CN115212352B - 生物干瓣膜的制备方法及生物干瓣膜 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物干瓣膜的制备方法及生物干瓣膜。所述方法为两步脱水法，包括：首次脱水步骤，将交联后的生物瓣膜浸泡在高渗透溶液中浸泡脱去部分自由水得到首次脱水生物瓣膜；二次脱水步骤，将首次脱水生物瓣膜在真空中冷冻干燥以脱去剩余自由水得到所述生物干瓣膜。本发明采用两步脱水法，第一步在高渗透溶液中脱去部分自由水，第二步继续冷冻干燥去除剩余的自由水，相比一步脱水法直接脱去全部自由水，二步脱水法更佳温和，减少生物瓣膜脱水后的褶皱。

Description

生物干瓣膜的制备方法及生物干瓣膜

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，进一步涉及一种生物干瓣膜的制备方法及生物干瓣膜。

背景技术

心脏瓣膜病是我国主要面临的一类心脏病。因生物瓣膜具有良好的生物相容性和耐久性能，不需要长期进行抗凝治疗，使得生物瓣膜的应用逐步提高。

临床上使用的生物瓣膜储存于戊二醛溶液中，戊二醛不仅可以杀灭微生物还具有良好的交联作用，使生物膜结构稳定。同时也存在以下问题：1、醛基使生物瓣膜钙化，影响使用寿命2、生物瓣膜储存不方便，运输成本高，3、临床使用前需要漂洗，操作繁琐。为了解决这些问题，改变传统使用液体介质储存生物瓣膜的方式，通过化学溶液脱水、物理方式干燥，制备干式生物瓣膜，获得的生物干瓣膜不仅避免生物瓣膜浸泡在戊二醛溶液中产生的问题，还能保持湿式生物瓣膜良好的耐久性，血流动力学。

欧洲专利EP2606723A1公开了一种制备生物干瓣膜的方法，其采用甘露醇的乙醇溶液作为渗透液，利用该渗透液形成的浓度梯度差进行脱水，乙醇能与水互溶，利用浓度差进行分子扩散，但是这种渗透作用很强烈，乙醇梯度渗入时可能由于存在浓度跳跃性突变，生物瓣膜组织易发生剧烈褶皱而变形；而且乙醇具有挥发性，溶质被置换进入生物瓣膜组织后便快速挥发，导致生物瓣膜组织脱水过快产生发硬、发脆等技术问题。

发明内容

针对现有技术制备的生物干瓣膜采用甘露醇的乙醇溶液作为渗透液，极易使得生物瓣膜组织发生剧烈褶皱而变形的技术问题，目的在于提供一种制备生物干瓣膜的高渗透溶液，本发明所述高渗透溶液包括：

单糖、二聚糖和/或糖醇，质量浓度为20～30％；

和生物多糖，质量浓度为20～30％。

在本发明的高渗透溶液中，单糖、二聚糖和/或糖醇形成梯度浓度，以使得组织脱水；生物多糖作为润湿性保湿剂添加在高渗透溶液中给脱水的生物瓣膜进行保湿。

在本发明一较佳实施例中，所述单糖、二聚糖和/或糖醇的质量浓度为20～30％，优选22～28％，更优选25％；

所述生物多糖的质量浓度为20～30％，优选22～28％，更优选25％。

在本发明一较佳实施例中，

所述单糖、二聚糖选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的一种或多种；所述糖醇选自甘露醇。

所述生物多糖选自壳聚糖、海藻糖、银耳多糖、葡聚糖、透明质酸中的一种或多种。

本发明的另一目的在于提供一种高渗透溶液在制备生物干瓣膜中的应用，其中，所述高渗透溶液包括：

单糖、二聚糖和/或糖醇，质量浓度为20～30％；

和生物多糖，质量浓度为20～30％。

在本发明一较佳实施例中，

所述单糖、二聚糖和/或糖醇的质量浓度为20～30％，优选22～28％，更优选25％；

所述生物多糖的质量浓度为20～30％，优选22～28％，更优选25％。

在本发明一较佳实施例中，所述单糖、二聚糖选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的一种或多种；所述糖醇选自甘露醇。

在本发明一较佳实施例中，所述生物多糖选自壳聚糖、海藻糖、银耳多糖、葡聚糖、透明质酸中的一种或多种。

在本发明一较佳实施例中，所述生物干瓣膜选自心包、真皮和血管中的一种或几种。

本发明还有一目的在于提供一种制备生物干瓣膜的方法，所述方法为两步脱水法，包括：

首次脱水步骤，将交联后的生物瓣膜浸泡在高渗透溶液中浸泡脱去部分自由水得到首次脱水生物瓣膜；

二次脱水步骤，将首次脱水生物瓣膜在真空中冷冻干燥以脱去剩余自由水得到所述生物干瓣膜。

在一较佳实施例中，所述方法还包括：

封闭保湿步骤，在首次脱水步骤后、二次脱水步骤前，将首次脱水生物瓣膜在封闭剂中浸泡以封闭首次脱水生物瓣膜。

在一较佳实施例中，所述方法还包括：

红外辐射步骤，在封闭保湿步骤后、二次脱水步骤前，将封闭后的生物瓣膜用红外线进行辐射以提高二次脱水的速率。

所述首次脱水步骤中，浸泡时间为8～72小时，优选16～36小时，更优选24～28小时。

在所述首次脱水步骤中，所述高渗透溶液包括：

单糖、二聚糖和/或糖醇；

和生物多糖。

本发明利用高渗透溶液在生物瓣膜组织内和组织外的浓度差，使生物瓣膜组织内的部分或全部水分渗透到高渗溶液中，以去除生物瓣膜内的部分或全部自由水。由于高渗溶液中水分含量低于生物瓣膜组织中自由水的含量，在高渗透溶液与生物瓣膜的界面处形成水的浓度梯度，生物瓣膜组织中的自由水由高浓度区向低浓度区移动，即表现出生物瓣膜的除水效应。

在一较佳实施例中，所述单糖、二聚糖和/或糖醇的质量浓度为20～30％，优选22～28％，更优选25％；所述生物多糖的质量浓度为20～30％，优选22～28％，更优选25％。

在一较佳实施例中，所述单糖、二聚糖选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的一种或多种；所述糖醇选自甘露醇。所述生物多糖选自壳聚糖和、海藻糖、银耳多糖、葡聚糖和透明质酸中的一种或多种。

在一较佳实施例中，所述二次脱水步骤中，

所述真空冷冻干燥为先在-60～-50℃优选-55℃下预冻8～20小时优选10～16小时更优选12小时后，再于常温下，抽真空至6～10Pa，优选8Pa干燥16～40小时优选20～30小时更优选24小时。

所述封闭保湿步骤中，生物瓣膜在封闭剂中于50～60℃下浸没2～24小时，优选4～12小时。所述封闭剂选自矿物油和动物脂肪中的一种或多种。所述矿物油选自石蜡油；和/或，所述动物脂肪选自羊毛脂。所述石蜡油为C18～30石蜡油，优选为C20-25的石蜡油；所述羊毛脂为分子量104.10的羊毛脂。

在所述红外辐射步骤中，封闭后的生物瓣膜用功率密度350～450w/g优选400w/g的红外线在温度70～90℃优选80℃、辐照距离100～150mm优选120mm处辐照3～5小时优选4小时。

在所述首次脱水步骤之前，还可以包括清洗步骤：将交联后的生物瓣膜用生理盐水清洗2～5次优选3次，每次4～10分钟优选5分钟。

所述生物瓣膜选自心包、真皮和血管中的一种或几种。

所述方法还包括：

干瓣膜保存步骤：所述生物干瓣膜保存在聚乙烯瓶中，所述聚乙烯瓶内壁涂抹有涂层，所述涂层的原料包括65～75质量％优选70质量％的羟脯氨酸和/或甘氨酸，以及25～35质量％优选30质量％的聚乙烯醇。

本发明最后目的还提供一种本发明所述的方法制备得到的生物干瓣膜。

所述生物干瓣膜的结合水为30～33％。

所述生物干瓣膜保存在聚乙烯瓶中，所述聚乙烯瓶内壁涂抹有涂层，所述涂层的原料包括65～75质量％优选70质量％的羟脯氨酸和/或甘氨酸，以及25～35质量％优选30质量％的聚乙烯醇。

与现有的技术相比，本发明的有益效果：

1)本发明采用两步脱水法，第一步在高渗透溶液中脱去部分自由水，第二步继续冷冻干燥去除剩余的自由水，相比一步脱水法直接脱去全部自由水，二步脱水法更佳温和，减少生物瓣膜脱水后的褶皱。

2)本发明采用葡萄糖、果糖和/或蔗糖作为高渗透溶液的溶质成分，通过添加生物多糖，可以使得脱水过程更温和，不要一次性脱水太过，以尽量保持脱水后生物干瓣膜的大小。

3)本发明采用葡萄糖、果糖和/或蔗糖作为高渗透溶液的溶质成分，分子量(如葡萄糖分子量180.16)比乙醇分子量(45)大，高浓度的糖溶液粘度(如葡萄糖粘度30Pa.s)比乙醇粘度(1.096pa.s)大，渗透速度比乙醇慢，因此渗透作用更温和。糖溶液还能避免使用乙醇产生的其他问题，例如乙醇具有挥发性，溶质被置换进入组织后便快速挥发，导致组织脱水过快产生发硬、发脆；另外乙醇梯度渗入时还存在浓度跳跃性突变的情形，组织易发生剧烈褶皱。

4)脱去自由水后的生物干瓣膜保留了适量的结合水。生物多糖作为润湿性保湿剂，生物多糖含有羟基、乙酰基和胺基，与水强力结合防止水分蒸发，使组织细胞柔韧、软化，具有较好的吸湿保湿性能。

5)本发明在二次脱水之前还用封闭剂进行封闭性保湿，在生物干瓣膜表面包裹一层不溶性脂类。这类不溶性脂类在生物干瓣膜上形成表面附加的润滑膜层，将组织包裹起来，通过封闭作用阻挡水分丢失，以防止水分蒸发。生物多糖作为润湿性保湿剂和不溶性脂类作为封闭性保湿剂的联合使用，可以达到更好的保湿效果。

6)在二次脱水之前，可以采用红外线的辐照，以提高二次脱水的脱除速率。

7)利用结合水的性质稳定，不易被破坏的特点，二次脱水去除自由水的同时，生物干瓣膜保持一定结合水。经过二次脱水后的生物干瓣膜含水量约30％，在生理盐水中复水5分钟的生物瓣膜含水量可恢复到初始状态约70％左右，相比于传统生物瓣膜使用前生理盐水冲洗5遍耗时30分钟而言，单单此步骤，即可以大幅缩短手术时间。

8)聚乙烯瓶的内壁涂抹涂层后，冷却至室温后形成橡胶状，不易脱落。羟脯氨酸吸水使得生物干瓣膜的含水量维持在30％～33％。羟脯氨酸可以吸收空气中多余的水分，保证制备得到的生物干瓣膜在存放过程中，能保持含水量稳定，而不会过度吸收空气中的水分。

9)本发明生物干瓣膜减少醛基残留，干式储存(不需要储存在溶液中)，便于运输，临床使用前不需漂洗，置于生理盐水中水合即可使用。

10)本发明生物干瓣膜选自心包、真皮和血管中的一种或几种，本发明提供的生物干瓣膜的制备方法还可以用于瓣膜、脑硬膜、肠粘膜、韧带、肌腱、巩膜、和带瓣管道的制备。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1～8

清洗步骤：将交联后的生物瓣膜(牛心包)裁剪成直径为2cm、4cm、6cm、8cm、10cm，厚度为0.3mm左右的圆形，用生理盐水对生物瓣膜清洗N1次，每次t1时间。

首次脱水步骤：称取糖、生物多糖溶解于水中得到高渗透溶液(成分及用量如表1所示)。将交联生物瓣膜浸入高渗透溶液中浸泡t2时间，脱去部分自由水得到首次脱水生物瓣膜。

封闭保湿步骤：将首次脱水生物瓣膜在T1温度下浸没于500mL封闭剂中浸没t3时间。

红外辐射步骤：封闭后的生物瓣膜用功率密度ρ的红外线在温度T2、辐照距离D处辐照t4时间。

二次脱水步骤：生物瓣膜先T3温度下预冻t5小时，再移至室温T4下抽真空至P1下干燥t6小时，使生物瓣膜表面析出的水分升华，得到生物干瓣膜

储藏步骤：将脱水后的生物干瓣膜放置在提前涂覆涂层(涂层含有一定质量分数的羟脯氨酸和聚乙烯醇)的聚乙烯瓶中，密封保存t7，并检测脱水生物瓣膜的水分含量。

工艺参数如表2所示。

表1高渗透溶液的成分及含量

表2实施例1～8以及对比实施例1的工艺参数

表2(续)实施例1～2以及对比实施例1的工艺参数

对比实施例

1、选取交联后的生物瓣膜(牛心包)，制备成直径为2cm、4cm、6cm、8cm、10cm，厚度为0.3mm左右的圆形，使用生理盐水对生物瓣膜清洗5次，每次5分钟，备用。

2、配制干燥溶液，量取含甘油70％的乙醇溶液250mL作为渗透溶液，将交联生物瓣膜浸入渗透溶液24小时后取出后，再换取同样的渗透溶液，重复一次，得到脱水生物瓣膜。

3、将脱水后的生物瓣膜真空包装，一定时间后测量生物瓣膜中的水分含量。

性能测试实施例

分别测量交联后生物瓣膜、脱水干燥后的生物干瓣膜以及水合后的生物瓣膜(瓣膜：生理盐水(体积比)＝1：100，将干瓣完全浸没5分钟)的拉伸最大力和断裂力。

测试方法：根据现有常规方法采用万能力学实验机进行拉伸测试(如表3)，拉伸速率25mm/min，拉伸直至试样反生断裂(如表4)。

表3拉伸强度检测数据(MPa)

表4断裂伸长率检测数据(％)

由表3、表4可知，交联后的生物瓣膜经脱水干燥后，其拉伸强度和断裂伸长率均有不同程度的下降，但对比例制备的生物干瓣膜下降的幅度更大，如拉伸强度，实施例1-4制备的生物干瓣膜的拉伸强度降低10％以内，而对比例得到的生物干瓣膜的拉伸强度降低18％以上。实施例1-4制备的生物干瓣膜的断裂伸长率降低40％左右，而对比例得到的生物干瓣膜的拉伸强度降低54％，明显比实施例1-4制备的生物干瓣膜更容易断裂。由表3和4可发现，本发明的生物干瓣膜水合后生物瓣膜的拉伸强度、断裂伸长率检测数据均优于对比例。这表明脱水后的生物瓣膜水合后机械强度效果更显著。

而制备得到的生物干瓣膜经水合后，生物瓣膜的拉伸强度、断裂伸长率均有回升，且实施例1-4制备得到的生物干瓣膜经水合后，拉伸强度、断裂伸长率均高于交联后生物瓣膜，也即采用本发明制备的生物瓣膜，在植入人体后，强度优于传统戊二醛交联制备得到的生物湿瓣膜。而对比例得到的生物干瓣膜经水合后，得到的生物瓣膜的拉伸强度、断裂伸长率均低于交联后生物瓣膜，说明对比例中的生物瓣膜水合后的强度没有完全恢复。

水分测试实施例

生物干瓣膜密封一段时间后，测试其水分含量(％)，采用分析天平称量得到W1，放置电热恒温鼓风干燥箱80℃烘干24小时，冷却至室温恒重后，再次称量得到W2。计算含水量，如表5所示。

表5密封一段时间后的含水量(wt％)

由表5可知，本发明制备的实施例1-4中生物干瓣膜在密封0-24个月中，水分无明显变化，均能稳定在30-32wt％范围内，这表明此干式储存方式可以使含水量稳定。而对比例中制备得到的生物干瓣膜，刚制备完成时，其水分含量为30.1％，在12个月内，其水分含量均能保持在30％-32％之间，而储存18个月后，其水分含量超过33％，24个月时，水分含量甚至高达36.5％，水分含量变高后，微生物繁殖明显加快，会影响产品的性能。

生物瓣膜尺寸变化测试

分别测定交联后直径为8cm的生物瓣膜，使用该生物瓣膜制备得到的生物干瓣膜，以及生物干瓣膜在生理盐水中浸泡(瓣膜：生理盐水＝1：100(体积比)，将干瓣完全浸没其中5分钟)水合后的生物瓣膜的直径和厚度变化(cm，平均值±标准差)，采用卡尺分别测得直径和厚度，分别如表6和表7所示。

表6水合前后的直径变化(cm)

由表6可知，以交联后生物瓣膜为基准(除水前)，本发明制备的实施例1-4中的生物干瓣膜的直径略有下降，均控制在1％以内，水合后生物瓣膜的的直径又有一定的恢复，相比于交联后至生物瓣膜，水合后生物瓣膜的直径下降幅度在0.25％以下，生物瓣膜经水合后，恢复至原来的水平，瓣膜能基本保持交联后生物瓣膜的骨架结构。而对比例中，制备的生物干瓣膜的直径降低5％以上，水合后，直径虽有一些恢复，但仍降低至2.75％左右，说明生物瓣膜在脱水过程中，瓣膜骨架受到破坏。

表7水合前后的厚度变化

由表7可知，以交联后生物瓣膜为基准(除水前)，本发明制备的实施例1-4中的生物干瓣膜的厚度，水合后生物瓣膜的厚度均无明显变化。而对比例中，制备的生物干瓣膜的厚度降低20％左右，水合后，生物瓣膜厚度有一定的恢复，但相对于交联后生物瓣膜，其厚度仍下降16％左右。由表6、7可发现该发明下的水合后的生物瓣膜直径、厚度与交联后相比无明显变化，这表明高渗透溶液脱水保持了生物瓣膜的尺寸稳定性。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (19)

1.一种制备生物干瓣膜的方法，其特征在于所述方法为两步脱水法，包括：

首次脱水步骤，将交联后的生物瓣膜浸泡在高渗透溶液中浸泡脱去部分自由水得到首次脱水生物瓣膜；

二次脱水步骤，将首次脱水生物瓣膜在真空中冷冻干燥以脱去剩余自由水得到所述生物干瓣膜；

封闭保湿步骤，在首次脱水步骤后、二次脱水步骤前，将首次脱水生物瓣膜在封闭剂中浸泡以封闭首次脱水生物瓣膜；

红外辐射步骤，在封闭保湿步骤后、二次脱水步骤前，将封闭后的生物瓣膜用红外线进行辐射以提高二次脱水的速率。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述首次脱水步骤中，浸泡时间为8～72小时。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述首次脱水步骤中，浸泡时间为16～36小时。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述首次脱水步骤中，浸泡时间为24～28小时。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于在所述首次脱水步骤中，所述高渗透溶液包括：

单糖、二聚糖和/或糖醇；

和生物多糖。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于

所述单糖、二聚糖和/或糖醇的质量浓度为20～30％；

所述生物多糖的质量浓度为20～30％。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于

所述单糖、二聚糖和/或糖醇的质量浓度为22～28％；

所述生物多糖的质量浓度为22～28％。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于

所述单糖、二聚糖和/或糖醇的质量浓度为25％；

所述生物多糖的质量浓度为25％。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于

所述单糖、二聚糖选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的一种或多种；所述糖醇选自甘露醇。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述二次脱水步骤中，

所述真空冷冻干燥为先在-60～-50℃预冻8～20小时后，再至常温条件下，抽真空至6～10Pa下干燥16～40小时。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述二次脱水步骤中，

所述真空冷冻干燥为先在-55℃下预冻10～16小时后，再至常温条件下，抽真空至8Pa下干燥20～30小时。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于所述二次脱水步骤中，

所述真空冷冻干燥为先在-55℃下预冻12小时后，再至常温条件下，抽真空至8Pa下干燥24小时。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述封闭保湿步骤中，

所述封闭剂选自矿物油和动物脂肪中的一种或多种。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于在所述红外辐射步骤中，

封闭后的生物瓣膜用功率密度350～450w/g的红外线在温度70～90℃、辐照距离100～150mm处辐照3～5小时。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于在所述红外辐射步骤中，

封闭后的生物瓣膜用功率密度400w/g的红外线在温度80℃、辐照距离120mm处辐照4小时。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法还包括：

干瓣膜保存步骤：所述生物干瓣膜保存在聚乙烯瓶中，所述聚乙烯瓶内壁涂抹有涂层，所述涂层的原料包括65～75质量％的羟脯氨酸和/或甘氨酸，以及25～35质量％的聚乙烯醇。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于所述方法还包括：

干瓣膜保存步骤：所述生物干瓣膜保存在聚乙烯瓶中，所述聚乙烯瓶内壁涂抹有涂层，所述涂层的原料包括70质量％的羟脯氨酸和/或甘氨酸，以及30质量％的聚乙烯醇。

18.一种权利要求1～16任一项所述的方法制备得到的生物干瓣膜，其特征在于：

所述生物干瓣膜的结合水为30～33％；

所述生物干瓣膜保存在聚乙烯瓶中，所述聚乙烯瓶内壁涂抹有涂层，所述涂层的原料包括65～75质量％的羟脯氨酸和/或甘氨酸，以及25～35质量％的聚乙烯醇。

19.如权利要求18所述的生物干瓣膜，其特征在于，所述生物干瓣膜保存在聚乙烯瓶中，所述聚乙烯瓶内壁涂抹有涂层，所述涂层的原料包括70质量％的羟脯氨酸和/或甘氨酸，以及30质量％的聚乙烯醇。