应体系及反应条件见表6和表7：

表6 Real-time RT-PCR反应体系(冰上操作)

表7 Real-time RT-PCR反应条件

利用ABI QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪进行RT-PCR反应，对每个基因的扩增产物进行Melting curve分析，判断PCR产物是否为特异性扩增，确定其特异性和纯度；分析每个基因的Ct值，计算出每个基因的△Ct值、△△Ct值，采用2-△△Ct相对定量法对目的基因的相对表达量进行评估。

ΔCt＝Ct样品-Ct内参

ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt对照组。

三、Western Blotting检测TLR4/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白的表达量：

采用Western blotting方法，对小鼠结肠组织中信号通路关键蛋白进行分析。提取结肠组织中总蛋白，利用BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量测定浓度，蛋白变性后进行蛋白免疫印迹操作，具体步骤如下。使用GelDoc Go凝胶成像系统曝光显影，IPWIN60软件处理系统分析目标带的光密度值。以GAPDH为内参，确定目标蛋白NF-κB p65，p-NF-κB p65，MyD88，IκB，p-IκB，TLR4表达变化。

目的蛋白相对含量＝目的条带灰度值/内参条带灰度值。

四、免疫组织化学法检测结肠组织紧密连接蛋白和黏蛋白的表达情况：

石蜡包埋并切片后的结肠组织在70℃烤箱中孵育2h，经二甲苯脱蜡、抗原修复、组化笔在组织周围画圈、血清封闭、滴加按一定比例配好的一抗4℃孵育过夜、滴加与一抗相应种属的二抗孵育避光室温孵育50min、DAB显色剂显色、苏木素复染细胞核、1％盐酸酒精分化、氨水返蓝、无水乙醇脱水、二甲苯透明中性树胶封固。目标蛋白为结肠中的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin和黏蛋白MUC-2，运用Image J软件进行评分。

五、结果与分析

由图9可以看出，NC组小鼠肠组织结构基本正常，粘膜层结构完整、排列整齐，上皮细胞未见变性脱落；黏膜下层未见水肿及炎症细胞浸润；杯状细胞数量未减少，黑色箭头表示杯状细胞。组织学损伤评分最低。DSS组肠组织结构重度异常，粘膜层隐窝结构部分消失，大量炎症细胞及纤维组织增生，如黄色箭头所示；残存隐窝扩张，如绿色箭头所示；粘膜层上皮细胞糜烂脱落，如红色箭头所示；粘膜下层可见水肿及炎症细胞浸润，如蓝色箭头所示。杯状细胞数量大量减少。组织学损伤评分最高，与NC组和JEC组均有显著差异(p<0.0001)。JEC可以使粘膜层上皮细胞脱落现象减少，排列更加紧密；炎症细胞浸润现象减少；杯状细胞数量增多且组织学损伤评分提高。

由图10可以看出，与NC组相比，DSS诱导后小鼠结肠组织中NF-κB p65，MyD88，TLR4的mRNA表达量显著升高，IκB的mRNA表达量显著降低(p<0.05)，表明造模后小鼠结肠TLR4，MyD88，NF-κB p65基因转录水平升高，IκB与其相反。与DSS组对比，JEC组TLR4，MyD88，NF-κBp65mRNA表达量显著显著降低，IκB的mRNA表达量显著升高，接近于NC组小鼠水平。

由图11可以看出，与NC组相比，DSS诱导后小鼠结肠组织中NF-κB p65，p-NF-κBp65，MyD88，p-IκB，TLR4蛋白质的表达量显著的升高，IκB蛋白质的表达量显著的降低。与DSS组对比，JEC组NF-κB p65，p-NF-κB p65，MyD88，p-IκB，TLR4蛋白表达被抑制，IκB与其相反。且与RT-PCR的结果一致，表明JEC具有抑制小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的作用。

由图12可以看出，与NC组对比，DSS组小鼠中与紧密连接结构呈负相关的Claudin-2的基因表达量显著增加，ZO-1、Claudin-1、Occludin、MUC-2显著下降(p<0.05)。JEC可以阻止DSS诱导的结肠炎小鼠肠道中TJ蛋白和黏蛋白的流失，保护小鼠结肠组织通透性，维持肠道稳态，JEC对TJ蛋白的保护作用更为显著。

由图13～图14可以看出，与NC组对比，DSS组小鼠中与紧密连接结构呈负相关的Claudin-2的平均光密度值极显著增加，ZO-1、Claudin-1、Occludin、MUC-2极显著下降(p<0.0001)，表明小鼠肠道黏膜屏障受损较为严重；值得注意的是，JEC组效果最为明显，可以通过上调紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin和MUC-2的平均光密度值，下调Claudin-2平均光密度值进一步提高肠道黏膜屏障功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种副干酪乳杆菌JY062组合物，其特征在于，包括副干酪乳杆菌JY062（Lactobacillus paracasei JY062）和副干酪乳杆菌JY062的胞外多糖；所述副干酪乳杆菌JY062的含量不低于10⁹CFU/mL；所述外多糖的浓度不低于30mg/mL。

2.根据权利要求1所述的一种副干酪乳杆菌JY062组合物的制备方法，其特征在于，所述包括以下步骤：

步骤一，将副干酪乳杆菌JY062按5%接种量接入灭菌的MRS液体培养基中，初始浓度为1.5×10⁹ CFU/mL；

步骤二，利用优化后的复合碳源MRS液体培养基，复合碳源等量添加；以34℃在发酵罐中以100rpm/min进行培养25h，发酵过程中补充20%w/v的氨水；在发酵 12h后开始补充MRS液体培养基100mL/30min，直至结束，收集菌液；

步骤三，将菌液离心，取上清液一，此步骤重复二次；

步骤四，取上清液一，将体积浓缩至原体积1/3，获得培养基；

步骤五，将培养基灭酶活，冷却至室温后收集上清液二；

步骤六，将上清液二除蛋白，离心后获得上清液三；

步骤七，将上清液三醇沉，离心后取沉淀；

步骤八，将沉淀重悬于去离子水中，得多糖溶液，多糖溶液置于MD34透析袋中，截留分子量为：8KD-14KD，放在去离子水在4℃中进行透析48h，每隔8h更换一次去离子水；

步骤九，将透析后的多糖上清液倒入平板中，置于-80℃冰箱预冻过夜后进行冷冻干燥24h，冻干后得到胞外多糖。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，MRS液体培养基的成分为：10g/L蛋白胨、8g/L牛肉粉、4g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、2g/L柠檬酸氢二铵、2g/L磷酸氢二钾、5g/L乙酸钠、0.2g/L硫酸镁、0.04g/L硫酸锰和1g/L Tween-80；将上述成分52.24g溶于1000mL蒸馏水中，玻璃棒搅拌，121℃，15min，高压灭菌，获得MRS液体培养基。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，优化后的复合碳源MRS液体培养基的成分为：10g/L蛋白胨、8g/L牛肉粉、4g/L酵母粉、2g/L柠檬酸氢二铵、2g/L磷酸氢二钾、5g/L乙酸钠、0.2g/L硫酸镁、0.04g/L硫酸锰和1g/L Tween-80、3.33g/L果糖、3.33g/L甘露糖、3.33g/L海藻糖、3.33g/L葡萄糖、3.33g/L半乳糖和3.33g/L乳糖；将上述成分52.24g溶于1000mL蒸馏水中，玻璃棒搅拌，121℃，15min，高压灭菌，获得优化后的复合碳源MRS液体培养基。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，离心工艺为：在10000r/min，4℃条件下离心15min。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤五中，灭酶活的工艺为：在沸水中加热10min。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤六中，除蛋白的工艺为：将80%w/v的三氯乙酸添加到上清液二中至终浓度为10%w/v，然后搅拌5min，并在4℃条件下静置10h，10000r/min，4℃条件下离心15min除蛋白。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤七中，醇沉工艺为：上清液三中添加2-3倍体积的无水乙醇，使其终浓度为70%，4℃条件下静置过夜，10000r/min，4℃条件下离心15min。

9.根据权利要求1所述的一种副干酪乳杆菌JY062组合物在制备增强肠道免疫活性保健品和功能食品中的应用。

10.根据权利要求1所述的一种副干酪乳杆菌JY062组合物在制备改善肠黏膜屏障损伤药物、保健品和功能食品中的应用。

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