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CN105727311A - Rnase4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用 - Google Patents

Rnase4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用 Download PDF

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CN105727311A
CN105727311A CN201610084270.4A CN201610084270A CN105727311A CN 105727311 A CN105727311 A CN 105727311A CN 201610084270 A CN201610084270 A CN 201610084270A CN 105727311 A CN105727311 A CN 105727311A
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胡国富
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陈光弟
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一个新的脑胶质瘤治疗靶点，具体而言，涉及将核糖核酸酶4蛋白作为脑胶质瘤治疗靶点，还涉及核糖核酸酶4的siRNA、shRNA和中和性抗体，包括使用该siRNA、shRNA和中和性抗体制备的药物作为靶向抑制脑胶质瘤生长的应用。本发明公开了RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用，所述RNASE4为核糖核酸酶4蛋白，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

Description

RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一个新的脑胶质瘤治疗靶点，具体而言，涉及将核糖核酸酶4蛋白作为脑胶质瘤治疗靶点，还涉及核糖核酸酶4的siRNA、shRNA和中和性抗体，包括使用该siRNA、shRNA和中和性抗体制备的药物作为靶向抑制脑胶质瘤生长的应用。
背景技术
脑胶质瘤泛指各种神经上皮来源的肿瘤，是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，约占全部颅内肿瘤的35％～60％。术语“脑胶质瘤”涵盖了一类脑部肿瘤，包括星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤。胶质瘤均呈恶性浸润性生长，即使外科手术也难以做到病理学的全切除，因而胶质瘤术后复发率非常高，是青年和成年人肿瘤死亡的第二大病因。由于颅内病变位置的特殊性，术后生存者多并发神经功能性障碍、生活质量低下等。因此，如何提高胶质瘤患者的治愈率和生存率是当前胶质瘤基础研究和临床实践中迫切需要解决的问题。
目前认为，诱发脑胶质瘤发生和发展的因素多样，且具有不确定性。迄今已发现诸如病毒感染、遗传因素以及癌基因和抑癌基因异常与胶质瘤关系密切。p53、p16Ink4a、PTEN和EGFR等基因突变会影响细胞信号转导和细胞周期等生物学过程，最终导致脑胶质瘤的产生和恶化。脑胶质细胞内RNA生物代谢的紊乱也可能导致其癌变，如非编码RNA异常调控(包括上调、下调和突变)、mRNA发生可变剪接、RNA表观遗传学修饰等都与胶质瘤的发生和发展密切相关。然而，脑胶质瘤发生和发展中引起RNA的生物代谢紊乱的分子机制仍不清楚，寻找和发现导致脑胶质瘤组织内RNA生物代谢的关键信号通路及调控因子，将为治疗脑胶质瘤提供新的靶点。
核糖核酸酶4(Ribonuclease-4，RNASE4，以下用“RNASE4”简写代表“核糖核酸酶4”)是人核糖核酸酶家族第四个成员。
成熟的RNASE4是一个由119个氨基酸残基组成的分泌型单链碱性蛋白质，相对分子量约为13.8kDa。RNASE4作为核糖核酸酶A超家族的成员，主要通过水解底物RNA参与各种生物学过程。与家族其它成员相同，RNASE4专一性水解RNA链上的嘧啶核苷酸3'端的5'-磷酯键，进而产生寡核苷酸或核苷酸。RNASE4保留了该家族共有的结构特性，包括三个酶催化位点(His-12，Lys-40和His-116)、保守序列CKXXNTF(XX为任意氨基酸)和由8个半胱氨酸残基形成的分子内二硫键(Cys25-Cys81,Cys39-Cys92,Cys57-Cys107和Cys64-Cys71)。然而，RNASE4又具自身的结构特征。与牛胰核糖核酸酶A(RNaseA)结构相比较，该酶的C端缺少了核糖核酸酶活性位点Ser-123，并且核酸催化结合结构域中的一些氨基酸残基也被相应的替换，例如RNaseA上Pro-42、Val-43和Lys-104分别被RNASE4上Arg-41、Phe-42和Arg-101替换。以上独特的结构导致RNASE4有别于其它核糖核酸内切酶，即更偏好于水解尿嘧啶核苷酸而非胞嘧啶核苷酸。此外，RNASE4是整个核糖核酸酶A超家族中进化最为保守的成员。RNASE4的一级序列在脊椎动物中的相似度高达90％，远高于家族其它成员。RNASE4这种高度的物种间保守性和独有的尿嘧啶核苷酸酶切偏好性，提示该酶可能通过其独特的核糖核酸酶活性执行一些基本的生物学功能。然而，RNASE4是否能够作为上述脑胶质瘤治疗靶点及作用机制仍未知。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用，所述RNASE4为核糖核酸酶4蛋白，其具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。
作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的改进：通过靶向抑制核糖核酸酶4的表达或者活性，从而实现靶向抑制脑胶质瘤生长。
作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进：所述靶向抑制核糖核酸酶4表达的方法为：通过慢病毒介导shRNA或者转染试剂介导siRNA的转染，将上述shRNA或者siRNA转入胶质瘤细胞，沉默胶质瘤细胞内核糖核酸酶4蛋白的表达。
作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进：所述siRNA/shRNA的核苷酸序列为以下任一：SEQIDNO：2，SEQIDNO：3、SEQIDNO：4。
作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进：所述siRNA/shRNA的核苷酸序列还包括位于核糖核酸酶4上的已知序列的互补序列。
作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进：利用核糖核酸酶4蛋白的中和性抗体抑制核糖核酸酶4蛋白的活性和作用。
作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进：所述中和性抗体为核糖核酸酶4特异性的兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体，以及对上述中和性抗体的序列进行的人源化替代后得到的抗体序列。
作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进：所述利用核糖核酸酶4的中和性抗体抑制胶质瘤中核糖核酸酶4蛋白活性的方法为：通过将上述中和性抗体直接作用于胶质瘤细胞体外培养体系，体内静脉注射给药(约10mg/kg/2day)，或者局部给药(约2mg/kg/3day)的方法抑制胶质瘤中核糖核酸酶4的作用。
本发明4个序列的特征如下：
SEQIDNO：1的序列特征：
长度：147个氨基酸；类型：氨基酸；链型：单链；拓扑结构：线型；特性：全长的RNASE4蛋白包含147个氨基酸，其中编码序列的1-28位为信号肽序列，成熟的肽的分子量为13.8kDa，等电点为10.3；来源：人类。
SEQIDNO：2的序列特征：
长度：21个核苷酸；类型：核苷酸；链型：单链；拓扑结构：线型；特性：siRNA/shRNA靶向RNASE4的mRNA作用序列；来源：人类RNASE4基因。
SEQIDNO：3的序列特征：
长度：21个核苷酸；类型：核苷酸；链型：单链；拓扑结构：线型；特性：siRNA/shRNA靶向RNASE4的mRNA作用序列；来源：人类RNASE4基因。
SEQIDNO：4的序列特征：
长度：21个核苷酸；类型：核苷酸；链型：单链；拓扑结构：线型；特性：siRNA/shRNA靶向RNASE4的mRNA作用序列；来源：人类RNASE4基因。
本发明的方案具体如下：
本发明提供了一个新的脑胶质瘤治疗靶点——核糖核酸酶4(蛋白序列如SEQIDNO.1所示)。具体而言，RNASE4基因在脑胶质母细胞瘤中呈显著性高表达(如图1所示)。进一步，免疫组织化学分析了430例临床上不同恶化程度脑胶质瘤患者的肿瘤组织中RNASE4蛋白的表达水平，Kaplan-Meier存活曲线和Log-Rank检验显示，RNASE4蛋白在恶性脑胶质瘤(包括III和IV级胶质瘤)中显著性高表达，并且其表达水平和脑胶质瘤患者5年总生存率呈负相关(如图2所示)。
本发明提供了一种抑制RNASE4基因表达水平的方法，利用转染试剂介导siRNA/shRNA方法、或者慢病毒介导shRNA感染方法，抑制RNASE4基因的表达水平。其中，术语“siRNA”是指短干扰RNA(ShortInterferingRNA，简称“siRNA”)，是长度20到25个核苷酸的双链RNA，能够专一性的方式抑制基因的表达。术语“shRNA”是指小发夹结构RNA(ShortHairpinRNA，简称“shRNA”)是一种短发夹结构的RNA序列，可以经由质粒表达而来，并干扰靶基因表达。上述特异性靶向RNASE4基因的siRNA/shRNA是根据其mRNA不同靶点进行设计，可以有多个不同的siRNA/shRNA序列。例如序列SEQIDNO.2；SEQIDNO.3；SEQIDNO.4所示为靶向RNASE4的mRNA的三条不同siRNA/shRNA作用序列。然而，本发明所涉及的RNASE4基因siRNA/shRNA不局限于上述三条序列，还包括所有位于RNASE4的mRNA序列其它互补序列。
本发明提供了一种利用RNASE4的中和性抗体抑制RNASE4蛋白的作用。上述的中和性抗体直接作用于脑胶质瘤细胞体外培养体系中或者小鼠体内静脉注射给药，抑制RNASE4蛋白的作用，并抑制脑胶质瘤细胞的生长。上述的中和性抗体主要包括RNASE4特异性的兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体，以及对于上述鼠单克隆抗体的序列进行的人源化替代后得到的抗体序列。
本发明提供的靶向抑制脑胶质瘤生长的方法，该方法为靶向抑制核糖核酸酶4蛋白(RNASE4)表达或者活性。
本发明具有如下有益效果：
与现有技术相比，本发明应用RNASE4的siRNA、shRNA和中和性抗体来抑制脑胶质瘤细胞生长的方法使得靶向RNASE4蛋白治疗具有普遍应用价值，使得所有的胶质瘤患者临床获益，本发明将RNASE4的siRNA、shRNA和中和性抗体用于制备抑制胶质瘤细胞生长的药物，克服了化疗对胶质瘤的非选择性，达到靶向治疗胶质瘤、改善患者预后的目的，弥补了手术、放化疗等局部治疗手段的不足，可以对微转移灶发挥作用；可以克服化疗对机体的毒副作用，扩大靶向治疗的范围。
综上所述，本发明公开一个新的脑胶质瘤治疗药物靶点。通过临床脑胶质瘤组织表达数据分析说明RNASE4在恶性脑胶质瘤组织中高表达，并与胶质瘤恶性程度呈正相关，进一步，体内外实验结果显示，RNASE4是胶质瘤细胞增殖和裸鼠皮下移植瘤生长所必须的，最后，RNASE4的siRNA、shRNA和中和性抗体能够显著抑制胶质瘤的生长，具有良好的治疗用途。本发明克服了化疗对脑胶质瘤的非选择性，达到靶向治疗胶质瘤、改善患者预后的目的，弥补了手术、放化疗等局部治疗手段的不足，可以对微转移灶发挥作用；可以克服化疗对机体的毒副作用，扩大靶向治疗的范围。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是RNASE4基因在脑恶性胶质瘤中呈显著性高表达且与患者生存时间呈负相关图；
A图代表RNASE4基因相比正常大脑，在脑恶性胶质瘤中呈显著高表达；
B图代表RNASE4基因表达水平与脑恶性胶质瘤患者生存时间呈负相关。
图2是RNASE4蛋白在恶性胶质瘤组织中高表达图；
A图代表RNASE4蛋白在不同恶性程度胶质瘤组织中免疫组织化学染色结果代表性图片，其中在低等级(I级和II级)胶质瘤组织中染色较弱，在高等级(III级和IV级)胶质瘤中染色较强；
B图代表上述图A的统计结果，显示RNASE4蛋白表达量随胶质瘤恶化程度增加而升高；
C图代表RNASE4蛋白表达水平和胶质瘤患者5年总生存率程负相关。
图3是siRNA抑制RNASE4表达的效率图；
A图代表RNASE4基因表达水平，实时荧光定量PCR方法检测细胞内RNASE4的mRNA水平，相比对照组(ControlsiRNA)，三条siRNA(RNASE4siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3)显著抑制RNASE4基因的表达至对照组的30％左右；
B图代表RNASE4蛋白水平，免疫印迹法检测细胞内RNASE4蛋白的水平，相比对照组(ControlsiRNA)，三条siRNA(RNASE4siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3)显著抑制RNASE4蛋白水平。
图4是shRNA抑制RNASE4表达的效率图；
A图代表RNASE4基因表达水平，实时荧光定量PCR方法检测细胞内RNASE4的mRNA水平，相比对照组(ControlshRNA)，三条shRNA(RNASE4shRNA-1，shRNA-2和shRNA-3)显著抑制RNASE4基因的表达至对照组的30％左右；
B图代表RNASE4蛋白水平，免疫印迹法检测细胞内RNASE4蛋白的水平，相比对照组(ControlshRNA)，三条shRNA(RNASE4shRNA-1，shRNA-2和shRNA-3)显著抑制RNASE4蛋白水平。
图5是RNASE4的siRNA抑制胶质瘤细胞U87NG的生长图。
图6是RNASE4的shRNA抑制胶质瘤细胞U87MG的生长图。
图7是RNASE4的shRNA抑制胶质瘤细胞U87MG克隆形成图；
A图代表RNASE4的shRNA对胶质瘤细胞克隆形成能力的影响，相比对照组(controlshRNA)，三条shRNA处理组(RNASE4shRNA-1，shRNA-2和shRNA-3)显著抑制克隆的数量和大小；
B图代表上述A图中细胞克隆数量的统计结果；
C图代表上述A图中细胞克隆大小的统计结果。
图8是靶向RNASE4基因的shRNA抑制裸鼠移植瘤的生长图；
A图代表裸鼠移植瘤不同天数的生长大小统计图；
B图代表最后裸鼠移植瘤解剖后肿瘤的大小图片。
图9是靶向RNASE4基因的shRNA抑制裸鼠移植瘤的生长和血管新生图。
图10是RNASE4中和性抗体抑制胶质瘤细胞的增殖实验图。
图11是核糖核酸酶家族成员对脑胶质瘤细胞增殖的影响图。
具体实施方式
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的RNASE4作为脑胶质瘤治疗靶点以及其siRNA、shRNA和中和性抗体治疗脑胶质瘤进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
实施例1、人脑胶质瘤组织中RNASE4蛋白的表达情况
为了研究RNASE4基因在脑胶质瘤组织中的表达情况，收集了430例临床上不同恶性程度的脑胶质瘤患者的组织，做了一系列的相关实验。首先，用常规的免疫组化的方法分析了脑胶质瘤中RNASE4蛋白的表达情况，结果如图2所示。
由苏木素将细胞核染成蓝色，显示细胞数量分布。组织中由DAB(二氨基联苯胺)显色的棕黄色部分(即为图中的深黑色显示部分)代表RNASE4蛋白的表达。
结果显示，染色阳性组织细胞排列无序，紧密疏松程度不一致，细胞核形状大小不一，是过度增长的肿瘤组织细胞，其细胞核的棕黄色染色也非常丰富，特别是在恶化程度高的胶质瘤组织血管周围(A图IV级箭头指示部分)，RNASE4的表达更为丰富。通过对上述染色图片进行统计分析，能发现随着胶质瘤恶性程度的增加，RNASE4蛋白的表达水平也显著升高，即图2的B所示。
上述染色结果显示脑胶质瘤中RNASE4蛋白表达异常丰富，通过构建Kaplan-Meier存活曲线和并利用Log-Rank检验方法评价RNASE4蛋白表达与胶质瘤患者预后的相关性。结果显示，RNASE4蛋白在恶性胶质瘤(包括III和IV级胶质瘤)中显著性高表达，并且其表达水平和胶质瘤患者5年总生存率呈负相关，结果如图2所示。
实施例2、靶向RNASE4基因的siRNA或shRNA能够抑制胶质瘤细胞的生长
将上所述靶向RNASE4基因的siRNA或shRNA导入胶质瘤细胞U87MG，沉默RNASE4基因的表达，从而抑制胶质瘤细胞生长的作用。转染过程既可以使用siRNA脂质体介导，也可以使用含有shRNA的慢病毒介导。
其中脂质体转染步骤如下：接种0.3x106个胶质瘤细胞U87MG至35mm细胞培养皿，每皿加入2ml的DMEM细胞培养液，置于培养箱中培养(培养条件为：5％CO2；温度为37度)，过夜，细胞贴壁后，待细胞贴壁率达到60％以上时，制备转染试剂(2000转染试剂，购自于美国Life公司，货号为11668027)与siRNA(委托上海吉玛生物技术工程公司合成，其中RNASE4siRNA-1序列为SEQIDNO：2，RNASE4siRNA-2序列为SEQIDNO：3，以及RNASE4siRNA-3序列为SEQIDNO：4)的转染混合物，所述转染混合物为5μL脂质体混合5μL2μM的siRNA，继续培养(培养条件为：5％CO2；温度为37度)36-72小时，通过实时荧光定量PCR和免疫印迹技术检测其转染效率，所示图3结果即对RNASE4的mRNA和蛋白的敲除效率，实时荧光定量PCR结果显示三条siRNA处理组中RNASE4的mRNA表达水平大约只有对照组的30％左右，而免疫印迹结果显示三条siRNA处理组中RNASE4蛋白水平显著下调(图中RNASE4条带的明暗代表其蛋白含量的高低)。
其中，含shRNA的慢病毒介导的方法如下：接种0.3x106个胶质瘤细胞U87MG至35mm细胞培养皿，每皿加入2ml的DMEM细胞培养液，置于5％CO2培养箱中培养(培养条件为：5％CO2；温度为37度)，过夜，细胞贴壁后，待细胞贴壁率达到60％以上时，加入包含5μLshRNA的慢病毒感染细胞(慢病毒提取自表达慢病毒载体的293T/17细胞株培养液)，其中RNASE4shRNA-1序列对应为SEQIDNO：2，RNASE4shRNA-2序列对应为SEQIDNO：3，以及RNASE4shRNA-3序列对应为SEQIDNO：4。继续感染24小时后，利用1ug/ml的Puromycin药物对感染的U87MG阳性细胞进行筛选(选用满足48小时细胞仍然存活条件的)，从而获得了稳定表达shRNA的细胞株，最后，通过实时荧光定量PCR和免疫印迹技术检测其转染效率，所示图4结果即对RNASE4的mRNA和蛋白的敲除效率，实时荧光定量PCR结果显示三条shRNA处理组中RNASE4的mRNA表达水平大约只有对照组的30％左右，而免疫印迹结果显示三条shRNA处理组中RNASE4蛋白水平显著下调(图中RNASE4条带的明暗代表其蛋白含量的高低)。
进一步，通过细胞计数方法检测上述siRNA和shRNA对胶质瘤细胞生长的影响(如图5和图6所示)。结果显示，RNASE4基因经siRNA和shRNA沉默后(其中RNASE4shRNA-1/siRNA-1、RNASE4shRNA-2/siRNA-2和RNASE4shRNA-3/siRNA-3的序列分别对应为SEQIDNO：2、SEQIDNO：3和SEQIDNO：4)，可显著地抑制胶质瘤细胞U87MG增殖活性达到50％(第四天处理组细胞数量/第四天对照组的细胞数量x100％)，而外源重组的RNASE4蛋白可以拯救该抑制效应。同时，通过体外软琼脂克隆形成实验检测上述shRNA对胶质瘤细胞克隆形成能力的影响(如图7所示)。其具体方法如下：首先，制备底层琼脂，完全溶化的5％琼脂和37℃左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在40℃均匀混合，加入培养皿(直径60mm)中，每皿含0.5％琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。然后，制备上层琼脂，取37℃不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中，加入40℃、5％琼脂等体积混匀，即成0.25％半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。最后，37℃、5％CO2静置培养2-3周，显微镜下观察克隆形成的大小以及整个培养皿中形成克隆数量。结果显示，RNASE4基因经shRNA沉默后，可显著地抑制胶质瘤细胞的克隆形成能力。
实施例3：靶向RNASE4基因的shRNA抑制裸鼠移植瘤的生长
采用RNASE4基因shRNA稳定表达细胞株，确定基因沉默的效率。之后，我们将18只5周大的雄性裸鼠随机分成三组，皮下注射胶质瘤U87MG稳定感染细胞株(ControlshRNA细胞株、RNase-4shRNA-1细胞株和RNase-4shRNA-2，这三株细胞株来自于上述感染了慢病毒的细胞分离而来)，每只小鼠注射5x106细胞/200μL。ControlshRNA细胞株注射前后的细胞活力分别为97.02％和96.53％，RNASE4shRNA-1细胞株注射前后的细胞活力分别为98.35％和97.69％，RNASE4shRNA-2细胞株注射前后的细胞活力分别为96.15％和93.29％，因此，皮下注射过程并未对细胞活力产生影响。裸鼠皮下肿瘤形成之后，每隔一天测量肿瘤的大小，以明确肿瘤的生长情况。结果显示，RNASE4基因沉默组与对照组相比，其生长速度显著降低。在第30天对所有移植瘤裸鼠进行解剖，剥离的肿瘤组织如图8所示，ControlshRNA的移植瘤显著大于RNASE4shRNA-1组和RNASE4shRNA-2移植瘤的大小。
接下来，对分离的移植瘤进行固定、石蜡包埋和切片，通过免疫组化分别检测了移植瘤中RNASE蛋白水平、细胞增殖标记蛋白Ki-67的表达量以及内皮细胞特异性蛋白vWF的表达水平(如图9所示)。结果显示，对照组移植瘤组织中有近一半的细胞为Ki-67阳性(47±1％)，说明这一半的细胞处于增殖状态，而RNASE4基因沉默移植瘤中Ki-67阳性率仅为9.6±1％，差异具有显著性。同时，对每张切片中血管内皮细胞进行了统计，发现在RNASE4基因沉默移植瘤中肿瘤血管内皮细胞的密度显著下降(从53±6降低到23±7)(如图9所示)。因此，RNASE4基因沉默不仅可以减慢肿瘤细胞的增殖，同时也可以抑制肿瘤血管新生。
实施例4：RNASE4中和性抗体抑制胶质瘤细胞的增殖实验
为检测RNASE4中和性抗体对胶质瘤生长的影响，具体实施如下：接种0.3x106个胶质瘤细胞U87MG至35mm细胞培养皿，每皿加入2ml的DMEM细胞培养液，置于5％CO2培养箱中培养，过夜，细胞贴壁后，待细胞贴壁率达到60％以上时，加入不同浓度的RNASE4中和性抗体(其中，NormalIg为常规的正常对照抗体；Antibody为特异性的RNASE4抗体)，继续培养，细胞计数。结果显示，随着RNASE4中和性抗体浓度的上升，肿瘤细胞的增殖显著性地受到抑制(如图10所示)。
对比例：
目前现有的RNASE4同家族的成员包括其自身一共有8个，具体如表1：
表1
代号 核糖核酸酶的名称 siRNA货号
RNASE1 核糖核酸酶-1 sc-39300
RNASE2 核糖核酸酶-2 sc-92235
RNASE3 核糖核酸酶-3 sc-92235
RNASE5 核糖核酸酶-5/血管生成素 sc-39291
RNASE6 核糖核酸酶-6 sc-92276
RNASE7 核糖核酸酶-7 sc-92112
RNASE8 核糖核酸酶-8 sc-92151
将上述核糖核酸酶如同上述实施例2所描述方法进行实验，所的结果图11所示，结果显示，只有RNASE4的siRNA抑制胶质瘤细胞U87MG的生长，其它家族成员的siRNA(购自美国StantaCruz公司，具体货号见表1，并进行敲除效率的验证)对胶质瘤细胞U87MG的生长无影响。我们得到结论，上述核糖核酸酶并不能作为脑胶质瘤治疗靶点。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用，所述RNASE4为核糖核酸酶4蛋白，其具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用，其特征是：通过靶向抑制核糖核酸酶4的表达或者活性，从而实现靶向抑制脑胶质瘤生长。
3.根据权利要求2所述的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用，其特征是：所述靶向抑制核糖核酸酶4表达的方法为：通过慢病毒介导shRNA或者转染试剂介导siRNA的转染，将上述shRNA或者siRNA转入胶质瘤细胞，沉默胶质瘤细胞内核糖核酸酶4蛋白的表达。
4.根据权利要求3所述的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用，其特征是：所述siRNA/shRNA的核苷酸序列为以下任一：SEQIDNO：2，SEQIDNO：3、SEQIDNO：4。
5.根据权利要求4所述的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用，其特征是：所述siRNA/shRNA的核苷酸序列还包括位于核糖核酸酶4上的已知序列的互补序列。
6.根据权利要求1～5任一所述的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用，其特征是：利用核糖核酸酶4蛋白的中和性抗体抑制核糖核酸酶4蛋白的活性和作用。
7.根据权利要求6所述的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用，其特征是：所述中和性抗体为核糖核酸酶4特异性的兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体，以及对上述中和性抗体的序列进行的人源化替代后得到的抗体序列。
8.根据权利要求7所述的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用，其特征是：所述利用核糖核酸酶4的中和性抗体抑制胶质瘤中核糖核酸酶4蛋白活性的方法为：通过将上述中和性抗体直接作用于胶质瘤细胞体外培养体系，体内静脉注射给药，或者局部给药的方法抑制胶质瘤中核糖核酸酶4的作用。
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