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CN110193095B - 一种干态生物组织材料及其制备方法 - Google Patents

一种干态生物组织材料及其制备方法 Download PDF

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CN110193095B CN201810164768.0A CN201810164768A CN110193095B CN 110193095 B CN110193095 B CN 110193095B CN 201810164768 A CN201810164768 A CN 201810164768A CN 110193095 B CN110193095 B CN 110193095B
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Abstract

本发明提供了一种干态生物组织材料及其制备方法，制备方法包括如下步骤：S1：清洗经过交联处理的生物组织；S2：将S1处理后的生物组织利用玻璃化溶液进行平衡；S3：将S2处理后的生物组织进行冷冻干燥处理；S4：将S3处理后的生物组织密封包装后进行灭菌，得到干态生物组织材料。本发明提供了一种干态生物组织材料及其制备方法，通过玻璃化溶液平衡及冷冻干燥的处理方式，使得生物组织材料中的水溶液在冷却处理时保持玻璃态，不会形成冰晶，避免了对胶原纤维结构的破坏，对组织的三维结构有较好的保护作用，该方法得到的生物组织形态和抗拉强度不会发生显著变化。

Description

一种干态生物组织材料及其制备方法
技术领域
本发明属于医疗器械领域，涉及一种干态生物组织材料及其制备方法。
背景技术
目前，临床所使用的生物组织如生物瓣膜、生物补片等所用的生物组织材料通常使用化学试剂如戊二醛和/或甲醛进行交联固定处理，并且贮存在包含戊二醛和/或甲醛的稀释水溶液中，使其保持无菌环境和水合状态。然而，大量的研究证明，采用戊二醛交联处理的生物组织存在以下缺陷：戊二醛具有较高的毒性，即使很低的残留量也会对人体产生很大影响，不利于生物组织内皮化的形成；在生物组织植入人体后，其残留的戊二醛会导致生物组织免疫反应，免疫反应是生物组织衰败的重要原因之一。因此，有戊二醛试剂残留的生物组织在植入人体前必须经过多次清洗。这个过程也为术者带来了极大地不便，同时也使得医护人员暴露在戊二醛环境中。
此外，在植入生物组织材料或其制备的生物假体时，手术前医疗人员应当尽量减少医疗器械暴露在外的准备工作，因为使用“易得即用”的组织和假体不仅可以降低染菌或误差几率，也可以减少植入时间。所以，开发一种干态生物组织材料不仅有广阔的发展前景也具有重要的实用价值。
专利文献CN1245222C描述了一种植入用顺性脱水组织的制备方法，首先将组织浸没在梯度增加的极性有机溶液中，然后用含甘油或者甘油水溶液或低分子量(<1000D)的聚乙二醇以及6000-15000D的聚乙二醇和肝素溶液处理。接着，将所述组织简单地浸入到肝素水溶液中冷冻和干燥。然而，这种脱水过程显著减少了组织的总尺寸，而且用到的化学试剂(如乙腈、丙酮等)具有一定的毒性。此外，该脱水过程的生物组织不能成功地再水合并恢复其原始尺寸。
专利文献CN101626682B涉及一种用于外科植入的生物组织，用包含多元醇和C1-C3醇的非水性处理溶液接触所述生物组织和从溶液处理过的生物组织去除部分处理溶液，让组织保持基本干燥状态。但是，该方法所需处理时间较长，所需溶液量较大，不利于简化操作和降低成本。此外，采用单一的醇类脱水处理并不能较好的控制“基本干燥状态”的组织中的剩余含水量，如果含水量大于30％会影响EO灭菌(环氧乙烷灭菌)效果导致灭菌不彻底。
巴西圣保罗大学Pitombo课题组公布了一种生物组织低温冷冻干燥处理方法，即先将动物源组织中的水分子冷冻至-80℃～-50℃，使之形成冰晶，然后再抽真空，保持低压条件下，冷冻的冰晶升华成气态，动物源组织变得干燥，同时在该过程中减少戊二醛残留。但是，由于冰的密度相较于水的密度大，在冷冻的过程中，当水冷冻为冰晶后，体积变大，会破坏胶原纤维组织结构。所以，处理后的生物组织机械性能较差。
综上可以看到，现有的生物组织制备、贮存方法(如醛类溶液保存)存在生物组织使用寿命短，生物组织使用时影响医护人员的工作环境，而且操作不便，增加手术时间等缺点。而后出现的甘油等多元醇类的脱水处理工艺获得的干态生物组织材料虽然具有一定的优势，但是其在生物组织形态变化、残留试剂、再水合性能和组织含水量的控制等方面仍需要进一步改进。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种干态生物组织材料及其制备方法，以解决现有技术中制备得到的生物组织存贮和使用不便、含水量控制不易、生物安全性低、处理后生物组织材料机械性能降低等问题中的至少一个。
为解决上述技术问题中的至少一个，本发明提供了一种干态生物组织材料的制备方法，包括：
步骤S1：清洗经过交联处理的生物组织；
步骤S2：将所述步骤S1处理后的生物组织利用玻璃化溶液进行平衡；
步骤S3：将所述步骤S2处理后的生物组织进行冷冻干燥处理；
步骤S4：将所述步骤S3处理后的生物组织密封包装后进行灭菌，得到所述干态生物组织材料。
进一步的，所述步骤S1中所述经过交联处理的生物组织为交联剂交联处理后的异种或同种异体生物组织。
进一步的，所述经过交联处理的生物组织为心包、心脏瓣膜、覆膜、胸膜、小肠粘膜下层、硬脑膜、硬脊膜、韧带或皮肤。
进一步的，所述步骤S1中，所述交联处理采用的交联剂选自戊二醛、京尼平、原花青素、碳化二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺中的一种或多种组合。
进一步的，所述步骤S1具体包括：
步骤S11：采用清洗液对所述经过交联处理的生物组织进行清洗；
步骤S12：采用玻璃化溶液对所述S11中清洗后的生物组织进行清洗。
进一步的，所述清洗液选自生理盐水、pH值为6.8～8.6磷酸盐缓冲液和pH值为6.8～8.6D-Hanks溶液中的一种或几种组合。
进一步的，所述步骤S2中，利用玻璃化溶液进行平衡的平衡时间为2h～24h。
进一步的，所述玻璃化溶液为质量百分比为50％～80％的冷冻保护剂的水溶液。
进一步的，所述冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂中的一种或两种组合。
进一步的，所述渗透性冷冻保护剂选自甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、乙酰胺和甲醇中的一种或多种组合。
进一步的，所述非渗透性冷冻保护剂选自聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉中的一种或多种组合。
进一步的，所述步骤S3具体包括：
步骤S31：将所述步骤S2处理后的生物组织投入制冷剂中冷却；
步骤S32：将所述步骤S31处理后的生物组织进行冷冻干燥处理。
进一步的，所述制冷剂为干冰浴、液氮浴、或者由干冰或液氮与挥发性的液体混合而成的低温浴。
进一步的，所述的挥发性的液体选自乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和乙腈中的一种或几种组合。
进一步的，所述步骤S31中，生物组织投入制冷剂中冷却时，冷却温度为-120℃～-70℃。
进一步的，所述步骤S32具体包括：将经过所述步骤S31处理后的生物组织抽真空，真空度为0.5kpa～3kpa；升温至-40℃～0℃，升温速率为0℃/h～40℃/h，并控制真空度为0.01kpa～0.1kpa；整个真空干燥时间为4h～12h；复温至室温，复温速率为40℃/h～80℃/h，气压回复到常压。
进一步的，抽真空至真空度为0.5kpa～3kpa时所需时间为15～45min，抽真空至0.01kpa～0.1kpa时所需时间为20～50min，回复到常压所需时间为0.5h～10h。
进一步的，所述步骤S4中，在相对湿度小于30％的环境或惰性环境中将所述步骤S3处理后的生物组织置入干燥洁净的容器进行密封包装。
进一步的，所述步骤S4中，灭菌方式为环氧乙烷灭菌、电子束辐射灭菌或伽马射线辐照灭菌。
本发明还提供了一种干态生物组织材料，采用如上所述的制备方法制备得到。
与现有技术相比，本发明提供了一种干态生物组织材料及其制备方法，通过玻璃化溶液平衡及冷冻干燥的处理方式，使得生物组织材料中的水溶液在冷却处理时保持玻璃态，不会形成冰晶，避免了对胶原纤维结构的破坏，对组织的三维结构有较好的保护作用，该方法得到的生物组织形态和抗拉强度不会发生显著变化。
并且，采用本发明制备得到的干态生物组织材料的生物相容性好、生物安全性高，无有毒试剂残留，降低了组织钙化的风险，而且组织含水量控制在15％～30％之间，后续可以采用常规灭菌方法灭菌。
此外，本发明的干态生物组织材料的制备方法简单快捷，制备的干态生物组织和相应的假体可以“即拿即用”，不仅可以降低染菌或误差机率，也可以缩短手术时间。临床手术操作时，在生理盐水中再水化速度快，一般15～20分钟左右即可恢复原先水合状态。
附图说明
图1是本发明一实施例提供的一种干态生物组织材料的制备方法的流程示意图；
图2是本发明实施例1制备得到的干态牛心包组织使用组织学染色实验后的染色图；
图3是本发明实施例2制备得到的干态猪心包组织使用组织学染色实验后的染色图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种干态生物组织材料及其制备方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。
通过参考以下实施方式和附图的详细描述，本发明构思的特征和实现本发明构思的方法可更加容易理解。然而，本发明构思可以体现为许多不同的形式，并且不应被解释为局限于在此阐述的实施方式。
图1是本发明一实施例提供的一种干态生物组织材料的制备方法的流程示意图。请参考图1，本申请的一种干态生物组织材料的制备方法，包括：
步骤S1：清洗经过交联处理的生物组织；
步骤S2：将所述步骤S1处理后的生物组织利用玻璃化溶液进行平衡；
步骤S3：将所述步骤S2处理后的生物组织进行冷冻干燥处理；
步骤S4：将所述步骤S3处理后的生物组织密封包装后进行灭菌，得到所述干态生物组织材料。
其中，在本发明中，所述步骤S1中所述经过交联处理的生物组织为交联剂交联处理后的异种或同种异体生物组织，例如心包、心脏瓣膜、覆膜、胸膜、小肠粘膜下层、硬脑膜、硬脊膜、韧带或皮肤。
并且，在本发明中，所述步骤S1中的所述交联处理采用的交联剂没有特别的限制。优选的，所述交联剂可以选自戊二醛、京尼平、原花青素、碳化二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺中的一种或多种组合。
在一些优选实施例中，所述步骤S1可以具体包括：步骤S11：采用清洗液对所述经过交联处理的生物组织进行清洗；步骤S12：采用玻璃化溶液对所述步骤S11中清洗后的生物组织进行清洗。
其中，所述清洗液可以选自生理盐水、pH值为6.8～8.6的磷酸盐缓冲液和pH值为6.8～8.6的D-Hanks溶液中的一种或几种组合。采用清洗液清洗时，对生物组织清洗3～5遍，每遍清洗3～5分钟。采用玻璃化溶液清洗时，对生物组织清洗3～5遍，每遍清洗1～10分钟。
在一些优选实施例中，所述步骤S2中，利用玻璃化溶液进行平衡的平衡时间为2h～24h。
在本发明的优选实施例中，所述步骤S12采用玻璃化溶液清洗，所述步骤S2采用玻璃化溶液平衡，是为了使玻璃化溶液中的冷冻保护剂更加充分渗透到生物组织内部，避免在后续冷却处理时生物组织内部的水溶液形成冰晶。
在本发明中，所述玻璃化溶液是指质量百分比为50％～80％的冷冻保护剂的水溶液。其中，所述冷冻保护剂可以选自渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂中的一种或两种组合。优选的，所述渗透性冷冻保护剂选自甘油、DMSO(二甲基亚砜)、乙二醇、丙二醇、乙酰胺和甲醇中的一种或多种组合。优选，所述非渗透性冷冻保护剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉中的一种或多种组合。本发明对于含有多种冷冻保护剂的水溶液中多种冷冻保护剂之间的比例没有特别的限制。
在本发明的一些优选实施例的冷冻干燥处理过程中，所述步骤S3具体包括：步骤S31：将所述步骤S2处理后的生物组织投入制冷剂中冷却1～5min；步骤S32：将所述步骤S31处理后的生物组织进行冷冻干燥处理。其中，所述制冷剂优选为干冰浴、液氮浴、或者由干冰或液氮与挥发性的液体混合而成的低温浴。进一步优选的，所述的挥发性的液体选自乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和乙腈中的一种或几种组合。优选的，在所述步骤S31中，生物组织投入制冷剂中冷却处理时，冷却温度为-120℃～-70℃。在实际操作时，可以采用低温温度计进行监测冷却温度。
经过上述步骤S31的快速降温冷却处理后，生物组织材料中所含的水溶液处于一种介于液态和固态之间的玻璃态，玻璃态的水溶液可以保持自己的形态，却不能像液体一样流动，具有以下特点：分子无定型结构，不按晶格结构排列。玻璃态的物理性能与固态和液态都不相同，可以避免或减轻冷却对组织造成的损伤。
另外，在所述步骤S32中，将步骤S31冷却处理的生物组织进行冷冻干燥处理时，先对所述生物组织抽真空处理，真空度(即标准大气压与绝对压强的差值)控制在0.5kpa～3kpa，优选抽真空时间为15～45min；然后升温至-40℃～0℃，升温速率为0℃/h～40℃/h，并控制真空度保持在0.01kpa～0.1kpa，优先抽真空时间为20～50min。整个真空干燥的时间为4h～12h。干燥结束后，控制冷冻干燥体系的温度复温至室温，复温速率为40℃/h～80℃/h，气压缓慢回复到常压，优选复压所需时间为0.5h～10h。干燥完成之后的生物组织含水量可以控制在15％～30％之间。
本发明一些优选实施例中，可以采用冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，将冷冻干燥机预冷至-100℃～-40℃，然后通过控制冷冻干燥机的程序，控制生物组织的温度变化速率、真空度和干燥时间，且尽量提高复温速率，使得组织含水量控制在15％～30％之间，达到最优的干燥状态。
发明人发现，生物组织冷冻干燥后在升温的过程中会从周围吸热发生“去玻璃化”现象。而且在去玻璃化过程中生成的冰晶对组织的损伤大于降温过程中形成的冰晶对细胞和组织的损伤，因此必须以一定的速率复温以避免复温过程中去玻璃化现象的发生。发明人经过大量实验，发现较高的复温速率可以提高去玻璃化的温度从而抑制冰晶生长，采用足够高的复温速率甚至可以完全避免冰晶的出现。
在本发明一些优选实施例，所述步骤S4中，密封包装过程如下：在相对湿度小于30％的环境或惰性环境中将所述步骤S3处理后的生物组织置入干燥洁净的容器(例如瓶或包装袋等)进行密封包装。所述步骤S4中灭菌方式可以为EO灭菌(环氧乙烷灭菌)、电子束辐射灭菌或伽马射线辐照灭菌。
本发明还提供了一种干态生物组织材料，采用如上所述的制备方法制备得到。
为了进一步理解本发明，下面将结合更加详细具体的实施方式对本发明的优选方案进行描述，以凸显本发明提供的一种干态生物组织材料及其制备方的特点和特征。这些描述只是举例说明本发明方法的特征和优点，而非限制本发明的保护范围。下述实施例中，没有特别说明，“溶液”均指水溶液。
实施例1
在本实施例中，生物组织材料选自牛心包组织，干态生物组织材料的制备方法具体如下：
步骤1.1：在当地屠宰厂获取牛心包组织，经过脂肪剥离、修剪和清洗后，用质量浓度为0.625％的戊二醛(Sigma-Aldrich Co.LLC.)溶液交联固定5天。将交联固定后的牛心包裁剪成小片(15mm*15mm)，用生理盐水(华仁药业股份有限公司)在室温下清洗牛心包组织小片，清洗3次，每次清洗3～5分钟。
步骤1.2：将该牛心包浸没在质量百分比为50％的甘油溶液中清洗3遍，每遍5-10分钟；
步骤1.3：将步骤1.2处理后的组织取出，移入质量百分比为60％的海藻糖溶液中平衡12h；
步骤1.4：将步骤1.3处理的组织取出，投入干冰-乙醚浴中冷却3min，采用低温温度计监测，温度约-100℃±5℃；
步骤1.5：将步骤1.4处理的组织取出，使用冷冻干燥机(德国Christ中试型冻干机Epsilon 2-6D)进行冷冻干燥处理；冷冻干燥机内的初始环境为室温20℃、常压。使用前预冷，将干燥机中环境温度降为-40℃，然后将步骤1.4处理过的生物组织快速放入冷冻干燥机中抽真空，在此温度(-40℃)下保持2h，控制冷冻干燥机里的真空度为0.832±0.2kpa，常压通过抽真空到达此真空度的时间约为30min。然后以10℃/h的速率升温至-20℃，升温过程持续2h，升温的过程同时抽真空，保持冷冻干燥机里的真空度为0.021±0.005kpa，通过抽真空到达此真空度的时间为40min。整个真空干燥时间为4h。接着，以40℃/h的速率升温至室温20℃，此时冷冻干燥机里的压力逐渐变为常压，复压时间为10h。
步骤1.6：在干燥的洁净环境中，将生物组织牛心包放入透析袋(
Figure BDA0001584101230000092
杜邦中国集团有限公司)中，密封，EO灭菌。
对利用上述方法制备得到的干态的牛心包组织进行含水量、再水化时间、细胞毒性等指标进行测量，以对其性能指标进行评价。其中，制备得到的干态牛心包组织的含水量为28.3±1.5％(通过梅特勒-托利多卡尔费休水分仪测得，下同)，再水化时间为16.07±0.55分钟，细胞毒性为1级。
将本实施例制备得到的干态牛心包组织进行水合，将水合后的形状尺寸、热皱温度、最大拉伸强度等指标与处理前进行对比，结果如下表1所示。
表1-牛心包处理前和水合后相关指标的对比
Figure BDA0001584101230000091
将经过上述方法制备得到的牛心包组织使用组织学(HE)染色实验，如图2所示，结果显示牛心包组织中的纤维走向相对一致，连续性好，呈波浪状，心包中的胶原纤维结构没有被破坏。由此可见，本实施例1中的制备方法得到的干态牛心包能够保持组织原先结构和状态。
实施例2
在本实施例中，生物组织材料选自猪心包组织，干态生物组织材料的制备方法具体如下：
步骤2.1：在当地屠宰厂获取猪心包组织经过脂肪剥离、修剪和清洗后用N-羟基琥珀酸亚胺交联固定，具体地，用pH＝5.5的PBS配制交联液，N-羟基琥珀酸亚胺的浓度为0.1mol/L，猪心包与交联液以8:1(W/V)比例混合；于20℃，以400r/min震荡交联16h；然后震荡清洗8次，每次10min。将固定后的猪心包裁剪成小片(30mm*50mm)，之后将交联固定后的猪心包用生理盐水在室温下清洗，清洗3～5次，每次清洗3～5分钟。
步骤2.2：将该猪心包浸没在质量百分比为65％的乙二醇溶液中清洗5遍，每遍5-10分钟；
步骤2.3：将步骤2.2处理的组织取出，移入质量百分比为30％的海藻糖和质量百分比为50％的蔗糖溶液中平衡6h；
步骤2.4：将步骤3处理的组织取出，投入液氮-乙醇中冷却2.5min，采用低温温度计监测，温度约-110℃±5℃；
步骤2.5：将步骤2.4处理的组织取出，使用冷冻干燥机(德国Christ中试型冻干机Epsilon 2-6D)进行冷冻干燥处理；冷冻干燥机内的初始环境为室温22℃、常压。使用前预冷，将干燥机中环境温度降为-70℃，然后将S4处理过的生物组织快速放入冷冻干燥机中抽真空，在此温度(-70℃)下保持4h，控制冷冻干燥机里的真空度为1.512±0.5kpa，常压通过抽真空到达此真空度的时间约为20min。然后以20℃/h的速率升温至-40℃，升温过程持续1.5h，升温的过程同时抽真空，保持冷冻干燥机里的真空度为0.065±0.005kpa，通过抽真空到达此真空度的时间为30min。整体体系在温度为-40℃、真空度为0.065±0.005kpa的条件下保持3h。因此，整个真空干燥时间为8.5h。接着，以60℃/h的速率升温至室温20℃，此时冷冻干燥机里的压力逐渐变为常压，复压时间为8h。步骤2.6：在干燥的含氮气的环境中，将生物组织猪心包放入透析袋中，密封，EO灭菌。
对利用上述方法制备得到的干态的猪心包组织进行含水量、再水化时间、细胞毒性等指标进行测量，以对其性能指标进行评价。其中，制备得到的干态猪心包组织的含水量为29.3±2.1％，再水化时间为15.07±0.69分钟，细胞毒性为1级。
将本实施例制备得到的干态猪心包组织进行水合，将水合后的形状尺寸、热皱温度、最大拉伸强度等指标与处理前进行对比，结果如下表2所示。
表2-猪心包处理前和水合后相关指标的对比
Figure BDA0001584101230000111
将经过上述方法制备得到的猪心包组织使用组织学(HE)染色实验，如图3所示，结果显示干态猪心包组织中的纤维走向相对一致，连续性好，呈波浪状，干态猪心包中的胶原纤维结构没有被破坏。由此可见，本实施例2中的制备方法得到的干态猪心包能够保持组织原先结构和状态。
实施例3
在本实施例中，生物组织材料选自牛心包组织，干态生物组织材料的制备方法具体如下：
步骤3.1：在当地屠宰厂获取牛心包组织，经过剥离、修剪和清洗后用碳化二亚胺交联固定，具体地，用pH＝5.5的PBS配制交联液，碳化二亚胺的浓度为0.1mol/L，猪小肠粘膜与交联液以8:1(W/V)比例混合；于20℃，以400r/min震荡交联16h；然后震荡清洗8次，每次10min。将固定后的牛心包组织裁剪成小片(30mm*50mm)，之后将交联固定后的牛心包组织用生理盐水在室温下清洗，清洗3～5次，每次清洗3～5分钟。
步骤3.2：将该牛心包组织浸没在质量百分比为50％的乙二醇和质量百分比为30％的甘油混合溶液中清洗3遍，每遍5-10分钟；
步骤3.3：将步骤3.2处理的组织取出，移入质量百分比为70％的蔗糖溶液中平衡2h；
步骤3.4：将步骤3.3处理的组织取出，投入干冰-丙酮中冷却3.5min，采用低温温度计监测，温度约-78℃±5℃；
步骤3.5：将步骤3.4处理的组织取出，使用冷冻干燥机(德国Christ中试型冻干机Epsilon 2-6D)进行冷冻干燥处理；冷冻干燥机内的初始环境为室温22℃、常压。使用前预冷，将干燥机中环境温度降为-100℃，然后将S4处理过的生物组织快速放入冷冻干燥机中抽真空，在此温度(-100℃)下保持1h，控制冷冻干燥机里的真空度为2.802±0.5kpa，常压通过抽真空到达此真空度的时间约为20min。然后以40℃/h的速率升温至-10℃，升温过程持续2.25h，升温的过程同时抽真空，保持冷冻干燥机里的真空度为0.091±0.005kpa，通过抽真空到达此真空度的时间为35min。在此温度压力(-10℃、0.091±0.005kpa)条件下保持抽真空8h。整个真空干燥时间为11.25h。接着，以60℃/h的速率升温至室温20℃，此时冷冻干燥机里的压力逐渐变为常压，复压时间为7h。
步骤3.6：在干燥的含氮气的环境中，将生物组织牛心包组织放入透析袋中，密封，EO灭菌。
对利用上述方法制备得到的干态的牛心包组织进行含水量、再水化时间、细胞毒性等指标进行测量，以对其性能指标进行评价。其中，制备得到的干态牛心包组织的含水量为25.3±1.5％，再水化时间为18.07±0.61分钟，细胞毒性为1级。
将本实施例制备得到的干态牛心包组织进行水合，将水合后的形状尺寸、热皱温度、最大拉伸强度等指标与处理前进行对比，结果如下表3所示。
表3-牛心包处理前和水合后相关指标的对比
Figure BDA0001584101230000121
综上所述，本发明提供了一种干态生物组织材料的制备方法，通过玻璃化溶液平衡及冷冻干燥的处理方式，使得生物组织材料中的溶液在冷却时保持玻璃态，不会形成冰晶，避免了对胶原纤维结构的破坏，对组织的三维结构有较好的保护作用，该方法得到的生物组织形态和抗拉强度不会发生显著变化。
并且，采用本发明制备得到的干态生物组织材料的生物相容性好、生物安全性高，无有毒试剂残留，降低了组织钙化的风险，而且组织含水量控制在15％-30％之间，有利于后续的灭菌。
此外，本发明制备的干态生物组织材料和以及相应的假体可以“即拿即用”，不仅可以降低染菌或误差机率，也可以缩短手术时间。临床手术操作时，在生理盐水中再水化速度快，一般15～20分钟左右即可恢复原先水合状态。
需要说明的是，本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。

Claims (19)

1.一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，包括：
步骤S1：清洗经过交联处理的生物组织；
步骤S2：将所述步骤S1处理后的生物组织利用玻璃化溶液进行平衡；
步骤S3：将所述步骤S2处理后的生物组织进行冷冻干燥处理；
步骤S4：将所述步骤S3处理后的生物组织密封包装后进行灭菌，得到所述干态生物组织材料；
所述步骤S3具体包括：
步骤S31：将所述步骤S2处理后的生物组织投入制冷剂中冷却；
步骤S32：将所述步骤S31处理后的生物组织进行冷冻干燥处理；
其中，所述步骤S32中，干燥结束后，控制冷冻干燥体系的温度复温至室温，复温速率为40℃/h～80℃/h。
2.根据权利要求1所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中所述经过交联处理的生物组织为交联剂交联处理后的异种或同种异体生物组织。
3.根据权利要求2所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述经过交联处理的生物组织为心包、心脏瓣膜、覆膜、胸膜、小肠粘膜下层、硬脑膜、硬脊膜、韧带或皮肤。
4.根据权利要求1所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述交联处理采用的交联剂选自戊二醛、京尼平、原花青素、碳化二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺中的一种或多种组合。
5.根据权利要求1所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：
步骤S11：采用清洗液对所述经过交联处理的生物组织进行清洗；
步骤S12：采用玻璃化溶液对所述S11中清洗后的生物组织进行清洗。
6.根据权利要求5所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述清洗液选自生理盐水、pH值为6.8～8.6的磷酸盐缓冲液和pH值为6.8～8.6的D-Hanks溶液中的一种或几种组合。
7.根据权利要求1所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，利用玻璃化溶液进行平衡的平衡时间为2h～24h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述玻璃化溶液为质量百分比为50％～80％的冷冻保护剂的水溶液。
9.根据权利要求8所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂中的一种或两种组合。
10.根据权利要求9所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述渗透性冷冻保护剂选自甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、乙酰胺和甲醇中的一种或多种组合。
11.根据权利要求9所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述非渗透性冷冻保护剂选自聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉中的一种或多种组合。
12.根据权利要求1所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述制冷剂为干冰浴、液氮浴、或者由干冰或液氮与挥发性的液体混合而成的低温浴。
13.根据权利要求12所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述的挥发性的液体选自乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和乙腈中的一种或几种组合。
14.根据权利要求1所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S31中，当所述生物组织被投入所述制冷剂中冷却时，冷却温度为-120℃～-70℃。
15.根据权利要求1所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S32具体包括：
将经过所述步骤S31处理后的生物组织抽真空，真空度为0.5kPa ～3kPa ；
升温至-40℃～0℃，升温速率为0℃/h～40℃/h，并控制真空度为0.01kPa ～0.1kPa ；
整个真空干燥时间为4h～12h；
干燥结束后，控制冷冻干燥体系的温度复温至室温，复温速率为40℃/h～80℃/h，气压回复到常压。
16.根据权利要求15所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，抽真空至真空度为0.5kPa ～3kPa 时所需时间为15～45min，抽真空至0.01kPa ～0.1kPa 时所需时间为20～50min，回复到常压所需时间为0.5h～10h。
17.根据权利要求1所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，在相对湿度小于30％的环境或惰性环境中将所述步骤S3处理后的生物组织置入干燥洁净的容器进行密封包装。
18.根据权利要求1所述的一种干态生物组织材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，灭菌方式为环氧乙烷灭菌、电子束辐射灭菌或伽马射线辐照灭菌。
19.一种干态生物组织材料，采用如权利要求1-18任一项所述的制备方法制备得到。
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