CN115212308B - Gasdermin e通路的靶向剂在治疗胰腺癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及GASDERMIN E通路的靶向剂在治疗胰腺癌中的应用。具体而言，本申请涉及靶向GSDME通路的试剂在制备治疗胰腺癌的药物中的用途。通过靶向作用于GASDERMIN E通路的成员(Gasdermin E、MUC1、或MUC13等)，打破肿瘤细胞对消化酶的抵抗作用，破坏胰腺肿瘤的原位生长。
Description
技术领域
本申请涉及生物、医学、临床领域。具体而言，涉及靶向gasdermin E及其下游通路在治疗胰腺癌中的用途。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤。约90％的胰腺癌为起源于腺管上皮的导管腺癌。胰腺导管腺癌的有效临床治疗方案有限，5年生存率低于8％。因此，迫切需要探索新的治疗策略。
胰腺癌临床表现取决于发病部位、病程早晚、有无转移以及邻近器官累及的情况。其临床特点是整个病程短、病情发展快和迅速恶化。最多见的是上腹部饱胀不适、疼痛。
目前的治疗原则仍然是以外科手术治疗为主，结合放化疗等综合治疗。胰腺癌由于恶性程度高，手术切除率低，预后不良。尽管手术仍然是首要的治疗方法，但由于胰腺癌常常发现较晚，而丧失根治的机会。因此，需要对胰腺癌进行综合治疗。迄今同大多数肿瘤一样，还没有一种高效和可完全应用的综合治疗方案。
胰腺导管腺癌起源于外分泌胰腺，包括腺泡和导管细胞，并分泌包含消化酶的胰液。生理情况下，分泌的胰液通过胰管流入十二指肠，发挥消化作用。同时，胰液也有潜在的危险性，例如在病理情况下胰液会消化邻近的胰腺细胞，导致急性胰腺炎等胰腺疾病。因此，胰腺导管结构必须严格有序地紧密排列，以避免产生自身消化。然而，胰腺肿瘤在恶性转化过程中，肿瘤的无序生长不可避免地破坏正常的导管结构，导致胰液溢出并消化附近的细胞。肿瘤细胞能够在这种恶劣环境中生长，一定存在抵抗胰液中消化酶的机制，使得肿瘤细胞逃避消化，形成胰腺原位肿瘤。
因此，揭示胰腺癌细胞在胰腺微环境中的生存机制，靶向肿瘤细胞的逃避胰液消化的抵抗通路，对胰腺癌的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明人出乎意料地发现：在胰腺肿瘤中gasdermin家族介导的黏蛋白上调表达机制，通过高表达黏蛋白在肿瘤细胞表面形成屏障，从而抵抗胰腺中胰液对肿瘤细胞的消化作用。前述发现为胰腺癌的治疗提供了一种策略，通过靶向抑制GSDME通路中的成员(包括gasdermin E及其下游黏蛋白)可破坏肿瘤的消化抵抗机制，从而实现对胰腺癌的临床治疗。
根据本申请的一些实施方案，提供了靶向GSDME通路的试剂在制备治疗胰腺癌的药物中的用途，其中所述靶向GSDME通路的试剂选自以下的任一项或组合：靶向GasderminE的试剂、靶向MUC1的试剂、靶向MUC13的试剂。
根据本申请的一些实施方案，提供了Gasdermin E作为靶点在制备治疗胰腺癌的药物中的用途。
根据本申请的一些实施方案，提供了靶向Gasdermin E的试剂在制备治疗胰腺癌的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述的靶向Gasdermin E的试剂是指能够在核酸水平或者在蛋白水平调节Gasdermin E或其表达产物的表达水平或活性的试剂。所述的调节选自：抑制、降低、失活、敲除、降低、或其组合。因而，所述靶向Gasdermin E的试剂抑制、降低、失活、敲除或敲低Gasdermin E或其表达产物的活性或水平。
在一些具体的实施方案中，靶向Gasdermin E的试剂能选择性或特异性识别并作用于Gasdermin E基因或其表达产物。
在一些具体的实施方案中，靶向Gasdermin E的试剂能够降低Gasdermin E基因或其表达产物的水平或活性。
在一些具体的实施方案中，靶向Gasdermin E的试剂能够敲除Gasdermin E基因。
在一些具体的实施方案中，靶向Gasdermin E的试剂能够敲低Gasdermin E基因。
在一些具体的实施方案中，靶向Gasdermin E的试剂能够失活Gasdermin E基因或其表达产物。
在一些实施方案中，Gasdermin E基因的表达产物是指Gasdermin E基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于Gasdermin E基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟的蛋白、及其片段。
在一些实施方案中，靶向Gasdermin E的试剂是核酸、多肽、或小分子药物。在一些实施方案中，所述核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA；多肽选自：抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体选自：嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段的示例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。
去除一个基因的表达可以给研究者提供有关该基因功能的信息。
在一些实施方案中，所述水平是蛋白水平。在另一些实施方案中，所述水平是核酸水平。在蛋白水平这可以通过运用特异性抑制剂(如抗体)抑制蛋白质功能而实现；或者在RNA水平通过阻止mRNA翻译成蛋白质来完成。用于RNA水平抑制的传统方法包括反义寡核苷酸和核酶。在mRNA水平沉默基因表达的方法，称为RNA干扰或RNAi。双链RNA参与这种转录后的基因沉默，dsRNA可诱导降解与dsRNA一条链具相同序列的mRNA(Fire等人，TrendsGenet.9：358-363，1999；Fire等，Nature 6669：806-811，1998；Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 17：9742-9747，2001)。
在具体的实施方案中，靶向Gasdermin E的试剂选自：敲除试剂、反义寡核苷酸、siRNA、dsRNA、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
在一些具体的实施方案中，所述敲除试剂是指现有技术中公知的那些，包括但不限于Marieke Aarts编著的《基因敲除实验指南》(科学出版社中)中提到的那些方法或试剂。
在一些具体的实施方案中，Gasdermin E作为靶点是指将Gasdermin E基因或其表达产物作为靶标(例如，通过敲除、敲低、RNA干扰)从而调节(降低)胰腺癌的细胞内Gasdermin E基因或其表达产物的水平或活性。
在一些实施方案中，将靶向Gasdermin E的试剂制备成药物，用于预防或治疗胰腺癌。在具体的实施方案中，所述胰腺癌选自：胰腺导管腺癌、浆液性囊腺瘤、胰腺上皮内瘤变、导管内乳头状黏液性胰腺肿瘤、导管内嗜酸性乳头状胰腺肿瘤、导管内管状乳头状胰腺肿瘤、黏液性囊性胰腺肿瘤、胰腺腺泡细胞癌、胰母细胞瘤、胰腺实性-假乳头状肿瘤、胰腺神经内分泌微腺瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、非功能型胰腺神经内分泌肿瘤、功能型胰腺神经内分泌肿瘤、胰腺神经内分泌癌、混合性神经-非神经内分泌胰腺肿瘤；优选地，所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
在具体的实施方案中，所述治疗是指以下任一项或组合：降低消化酶抵抗、抑制胰腺癌细胞的原位生长、抑制胰腺癌细胞的增殖、或降低胰腺癌的转移。
根据本申请的一些实施方案，提供了MUC1作为靶点在制备治疗胰腺癌的药物中的用途。
根据本申请的一些实施方案，提供了靶向MUC1的试剂在制备治疗胰腺癌的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述的靶向MUC1的试剂是指能够在核酸水平或者在蛋白水平调节MUC1或其表达产物的表达水平或活性的试剂。所述的调节选自：抑制、降低、失活、敲除、降低、或其组合。因而，所述靶向MUC1的试剂抑制、降低、失活、敲除或敲低MUC1或其表达产物的活性或水平。
在一些具体的实施方案中，靶向MUC1的试剂能选择性或特异性识别并作用于MUC1基因或其表达产物。
在一些具体的实施方案中，靶向MUC1的试剂能够降低MUC1基因或其表达产物的水平或活性。
在一些具体的实施方案中，靶向MUC1的试剂能够敲除MUC1基因。
在一些具体的实施方案中，靶向MUC1的试剂能够敲低MUC1基因。
在一些具体的实施方案中，靶向MUC1的试剂能够失活MUC1基因或其表达产物。
在一些实施方案中，MUC1基因的表达产物是指MUC1基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于MUC1基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟的蛋白、及其片段。
在一些实施方案中，靶向MUC1的试剂是核酸、多肽、或小分子药物。在一些实施方案中，所述核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA；多肽选自：抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述水平是蛋白水平。
在一些实施方案中，抗体选自：嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段的示例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、线性抗体(linearantibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。
在另一些实施方案中，所述水平是核酸水平。
在具体的实施方案中，靶向MUC1的试剂选自：敲除试剂、反义寡核苷酸、siRNA、dsRNA、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
在一些具体的实施方案中，MUC1作为靶点是指将MUC1基因或其表达产物作为靶标(例如，通过敲除、敲低、RNA干扰)从而调节(降低)胰腺癌的细胞内MUC1基因或其表达产物的水平或活性。
在一些实施方案中，将靶向MUC1的试剂制备成药物，用于预防或治疗胰腺癌。在具体的实施方案中，所述胰腺癌选自：胰腺导管腺癌、浆液性囊腺瘤、胰腺上皮内瘤变、导管内乳头状黏液性胰腺肿瘤、导管内嗜酸性乳头状胰腺肿瘤、导管内管状乳头状胰腺肿瘤、黏液性囊性胰腺肿瘤、胰腺腺泡细胞癌、胰母细胞瘤、胰腺实性-假乳头状肿瘤、胰腺神经内分泌微腺瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、非功能型胰腺神经内分泌肿瘤、功能型胰腺神经内分泌肿瘤、胰腺神经内分泌癌、混合性神经-非神经内分泌胰腺肿瘤；优选地，所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
在具体的实施方案中，所述治疗是指以下任一项或组合：降低消化酶抵抗、抑制胰腺癌细胞的原位生长、抑制胰腺癌细胞的增殖、或降低胰腺癌的转移。
根据本申请的一些实施方案，提供了MUC13作为靶点在制备治疗胰腺癌的药物中的用途。
根据本申请的一些实施方案，提供了靶向MUC13的试剂在制备治疗胰腺癌的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述的靶向MUC13的试剂是指能够在核酸水平或者在蛋白水平调节MUC13或其表达产物的表达水平或活性的试剂。所述的调节选自：抑制、降低、失活、敲除、降低、或其组合。因而，所述靶向MUC13的试剂抑制、降低、失活、敲除或敲低MUC13或其表达产物的活性或水平。
在一些具体的实施方案中，靶向MUC13的试剂能选择性或特异性识别并作用于MUC13基因或其表达产物。
在一些具体的实施方案中，靶向MUC13的试剂能够降低MUC13基因或其表达产物的水平或活性。
在一些具体的实施方案中，靶向MUC13的试剂能够敲除MUC13基因。
在一些具体的实施方案中，靶向MUC13的试剂能够敲低MUC13基因。
在一些具体的实施方案中，靶向MUC13的试剂能够失活MUC13基因或其表达产物。
在一些实施方案中，MUC13基因的表达产物是指MUC13基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于MUC13基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟的蛋白、及其片段。
在一些实施方案中，靶向MUC13的试剂是核酸、多肽、或小分子药物。在一些实施方案中，所述核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA；多肽选自：抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述水平是蛋白水平。
在一些实施方案中，抗体选自：嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段的示例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、线性抗体(linearantibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。
在另一些实施方案中，所述水平是核酸水平。
在具体的实施方案中，靶向MUC13的试剂选自：敲除试剂、反义寡核苷酸、siRNA、dsRNA、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
在一些具体的实施方案中，MUC13作为靶点是指将MUC13基因或其表达产物作为靶标(例如，通过敲除、敲低、RNA干扰)从而调节(降低)胰腺癌的细胞内MUC13基因或其表达产物的水平或活性。
在一些实施方案中，将靶向MUC13的试剂制备成药物，用于预防或治疗胰腺癌。在具体的实施方案中，所述胰腺癌选自：胰腺导管腺癌、浆液性囊腺瘤、胰腺上皮内瘤变、导管内乳头状黏液性胰腺肿瘤、导管内嗜酸性乳头状胰腺肿瘤、导管内管状乳头状胰腺肿瘤、黏液性囊性胰腺肿瘤、胰腺腺泡细胞癌、胰母细胞瘤、胰腺实性-假乳头状肿瘤、胰腺神经内分泌微腺瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、非功能型胰腺神经内分泌肿瘤、功能型胰腺神经内分泌肿瘤、胰腺神经内分泌癌、混合性神经-非神经内分泌胰腺肿瘤；优选地，所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
在具体的实施方案中，所述治疗是指以下任一项或组合：降低消化酶抵抗、抑制胰腺癌细胞的原位生长、抑制胰腺癌细胞的增殖、或降低胰腺癌的转移。
在一些实施方案中，受试者选自：人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、马、猴、犬。
在一些实施方案中，受试者是胰腺癌患者。
在一些实施方案中，受试者是小鼠。在一些实施方案中，受试者是荷瘤小鼠；所述小鼠接种有以下的胰腺癌细胞系，例如但不限于：SW1990人胰腺癌细胞系、PANC-1人胰腺导管上皮癌细胞、CFPAC-1人胰腺癌细胞、BxPC-3人原位胰腺腺癌细胞、AsPC-1人转移胰腺腺癌细胞、Capan-1、Capan-2、HPAC、Hs 766T、MIA Paca-2、SU.86.86细胞系。
在一些实施方案中，SW1990是从II级胰腺癌的脾转移中分离并建立的细胞系。
在一些实施方案中，PANC-1由M.Liebe在1973年从一位56岁患有胰腺癌的男性胰腺导管组织中分离得到；有转移。
在一些实施方案中，AsPC-1源自胰头癌原发肿瘤；有转移；分泌黏蛋白和CEA。
在一些实施方案中，BxPC-3细胞源自胰体癌原发肿瘤；无转移。
在一些实施方案中，Capan-1细胞源自胰头癌肝脏转移灶。
在一些实施方案中，Capan-2细胞源自胰头癌；有浸润。
在一些实施方案中，CFPAC-1细胞源自胰头癌肝脏转移灶；有转移，广泛转移至肝脏；携带CFTR突变。
在一些实施方案中，HPAC细胞源自胰头癌；分化稳定、良好。
在一些实施方案中，Hs 766T细胞源自胰腺癌淋巴结转移灶。
在一些实施方案中，MIA Paca-2细胞源自胰体尾癌原位肿瘤；有浸润；ALP阴性。
在一些实施方案中，SU.86.86细胞源自胰头癌肝脏转移灶。
根据一些实施方案，提供一种靶向组合物，其包含：
-可药用载体、和
-选自以下的任一项或组合：
-前述靶向Gasdermin E的试剂、
-前述靶向MUC1的试剂、
-前述靶向MUC13的试剂、
-前述靶向MUC1的试剂和前述靶向MUC13的试剂。
在实施方案中，将本公开的靶向试剂封装在脂质体中或连接于载体分子(例如，胆固醇、TAT肽)。
尽管本公开的靶向试剂(例如反义寡核苷酸)不必以载体的形式施用以便调节靶标的表达和/或功能，但是一些实施方案涉及用于表达反义寡核苷酸的表达载体构建体(包括启动子、杂合体启动子基因序列)，并具备启动子活性或可诱导的启动子活性。
在实施方案中，以适当的核酸递送系统施用至少一种本公开的靶向试剂(例如反义寡核苷酸)。在一个实施方案中，该递送系统包括可操作地连接于多核苷酸的非病毒载体。在一个实施方案中，适当的递送系统包括病毒载体，通常序列来自以下的至少一种：腺病毒、腺病毒相关病毒、辅助病毒依赖型腺病毒、逆转录病毒或日本血凝病毒-脂质体复合体。作为一个示例，病毒载体包括可操作地连接于多核苷酸的强的真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子；另外优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。
本公开的药物组合物可方便地以单位剂型呈现。包括将活性成分与药物载体或赋形剂关联的步骤。通常，本公开的药物组合物可配制为任何适当的剂型，例如但不限于，注射剂、片剂、胶囊、凝胶等。本公开的药物组合物还可配制为在含水、不含水或混合介质中的悬浮剂。本公开的药物组合物包括但不限于溶液、乳液、泡沫剂和含脂质体制剂。本公开的药物组合物可包括一种或多种渗透促进剂、载体、赋形剂或其它无活性配料。
根据一些实施方案，提供一种治疗胰腺癌的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请的靶向试剂或药物组合物。
附图说明
图1显示了将人胰腺癌细胞接种到免疫缺陷小鼠胰腺原位，GSDME基因敲除可显著抑制胰腺原位中的肿瘤生长，重新表达GSDME后恢复原位成瘤能力。
图2显示了用胰腺裂解液处理胰腺肿瘤细胞，GSDME基因敲除细胞在胰腺裂解液中细胞活力显著降低，GSDME是抵抗消化酶损伤所必须的。
图3显示了敲除AsPC-1细胞中的GSDME可导致MUC1和MUC13表达下调。
图4显示了用胰蛋白酶/糜蛋白酶处理胰腺肿瘤细胞，粘蛋白的敲除或抑制导致肿瘤细胞对消化酶的抵抗性性降低。
图5显示了将MUC1敲除、MUC13敲除和MUC1/13敲除肿瘤细胞接种到小鼠胰腺，敲除MUC1或MUC13均可抑制肿瘤原位生长，双敲除可实现最大程度的肿瘤生长抑制。
图6A和图6B显示了胰腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织中GSDME或MUC13的表达水平，证明在人胰腺癌中GSDME和黏蛋白具有相同的保护作用。
具体实施方式
靶标
在本申请中，靶标是指本申请的治疗活性成分(靶向试剂)所针对的客体；其可以是核酸(基因、mRNA等)，也可以是蛋白(前体、同种型)；尤其是指GSDME通路的各成员。作为一个示例，本申请中的靶标是gasdermin E基因作为靶标基因。作为另一个示例，本申请中的靶标也可以是gasdermin E基因所表达的成熟蛋白作为靶标蛋白。
本文所用的术语"靶标核酸"涵盖DNA、从DNA转录的RNA(包括前体mRNA和mRNA)、还有从这种RNA衍生的cDNA、编码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。特异性地与靶标核酸杂交的化合物对靶标核酸功能的这一调节通常称为"反义"。待干扰的DNA功能包括，例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括，例如，RNA的剪接以产生一种或多种mRNA种类、RNA向蛋白翻译的易位、从RNA翻译为蛋白、以及可能由RNA参与或促进的催化活性。这种干扰靶标核酸功能的总效果是调节编码的产物或寡核苷酸的表达。
“GSDME通路”是指由包含成员GSDME、YBX-1(任选)、MUC1以及MUC13的作用通路。细胞内各种不同的生化反应通路都是由一系列不同的活性分子(核酸、蛋白或复合物)组成的，相互作用而执行特定的生理生化功能；通路中上游分子对下游分子的活性进行调节(包括激活或抑制，进而引发一些列生理活性的改变。在GSDME通路中，上游分子GSDME促进胰腺肿瘤细胞中下游分子MUC1和MUC13的表达，从而形成一个黏蛋白屏障，构成肿瘤细胞对蛋白酶消化作用的抵抗/耐受。
作为靶标的GSDME、MUC1、MUC13的核苷酸或氨基酸信息是本领域公知的，例如但不限于可以从文献或数据库中获取。
人GSDME包括但不限于NCBI ID登录号1687；OpenTargets
登录号ENSG 00000105928；Orphanet登录号90635；PharmGKB登录号PA27281；KEGG登录号hsa:1687；UCSC登录号uc003sxa.2[O60443-1]；UniProtKB登录号O60443。
人MUC1包括但不限于NCBI ID登录号4582；MEROPS登录号S71.001；HGNC登录号HGNC:7508；neXtProt登录号NX_P15941；VEuPathDB登录号HostDB:ENSG00000185499.16；Pharos登录号P15941；ChEMBLi登录号3580494；DrugBank登录号DB11090；BioMuta登录号MUC1；DMDM登录号296439295。
人MUC13包括但不限于NCBI ID登录号56667；UniProtKB登录号Q9H3R2；neXtProt登录号NX_Q9H3R2；VEuPathDB登录号HostDB:ENSG00000173702.7；jPOST登录号Q9H3R2；MassIVE登录号Q9H3R2；MaxQB登录号Q9H3R2；PaxDb登录号Q9H3R2；PeptideAtlas登录号Q9H3R2；PRIDE登录号Q9H3R2；ProteomicsDB登录号80744；Ensembl登录号ENST00000616727；UCSC登录号uc032sai.1；neXtProt登录号NX_Q9H3R2；PharmGKB登录号PA31312。
在本申请中，gasdermin E(GSDME)是指caspase 3裂解蛋白或其编码核酸，该术语涵盖GSDME天然变体的范畴。根据上下文的内容，可以清楚地理解GSDME是指代蛋白、还是其对应的核酸、还是二者兼有。根据目前的研究，gasdermin家族成员通过形成孔洞发挥介导炎症细胞死亡的关键作用。GSDME在人胰腺导管腺癌肿瘤细胞系(例如但不限于BxPC-3、AsPC-1和PANC-1)中强烈表达。
在本申请中，黏蛋白(MUC)是指是高分子量的糖蛋白，其广泛覆盖在管状器官(如气管、胃肠道等)的多种上皮细胞表面，以及肝脏、胰腺、胆囊和泪腺的上皮细胞表面。黏蛋白多样化的生物学功能在肿瘤形成、细胞粘附、免疫应答以及细胞信号传导中起着至关重要的作用。
本文所用的术语“mRNA”是指靶标基因的已知的mRNA转录物和/或任何进一步的转录物。
靶向试剂
在本申请中，靶向试剂是特异性靶向靶标(Gasdermin E、MUC1、或MUC13或其表达产物)的多核苷酸或抗体(或其抗原结合片段)。
"反义寡核苷酸"是指结合靶标RNA(或靶标DNA)的RNA(或DNA)分子。例如，如果是RNA寡核苷酸的情况下，其借助于RNA-RNA相互作用结合另一靶标RNA，并且改变靶标RNA的活性。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。这种分子包括，例如，反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、microRNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治疗性编辑RNA和激动剂与拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可选剪接体、引物、探针以及与靶核酸的至少一部分杂交的寡聚化合物。因此，这些分子可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式。
本申请所用的术语“特异性”、“选择性”是指靶向试剂与预定的靶标(如多核苷酸或蛋白)结合。
本文所用的术语"对…有特异性的寡核苷酸"或"靶向…的寡核苷酸"是指：
i)能够与靶标基因的一部分形成稳定复合体，或
ii)能够与靶标基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体的序列的寡核苷酸；复合体和双链体的稳定性可通过本领域公知的理论计算和/或体外测定来确定。用于确定杂交复合体和双链体的稳定性的方法也是本领域公知的。
RNA干扰(RNAi)由对其靶标核酸具有序列特异性的同源性的双链RNA(dsRNA)分子介导。在某些实施方案中，介导物是3025个核苷酸长的小干扰RNA双链体(siRNA)。siRNA来源于称为Dicer的RNA酶对dsRNA的加工。siRNA双链体产物被募集到称为RISC(RNA诱导沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中，RISC被引导至靶标核酸(例如mRNA)，在那里siRNA双链体以序列特异性方式相互作用来以催化方式介导裂解。
根据本申请可使用的小干扰RNA可根据本领域公知并且本领域普通技术人员熟悉的方案合成和使用。用于本申请方法的小干扰RNA适当地包括约1至约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施方案的示例中，siRNA可包括约5nt至约40nt、约5nt至约30nt、约10nt至约30nt、约15nt至约25nt或约20nt至25nt。
酶促RNA是指具有酶促活性的RNA分子。酶促核酸首先识别靶标RNA，然后经由碱基配对结合靶标RNA，结合到正确位置时，酶促地作用以切割靶标RNA。
本文所用的"杂交"是指寡聚化合物的互补链的大致配对。配对的一种机制包括寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键合。例如，腺嘌呤A和胸腺嘧啶T是经由氢键形成而配对的互补核苷酸。
当靶向试剂(例如反义寡核苷酸)与靶标核酸的结合干扰靶标核酸的正常功能以导致功能和/或活性的调节时，则认为该靶向试剂是“特异性杂交的”，且在期望特异性结合的条件下存在足够程度的互补性以避免靶向试剂与非靶标核酸序列的结合。
本文所用的"互补"是指一条或两条寡聚链上的两个核苷酸之间准确配对的能力。例如，如果在反义寡核苷酸某一位置的核碱基能够与在靶标核酸某一位置的核碱基氢键结合，所述靶标核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，则认为寡核苷酸与靶标核酸之间的氢键结合位置是互补位置。因此，"可特异性杂交"和"互补"是用来表示经足够数目的核苷酸足够程度的准确配对或互补性，从而在寡聚化合物和靶标核酸之间发生稳定和特异性结合的术语。
本领域技术人员应理解的是，寡聚化合物的序列不必与其靶标核酸的序列100％的互补。而且，寡核苷酸可经一个或多个区段杂交，从而其间的区段不牵涉在杂交事件中(例如，不产生环结构、错配或发夹结构)。作为一个示例，其中反义寡核苷酸的20个核苷酸中的18个与靶标区域互补从而将特异性杂交的反义寡核苷酸将表示90％互补性。在这一实例中，其余非互补核苷酸可成串或散布于互补核苷酸，不必彼此连续或与互补核苷酸连续。反义寡核苷酸与靶标核酸的区域的互补性百分比可常规地利用本领域已知的BLAST和Power BLAST程序来确定。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用Gap程序确定。
术语“全人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。
术语“人源化抗体”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将非人的CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将第一物种(如鼠源)抗体的可变区与另一物种(如人)抗体的恒定区融合而成的抗体。
术语“抗原结合片段”是指抗体片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。这样的抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合。
本领域技术人员在知晓靶标的序列信息后，可以根据已知的技术涉及靶向试剂。例如，根据gasdermin E在数据库或文献中的氨基酸序列，设计针对特定表位的特异性抗体。例如，根据gasdermin E在数据库或文献中的核苷酸序列，涉及和gasdermin E具有序列特异性的同源性的dsRNA分子，从而介导对gasdermin E的靶向敲除。
治疗方法
“治疗”意指给予受试者本申请的靶向试剂，如包含本申请的任一种抗体或其抗原结合片段的组合物，或者本申请的任一种干扰RNA。所述受试者具有一种或多种胰腺癌的症状。通常，在受治疗受试者或受试者群体中以有效缓解一种或多种胰腺癌症状的量施用靶向试剂。
有效缓解任何胰腺癌症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价胰腺癌的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价胰腺癌是否已被减轻。
胰腺癌
适用于本申请方法进行治疗的适应症是胰腺癌，参照本领域公知的临床指南确定其定义。胰腺癌的分类按照WHO 2020版进行(表1)。适用于本申请方法进行治疗的适应症尤其是导管腺癌。
表1. 2020年版WHO胰腺肿瘤组织学分类
实施例
测试材料
1.下述实施例中使用的各种细胞系、药物及实验动物：
ASPC-1和BxPC-3人胰腺癌细胞系购自中国典型物保藏中心CCTCC；
胰蛋白酶溶液购自Solarbio公司；
GSDME、MUC1、MUC13抗体购自Abcam公司；
6-8周龄雌性NOD-SCID小鼠购自中国医学科学院协和医学院实验动物中心。
2.患者样本来源：
人胰腺胆管腺癌组织病理学切片均取自北京协和医院外科。伦理许可由北京协和医院临床试验伦理委员会批准。所有患者都提供了参与研究的书面知情同意书。
实施例1.GSDME基因敲除可显著抑制胰腺原位中的肿瘤生长
1.实验步骤
雌性NOD-SCID小鼠(6-8周)原位注射未敲除的、GSDME敲除、GSDME敲除再表达GSDME的BxPC-3细胞(2.5×105个/鼠)。于第40天处死小鼠，称量胰腺肿瘤重量，记录小鼠存活时间。
①为了构建BxPC-3细胞的GSDME基因的稳定敲除细胞株，使用了靶向GSDME的SGRNA序列(其它GSDME的特异性片段均可)。
②SGRNA被克隆到pL-CRISPR.EFS.GFP载体质粒中，并与包装质粒psPAX2和pMD2.G转染入HEK 293T细胞。
③48小时后，收获慢病毒并浓缩。将慢病毒以及终浓度为8μg/ml的polybrene一起加入BxPC-3细胞中，实现慢病毒的感染。两天后，使用细胞流式分选仪将GFP阳性细胞分选出来，铺96孔板，保证一个孔里有且仅有一个细胞，将单个细胞长出的克隆扩大培养。通过Western blot方法验证候选敲除细胞，有敲除效果的单个细胞长成的细胞株即为敲除细胞株。
2.实验结果
未敲除的BXBC-3细胞可在小鼠胰腺原位形成肿瘤，GSDME基因敲除可显著抑制胰腺原位中的肿瘤生长，重新表达GSDME后恢复原位成瘤能力(图1)。
实施例2.GSDME在抵抗消化酶消化中的作用
1.实验步骤
将未敲除的和GSDME敲除的ASPC-1细胞分为两组，其中一组分别用20μl/ml的小鼠胰腺裂解液处理72小时，另一组用PBS作为对照。用台盼蓝(TB)染色检测细胞活性，细胞与0.4％台盼蓝染料混合，因为死亡细胞可以被染成蓝色，所以活细胞和死亡细胞可以在3min内计数。细胞活性是通过活细胞数与细胞总数的比率来计算。
2.实验结果
GSDME基因敲除细胞在胰腺裂解液中细胞活性显著降低(图2)。
实施例3.敲除AsPC-1细胞中的GSDME可导致MUC1和MUC13表达下调
1.实验步骤：
未敲除的和GSDME敲除的AsPC-1细胞分为两组，其中一组用胰蛋白酶/糜蛋白酶处理48h，另一组用PBS作为对照。收集细胞，在裂解缓冲液中裂解，超声处理。蛋白质浓度由BCA试剂盒测定。然后，在SDS-PAGE凝胶上运行该蛋白，并将其转移到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用5％牛血清白蛋白封闭，并用抗体检测过夜，检测MUC1和MUC13的表达。
2.实验结果：
PBS组敲除AsPC-1细胞中的GSDME可导致MUC1和MUC13表达下调。用胰蛋白酶/糜蛋白酶处理后，未经敲除的细胞的MUC1和MUC13表达略高于PBS组，GSDME敲除后，MUC1和MUC13同样表达下调。
实施例4.粘蛋白的敲除导致肿瘤细胞对消化酶的抵抗性性降低
1.实验步骤：
将未经敲除的ASPC-1细胞、MUC1敲除、MUC13敲除以及MUC1/MUC13共敲除的ASPC-1细胞用胰蛋白酶/糜蛋白酶处理72小时，另一组用PBS作为对照。台盼蓝(TB)染色检测细胞活性，细胞与0.4％台盼蓝染料混合，死细胞可以被染成蓝色。细胞活性为活细胞数与细胞总数的比率。
2.实验结果：
MUC1或MUC13的敲除导致肿瘤细胞对消化酶的抵抗降低，MUC1/MUC13敲除的ASPC-1细胞经消化酶处理后活性最低(图4)。
实施例5.黏蛋白基因敲除可显著抑制胰腺原位中的肿瘤生长
1.实验步骤
未经敲除的ASPC-1细胞、MUC1敲除、MUC13敲除以及MUC1/MUC13共敲除的ASPC-1细胞原位注射(2.5×105个/鼠)雌性NOD-SCID小鼠(6-8周)。于第40天处死小鼠，称量胰腺肿瘤重量，记录小鼠存活时间。
2.实验结果
未经敲除的ASPC-1细胞可在小鼠胰腺原位形成肿瘤，敲除MUC1或MUC13均可抑制肿瘤原位生长，双敲除可实现最大程度的肿瘤生长抑制(图5)。
实施例6.人胰腺癌中GSDME和黏蛋白均表达高于正常组织
1.实验步骤
于北京协和医院外科取得人胰腺癌组织，取胰腺肿瘤组织石蜡包埋切片，免疫组织化学染色。采用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒按生产说明进行免疫组织化学染色。石蜡包埋组织切片用抗MUC13、抗GSDME。然后，将载玻片与HRP偶联二抗在室温下连续孵育1小时。染色的切片利用显微镜进行扫描。
2.实验结果
与邻近组织相比，肿瘤组织中的GSDME水平要高得多。此外，在肿瘤细胞中观察到GSDME在细胞核中的显性定位，而在邻近的正常细胞中未观察到GSDME(图6A)。与GSDME上调一致，MUC13在肿瘤组织中的表达也上调，但在邻近组织中不表达(图6B)。更重要的是，GSDME或MUC1水平与患者生存呈负相关。
综上，本申请的方案具有以下效果：
1)本申请的GSDME介导的黏蛋白表达上调合理地解释了胰腺肿瘤细胞抵抗胰液消化的内在机制，阐明了胰腺肿瘤原位生长的原理，有很好的临床应用前景。
2)胰腺肿瘤细胞在面对消化酶损伤时，使用gasdermin E来介导其对消化酶的抵抗。GSDME可以促进胰腺肿瘤细胞中黏液蛋白1和13的表达，从而形成一个屏障，阻止蛋白酶的消化作用。针对GSDME和MUC1、MUC13可进行靶向抑制，打破肿瘤细胞对消化酶的抵抗作用，破坏胰腺肿瘤的原位生长。
3)本申请的GSDME及其下游通路开拓了治疗胰腺癌的新策略，一种是靶向GSDME-粘蛋白途径，破坏肿瘤细胞对酶消化的抵抗；另一种是激发GSDME的成孔活性，触发肿瘤细胞趋化激活抗肿瘤免疫反应。
Claims (20)
1. 靶向Gasdermin E的试剂在制备治疗胰腺癌的药物中的用途，其中：
所述靶向Gasdermin E的试剂在核酸水平抑制、失活、或敲除Gasdermin E；
所述试剂选自以下的任一项：反义寡核苷酸、siRNA、dsRNA、microRNA、酶促RNA、shRNA。
2.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
3.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是浆液性囊腺瘤。
4.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是胰腺上皮内瘤变。
5.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是导管内乳头状黏液性胰腺肿瘤。
6.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是导管内嗜酸性乳头状胰腺肿瘤。
7.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是导管内管状乳头状胰腺肿瘤。
8.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是黏液性囊性胰腺肿瘤。
9.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是胰腺腺泡细胞癌。
10.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是胰母细胞瘤。
11.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是胰腺实性-假乳头状肿瘤。
12.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是胰腺神经内分泌微腺瘤。
13.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是胰腺神经内分泌肿瘤。
14.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是非功能型胰腺神经内分泌肿瘤。
15.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是功能型胰腺神经内分泌肿瘤。
16.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是胰腺神经内分泌癌。
17.根据权利要求1所述的用途，所述胰腺癌是混合性神经-非神经内分泌胰腺肿瘤。
18.根据权利要求1所述的用途，所述siRNA是esiRNA。
19.根据权利要求1所述的用途，其中：
所述Gasdermin E是NCBI ID登录号1687所示。
20.根据权利要求1所述的用途，所述治疗胰腺癌是指以下任一项或组合：降低消化酶抵抗、抑制胰腺癌细胞的原位生长、抑制胰腺癌细胞的增殖、或降低胰腺癌的转移。
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