[go: up one dir, main page]

CN112760247A - 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌 - Google Patents

用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌 Download PDF

Info

Publication number
CN112760247A
CN112760247A CN202011248842.0A CN202011248842A CN112760247A CN 112760247 A CN112760247 A CN 112760247A CN 202011248842 A CN202011248842 A CN 202011248842A CN 112760247 A CN112760247 A CN 112760247A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus rhamnosus
product
genital tract
15ph10t
bone loss
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011248842.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112760247B (zh
Inventor
张笑薇
吕金丽
赵少伟
高蒙玙
邹远强
肖亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bgi Precision Nutrition Shenzhen Technology Co ltd
BGI Shenzhen Co Ltd
Original Assignee
BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BGI Shenzhen Co Ltd filed Critical BGI Shenzhen Co Ltd
Priority to CN202011248842.0A priority Critical patent/CN112760247B/zh
Publication of CN112760247A publication Critical patent/CN112760247A/zh
Priority to PCT/CN2021/129909 priority patent/WO2022100632A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112760247B publication Critical patent/CN112760247B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/385—Concentrates of non-alcoholic beverages
    • A23L2/39—Dry compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/175—Rhamnosus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌及其应用。本发明为解决现有的治疗生殖道感染的药物具有不同程度副作用、复发率高或创伤大等技术问题，筛选出一种新的用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病和/或骨质流失引起的相关疾病的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44‑15Ph10T，其能够产生乳酸和过氧化氢等分泌物，以抑制生殖道感染致病菌的生长，用于预防和/或治疗生殖道感染疾病，尤其降低复发率，毒副作用小，同时其作为阴道优势乳杆菌，修复菌群紊乱，恢复阴道稳态。同时，本发明中的鼠李糖乳杆菌还能够抑制骨质流失，从而治疗和改善骨质疏松症。

Description

用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾 病的鼠李糖乳杆菌
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌及其应用。
背景技术
女性生殖道环境常会受到激素水平波动、卫生情况控制不佳、季节变化、甚至心情不稳定等各种影响而造成菌群紊乱，进而导致病原菌入侵，引发细菌、霉菌、病毒等微生物感染，常见的有大肠杆菌、加德纳菌、白色念珠菌和HPV病毒等。生殖道感染疾病的临床症状表现为：阴道瘙痒灼热，分泌物异常，尿频尿痛，严重则会导致孕妇早产，宫颈癌等。据统计，我国育龄女性中生殖道微生物感染率高达80％，绝大多数细菌性或真菌性感染的患者接受的临床治疗手段是使用抗生素。抗生素在对抗病原菌的同时也会降低益生菌的丰度，不利于维持生殖道菌群稳态，从而增高复发风险。而针对HPV病毒感染患者，现在暂无完善的治疗方法，多采用定期筛查和随访的方式，严重则会进行手术治疗。因此，亟需开发一种能够预防或治疗女性生殖道感染的同时，又不会影响生殖道环境益生菌的丰度的菌种或药物。
骨质疏松症是以骨量减少，骨质量受损及骨强度降低，导致脆性骨质增加、易发生骨折为特征的全身性骨病。流行病学调查显示骨质疏松已经成为我国50岁以上人群重要健康问题，患病率高达19.2％，而低骨量人群更是高达46.4％。虽然骨质疏松症多数情况下并不会直接导致死亡，但骨质疏松症增加骨折机会，从而影响患者的健康和独立生活能力，更大大增加社会医疗负担。现有的药物治疗包括雌激素代替疗法等，虽能治疗骨质疏松症，但潜在风险较大且副作用较大，例如可能会导致人体的激素紊乱。
发明内容
女性的生殖健康和生殖道内生存的微生物菌群息息相关，也已有多项研究表明生殖道的菌群紊乱是导致细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎或HPV感染的直接原因。现代医学对生殖道炎症疾病的治疗主要集中在服用抗生素、放置抗生素栓剂等药物治疗。但抗生素药物治疗存在很多问题：第一，抗生素在杀死病原菌，消除炎症的同时也抑制了益生菌的生长，降低了益生菌的丰度，非常不利于生殖道维持稳态，大大增加了重复感染和复发的风险；第二，服用药物不能达到精准治疗的目的，只能广谱性的全身范围内作用，尤其容易损伤肝肾功能；第三，经常使用抗生素容易导致病原菌产生耐药性，这也是造成二次感染的重要原因。
在阴道菌群中，虽然存在个体差异，但绝大多数女性生殖道内的优势菌种是乳酸杆菌，这些乳杆菌主要通过产生乳酸来维持阴道较低的pH值，从而抑制病原菌的入侵和生长，另外，乳杆菌还可合成过氧化氢以保证阴道内的厌氧环境，以防止好氧细菌的滋生。一旦菌群结构被破坏，病原菌便会感染生殖道，引发炎症，并且和乳杆菌形成竞争关系，从而破坏生殖道微生物稳态。此时，补充乳杆菌以维持健康的生殖道菌群结构比单一使用抗生素更有效。
现有的预防和治疗骨质疏松的办法包括：雌激素代替疗法、降钙素、选择性雌激素受体调节剂以及二磷酸盐。用于治疗和阻止骨质疏松症发展的药物分为两大类，第一类为抑制骨吸收药，包括钙剂、维生素D及活性维生素D、降钙素、二磷酸盐、雌激素以及异黄酮；第二类为促进骨性成药，包括氟化物、合成类固醇、甲状旁腺激素以及异黄酮。
对于治疗骨质疏松症，激素代替疗法被认为是治疗绝经后妇女骨质疏松症的最佳选择，也是最有效的治疗方法，然而存在的问题是激素代替疗法可能带来其他系统的不良反应。并且激素代替疗法不能用于患有乳腺疾病的患者，以及不能耐受其副作用者。选择性雌激素受体调节剂该类药物在某些器官具有弱的雌激素样作用，而在另一些器官可起雌激素的拮抗作用。SERMs能防止骨质疏松、还能减少心血管疾病、乳腺癌和子宫内膜癌的发生率。这类药物有雷洛昔芬，为非类固醇的苯骈噻吩是雌激素的激动药，能抑制骨吸收、增加脊柱和髋部的骨密度，能使椎体骨折的危险性下降40％～50％，但疗效较雌激素差，并且绝经前妇女禁用。现有的药物治疗虽能治疗骨质疏松症，但潜在风险较大且副作用较大，例如可能会导致人体的激素紊乱。
本发明为解决现有技术中的药物具有不同程度副作用、复发率高或创伤大等技术问题。筛选出一种新的用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病(尤其指人类中女性生殖道菌群紊乱)和/或骨质流失引起的相关疾病的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)OF44-15Ph10T，其能够产生乳酸和过氧化氢等分泌物，以抑制生殖道感染致病菌的生长，用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病，尤其降低复发率，毒副作用小，效力持久。同时，该菌能够抑制骨质流失，从而治疗或改善骨质疏松症。
为此，本发明一方面提供一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T，其保藏号为GDMCC No:60406。
本发明从约30,000株的人体共生单菌库里筛选出一株女性生殖道益生菌鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T，该菌株是一株全新的分离株，该菌株已于2018年8月24日在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC，广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼)保藏，其保藏编号为GDMCC No:60406。
本发明所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T采用改良版PYG培养基进行分离，鉴定后用MRS培养基传代保藏。在MRS培养基中培养48小时，OF44-15Ph10T的菌落是白色光滑、圆形、边缘整齐，菌落直径约1-2mm。在1000倍的显微镜下观察，菌体呈现细长杆状，革兰氏染色为阳性，没有芽孢和鞭毛产生。
本发明另一方面提供所述的鼠李糖乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备产品中的应用，所述产品用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病和/或骨质流失引起的相关疾病。
本发明提供的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T，经研究发现其有较强产L-乳酸、D-乳酸和过氧化氢的能力；生长能力强且高度耐酸碱；对大多抗生素敏感，无质粒和转移元件等风险基因；同时对人阴道上皮细胞也表现出强粘附能力，对常见的阴道感染的致病菌有强抑菌能力，可用于预防和/或治疗生殖道微生物感染。
同时，发明人通过大规模人群关联研究与动物模型实验发现，鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus OF44-15Ph10T可以有效减少骨质流失，可用于预防和/或治疗骨量减少引起的相关疾病，例如骨质疏松症。
在本发明的一些实施方案中，所述生殖道菌群紊乱相关疾病为生殖道感染。
在本发明的一些实施方案中，所述生殖道感染包括选自细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、好氧性阴道炎、老年性阴道炎和病毒感染中的至少之一。
在本发明的另一些实施方案中，引起所述细菌性阴道炎的细菌为引起女性生殖道感染的常见细菌，包括大肠杆菌(E.coli)、加德纳杆菌(Gardnerella vaginalisBNCC337545)、棒状杆菌、嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性厌氧菌。
在本发明的一些实施方案中，引起所述霉菌性阴道炎的霉菌为引起女性生殖道感染的常见假丝酵母菌，包括白假丝酵母菌(白色念珠菌Candida albicans SC5314)、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌和都柏林假丝酵母菌等。
在本发明的另一些实施方案中，引起所述生殖道病毒感染的病毒为引起女性生殖道感染的常见病毒，包括HPV、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等。
在本发明的一些实施方案中，所述骨质流失引起的相关疾病包括选自骨量减少、骨质疏松症、骨质疏松性骨折中的至少之一。
本发明又一方面提供所述的鼠李糖乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备产品中的应用，所述产品用于抗菌、粘附阴道上皮细胞和/或宫颈细胞、产乳酸、产H2O2、和/或抑制骨质流失。
在本发明的一些实施方案中，所述产品为食品、药物或者保健品。其中，所述食品可以是益生菌酸奶、益生菌片、益生菌固体饮料等。
在本发明的另一些实施方案中，所述产品为药物，所述药物的给药剂量为105-1012CFU/天。
在本发明又一方面提供一种食品、药物或保健品，所述食品、药物或保健品包括所述的鼠李糖乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
在本发明的一些实施方案中，所述食品、药物或者保健品选自预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的产品、预防和/或治疗骨质流失引起的相关疾病、抗菌的产品、粘附阴道上皮细胞和/或宫颈细胞的产品、产乳酸的产品、产H2O2的产品中的至少之一。
本发明又一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述的鼠李糖乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物呈单剂量形式，所述药物组合物含有日剂量为105-1012CFU的所述的鼠李糖乳杆菌。
在本发明的另一些实施方案中，所述药物组合物呈适于外用或者口服的剂型。本发明中所用的“生殖道感染”是指动物中的雌性或人类中女性的生殖道感染。
目前，也有报道利用乳杆菌预防或治疗女性生殖道感染，例如鼠李糖乳杆菌GR-1和罗伊氏乳杆菌RC-14的组合菌，这两株菌已经被公认且被广泛商业化，作为维护女性生殖道健康的益生菌菌株。产品的品牌很多，有Jarrow Formulas,Blackmores，Renew life和Clinicans。但其菌种非生殖道优势菌种，且相关临床研究仅限于欧美人群，缺少亚洲人群疗效评估。
利用抗生素和栓剂进行治疗又存在诸多缺点。例如，甲硝唑、替硝唑、克林霉素等抗生素，其作用是杀死入侵的厌氧病原细菌，从而治疗细菌性阴道炎。但同时也抑制了阴道益生菌乳杆菌的生长，无法重建健康的菌群结构。咪康唑、克霉唑等栓剂，主要用于霉菌性阴道炎，其作用机制是抑制念珠菌等真菌细胞膜的固醇合成，影响细胞膜通透性，抑制真菌生长，导致死亡。该药物常用于栓剂，具有一定使用限制性，造成诸多不便，且不正当使用会造成二次感染。
而口服益生菌的方法干预肠道菌群调节免疫系统，局部使用补充生殖道乳酸杆菌的丰度，可以弥补传统抗生素治疗带来的弊端，在抑制或清除病原菌的同时帮助菌群恢复稳态，大大提高治愈率，降低复发率，帮助HPV转阴，有效治疗或预防生殖道微生物感染疾病，解决临床一大难题。
本发明的发明人从约30,000株人体共生单菌库里筛选出一株女性生殖道益生菌鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T，该菌株是一株全新的分离株，其具有较强产L-乳酸、D-乳酸和过氧化氢的能力，对大多抗生素敏感，生长能力强且高度耐酸碱，同时对人阴道上皮细胞也表现出强粘附能力，对常见的阴道微生物感染的致病菌有强抑菌能力的鼠李糖乳杆菌OF44-15Ph10T，可作为食品、保健品、外用或口服药品开发以预防、治疗或辅助治疗女性生殖道感染的病症。本发明中的鼠李糖乳杆菌通过产生乳酸和过氧化氢等分泌物，以抑制生殖道感染致病菌的生长，用于预防和/或治疗生殖道感染疾病，尤其降低复发率，毒副作用小，效力持久。同时，发明人还发现本发明中的鼠李糖乳杆菌可以有效减少骨质流失，因此该菌还可用于预防和/或治疗骨质流失引起的相关疾病，例如骨质疏松症。从而解决现有的治疗骨质疏松症的药物潜在风险较大且副作用较大，可能会导致人体的激素紊乱的问题。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
保藏信息：
菌株名称：Lactobacillus rhamnosus OF44-15Ph10T
保藏日期：2018年8月24日
保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)
保藏编号：GDMCC No:60406
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T的基因组图谱；
图2：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T的益生功能基因注释结果；
图3A：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T与市售菌株L-乳酸的比较；
图3B：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T与市售菌株D-乳酸的比较；
在图中3A和3B中，GR-1表示鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GR-1，OF44表示本发明中的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T；
图4：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T、鼠李糖乳杆菌GR-1抑制大肠杆菌生长的情况，图中E.coli表示大肠杆菌，OF44表示本发明中的鼠李糖乳杆菌OF44-15Ph10T，GR-1表示鼠李糖乳杆菌GR-1；
图5：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T、鼠李糖乳杆菌GR-1抑制加德纳杆菌(Gardnerella vaginalis)的生长情况，图中GV表示加德纳杆菌，OF44表示本发明中的鼠李糖乳杆菌OF44-15Ph10T，GR-1表示鼠李糖乳杆菌GR-1；
图6：实施例9中模型组和益生菌组鼠李糖乳杆菌OF44-15Ph10T的菌数；
图7：实施例9中模型组和益生菌组加德纳杆菌的菌数；
图8：实施例10中Sham(假手术)对照组、模型组和益生菌组小鼠骨相关指标的对比情况；
图9：实施例10中Sham(假手术)对照组、模型组和益生菌组小鼠骨相关的组织三维重建图像(micro-CT)的对比结果。
具体实施方式
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例的实验中所用到的试剂，如无特殊说明，均可通过市售获得。
实施例1：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T的分离鉴定
1、样品采集
分离样品来自于一位健康女性粪便，将粪便采集至无菌的样品管中，1h内带回实验室进行分选。
2、分离纯化
收集的新鲜样品立刻转移至厌氧操作箱中，取0.2g样品于1mL无菌的PBS(磷酸缓冲液)中，充分震荡混匀，然后进行梯度稀释涂布，培养基采用改良版PYG培养基(购自环凯微生物科技公司)，具体配方是(1L)：胰蛋白胨8g，大豆蛋白胨2g，多聚蛋白1g，干酪素1g，酵母粉10g，牛肉膏5g，葡萄糖5g，K2HPO4 2g，麦芽糖0.5g，纤维二糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，硫化钠0.25g，Tween 80 0.5mL，Cysteine-HCl·H2O 0.5g，甘油0.5mL，乙酸钠5g，血红素5mg，维生素K11μL，无机盐溶液(每L无机盐溶液含有CaCl2·2H2O0.25g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，NaHCO3 10g，NaCl 2g)40mL，刃天青1mg，加入蒸馏水至1L，调节pH至6.8～7.0。涂布的平板置于37℃厌氧培养，厌氧的气体组分为N2：CO2：H2＝90：5：5。培养3天后，挑取单菌落进行划线分离，获得每株单菌的纯培养菌株。
3、菌种保藏
对获得的纯培养菌株进行培养，至浓度约为109CFU/mL，取400μL菌液添加40％甘油400μL，使其甘油浓度达到20％，然后进行-80℃超低温保藏。
按照如下操作步骤制作菌株真空冻干粉，并保藏至广东省微生物菌种保藏中心GDMCC No:60406。
将安瓿管和保护剂经高压灭菌待用，对过夜培养的菌液进行划线，37℃培养24h，观察未发现杂菌污染后进行以下操作。菌液经离心收集并用灭菌生理盐水洗涤，加入2～3mL脱脂牛奶保护剂，悬浮制成菌落数为108～1010个/mL菌悬液，并分装在无菌安瓿管中，置于-80℃冰箱中预冻1～2小时。按照《冷冻干燥机标准操作规程》，在冷冻干燥机中进行冷冻干燥8～20h，直至冻干为止。冻干后取出样品安瓿管，按照《真空安瓿熔封机标准操作规程》，将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封。
4、16S rDNA鉴定
将获得的分离菌株在液体PYG培养基中培养24h，取1mL菌液进行10000r/min离心5min，收集菌体，提取基因组DNA。以基因组DNA作为模板，使用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增体系为：10×PCR buffer，3μL；dNTP，2.5μL；27F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，如SEQ ID NO:1所示)，0.5μL；1492R(5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，如SEQ ID NO:2所示)，0.5μL；Taq酶，0.3μL；模板，1μL；ddH2O，18.2μL。PCR扩增条件为：95℃预变性4min，然后95℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min30s，30个循环。将获得的16S rDNA扩增产物进行电泳检测、纯化、3730测序，获得长度为1200bp的16S rDNA序列(SEQ ID NO:3)。将这段序列在genebank中进行blast比对分析，获得OF44-15Ph10T的鉴定结果为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T的16S rDNA序列如下：
Figure BDA0002770927720000071
Figure BDA0002770927720000081
5、OF44-15Ph10T的生理生化特征
在MRS培养基(购自环凯微生物科技公司)中培养48小时，OF44-15Ph10T的菌落是白色光滑、圆形、边缘整齐，菌落直径约1-2mm。在1000倍的显微镜下观察，菌体呈现细长杆状，革兰氏染色为阳性，没有芽孢和鞭毛产生。OF44-15Ph10T的过氧化氢酶反应为阴性，氧化酶阴性，严格厌氧，碳源利用情况使用API 50CHL试剂盒进行检测。结果如表1(+，表示阳性反应；-，表示阴性反应；W表示弱阳性反应)。
表1：OF44-15Ph10T碳源利用结果
Figure BDA0002770927720000082
Figure BDA0002770927720000091
实施例2：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T的基因组测序及物种分类和功能基因分析
1、基因组测序
将过夜培养的OF44-15Ph10T菌液，在7,227g 4℃下离心10分钟，将得到的沉淀重悬于1mL Tris-EDTA中，加入50μL 10％SDS和10μL蛋白酶K(20mg/mL)在55℃下水浴2小时，使细胞裂解，并用酚-氯仿法提取DNA。并用Illumina Hiseq 2000平台对其进行测序，测序长度为双向500bp，并用SOAPdenovo对reads进行组装。经过评估后，用GCskew分析全基因组GC含量及可视化全基因组序列及功能分布(图1)。
2、菌株基因组物种分类
使用Checkm软件对全基因组序列进行比对分析，得出与该基因组最相近的物种信息为厚壁菌门-芽孢杆菌纲-乳杆菌目-乳杆菌科-乳杆菌属-鼠李糖乳杆菌种，注释到的基因组数量为31，注释到的标记数量为586，基因组的完整度为99.46％，污染程度为0。
3、益生功能基因及安全性分析
为了检查在OF44-15Ph10T中与治疗生殖道感染疾病相关的代谢通路是否完善，分别从KEGG的prokaryoties的数据库中，选出了与乳酸合成(Lactic acid synthesis)、过氧化氢产生(Peroxide hydrocarbon production)和短链脂肪酸合成(short-chain fattyacid synthesis)所有相关的酶，分别建立单独的数据库。使用blastx将OF44-15Ph10T的全基因序列分别与这些数据库比对，选择e-value大于等于0.01，identity大于等于60的注释结果，相关通路的酶的基因拷贝数多少用颜色深浅表示，注释到基因便证明菌株有该功能，基因拷贝数越多则证明功能越强(图2)，基因组未注释到抗生素抗性基因、毒力因子、质粒、转移元件、噬菌体及病毒，证明该菌株可安全使用。
实施例3：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T的生物活性物质
OF44-15Ph10T的生物活性物质主要考察代谢产物中的L-乳酸含量，D-乳酸含量，和过氧化氢产生情况。
1、样品预处理
将菌株OF44-15Ph10T接种至MRS培养基中，分别在好氧和厌氧条件下，于37℃培养24h。
各取1mL菌液进行8000r/min离心5min，取上清，待检测L-乳酸和D-乳酸含量。
再各取1mL菌液加入溶菌酶(终浓度为1mg/mL)，37℃静置15min，8000r/min离心5min，取上清，待检测过氧化氢浓度。
2、测定方法
用L-Lactic Acid(L-Lactate)Assay Kit和D-Lactic Acid(D-Lactate)AssayKit(购自Megazyme Inc.US)按照标准操作手册测得L-乳酸和D-乳酸含量。
用过氧化氢测定试剂盒(比色法)(购自南京建成生物工程研究所)按照标准操作手册测得过氧化氢含量。
3、实验结果见表2。
表2OF44-15Ph10T乳酸及过氧化氢产量测定
Figure BDA0002770927720000101
4、与商业菌株比较
本发明选择市售鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GR-1)作为对照试验，实验方法同上，结果表明在厌氧条件下，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GR-1)的L-乳酸和D-乳酸产量分别为5.59g/L和0.45g/L，相比之下，OF44-15Ph10T的L-乳酸和D-乳酸产量均高于对比菌株，结果见图3A和3B。
实施例4：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T抑制生殖道感染致病菌的能力鉴定
1、OF44-15Ph10T抑制大肠杆菌E.coli的能力鉴定
在厌氧条件下，将过夜培养的OF44-15Ph10T以及鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus GR-1)(浓度达到108CFU)用0.22μm的滤膜过滤菌体，得到上层清液，同时将100μL过夜培养的大肠杆菌(浓度达到108CFU)分别加入到1mL的OF44-15Ph10T的上层清液和MRS培养基，37℃培养24h，获得菌液，测其在OD595下的吸光值。以大肠杆菌加入MRS液体培养基所获得的菌液作为阳性对照。如图4，E.coli代表加入至到MRS液体培养基的菌液，OF44代表加入至OF44-15Ph10T上层清液的菌液，GR-1代表代表加入至鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus GR-1)上层清液的菌液，结果说明本发明中的OF44-15Ph10T和GR-1的代谢物能够明显抑制大肠杆菌的生长，且OF44-15Ph10T的抑制效果好于GR-1。
2、OF44-15Ph10T抑制加德纳杆菌Gardnerella vaginalis BNCC337545的能力鉴定
在厌氧条件下，将过夜培养的OF44-15Ph10T以及鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus GR-1)(浓度达到108CFU)用0.22μm的滤膜过滤菌体得到上层清液，同时将100μL过夜培养的加德纳杆菌(浓度达到108CFU)分别加入到1mL的OF44-15Ph10T的上层清液和MRS培养基，37℃培养24h，获得菌液，测其在OD595下的吸光值。以加德纳杆菌加入MRS液体培养基所获得的菌液作为阳性对照。如图5，GV代表加入至MRS液体培养基的菌液，OF44代表加入至OF44-15Ph10T上层清液的菌液，GR-1代表代表加入至鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus GR-1)上层清液的菌液，结果说明本发明中的OF44-15Ph10T和GR-1的代谢物能够明显抑制加德纳杆菌的生长，且OF44-15Ph10T的抑制效果好于GR-1。
3、OF44-15Ph10T抑制白色念珠菌Candida albicans SC5314的能力鉴定
将过夜培养的OF44-15Ph10T和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GR-1)分别接种至1.5mL的MRS培养基中，再将100uL过夜培养的SC5314(浓度为105CFU)分别接种至OF44-15Ph10T和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GR-1)菌液中获得混合菌液，在好氧条件下，37℃培养24h。将混合菌液梯度稀释涂布至PDA固体培养基(购自环凯微生物科技公司)于37℃培养24h，菌落计数。同时用只接种了SC5314作为阳性对照。计数结果显示为OF44-15Ph10T组为9.4x104CFU/mL，SC5314组为8.6x105CFU/mL，GR-1组为1.2x105CFU/mL。结果表明OF44-15Ph10T和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GR-1)能够抑制白色念珠菌的生长，且OF44-15Ph10T的抑制效果优于GR-1。
实施例5：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T的抗生素敏感情况
考察OF44-15Ph10T对常见15种抗生素的敏感情况，采用药敏纸片法进行实验，取培养至对数期的OF44-15Ph10T的菌液100μL进行平板涂布，将抗生素药敏片贴在平板表面，37℃培养48h，测量抑菌圈大小，其结果如表3。
表3OF44-15Ph10T的抗生素敏感情况
抗生素 抑菌圈直径(cm) 抗生素 抑菌圈直径(cm)
氨苄西林 3 头孢曲松 2
杆菌肽 0 万古霉素 0
青霉素 3.6 苯唑西林 1.4
卡那霉素 1.5 阿莫西林 3
四环素 2.6 阿奇霉素 2
呱啦西林 3.5 克林霉素 2.2
红霉素 2.7 庆大霉素 1.4
氯霉素 2.7
结果显示，OF44-15Ph10T对杆菌肽和万古霉素有抗性，对其他13种抗生素敏感，可以安全使用。
实施例6：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T对酸和胆盐的耐受能力
因人益生菌到达肠道需要经过胃和小肠，因此需要经历pH2.5左右的胃酸和0.3％浓度的胆盐。只有具有酸和胆盐耐受的菌株才能到达肠道发挥益生作用。所以本实施例对OF44-15Ph10T的酸和胆盐耐受情况作了考察。
1、OF44-15Ph10T的酸耐受情况
分别配制pH 2、pH 3、pH 4、pH 4.5、pH 7的MRS培养基，将100μL浓度为8.5E+09过夜培养的OF44-15Ph10T菌液接种至不同pH的MRS培养基中，37℃培养24h后对菌液进行平板涂布计数。结果显示OF44-15Ph10T在pH 2、pH 3、pH 4、pH 4.5、pH 7的条件下不仅可以存活，而且可以生长(表4)。
表4OF44-15Ph10T的酸耐受情况
Figure BDA0002770927720000121
2、OF44-15Ph10T的胆盐耐受情况
分别配制含有0.05％、0.1％、0.2％、0.3％胆盐的MRS培养基，将100μL浓度为8.5E+09过夜培养的OF44-15Ph10T菌液接种至不同胆盐含量的MRS培养基中，37℃培养24h后对菌液进行平板涂布计数。结果显示OF44-15Ph10T在0.05％、0.1％、0.2％、0.3％胆盐的条件下不仅可以存活，而且可以生长(表5)。
表5OF44-15Ph10T的胆盐耐受情况
Figure BDA0002770927720000122
结果表明：本发明的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T对酸和胆盐耐受能力强。
实施例7：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T定植能力的评估
1、OF44-15Ph10T自凝集能力的评估
将过夜培养的OF44-15Ph10T菌液分装10mL在15mL试管中，取最上层菌液，用紫外分光光度计测得OD600处的吸光值。室温静置30min，再取最上层菌液，用紫外分光光度计测得OD600处的吸光值。比较前后的吸光值，差值越大表示自凝集能力越强。OF44-15Ph10T表现出了较好的自凝集能力(表6)。
表6OF44-15Ph10T的自凝集能力
Figure BDA0002770927720000123
2、OF44-15Ph10T与人宫颈癌上皮细胞Hela粘附能力的评估
将培养好的Hela细胞进行消化，用不含双抗的1640完全培养液(GIBCO，购自于沃卡威北京生物技术有限公司)稀释细胞，血球计数板计数(方法见下)，使细胞浓度达到约2×105cell/mL，滴加1mL于细胞培养皿(12或6孔板)中，于5％CO2-95％空气培养箱中37℃孵育至完全分化。
待细胞长成致密单层后，用灭菌的PBS缓冲液漂洗细胞2次，然后每孔加入lmL1640培养液和1mL过夜培养并调整至108CFU/mL的菌悬液，轻轻摇晃混匀，于37℃、5％CO2的孵箱继续孵育，每株菌样品重复三孔。
孵育90min后，取出六孔培养板，弃细菌悬液，单细胞层用灭菌的PBS缓冲液洗涤细胞5次，除去未粘附的细菌，然后加入无水甲醇固定20min。取上述经无水甲醇固定的细胞玻片，进行革兰氏染色。干燥后镜下观察计数，计算20个随机视野内100个细胞上粘附的细菌数，计算得每个细胞平均粘附34.59±4.63个。
本发明选择商业广泛使用菌株：鼠李糖乳杆菌GR-1、罗伊氏乳杆菌RC-14和已经上市药用菌株德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)作为对照试验，实验方法同上，结果显示每个Hela细胞平均粘附13.43±7.07个GR-1，17.48±4.24个RC-14和25.23±2.12个德氏乳杆菌，表明OF44-15Ph10T与人宫颈癌细胞Hela的粘附能力均高于两株商业菌株。粘附能力越强，证明菌株的定植能力更强，更容易存留在阴道环境内进行繁殖，进而起到抑制致病菌、保护阴道粘膜、恢复阴道菌群的功能，达到治疗或预防阴道感染症状的疗效。
3、OF44-15Ph10T与人阴道上皮细胞VK2E6/E7粘附能力的评估
将培养好的VK2E6/E7细胞(购于北京北纳创联生物技术研究院)进行消化，用不含双抗的1640完全培养液稀释细胞，血球计数板计数(方法见下)，使细胞浓度达到约2×105cell/mL，滴加1mL于细胞培养皿(12或6孔板)中，于5％CO2-95％空气培养箱中37℃孵育至完全分化。
待细胞长成致密单层后，用灭菌的PBS缓冲液漂洗细胞2次，然后每孔加入lmL1640培养液和1mL过夜培养并调整至108CFU/mL的菌悬液，轻轻摇晃混匀，于37℃、5％CO2的孵箱继续孵育，每株菌样品重复三孔。
孵育90min后，取出六孔培养板，弃细菌悬液，单细胞层用灭菌的PBS缓冲液洗涤细胞5次，除去未粘附的细菌，然后加入无水甲醇固定20min。取上述经无水甲醇固定的细胞玻片，进行革兰氏染色。干燥后镜下观察计数，计算20个随机视野内100个细胞上粘附的细菌数，计算得每个细胞平均粘附69.51±47.02个。
本发明选择商业广泛使用菌株：鼠李糖乳杆菌GR-1、罗伊氏乳杆菌RC-14和已经上市药用菌株德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)作为对照试验，实验方法同上，结果显示每个VK2E6/E7细胞平均粘附27.4±8.11个GR-1，14.5±4.63个RC-14和22.24±9.26个德氏乳杆菌，表明OF44-15Ph10T与人阴道上皮细胞VK2E6/E7的粘附能力高于鼠李糖乳杆菌GR-1、罗伊氏乳杆菌RC-14和德氏乳杆菌。粘附能力越强，证明菌株的定植能力更强，更容易存留在阴道环境内进行繁殖，进而起到抑制致病菌、保护阴道粘膜、恢复阴道菌群的功能，达到治疗或预防阴道感染症状的疗效。
4、细胞计数
将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上；然后吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3分钟；最后镜检，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的(细胞数/mL＝4大格细胞总数/4×10000)。
实施例8：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T的大鼠毒性试验
本实施例所选取的大鼠为SD雌性大鼠，7周龄，体重250g±50g，大鼠饲养环境为SPF级，实验动物分为6组，分别为3组灌胃组和3组阴道灌洗组。每组10只，共60只，均用标准饮食饲喂。
灌胃组：分3组，以不同剂量灌胃，每只大鼠经口灌胃0.5mL新鲜菌液(浓度分别为1×105、1×109、1×1012CFU/mL)，每天1次，连续3天，从第1天灌胃起连续观察至第7天，大鼠均健康存活、体重增加。
阴道灌洗组：分3组，以不同剂量灌洗阴道，每只大鼠用0.2mL新鲜菌液灌洗阴道(浓度分别为1×105、1×109、1×1012CFU/mL)每天1次，连续3天，从第1天灌洗起连续观察至第7天，大鼠均健康存活、体重增加。
上述实验结果表明，向大鼠施用0.2×105～0.5×1012CFU/天剂量的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T，不会对大鼠的健康造成影响，未发现毒性反应，表明在该剂量下是较为安全的。
实施例9：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T治疗大鼠生殖道感染的能力
本实施例所选取的大鼠模型为生殖道加德纳菌感染的大鼠模型，采用SD雌性大鼠，7周龄，体重250g±250g，大鼠饲养环境为SPF级，实验动物分为2组，分别为模型组和益生菌组。每组10只，共20只，均用标准饮食饲喂。
实验分为适应期，建模期，干预期和观察期。适应期：标准饮食饲喂大鼠7天。在造模前三天皮下注射0.5mgβ-estradiol-3-benzoate，保持大鼠假发情现象。造模前观察并记录大鼠阴道是否红肿和溢液，是否有红斑和颗粒物表型特征；建模期：用过夜培养的阴道加德纳菌(购于北京北纳创联生物技术研究院)(PBS菌液)冲洗大鼠阴道，每天一次，连续冲洗3天，第4天观察并记录阴道是否红肿和溢液，是否有红斑和颗粒物等表型特征，选择符合建模要求的大鼠进行试验。干预期：共7天，模型组大鼠不作处理；益生菌组大鼠用OF44-15Ph10T的PBS菌液冲洗大鼠阴道，每次总活菌量不低于1×108CFU/mL，每天冲洗1次，连续冲洗7天。定时观察并记录大鼠阴道是否红肿和溢液，是否有红斑和颗粒物表型特征。观察期：干预结束后3天，观察并记录大鼠阴道是否红肿和溢液，是否有红斑和颗粒物表型特征。在每次观察大鼠表型的同时，取大鼠阴道冲洗液，用定量PCR的方法检测加德纳菌的清除情况及格氏乳杆菌的定植情况
结果显示，鼠李糖乳杆菌OF44-15Ph10T可以定植大鼠阴道内(图6)，同时有改善大鼠阴道加德纳杆菌感染并抑制其复发的效果(图7和表7)。(表8)。
表7大鼠阴道表型记录结果
Figure BDA0002770927720000151
实施例10：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus OF44-15Ph10T治疗小鼠骨质流失模型的效果
骨质流失模型采用C57BL/6雌性小鼠(购自广东省医学实验动物中心)，8周龄，体重20±2g在SPF环境下自由进食和饮水。随机分成3个组，每组9～10只。
第一组9只小鼠为Sham(假手术)对照组，进行假手术操作，只划开皮肤随后进行缝合，实验过程中，喂养含有目标菌株(OF44-15Ph10T)的培养基，喂养量和体重正比；
第二组10只小鼠为实验组，利用卵巢器官的摘除诱导造成骨质疏松模型，目标菌株饱和悬浮液灌胃，喂养量和体重正比；
第三组10只小鼠为阴性对照组，利用卵巢器官的摘除诱导造成骨质疏松模型，培养基灌胃，喂养量和体重正比。
实验过程中，每周记录小鼠体重数据(表8)；实验结束后处死小鼠，使用micro-CT检测骨相关指标的变化(表9和图8所示)，并建立组织三维重建图像(图9)。
结果显示，益生菌小组(第二组)，和Sham对照组(第一组)无明显的差别(p>0.05)；相比于模型组(第三组)，多个骨相关的指标具有统计学上的显著差异(p<0.05)；结果表明肠道益生菌Lactobacillus rhamnosus OF44-15Ph10T在小鼠模型中具有抑制骨流失的作用。
表8灌胃前后各组小鼠体重记录
编号 组别 20190722 20190805 20190819 20190902 20190913
GG_20864 第二组 20.2 22.3 22.2 23.5 23.8
GG_20874 第二组 19.1 23.7 22.8 22.7 24
GG_20845 第二组 18.5 24.5 22.2 22.6 24.4
GG_20855 第二组 18.5 22.4 22 21.9 22.5
GG_20899 第二组 18.7 22.5 21.1 20.8 22.4
GG_20857 第二组 17.7 22.6 21.4 21.3 22.3
GG_20872 第二组 18.4 21.5 21.8 21 21.8
GG_20853 第二组 18.3 20 20.4 20 22.1
GG_20868 第二组 17.8 21.7 21.4 21.8 22.1
GG_20866 第二组 15.2 19.3 20.1 20.2 20.8
OVX_20800 第三组 18.5 21.7 22.3 22.1 24
OVX_20885 第三组 18.9 22.6 21.4 22.5 22.6
OVX_20871 第三组 20.1 22.1 22.7 22.7 23.7
OVX_20861 第三组 18.7 20.6 21 21.2 22.9
OVX_20881 第三组 17.6 23.6 21.2 21.6 21.9
OVX_20878 第三组 18.2 22.9 22 21.2 22.8
OVX_20896 第三组 18.3 21.3 20.7 20.4 21.5
OVX_20849 第三组 15.7 22.2 21.5 21.8 22.9
OVX_20882 第三组 17 20.2 21.4 20.2 21.9
OVX_20851 第三组 17.1 16.6 18.4 21.5 22.6
Sham_20804 第一组 18.7 20.9 20.5 20.5 21.6
Sham_20806 第一组 18.6 19.4 19.9 20.3 21.1
Sham_20809 第一组 17.3 18.8 19.4 19.8 20.9
Sham_20811 第一组 18.4 19.1 19 20 20.8
Sham_20813 第一组 18.8 20 20.2 20.2 22.2
Sham_20814 第一组 17 17.8 19.1 19.1 20.5
Sham_20816 第一组 18 19.5 20.2 20 21.7
Sham_20817 第一组 18.6 19.9 20.3 19.4 20.3
Sham_20818 第一组 19 20.1 20.8 19.9 21.6
表9各组小鼠骨相关指标记录情况
Figure BDA0002770927720000161
Figure BDA0002770927720000171
本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌
<130> PIDC3202923
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat catggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagggttacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1200
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌OF44-15Ph10T（Lactobacillus rhamnosus OF44-15Ph10T）
<220>
<221> misc_feature
<223> 16S rDNA序列
<400> 3
gtgcctatac atgcaagtcg aacgagttct gattattgaa aggtgcttgc atcttgattt 60
aattttgaac gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccct taagtggggg 120
ataacatttg gaaacagatg ctaataccgc ataaatccaa gaaccgcatg gttcttggct 180
gaaagatggc gtaagctatc gcttttggat ggacccgcgg cgtattagct agttggtgag 240
gtaacggctc accaaggcaa tgatacgtag ccgaactgag aggttgatcg gccacattgg 300
gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac 360
gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt 420
tgttggagaa gaatggtcgg cagagtaact gttgtcggcg tgacggtatc caaccagaaa 480
gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga 540
tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa gccctcggct 600
taaccgagga agtgcatcgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggac agtggaactc 660
catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctgtc 720
tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt agataccctg 780
gtagtccatg ccgtaaacga tgaatgctag gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgccg 840
cagctaacgc attaagcatt ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgagaacc 960
ttaccaggtc ttgacatctt tttgatcacc tgagagatca agtttctcct tcgggggcaa 1020
atgacagtgt gcatgcttgt cgtcagctcg tgttcgtgag atgttggtta agttccgcac 1080
gagcgcaccc tatgactagg tgctagcatt tagtggtcac tctagtaaga actgcgtgac 1140
catcgagatg gtgggtatga cgtcatcatc atggccttat gacctggcta caacgtgtct 1200

Claims (10)

1.一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)OF44-15Ph10T，其保藏号为GDMCCNo:60406。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备产品中的应用，其特征在于，所述产品用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病和/或骨质流失引起的相关疾病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生殖道菌群紊乱相关疾病为生殖道感染；任选地，所述生殖道感染包括选自细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、好氧性阴道炎、老年性阴道炎和病毒感染中的至少之一；
任选地，所述骨质流失引起的相关疾病包括选自骨量减少、骨质疏松症、骨质疏松性骨折中的至少之一。
4.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备产品中的应用，其特征在于，所述产品用于抗菌、粘附阴道上皮细胞和/或宫颈细胞、产乳酸、产H2O2、和/或抑制骨质流失。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、药物或者保健品。
6.根据权利要求2-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为药物，所述药物的给药剂量为105-1012CFU/天。
7.一种食品、药物或保健品，其特征在于，所述食品、药物或保健品包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
8.根据权利要求7所述的食品、药物或保健品，其特征在于，所述食品、药物或者保健品选自预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的产品、预防和/或治疗骨质流失引起的相关疾病、抗菌的产品、粘附阴道上皮细胞和/或宫颈细胞的产品、产乳酸的产品、产H2O2的产品中的至少之一。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液，
任选地，所述药物组合物呈单剂量形式，所述药物组合物含有日剂量为105-1012CFU的所述的鼠李糖乳杆菌。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈适于外用或者口服的剂型。
CN202011248842.0A 2020-11-10 2020-11-10 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌 Active CN112760247B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011248842.0A CN112760247B (zh) 2020-11-10 2020-11-10 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌
PCT/CN2021/129909 WO2022100632A1 (zh) 2020-11-10 2021-11-10 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011248842.0A CN112760247B (zh) 2020-11-10 2020-11-10 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112760247A true CN112760247A (zh) 2021-05-07
CN112760247B CN112760247B (zh) 2022-10-25

Family

ID=75693257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011248842.0A Active CN112760247B (zh) 2020-11-10 2020-11-10 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112760247B (zh)
WO (1) WO2022100632A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022100632A1 (zh) * 2020-11-10 2022-05-19 深圳华大生命科学研究院 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌
CN115154488A (zh) * 2022-03-31 2022-10-11 合肥工业大学 一种鼠李糖乳杆菌改善记忆损伤的新用途
CN115838675A (zh) * 2022-12-23 2023-03-24 四川高福记生物科技有限公司 一种鼠李糖乳杆菌及其组合物与应用
CN115895967A (zh) * 2022-12-01 2023-04-04 上海利康精准医疗技术有限公司 抗人乳头瘤病毒hpv的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN117821309A (zh) * 2023-12-26 2024-04-05 上海华聿康生物科技有限公司 一株鼠李糖乳杆菌Lr-HS56及其用于女性私密制品的应用
CN120022297A (zh) * 2025-04-11 2025-05-23 华大精准营养（深圳）科技有限公司 鼠李糖乳酪杆菌在制备缓解过敏性鼻炎制剂中的应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117535207A (zh) * 2024-01-04 2024-02-09 四川厌氧生物科技有限责任公司 一种格氏乳杆菌及其应用
CN118726136B (zh) * 2024-06-06 2025-02-14 科为生物(镇江)有限公司 一株可调节生殖道微生态和修复生殖道黏膜屏障损伤的鼠李糖乳酪杆菌bb520及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120263695A1 (en) * 2009-08-11 2012-10-18 Jurgen Schrezenmeir Composition having strains of lactobacillus fermentum
CN103889241A (zh) * 2011-10-18 2014-06-25 雀巢产品技术援助有限公司 用于促进健康的骨生长和/或用于预防和/或治疗骨疾病的组合物
US20170209504A1 (en) * 2014-03-06 2017-07-27 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Probiotic formulations and methods for use
CN108004188A (zh) * 2018-01-11 2018-05-08 广东龙创基药业有限公司 一种鼠李糖乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用
EP3318262A2 (en) * 2016-11-03 2018-05-09 Cell Biotech Co., Ltd. Composition for preventing or treating bone disease, obesity and lipid-related metabolic disease
CN110016442A (zh) * 2019-02-21 2019-07-16 河北一然生物科技有限公司 鼠李糖乳杆菌及其复合菌粉在防治阴道炎制品中的应用
CN110122877A (zh) * 2018-02-09 2019-08-16 深圳市华大农业应用研究院 鼠李糖乳杆菌及其用途
CN110172420A (zh) * 2019-05-15 2019-08-27 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一株鼠李糖乳杆菌及其应用
CN111647525A (zh) * 2020-05-18 2020-09-11 深圳市华大农业应用研究院 复合益生菌、菌剂及其在制备防治白色念珠菌性阴道炎菌剂中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040028665A1 (en) * 2002-01-08 2004-02-12 Garner Bryan E. Compositions and methods for inhibiting pathogenic growth
CN112760247B (zh) * 2020-11-10 2022-10-25 深圳华大生命科学研究院 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120263695A1 (en) * 2009-08-11 2012-10-18 Jurgen Schrezenmeir Composition having strains of lactobacillus fermentum
CN103889241A (zh) * 2011-10-18 2014-06-25 雀巢产品技术援助有限公司 用于促进健康的骨生长和/或用于预防和/或治疗骨疾病的组合物
US20170209504A1 (en) * 2014-03-06 2017-07-27 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Probiotic formulations and methods for use
EP3318262A2 (en) * 2016-11-03 2018-05-09 Cell Biotech Co., Ltd. Composition for preventing or treating bone disease, obesity and lipid-related metabolic disease
CN108004188A (zh) * 2018-01-11 2018-05-08 广东龙创基药业有限公司 一种鼠李糖乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用
CN110122877A (zh) * 2018-02-09 2019-08-16 深圳市华大农业应用研究院 鼠李糖乳杆菌及其用途
CN110016442A (zh) * 2019-02-21 2019-07-16 河北一然生物科技有限公司 鼠李糖乳杆菌及其复合菌粉在防治阴道炎制品中的应用
CN110172420A (zh) * 2019-05-15 2019-08-27 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一株鼠李糖乳杆菌及其应用
CN111647525A (zh) * 2020-05-18 2020-09-11 深圳市华大农业应用研究院 复合益生菌、菌剂及其在制备防治白色念珠菌性阴道炎菌剂中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘海燕等: "肠道益生菌对骨质疏松症影响及其机制的研究进展", 《工业微生物》 *
钟燕等: "鼠李糖乳杆菌GR-1和罗伊氏乳杆菌RC-14防治阴道炎的研究进展", 《国际妇产科学杂志》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022100632A1 (zh) * 2020-11-10 2022-05-19 深圳华大生命科学研究院 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌
CN115154488A (zh) * 2022-03-31 2022-10-11 合肥工业大学 一种鼠李糖乳杆菌改善记忆损伤的新用途
CN115154488B (zh) * 2022-03-31 2024-04-26 合肥工业大学 一种鼠李糖乳杆菌改善记忆损伤的用途
CN115895967A (zh) * 2022-12-01 2023-04-04 上海利康精准医疗技术有限公司 抗人乳头瘤病毒hpv的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN115895967B (zh) * 2022-12-01 2024-01-12 上海利康精准医疗技术有限公司 抗人乳头瘤病毒hpv的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN115838675A (zh) * 2022-12-23 2023-03-24 四川高福记生物科技有限公司 一种鼠李糖乳杆菌及其组合物与应用
CN115838675B (zh) * 2022-12-23 2024-07-23 四川高福记生物科技有限公司 一种鼠李糖乳杆菌及其组合物与应用
CN117821309A (zh) * 2023-12-26 2024-04-05 上海华聿康生物科技有限公司 一株鼠李糖乳杆菌Lr-HS56及其用于女性私密制品的应用
CN120022297A (zh) * 2025-04-11 2025-05-23 华大精准营养（深圳）科技有限公司 鼠李糖乳酪杆菌在制备缓解过敏性鼻炎制剂中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022100632A1 (zh) 2022-05-19
CN112760247B (zh) 2022-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022100633A1 (zh) 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的格氏乳杆菌
WO2022100631A1 (zh) 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的卷曲乳杆菌
CN112760247A (zh) 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱和/或骨质流失引起的疾病的鼠李糖乳杆菌
CN104560820B (zh) 屎肠球菌kq2.6及应用
TWI627276B (zh) 新穎之卷曲乳酸桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）菌株
CN113293113B (zh) 一株长双歧杆菌mi-186及其应用
CN110777087B (zh) 一种约氏乳杆菌及其应用
JP2022524157A (ja) 複合ラクトバチルス組成物およびその女性の膣の健康における用途
CN110982726B (zh) 一种卷曲乳杆菌及其应用
CN116445346B (zh) 一种改善多囊卵巢综合征的罗伊氏乳杆菌及其应用
CN116218708B (zh) 乳杆菌、多联乳杆菌复合物、制剂及其应用
CN110023484B (zh) 一种假小链状双歧杆菌及其培养方法和应用
CN115501259A (zh) 一种用于缓解溃疡性结肠炎的组合物和应用
CN116790402B (zh) 一株具有抗炎特性的单形拟杆菌菌株、培养方法及应用
CN108295096B (zh) 菌株在预防和治疗霉菌性、细菌性阴道炎制剂中的应用
WO2018112740A1 (zh) 一种加氏乳杆菌及其培养方法和应用
CN114015598A (zh) 分离自藏灵菇的乳酸片球菌及其在防治轮状病毒感染中的应用
WO2024260441A1 (zh) 一种复合菌粉制剂及其制备方法和用途
CN118222440A (zh) 一株缓解慢性肾病小鼠病理特征的长双歧杆菌长亚种及其应用
CN113604400B (zh) 具有预防或治疗糖尿病作用的新型乳杆菌yuyingw
HK40041405A (zh) 用於預防和/或治療生殖道菌群紊亂和/或骨質流失引起的疾病的鼠李糖乳桿菌
CN111004734A (zh) 一种能够调控肠道中不动杆菌属相对丰度的鼠李糖乳杆菌
HK40041405B (zh) 用於預防和/或治療生殖道菌群紊亂和/或骨質流失引起的疾病的鼠李糖乳桿菌
HK40041870A (zh) 用於預防和/或治療生殖道菌群紊亂相關疾病的卷曲乳桿菌
HK40041869A (zh) 用於預防和/或治療生殖道菌群紊亂相關疾病的格氏乳桿菌

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40041405

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20221011

Address after: 518083 comprehensive building, Beishan Industrial Zone, Yantian District, Guangdong, Shenzhen

Applicant after: BGI SHENZHEN

Applicant after: BGI PRECISION NUTRITION (SHENZHEN) TECHNOLOGY CO.,LTD.

Address before: 518083 comprehensive building, Beishan Industrial Zone, Yantian District, Guangdong, Shenzhen

Applicant before: BGI SHENZHEN

TA01 Transfer of patent application right