CN115212301A - 用以癌症治疗的天花疫苗 - Google Patents

Abstract

本文公开了涉及癌症治疗的方法和组合物。更具体地，本文公开的方法和组合物涉及天花病毒疫苗在诱导有效抗肿瘤免疫应答中的用途。

Description

用以癌症治疗的天花疫苗

本申请是申请日为2016年8月11日，申请号为201680058874.X，题目为“用以癌症治疗的天花疫苗”的专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求以下美国临时申请专利的权益与优先权：于2015年8月11日提交的美国临时申请No.62/203,835，于2015年9月9日提交的美国临时申请No.62/216,292，和于2016年4月1日提交的美国临时申请No.62/317,226，其每项专利的所有内容均在此并入引用。

背景技术

癌症是美国第二最常见的死因，仅次于心脏病。在美国，每4人死亡就有1人是因为癌症。1996-2003年间确诊的所有癌症患者的5年相对存活率为66％，高于1975-1977年间的50％(《癌症事实与数据》，美国癌症协会：亚特兰大，乔治亚州(2008))。发现高效的癌症治疗方法是癌症研究的主要目标。

发明内容

在此所公开的，是治疗对象所患的实体瘤或恶性血液病的方法和组合物。

在一些实施方案中，在此公开的是一种用于治疗对象的增殖性疾病(例如，实体瘤或恶性血液病)的方法，其包括向对象施用天花疫苗。在一些实施方案中，天花疫苗是具有复制能力的病毒。在一些实施方案中，天花疫苗不包含异源核酸。在一些实施方案中，通过瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内或眼内注射施用天花疫苗。在一些实施方案中，天花疫苗是痘苗病毒的减毒New York City Board of Health(NYCBOH)株。在一些实施方案中，该痘苗病毒的NYCBOH株可以是ATCC VR-118或CJ-MVB-SPX。在一些实施方案中，天花疫苗选自Dryvax、ACAM100、ACAM2000、Lister、EM63、LIVP、Tian Tan、Copenhagen、WesternReserve或Modified Vaccinia Ankara(MVA)。在一些实施方案中，实体瘤选自：胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是儿科患者。在一些实施方案中，增殖性疾病是一种儿童期或儿科肿瘤或癌症。

在一些实施方案中，本文公开了用于治疗对象的实体瘤或恶性血液病的方法，其包括向对象同时施用天花疫苗与干细胞。在一些实施方案中，干细胞是自体干细胞。在一些实施方案中，干细胞选自由以下组成的组中：成体干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cell)、专能干细胞(multipotent stem cell)、寡能干细胞、单能干细胞、脂肪基质细胞、内皮干细胞、诱导多能干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、成体外周血干细胞、成肌细胞干细胞、小幼稚干细胞、皮肤成纤维细胞干细胞，及其组合。在一些实施方案中，干细胞是脂肪基质细胞。

在一些实施方案中，干细胞是经修饰的干细胞。在一些实施方案中，经修饰的干细胞是成体干细胞。在一些实施方案中，经修饰的干细胞采用慢病毒或逆转录病毒转化。在一些实施方案中，经修饰的干细胞采用人工染色体、病毒或质粒DNA瞬时转染。在一些实施方案中，干细胞是自体来源的。在一些实施方案中，天花疫苗不包含异源核酸。在一些实施方案中，通过瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内或眼内注射施用天花疫苗。在一些实施方案中，天花疫苗是痘苗病毒的减毒New York City Board of Health(NYCBOH)株。在一些实施方案中，该痘苗病毒的NYCBOH株可以是ATCC VR-118或CJ-MVB-SPX。在一些实施方案中，天花疫苗选自Dryvax、ACAM100、ACAM2000、Lister、EM63、LIVP、Tian Tan、Copenhagen、Western Reserve或Modified Vaccinia Ankara(MVA)。在一些实施方案中，实体瘤是胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，干细胞和天花疫苗通过瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内或眼内注射同时施用于对象。在一些实施方案中，干细胞和天花疫苗在注射入对象之前被容纳在同一容器中。在一些实施方案中，该方法进一步包括向对象同时施用基因工程改造的病毒。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是儿科患者。在一些实施方案中，增殖性疾病是儿童期或儿科肿瘤或癌症。

在一些实施方案中，本文公开了治疗对象中增殖性疾病的方法，其包括向对象同时施用天花疫苗和脂肪来源的基质血管成分(SVF)。在一些实施方案中，脂肪来源的基质血管成分是自体的。在一些实施方案中，脂肪来源的SVF在从对象取得脂肪组织24小时内施用于对象。在一些实施方案中，天花疫苗通过瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内或眼内注射施用。在一些实施方案中，脂肪来源的SVF通过Time Machine^TM装置从对象中移除。在一些实施方案中，使用2.5-3mM插管从对象移除脂肪来源的SVF。在一些实施方案中，天花疫苗是痘苗病毒的减毒New York City Board of Health(NYCBOH)株。在一些实施方案中，该痘苗病毒的NYCBOH株可以是ATCC VR-118或CJ-MVB-SPX。在一些实施方案中，天花疫苗选择自Dryvax、ACAM100、ACAM2000、Lister、EM63、LIVP、Tian Tan、Copenhagen、WesternReserve或Modified Vaccinia Ankara(MVA)。在一些实施方案中，实体瘤是胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述对象是儿科患者。在一些实施方案中，增殖性疾病是儿童期或儿科肿瘤或癌症。

本文在此所公开的，在一些实施方案中，是一种治疗对象的增殖性疾病例如实体瘤或血液恶性肿瘤的方法，其包括向对象同时施用天花疫苗与载体细胞。在一些实施方案中，载体细胞是来自对象的自体细胞。在一些实施方案中，载体细胞是一种免疫细胞，其选自粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，载体细胞包含异源核酸。在一些实施方案中，天花疫苗和载体细胞在施用于对象之前在体外共同培养。在一些实施方案中，天花疫苗和载体细胞在施用于对象之前被容纳在同一容器中。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是儿科患者。在一些实施方案中，增殖性疾病是儿童期或儿科肿瘤或癌症。

在一些实施方案中，本文在此公开的是一种组合物，其包含：(a)天花疫苗和(b)干细胞。在一些实施方案中，组合物还包含一种药学上可接受的载体。在一些实施方案中，干细胞选自由以下组成的组中：成体干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞、脂肪基质细胞、内皮干细胞、诱导多能干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、成体外周血干细胞、成肌细胞干细胞、小幼稚干细胞、皮肤成纤维细胞干细胞，及其组合。在一些实施方案中，干细胞是脂肪基质细胞。在一些实施方案中，干细胞是经修饰的干细胞。在一些实施方案中，经修饰的干细胞采用慢病毒或逆转录病毒转化。在一些实施方案中，经修饰的干细胞采用人工染色体，病毒或质粒DNA瞬时转染。在一些实施方案中，天花疫苗不包含异源核酸。在一些实施方案中，组合物还包含基因工程改造的病毒。

在一些实施方案中，本文在此公开的是一种组合物，其包含：(a)天花疫苗；和(b)免疫细胞，如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞或淋巴细胞。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含异源核酸。

在一些实施方案中，本文在此公开的是一种组合物，其包含：(a)天花疫苗；和(b)分离的脂肪基质血管成分(SVF)。

在一些实施方案中，本文进一步公开的是一种宿主细胞，或肿瘤细胞，或哺乳动物生物体，其包含任何一种下列组合物的组合：包括天花疫苗和干细胞的组合物；或包括天花疫苗和一种免疫细胞的组合物，该免疫细胞选自粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞；或包括天花疫苗和分离的脂肪基质血管成分(SVF)的组合物。

附图说明

本专利或申请文件至少包含一张彩色图。一经请求并支付必要的费用后，本专利或专利申请公开的带彩图的副本将由专利局提供。

图1A和1B展示的是一组人类肿瘤细胞系分别感染Lister和ACAM2000病毒株后的溶瘤效果。

具体实施方式

尽管过去30年来抗癌治疗取得了巨大进展，但癌症仍然是全球主要的死亡原因。本文在此提供的是用于治疗对象(例如人对象或动物对象)中的肿瘤、癌症或转移的方法和组合物。具体而言，在此所公开的，是通过施用天花疫苗而激活人体自身免疫系统以抵抗癌症的方法和组合物。

定义

如本文所用的，对象包括预期用于进行诊断、筛查、监测或治疗的任何动物。动物包括哺乳动物，例如灵长类动物和家养动物。优选地，灵长类动物是人类。患者指的是诸如哺乳动物、灵长类动物、人或牲畜的对象，这些对象罹患疾病，或需要确定其疾病，或需要确定疾病的风险。

如本文所用的“儿科患者”，是指在接受诊断或治疗时年龄为21岁或更小的人。在一些实施方案中，可以从新生儿、婴儿、儿童和青少年中选择儿科患者。“新生儿”是指从出生到生命的前38天的人。“婴儿”是指29日龄到少于两岁的人。“儿童”是指两岁至十二岁以下的人。“青少年”是指12岁至21岁(直到但不包括二十二岁生日)的人。在一些实施方案中，儿科患者年龄大于12个月。在一些实施例中，儿科患者年龄小于18岁。

如本文所用，术语“同时”指施用天花疫苗和细胞时，在48小时内施用彼此二者。在一些实施方案中，在36小时内施用天花疫苗和细胞彼此二者，在24小时内施用彼此二者，在12小时内施用彼此二者，在10小时内施用彼此二者，在8小时内施用彼此二者，在6小时内施用彼此二者，在彼此的4小时内施用彼此二者，在2小时内施用彼此二者，在1小时内施用彼此二者。

如本文所使用的与细胞移植有关的术语“自体的”、“自体细胞”或“自体移植”，指的是细胞的供体和受体是相同的个体。如本文所使用的与细胞移植相关的术语“同种异体的”，“同种异体细胞”或“同种异体移植”，指的是细胞的供体和受体是同一物种的不同个体。

如本文所用，术语“脂肪组织”是指身体的脂肪组织，是一种主要由脂肪细胞组成的疏松结缔组织。除脂肪细胞外，脂肪组织还含有细胞的基质血管成分(SVF)，所述细胞包括前脂肪细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、各种免疫细胞以及再生性干细胞。

如本文所用，术语“脂肪干细胞”或“脂肪来源的成体干细胞(ADASC)”是指可从脂肪组织分离的干细胞，是能够分化成多种细胞类型的多能干细胞。就细胞分化潜能、血管生成和抗炎作用而言，脂肪干细胞被发现即使不优于，也是等价于骨髓干细胞的。

如本文所用，术语“肿瘤”或“肿瘤细胞”是指任何类型的肿瘤，包括实体瘤或非实体瘤、分散性肿瘤、转移性或弥散性肿瘤，或来自任何形式的肿瘤的肿瘤细胞。

如本文所用的术语“疫苗”，是指任何类型的有助于或引发针对特定疾病或病原体的主动免疫应答的生物制剂。这样的生物制剂可以包括但不限于来自致病原的抗原或来自致病原的抗原的一部分。这样的生物制剂也可能是活减毒制剂的形式，包括活的、或减弱的、或经修饰的致病原或病原体；或者为灭活或已杀死的致病原或病原体的形式。这种生物制剂的替代形式进一步包括但不限于亚基、类毒素、缀合物、DNA和重组载体的形式，或者任何可能于未来开发或可获得的、能引发针对性的主动免疫应答的合适形式。

应该注意到的是，在一些实施方案中，尽管本文在此使用了术语“疫苗”，但疫苗不需要提供针对天花(或任何其他病原体)的显著的免疫力，而只需要其对本文所述的癌症或增殖性疾病有效。例如，疫苗可以是治疗癌症的任何免疫原性或感染性组合物。在某些情况下，该术语用于确认特定的材料或组合物，而不一定是指该材料或组合物提供免疫力(例如针对天花的免疫力)的能力。在一些实施方案中，所施用的组合物或材料可以是引发针对肿瘤细胞的免疫原性应答的病毒，或引发针对天花的免疫原性应答的病毒。病毒可以来自任何病毒株，包括如下文和它处所列的一个或多个病毒，包括不在已经批准的或预期的疫苗之列的病毒株。在一些实施方案中，例如，病毒可以是痘苗病毒，或本文所述的任何其他类型的病毒，或具有类似特性的病毒。

如本文所使用，“病毒”是指被称为病毒的一大组实体中的任何一种。病毒通常包含一个蛋白质衣壳，其包裹的遗传物质RNA或DNA的核心，但不包含半透膜，并且仅能在活细胞中生长和增殖。用于本文所提方法的病毒包括但不限于痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、水泡性口膜炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、汉坦病毒、粘液瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、慢病毒以及任何植物或昆虫病毒。

如本文所用，“恶性血液病”是指血液和淋巴系统的肿瘤(例如，霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、艾滋病相关淋巴瘤、恶性免疫增殖性疾病、多发性骨髓瘤和恶性浆细胞瘤、淋巴性白血病、骨髓性白血病、急性或慢性淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、特定细胞类型的其他白血病、未指定细胞类型的白血病、其他和未指明的淋巴、造血和相关组织的恶性肿瘤，例如弥漫性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤)。

如本文所用，“异源核酸”是指被引入到病毒或细胞(或祖细胞)中的核酸，DNA或RNA。这种异源核酸可以包含基因的序列和可操作的调控元件。例如，异源核酸可包含选择标记基因、自杀基因、或一个表达有用蛋白质产物(在内源不表达或表达水平低)的基因。

天花疫苗与抗癌组合物

在一些实施方案中，本文公开的是用于治疗对象中的实体瘤或恶性血液病的方法，其包括向对象施用天花疫苗、其他天花免疫原性组合物或其他能够引发相似的应答的组合物(免疫原性或其他)。需要理解的是，尽管文中自始至终可能使用天花疫苗这一术语，其它可能未被正式批准或指定为“疫苗”的组合物也可能作为替代使用。例如，可以使用其他天花免疫原性组合物或其他免疫原性组合物。在一些实施方案中，天花疫苗不包含异源核酸。在一些实施方案中，通过瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内或眼内注射，或皮内注射，或任何其合适的递送方法来施用天花疫苗。

天花病毒是引发天花的原因。与天花病毒不同，用于天花疫苗接种的痘苗病毒通常不会引起具有免疫力的个体的全身性疾病，因此它被用作活疫苗进行天花免疫。世界范围内痘苗病毒的成功免疫接种在20世纪80年代根除消灭作为自然疾病的天花时达到了高潮。自那时起，除痘病毒感染风险较高的人员(例如实验室工作人员)外，天花疫苗的接种已停止多年。尽管1972年美国终止了对天花的儿童常规免疫接种，但普遍认为天花疫苗对儿童使用是安全的。

在一些实施方案中，源自病原性病毒的减毒株被用于制造活疫苗。已用作天花疫苗的病毒株的非限制性例子包括但不限于Lister(又称作Elstree)，New York City Boardof Health(“NYCBH株”)、Dairen、Ikeda、LC16M8、Western(WR)、Copenhagen、Tashkent、TianTan、Wyeth、IHD-J、和IHD-W、Brighton、Ankara、MVA、Dairen I、LIPV、LC16MO、LIVP、WR 65-16、EM63和Connaught。在一些实施方案中，在此所公开的方法中使用的天花疫苗是痘苗病毒的减毒New York City Board of Health(NYCBOH)株。在一些实施方案中，该痘苗病毒的NYCBOH株可以是ATCC VR-118或CJ-MVBSPX。

在一些实施方案中，天花疫苗是未减毒的。

在一些实施方案中，天花疫苗选自Dryvax、ACAM1000、ACAM2000、Lister、EM63、LIVP、Tian Tan、Copenhagen、Western Reserve或Modified Vaccinia Ankara(MVA)。在一些实施方案中，天花疫苗不缺失其中一种或多种病毒株中存在的任何基因。

在一些实施方案中，天花疫苗是具有复制能力的病毒。在一些实施方案中，天花疫苗是复制缺陷型。

本文公开的方法可用于治疗任何实体瘤或恶性血液病。可通过本文公开的方法治疗的肿瘤包括但不限于：膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、癌(carcinoma)、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、CNS癌症、神经胶质瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症如淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳腺肿瘤、肥大细胞瘤、脑瘤、黑色素瘤、腺鳞癌、类癌肺肿瘤、支气管腺瘤、细支气管腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头瘤、视网膜母细胞瘤、尤因氏(Ewing)肉瘤、维尔姆氏(Wilm)瘤、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、小胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、破骨细胞瘤、口腔瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、传染性性病肿瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利氏(Sertoli)细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤、粒细胞肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌、白血病、血管外皮细胞瘤、眼瘤、包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤形成、肥大细胞瘤、肝细胞癌、淋巴瘤、肺腺瘤病、肺肉瘤、鲁斯氏(Rous)肉瘤、网状内皮增生症、纤维肉瘤、肾母细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴系白细胞增生、成视网膜细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤、类浆细胞白血病、鳍肉瘤(鱼类)、干酪样淋巴结炎、肺癌、胰岛瘤、淋巴瘤、肉瘤、唾液腺肿瘤、神经瘤、胰岛细胞瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。

在一些实施方案中，肿瘤选自转移性黑色素瘤、食管和胃腺癌、胆管癌(任何阶段)、胰腺癌(任何阶段)、胆囊癌(任何阶段)、高级别阑尾粘液腺癌(任何阶段)、高级别胃肠神经内分泌癌(任何阶段)、间皮瘤(任何阶段)、软组织肉瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肺小细胞癌、肺非小细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌和胶质母细胞瘤。

在一些实施方案中，肿瘤选自：胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤和黑色素瘤。

在一些实施方案中，可以治疗的肿瘤或癌症是儿童期或儿科肿瘤或癌症。例如，肿瘤或癌症可以是白血病、淋巴瘤、肉瘤等。白血病的非限制性例子包括急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)。淋巴瘤的非限制性例子包括霍奇金病(或霍奇金淋巴瘤)和非霍奇金淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤)。儿科患者所患的实体瘤或癌症的非限制性例子包括脑瘤、尤因氏(Ewing)肉瘤、眼癌(视网膜母细胞瘤)、生殖细胞肿瘤、肾肿瘤(例如肾母细胞瘤)、肝癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、皮肤癌(例如黑色素瘤)、软组织肉瘤和甲状腺癌。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是儿科患者。在一些实施方案中，对象是新生儿。在一些实施方案中，对象是婴儿。在一些实施例中，对象是儿童。在一些实施例中，该对象是青少年。在一些实施方案中，对象年龄大于12个月。在一些实施方案中，对象的年龄小于18岁。

天花疫苗与组合物载体

免疫原性细胞死亡诱导物，例如病毒，在全身应用后会被显著清除和/或中和。因此，在一些实施方案中，本文公开的是用于保护所公开的天花疫苗免于被血液中的体液和细胞免疫因子清除的载体，以及用于将他们靶向递送至肿瘤部位的方法。

因此，在一些实施方案中，本文所公开的治疗对象中的实体瘤或血液恶性肿瘤的方法，包括向对象同时施用天花疫苗与载体细胞。在一些实施方案中，载体细胞是来自对象的自体细胞。在其他实施方案中，细胞可以是非自体的或同种异体的。

在一些实施方案中，载体细胞是昆虫细胞、爬行动物细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，载体细胞是永生化细胞。在一些实施方案中，载体细胞是肿瘤来源的赘生性细胞。在一些实施方案中，载体细胞是人类细胞。

在一些实施方案中，天花疫苗或本文所述的其他组合物和载体细胞，是同时施用的。在一些实施方案中，通过一种施用媒介物同时施用天花疫苗和载体细胞。在一些实施方案中，天花疫苗和载体细胞通过一个容器同时施用，例如同一个注射器，经由瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内或眼内注射或皮内注射，或任何其合适的递送方法。

干细胞

最近的研究已经证实神经胶质细胞瘤可容纳大量干细胞，并证明了使用病毒载体将基因转入干细胞的可能性。这些研究表明，干细胞是一种用于将抗癌剂递送至肿瘤部位的有前景的媒介物候选者。

因此，本文所公开的一些实施方案中，使用干细胞作为体内递送天花疫苗至癌细胞或肿瘤的载体。在一些实施方案中，将天花疫苗与载体干细胞混合，以避免免疫系统在病毒到达肿瘤之前清除病毒。所以，在一些实施方案中，本文所公开的用于治疗对象的实体瘤或恶性血液病的方法，包括向对象同时施用天花疫苗和干细胞。在一些实施方案中，天花疫苗不包含异源核酸。在一些实施方案中，该方法进一步包括向对象同时施用基因工程修饰的病毒。一些实施方案涉及在施用前制备干细胞和天花疫苗组合物的方法。

在一些实施方案中，载体干细胞是自体干细胞。在其他实施方案中，它是非自体或同种异体的。

在一些实施方案中，载体干细胞选自由以下组成的组中：成体干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞、脂肪基质细胞、内皮干细胞、诱导多能干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、成体外周血干细胞、成肌细胞干细胞、小幼稚干细胞、皮肤成纤维细胞干细胞，及其组合。在一些实施方案中，经修饰的干细胞是脐带来源的间充质样细胞。在一些实施方案中，脐带来源的间充质样细胞是Immstem^TM细胞。在一些实施方案中，干细胞是脂肪基质细胞。上列的一种或多种细胞可以从一些实施方案的组合物和方法中特别地排除。

在一些实施方案中，所述载体干细胞是经修饰的。特别地，在一些实施方案中，经修饰的干细胞是成体干细胞(ASC)。在一些实施方案中，经修饰的干细胞用病毒载体转化。在一些实施方案中，经修饰的干细胞用慢病毒或逆转录病毒转化。在一些实施方案中，经修饰的干细胞用重组病毒转化。在一些实施方案中，经修饰的干细胞用人工染色体、病毒或质粒DNA瞬时转染。在一些实施方案中，病毒是溶瘤病毒。在一些实施方案中，病毒是痘苗病毒。在一些实施方案中，病毒是具有复制能力的溶瘤痘苗病毒(VACV)。在一些实施方案中，经修饰的干细胞能够定位于肿瘤。在一些实施方案中，经修饰的干细胞是自体的。在一些实施方案中，经修饰的干细胞是同种异体的。

在一些实施方案中，经修饰的干细胞是成体干细胞。在一些实施方案中，经修饰的干细胞用慢病毒或逆转录病毒转化。在一些实施方案中，经修饰的干细胞用人工染色体、病毒或质粒DNA瞬时转染。在一些实施方案中，经修饰的干细胞能够定位于肿瘤。在一些实施方案中，经修饰的干细胞是自体的。在一些实施方案中，经修饰的干细胞是同种异体的。在一些实施方案中，经修饰的干细胞选自由以下组成的组中：成体干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞、脂肪基质细胞、内皮干细胞及其组合。在一些实施方案中，经修饰的干细胞是脐带来源的的间充质样细胞。在一些实施方案中，脐带来源的间充质样细胞是Immstem^TM细胞。

ImmStem是脐带来源的间充质样细胞，其具有多能分化能力，并且具有独特的细胞膜表面标记且产生特有的生长因子。与其它的干细胞来源相比，ImmStem具有许多优点，包括易于收集、更高的增殖率、非常低的免疫原性，并且具有分化成代表所有三种胚层的组织的能力。已经证明，与其它间充质干细胞(MSC)亚型相比，由于在施用前所用的“细胞因子活化”步骤，ImmStem具有上调的抗炎和迁移能力。ImmStem细胞来自人脐带，脐带是在分娩后立即从足月妇女获得的。为激发应激反应，加入干扰素γ培养细胞约48小时。在一些实施方案中，IFNγ培养时间可以是1至72小时或其中的任何值或子范围。

在一些实施方案中，通过任何合适的施用方法将天花疫苗和/或干细胞施用于对象。在一些实施方案中，天花疫苗和/或干细胞通过瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内或眼内注射施用。

在一些实施方案中，天花疫苗和干细胞同时施用。在一些实施方案中，天花疫苗和干细胞通过一种施用媒介物同时施用。在一些实施方案中，天花疫苗和干细胞通过一个容器同时施用，例如通过注射器，经由瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内、眼内或皮内注射施用，或任何其合适的递送方法。

在一些实施方案中，肿瘤选自转移性黑色素瘤、食管和胃腺癌、胆管癌(任何阶段)、胰腺癌(任何阶段)、胆囊癌(任何阶段)、高级别阑尾粘液腺癌(任何阶段)、高级别胃肠神经内分泌癌(任何阶段)、间皮瘤(任何阶段)、软组织肉瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肺小细胞癌、肺非小细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌和胶质母细胞瘤。

在一些实施方案中，肿瘤选自：胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤和黑色素瘤。在一些实施方案中，上述所列肿瘤、癌症或恶性肿瘤中的一种或多种，可以从本文所述的组合物和/或方法中特别地排除。

免疫细胞

在此进一步公开的是，在一些实施方案中，免疫细胞作为媒介物用于体内递送天花疫苗至癌细胞或肿瘤的用途。在一些实施方案中，抗癌制剂与媒介物免疫载体细胞混合，以避免病毒在到达肿瘤之前，免疫系统将病毒清除。因此，在一些实施方案中，本文在此公开的治疗对象中的实体瘤或血液恶性肿瘤的方法，其包括向对象同时施用天花疫苗和免疫细胞，该免疫细胞选自粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是自体细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含异源核酸。在一些实施方案中，天花疫苗和免疫细胞在施用于对象之前在体外共同培养。

在一些实施方案中，天花疫苗和免疫细胞同时施用。在一些实施方案中，通过一种施用媒介物同时施用天花疫苗和免疫细胞。在一些实施方案中，天花疫苗和免疫细胞通过一个容器同时施用，例如经由注射器，通过瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内、眼内或皮内注射，或任何其合适的递送方法。

在一些实施方案中，肿瘤选自转移性黑色素瘤、食管和胃腺癌、胆管癌(任何阶段)、胰腺癌(任何阶段)、胆囊癌(任何阶段)、高级别粘液阑尾癌(任何阶段)、高级别胃肠神经内分泌癌(任何阶段)、间皮瘤(任何阶段)、软组织肉瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肺小细胞癌、肺非小细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌和胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，上述所列的肿瘤、癌症或恶性肿瘤中的一种或多种可以从本文描述的组合物和/或方法中特别地排除。

在一些实施方案中，肿瘤选自：胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤和黑色素瘤。

脂肪基质血管成分

在一些实施方案中，本文所公开的治疗对象中增殖性疾病的方法，包括向对象同时施用天花疫苗和脂肪来源的基质血管成分(stromal vascular fraction，SVF)，其中脂肪来源的SVF是自体来源的。在一些实施方案中，脂肪来源的SVF在从对象获取脂肪组织约24小时内施用给对象。在一些实施方案中，脂肪来源的SVF可以在收集后直至48小时内的任何时间、或这之间任何时间点或子时间范围内施用。在一些实施方案中，施用天花疫苗经由瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内、眼内或皮内注射，或任何其合适的递送方法。

出于以下原因，脂肪组织可替代骨髓作为干细胞的来源：a)提取脂肪来源的干细胞比提取骨髓更简单，侵入性更小；b)与骨髓相比，脂肪组织含有更高含量的间充质干细胞(MSC)；c)来自脂肪组织的MSC数量不随年龄的增加而减少，因此可作为所有患者的自体细胞来源；d)除具有治疗潜力的MSC外，脂肪组织还是其他具有独特治疗潜能的细胞群体的来源，包括内皮细胞和调节性T细胞。

MSC免疫原性弱，并具有免疫调节活性，来自不同组织的MSC均具有这些特征。这种弱免疫原性被认为在治疗性施用MSC时能保证同种异体MSC的存活和活性。

特别地，已知脂肪来源的SVF除了干/祖细胞成分之外，还包含单核细胞/巨噬细胞和内皮细胞。

来自全脂肪抽取物的SVF缓解了对其中细胞的深层加工的需要，这使得可能引入污染的步骤最少化(Kurita et al.,Plast Reconstr Surg 2008,121:1033-1041；discussion 1042-1033；Yoshimura et al.,Aesthetic Plast Surg 2008,32:48-55；discussion 56-47)。脂肪来源细胞施用的安全性得到自体脂肪移植的支持，这是整容手术中的常见方法(Hang-Fu et al.,Aesthetic Plast Surg 1995,19:427-437)。上述每篇参考文献的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，脂肪来源的SVF可通过本领域技术人员已知的手段和知识获得。在一些实施方案中，脂肪来源的SVF通过Time Machine^TM装置从对象中移除。在一些实施方案中，使用2.5-3mM插管从对象移除脂肪来源的SVF。在一些实施方案中，可以使用一种或多种以下装置：PNC的Multi Station,CRA Biotech ChaStation,Cytori Celution 800/CRS System以及带MaxStem的Medi-Khan's Lipokit。

在一些实施方案中，天花疫苗和脂肪来源的SVF同时(concurrently)施用。在一些实施方案中，天花疫苗和脂肪来源的血管基质部同时(simultaneously)施用。在一些实施方案中，通过一种施用媒介物同时施用天花疫苗和脂肪来源的SVF。在一些实施方案中，天花疫苗和脂肪来源的SVF通过一个容器同时施用，例如，通过注射器，经由瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内、眼内或皮内注射，或任何其合适的递送方法。

在一些实施方案中，肿瘤选自转移性黑色素瘤、食管和胃腺癌、胆管癌(任何阶段)、胰腺癌(任何阶段)、胆囊癌(任何阶段)、高级别阑尾粘液腺癌(任何阶段)、高级别胃肠神经内分泌癌(任何阶段)、间皮瘤(任何阶段)、软组织肉瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肺小细胞癌、肺非小细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌和胶质母细胞瘤。一种或多种上述肿瘤可以从一些实施方案的组合物和方法中特别地排除。

在一些实施方案中，肿瘤选自：胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤和黑色素瘤。一种或多种上述肿瘤可以从一些实施方案的组合物和方法中特别地排除。

组合物

在此所公开的，是本文用于治疗实体瘤或血液恶性肿瘤的方法中的各种组合物。

在一些实施方案中，在此所公开的组合物包含天花疫苗和载体细胞。

在一些实施方案中，在此所公开的组合物包含：(a)天花疫苗；及(b)干细胞。在一些实施方案中，干细胞选自由以下组成的组中：成体干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cells)、专能干细胞(multipotent stem cells)、寡能干细胞、单能干细胞、脂肪基质细胞、内皮干细胞及其组合。在一些实施方案中，干细胞是脂肪基质细胞。在一些实施方案中，干细胞是经修饰的干细胞。在一些实施方案中，经修饰的干细胞是成体干细胞。在一些实施方案中，经修饰的干细胞用慢病毒或逆转录病毒转化。在一些实施方案中，经修饰的干细胞用人工染色体、病毒或质粒DNA瞬时转染。在一些实施方案中，天花疫苗不包含异源核酸。在一些实施方案中，组合物还包含基因工程改造的病毒。一种或多种上述组分可以从一些实施方案的组合物和方法中特别地排除。

在一些实施方案中，在此所公开的组合物包含：(a)天花疫苗；及(b)选自粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、天然杀伤细胞和淋巴细胞的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。

在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含异源核酸。

在一些实施方案中，在此所公开的组合物包含：(a)天花疫苗；及(b)分离的脂肪基质血管成分(SVF)。

在一些实施方案中，在此所公开的组合物包含药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指适用于特定剂型的溶剂、稀释剂、防腐剂、分散或悬浮助剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂和润滑剂。本领域技术人员知晓可用于配制药物组合物的各种不同载体并且知晓其制备技术(参见Remington's PharmaceuticalSciences,Gennaro编，Mack Publishing,Easton，Pa.,1995；其以整体并入本文引用)。药学上可接受的载体可以包括但不限于林格氏液、等渗盐水、淀粉、马铃薯淀粉、糖、葡萄糖、黄蓍胶粉、麦芽、明胶、滑石、纤维素和其衍生物、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙酸纤维素赋形剂、可可脂、栓剂蜡、琼脂、海藻酸、油、棉籽油、花生油、红花油、芝麻油、橄榄油、大豆油、玉米油、二醇、丙二醇、酯、月桂酸乙酯、油酸乙酯、缓冲剂、氢氧化铝、氢氧化镁、磷酸盐缓冲溶液、无热原水、乙醇、其他无毒相容润滑剂、月桂基硫酸钠、硬脂酸镁、着色剂、脱模剂、被膜剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。药学上可接受的载体还可以包括防腐剂和抗氧化剂。一种或多种上述材料可以从一些实施方案的组合物和方法中特别地排除。

在此所公开的含活天花疫苗的组合物可以包含佐剂。任选地，疫苗中可以包含一种或多种具有佐剂活性的化合物。佐剂是免疫系统的非特异性刺激物，其增强宿主对疫苗的免疫应答。本领域已知的佐剂的实例是弗氏完全佐剂和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOM(免疫刺激复合物)、皂苷、矿物油、植物油和Carbopol。佐剂(特别适用于粘膜应用)的例子是大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)或霍乱毒素(CT)。其他合适的佐剂例如，氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、油乳剂(例如Bayol

或Marcol

皂苷或维生素E增溶剂)。一种或多种上述材料可以从一些实施方案的组合物和方法中特别地排除。

治疗模式的施用

本文在此所公开的每种治疗模式的有效剂量可以根据各种因素而变化，这些因素包括但不限于：特定的治疗方法、所采用的化合物或药物组合物、施用模式、所治疗的病症和/或所治疗病症的严重程度。因此，本发明组合的剂量方案依据各种因素来选择，包括给药途径和患者的肾肝功能。所属领域的普通医师、临床医生或兽医，可以容易地确定并开出用以预防、抵抗或阻止病症发展所需的有效剂量的单一活性成分。在活性成分产生功效而无毒性的浓度范围内精确确定其最佳浓度，所需的方案应基于活性成分对靶位点可获得性的动力学。

制备在此所公开的包括相关治疗的药物组合物的方法，在本领域中是已知的，依据已知的标准参考文献容易获得，如Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Easton,Pa.,第18版(1990年)，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，通过任何适当的方法将所述天花疫苗和/或细胞施用于对象。在一些实施方案中，本文所公开的天花疫苗和/或细胞经由瘤内、静脉内、腹膜内、鞘内、心室内、关节内、眼内或皮内注射，或任何其合适的递送方法。

疫苗施用至平均体型的成人的量可以是：例如，1×10²至1×10¹⁰噬菌斑形成单位，1×10³至1×10⁸噬菌斑形成单位，1×10⁴至1×10¹⁰噬斑形成单位，或此间的任何值或子范围。作为一个具体的例子，可以使用约2.5×10⁵噬菌斑形成单位。

需要理解的是，本文在此所描述的实施方案不仅限于疫苗或疫苗接种本身，还涉及到产生针对癌细胞的免疫应答或反应。虽然为了便利而使用“疫苗”、“疫苗接种”或其他类似术语，但需要理解的是，此类实施方案还涉及免疫组合物、免疫原性组合物、免疫应答产生、免疫等，其中绝对预防性免疫不是必需或被产生的。例如，提及疫苗接种的实施方案，还可能涉及到产生或协助产生针对肿瘤细胞或肿瘤的免疫原性或免疫应答，无论该免疫应答是否根除此肿瘤细胞、肿瘤或癌症，或导致针对此肿瘤细胞、肿瘤或癌症的免疫。

本文说明性描述所公开的内容，可在缺少任何未在此特别说明的一个或多个要素、一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，“包括”，“包含”，“含有”等术语应该被广义地、无限制地理解。此外，本文所使用的术语和表达，是作为描述性而不是限制性术语使用的，并且在使用这些术语和表达时，并无意排除任何与所展示和描述的特征或其部分等价的事物，而应认识到，在所公开的专利权范围之内可以进行各种修改。

其他实施方案在权利要求中阐述。

实施例

实施例1:ACAM2000疫苗的制备

在复原之前，疫苗瓶应从冷藏中取出并使其达到室温。去除疫苗瓶和稀释液瓶的翻盖密封，并用异丙醇棉签擦拭每个橡胶塞，而后使其充分干燥。

无菌操作下，用装有25G x 5/8”针头(提供)的无菌1mL注射器吸取0.3mL稀释液，并将注射器的全部内容物转移到疫苗瓶中。轻轻旋转以混合，但尽量避免将内容物沾到橡胶塞上。复原好的疫苗应为清澈至微浊、无色至稻草黄色的液体，不含异物。在施用之前，应目视检查疫苗是否存在颗粒物质和发生变色。若观察到颗粒物或变色，则不应使用该疫苗，并应安全处置疫苗瓶。

在从冻干剂复原后，每瓶疫苗含有约2.5-12.5×10⁷噬菌斑形成单位(pfu)的(活)痘苗病毒。复原后，若保存在室温下(20-25℃，68-77°F)，ACAM2000疫苗可在6至8小时内使用。未经使用的复原好的ACAM2000疫苗可存放于冰箱中(2-8℃，36-46°F)，最长可保存30天，过期之后应作为生物危害性物质丢弃处理。

准备和施用疫苗的人员应佩戴手术手套或防护手套，并避免疫苗与皮肤、眼睛或粘膜接触。

疫苗瓶、瓶塞、稀释剂注射器、用于复原的通气针、用于注射的针头、以及与疫苗接触的任何材料，应丢弃于防漏、防刺穿的生物危害容器中。该容器应该被妥善处置。

疫苗施用时，轻轻旋转疫苗小瓶混合，但避免内容物沾到橡胶塞。

无菌操作下，使用装有25G x 5/8”针头的无菌1mL注射器，将疫苗瓶的全部内容物吸出并转移到含有基质血管成分的标记的20cc注射器中。

轻轻地旋转充分混合，并在37℃下孵育2至4小时。

实施例2:获取和制备脂肪基质血管成分

患者将接受局部麻醉，麻醉剂含0.5％利多卡因与1：400,000肾上腺素并用8.4％HCO₃滴定至pH值7.4(通常5cc HCO₃，溶液总体积60cc)。然后利用Time-Machine^TM设备、脂肪处理单元(注射器)和2.5-3mm插管对患者进行吸脂。创口覆以杆菌肽软膏和创可贴，并用压迫绷带固定。

SVF(ADSCs)根据以下流程在密闭系统中制备：

a.

收集脂肪进入60cc TP-101注射器(一次性使用无菌脂肪处理注射器)。

b.以2800rpm离心3分钟。

c.通过TP-109密闭系统去除游离脂肪酸和残渣(局部/血液)

d.将25cc浓缩的脂肪转移至TP-102注射器(SVF处理注射器)

e.加入25cc预热的(38℃)含12.5Wunsch单位的Roche

Time MachineAccelerator(GMP级胶原酶)。

f.在38℃孵育30-45分钟。

g.以200g离心4分钟

h.除去除底部3-10cc外的上清夜。

i.加入50cc D5LR作为洗涤液以除去胶原酶残留物，并以200g离心4分钟。

j.再重复2次，共进行3次洗涤。

k.弃去所有上清液，保留3-10cc的沉积物——这即是基质血管组分。

l.利用100微米过滤器将SVF转移至标记的20cc注射器。

m.收集SVF样品，鉴定细胞数量和活力，并确认没有结块或碎片。

n.每种细胞悬液将留下小份样本用于内毒素测试和无菌染色。只有确认内毒素测试结果EU等级小于或等于5EU/kg/hr且革兰氏染色结果为阴性后，SVF才被释放用于注射。

o.将细胞重新悬浮在20ml Isolyte中。细胞悬液将通过18G针头吸入注射器中进行注射。多达1亿个活细胞将被用于注射。

p.将注射器放入标有病人姓名和医疗记录号的密封标本袋中，以便运送到手术室进行注射。

实施例3:天花疫苗与脂肪SVF的施用

施用方法：

a.静脉注射：未扩增的自体基质血管成分(SVF)从多达500ml脂肪抽取物中提取，并通过胶原酶消化和一系列洗涤步骤纯化，含有高达1亿个细胞，其与痘苗病毒共同培养后，将通过静脉注射施用，注射量为20毫升。

b.肿内注射：未扩增的自体基质血管成分(SVF)从多达500ml脂肪抽取物中提取，并通过胶原酶消化和一系列洗涤步骤纯化，含有高达1亿个细胞，其与痘苗病毒共同培养后，将通过肿瘤内注射施用。注射量和所注射细胞的数量，将根据肿瘤类型和肿瘤大小及位置改变。

实施例4：用Lister和ACAM2000病毒株体外感染人肿瘤细胞系后的溶瘤，及用 ACAM2000或Lister痘苗病毒株定殖携带A549和PC3肿瘤的裸鼠的体内实体瘤退缩对比，以 及临床研究

体外

为了比较研究天花疫苗ACAM2000的抗肿瘤活性，将ACAM2000和Lister病毒株以0.01的感染复数(MOI)感染一组人类癌细胞系。

在感染前24小时，将乳腺癌细胞系MDA-MB-231，肺腺癌细胞系A549和NCI-H1299，前列腺癌细胞系PC3和宫颈癌细胞系SiHa接种在96孔板上。第二天，细胞几乎已汇合，用50ul含有适当痘苗病毒量(MOI为0.01)的DMEM感染，DMEM中添加2％胎牛血清(FBS)。对照组细胞不进行处理。培养1小时后，用添加10％FBS的DMEM代替培养基。96小时后，采用MTT法分析肿瘤细胞死亡情况。

在ACAM2000或Lister痘苗病毒(MOI为0.01)感染96小时后，对细胞死亡情况进行测定。存活率通过比色MTT法来测量，在570nm测量光密度，n＝3。(A)中结果表示为相对于未处理细胞的细胞死亡的百分比(％)。(B)表显示ACAM2000和Lister杀伤效力的比较(+＝1-25％，++＝26-50％，+++＝51-75％，++++＝76-100％)。

如图1A和1B所示，ACAM2000病毒株有效杀死除NCI-H1299外所有人类癌细胞系，与Lister病毒株的结果接近(图1A和B)。用Copenhagen、MVA和其它所选痘苗病毒毒株进行的实验获得了相似的结果。

体内

为了进一步对比研究天花疫苗ACAM2000和Lister的抗肿瘤活性，将A549和PC-3肿瘤细胞皮下注射到裸鼠中。一旦小鼠肿瘤达到350mm³的体积，眼眶后注射病毒接种物(5x10⁶PFU)(n＝5)。对照组荷瘤小鼠注射生理盐水缓冲液。在携带A549肿瘤的小鼠中注射病毒20天后，以及在携带PC-3肿瘤的小鼠中注射病毒14天后，两种疫苗病毒均导致了相似的肿瘤抑制效果(数据未显示)。

临床

在StemImmune最近的试验中，用自体干细胞/痘苗病毒组合治疗了25名晚期转移性实体瘤和恶性血液病患者。该试验中的25名患者都没有出现任何干细胞/痘苗病毒施用引起的副作用。具体来说，没有发烧、发冷或任何其他病毒相关的副作用的报告，相比之下，之前临床试验中施用不含干细胞的裸病毒6-12小时后，观察到出现这些副作用。重要的是，在目前的试验中，所有患者在干细胞/溶瘤病毒施用约1至3周后感受到肿瘤位置特异性的“烧灼感”，这表明病毒被有效地递送至肿瘤部位并成功感染所靶向的肿瘤。在一些患者中观察到肿瘤缩小和肿瘤的完全清除。

在治疗前(基线样品)以及治疗后第1天、第1周、第1个月、第3个月和第6个月，对参与治疗的患者进行系列血液样品取样。对这些样品进行的分析显示，治疗后约1周可有效地诱导细胞因子的释放。重要的是，流式细胞术分析证实，在治疗后一个月内活化的T细胞和记忆T细胞被诱导产生。

总之，这些结果证实了：i)该治疗显著的安全性，没有任何治疗相关的副作用；ii)在一些患者中使肿瘤缩小甚至根除的功效；及iii)在进行该治疗后，可有效地诱导出现细胞因子的释放和显著的细胞应答。

实施例5：天花疫苗与脂肪SVF的临床试验

研究设计

本研究评估在晚期实体瘤患者中脂肪来源的SVF组合ACAM2000(SVF/ACAM2000)的安全性，本研究基于对患者评估的主观和客观发现。通过检验切除/活检的肿瘤标本(情况允许条件下)，本研究还评估了施用SVF/ACAM200的抗肿瘤作用，以及SVF/ACAM200注射后恶性肿瘤内痘苗病毒的存在。此外，还评估了施用SVF/ACAM2000后的抗痘苗病毒和抗肿瘤的免疫应答。

所有施用技术(静脉内和肿瘤内)将被分类，而无论获得关于特定施用技术信息的情况如何。本研究将追踪每位患者，以确定施用SVF/ACAM2000治疗后是否存在任何不良事件。

纳入标准

具有组织学证实的，原发性或复发性的晚期(由美国癌症联合委员会(AJCC；第7版)定义为III期或IV期，和/或侵袭性(定义为：已公开的在接收现有最佳疗法后5年疾病相关生存率小于20％)实体器官癌症。

患者将提供书面同意，以允许进行基线情况下的肿瘤组织(原发性或转移性)的空芯针活检，用于分析与他/她的恶性肿瘤相关的突变、分析肿瘤细胞对痘苗病毒的敏感性及相关性研究。若有可供使用的福尔马林固定石蜡包埋组织块(来自他/她的原发性或转移性肿瘤)，患者可以选择提供，其取样时间，需是在签署临床试验书面同意书授权使用该组织块前45天之内。

标准包括：

1.能够理解并愿意签署书面知情同意书。

2.经过组织学检测确诊为晚期(AJCC，第7版：III期或IV期)或侵袭性(已发表的疾病特异性存活率，在接受现有最佳疗法5年后低于20％)实体器官癌。

这包括但不限于：

·转移性黑色素瘤；

·食管和胃腺癌(III期/IV期)；

·胆管癌(任何阶段)；

·胰腺癌(任何阶段)；

·胆囊癌(任何阶段)；

·高级别阑尾粘液腺癌(任何阶段)；

·高级别胃肠神经内分泌癌(任何阶段)；

·间皮瘤(任何阶段)；

·晚期软组织肉瘤(任何阶段)。

·前列腺癌

·肾细胞癌

·肺小细胞癌

·肺非小细胞癌

·头颈部鳞状细胞癌

·结肠直肠癌

·卵巢癌

·肝细胞癌

·胶质母细胞瘤

3.任何先前治疗(包括但不限于生物疗法、放射疗法、化学疗法或外科手术)都不存持续的急性毒性效应，即所有这些治疗的影响按照《通用不良反应术语标准》(CTCAE，4.0版)的等级≤1。参与研究前至少28天内未进行任何其他手术(活组织检查除外)。

4.ECOG表现状况为0到2。

5.预期寿命至少3个月。

6.足够的器官和骨髓功能，定义如下：

·绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)≥1.5×10⁹；

·血小板(Platelets)≥100×10⁹(无血小板输注)；

·血红蛋白(Hemoglobin)≥9.0g/dL(有或没有进行红细胞(RBC)输血)；

·血清肌酸酐(Serum creatinine)：≤1.5×正常上限(ULN)；

·胆红素(Bilirubin)≤1.5×ULN；

·ALT和AST≤2.5×ULN(在肝转移的情况下：AST/ALT≤5.0×ULN)；

·LDH≤1.5×ULN。

7.具有生育潜能的女性和具有生育潜能的伴侣的男性必须同意在进入研究前、在参与研究期间及完成治疗后的90天内，使用适当的避孕措施(荷尔蒙或屏障避孕方法；禁欲)。若女性在参加本研究时怀孕或怀疑自己怀孕，应立即通知其治疗医生。

·具有生育潜能的女性是指符合以下标准的任何女性(不论性取向如何，是否经过输卵管结扎术，或选择保持独身)

o没有进行子宫切除术或双侧卵巢切除术；或

o至少连续12个月没有自然绝经(即，此前12个月的任何时间有过月经)

8.开始研究药物给药之前，有生育潜能的女性妊娠试验结果为阴性。

9.愿意并且能够遵守所安排的访问、治疗计划、成像和实验室检测。

排除标准

1.当前或预期在研究期间使用其他试验药物或市售的抗癌药物。

2.在进入研究前4周内接受过化学疗法或放射疗法的患者，或者还未从早于4周前施用药物而引发的不良反应中恢复的患者。

3.在进入研究前四周内接受过手术(活检除外)，或手术相关的创伤或伤口愈合恢复不充分的患者。

4.已知患有免疫系统疾病(包括获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)，HIV感染或乙型肝炎或丙型肝炎)。符合条件的患者在研究开始前4周内HIV检测结果必须为阴性。

5.正在接受其它免疫抑制治疗或服用任何类固醇的患者(每日皮质类固醇同时用量小于20mg的除外，这里采用泼尼松龙当量)。

6.曾接受过任何类型的基因治疗或溶细胞性病毒治疗。

7.有临床意义的心脏病(纽约心脏协会等级III或IV)，包括之前存在的心律失常，不受控制的心绞痛和进入研究前一年内出现的心肌梗塞，或者2级或更高级别的左心室射血分数降低。

8.静息时脉搏血氧饱和度<90％。

9.患有痴呆症或精神状态改变，导致无法进行知情同意。

10.研究者所认可的、会损害接受本研究治疗能力的、严重或不受控制的疾病(即，不受控制的糖尿病、慢性肾脏疾病、慢性肺病，或者活跃性、发烧、全身性和/或不受控制的感染，使对象遵守研究要求的能力受限的精神疾病/社会条件)。

11.在研究过程中，同时接受抗痘苗病毒的抗病毒制剂(例如西多福韦、牛痘免疫球蛋白、伊马替尼、ST-246)。

12.已知对卵清蛋白或其他蛋制品过敏。

13.患有临床显著的皮肤科疾病(例如，湿疹、牛皮癣或任何未愈合的皮肤伤口或溃疡)，这由主要研究人员在筛查和研究期间评估。

14.对碘化造影剂有过敏史。

15.具有已知的脑转移的患者应该排除在本临床试验之外，因其预后不良，并且因为他们经常患有进行性神经功能障碍，这会妨碍对神经性不良事件和其他不良事件的评估。

16.怀孕或哺乳。存在造成先天性畸形的可能性，并且本方案有对哺乳婴儿造成伤害的可能。

17.由我们的医师团队中一人或多人确定不被接收入该研究的病人，因为他们的病情可能不属于可以被SVF/ACAM2000改善的情况。

干预、施用和持续时间

干预措施如下：

a)患者将接受局部麻醉，其包含0.5％利多卡因与1：400,000的肾上腺素，用8.4％的HCO₃滴定至pH值7.4(通常5cc HCO₃至总体积60cc)。

b)对患者进行无菌准备。

c)使用Time-Machine^TM设备、脂肪处理单元(注射器)和2.5-3mm插管对患者进行吸脂操作。

d)将杆菌肽软膏和创可贴用压缩绷带固定在创口上。

e)SVF(ADSCs)根据既定流程在密闭系统中准备(见第5页)

施用方法：

a.静脉注射：未扩增的自体基质血管成分(SVF)从多达500ml脂肪抽取物中提取，并通过胶原酶消化和一系列洗涤步骤纯化，含有高达1亿个细胞，其与痘苗病毒共同培养后，将通过静脉注射施用，注射量为20毫升。

b.肿瘤内：与痘苗病毒一起温育的基质血管成分将通过瘤内注射，在加利福尼亚州Palm Dersert的Desert Medical Imaging医学影像中心进行。注射细胞的体积和数量可能会变化，其取决于肿瘤类型和肿瘤的大小和位置。给药剂量取决于个体产量。若我们发现与特定的细胞计数的特别的相关性，我们可能会尝试为未来的患者优化这种计数。然而，这对本研究的基本性质并不重要，不应影响其结果。

允许的伴随治疗

允许使用用于以下治疗的药物：治疗不良事件和控制癌症症状的药物，并发的稳定性疾病(例如可控的高血压)，支持治疗(例如促红细胞生成素或输血)和止痛药物。若在研究开始后患者服用任何新药物，他/她需要通知临床实验机构。研究开始后对患者施用的所有药物(所研究药物除外)和显著性的非药物治疗(包括物理治疗和输血)都必须记录在患者的病历之中。

以下是允许的支持治疗/程序的列表：

·止吐药；

·止泻药；

·镇痛药(如非甾体类抗炎药(NSAIDs)，或者口服或经皮肤的麻醉止痛药；

·抗生素；

·营养和补液；

·骨髓生长因子(除常规使用G-CSF和GM-CSF外)；

·双膦酸盐；

·主治医师可自行决定是否允许输血和使用促红细胞生成素；

·预防性抗凝治疗(低剂量)和完全抗凝是允许的。

禁止的伴随治疗

在研究进行中，患者不得使用其他研究性治疗手段。在研究治疗期间，除了本研究治疗以外，患者不得接受抗癌治疗(例如化学疗法、生物疗法或放射疗法、手术)。如果这些治疗和药物是患者所必需的，那么该患者在本研究的治疗部分的参与必须终止。

不被允许的支持疗法列表如下：

·手术(除了所允许的手术切除原发肿瘤外)；

·其他研究性治疗；

·其他抗癌治疗；

·全身性免疫抑制剂(除同时使用的皮质类固醇外，采用泼尼松龙当量，每天不超过20mg)；

·免疫疗法；

·常规预防性使用生长因子(G-CSF或GM-CSF)。

毒性和给药延迟/剂量修改

任何接受本方案治疗的患者都将用于毒性评估。根据NCI《通用不良反应术语标准》(CTCAE，4.03版)，对每位患者中的的毒性发展进行评估。超过2周的毒性相关的治疗延迟，被定义为需要从研究治疗中退出的DLT。

安全性/耐受性

所有接受至少一剂量研究药物的患者将被用于分析。该研究将使用CTCAE 4.03版(http://ctep.cancer.gov/reporting/ctc.html)报告不良事件(附录B)。

抗肿瘤作用——实体瘤

患者的病情将通过横断面成像进行追踪。

肿瘤反应评估(来自Stanford I.T.试验)

肿瘤反应率将基于实体瘤中的免疫相关反应标准(Immune-related ResponseCriteria，irRC)计算(Wolchok et al.,Guidelines for the evaluation of immunetherapy activity in solid tumors:immune-related response criteria,Clin.CancerRes.2009,15:7412-7420)，其次是Choi Criteria对胃肠道间质瘤(GIST)的事件后评估。参见Choi et al.,Correlation of computed tomography and positron emissiontomography in patients with metastatic gastrointestinal stromal tumor treatedat a single institution with imatinib mesylate:proposal of new computedtomography response criteria,J.Clin.Oncol.2007,25:1753-1759。有关的肿瘤影像学研究将在以下时间获取：基线期，治疗中，治疗后第1和第3个月，之后的12个月每三个月一次，然后每年进行一次。

由于免疫疗法可以增加肿瘤负荷(1)由于直到免疫反应起作用前肿瘤的继续生长，或由于暂时性的、伴随或不伴随水肿的免疫细胞浸润，或者(2)导致新的肿瘤病变出现(即，新病变难以与基线期非显著的病变区分，后者是由于T细胞浸润已成形的、放射学检测无法检测到的的肿瘤沉积物)，治疗应当继续，因为在后续追踪时间点确认疾病发展之后，肿瘤可能开始萎缩。具有稳定的病情和实验检测结果且未显著恶化的患者，或者经体检或放射成像检查肿瘤生长中等的患者，应该在确定疾病恶化发展并且撤回治疗之前重复进行确认扫描。是否继续治疗应与继续治疗潜在的毒性进行权衡。

活性的主分析基于免疫相关应答标准。最佳总体反应率(BORR)，即具有CR或PR的BOR的患者数量除以接受治疗的患者的数量。疾病控制率(DCR)是具有CR、PR或SD的患者的数量除以接受治疗患者的数量。

总体存活(OS)被定义为从随机化处理直至任何原因的死亡的时间。

无病生存(DFS)是从随机化处理直至肿瘤复发或直至任何原因造成的死亡的事件。

复发时间被定义为从研究治疗开始到首次发生复发事件的持续时间。复发事件定义为新的或持续的局部、区域或远发疾病的临床、放射学或病理学证据。

Claims (22)

1.一种用于治疗对象中实体瘤或恶性血液病的组合物，其包含天花疫苗和载体细胞，其中所述天花疫苗和所述载体细胞一起体外培养。

2.权利要求1的组合物，其中所述载体细胞是干细胞、免疫细胞、赘生性细胞或永生化细胞。

3.权利要求1的组合物，其中脂肪基质细胞对于要施用所述组合物的对象而言是自体的。

4.权利要求1的组合物，其中脂肪基质细胞对于要施用所述组合物的对象而言是同种异体的。

5.权利要求1的组合物，其中所述载体细胞是干细胞。

6.权利要求5的组合物，其中所述干细胞选自成体干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞、脂肪基质细胞、内皮干细胞、诱导多能干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、成体外周血干细胞、成肌细胞干细胞、小幼稚干细胞、皮肤成纤维细胞干细胞，及其组合。

7.权利要求1的组合物，其中在培养之后并且在施用于所述对象之前储存所述天花疫苗和所述载体细胞。

8.权利要求1的组合物，其中所述天花疫苗是Wyeth株、减毒的Wyeth株、New York CityBoard of Health(NYCBOH)株或减毒的NYCBOH株。

9.权利要求8的组合物，其中毒株是命名为ATCC VR-118或CJ-MVB-SPX的NYCBOH株，或源自其的毒株。

10.权利要求1的组合物，其中所述天花疫苗选自Dryvax、ACAM100、ACAM2000、Lister、EM63、LIVP、Tian Tan、Copenhagen、Western Reserve或Modified Vaccinia Ankara(MVA)株。

11.权利要求6的组合物，其中所述天花疫苗是Wyeth株、减毒的Wyeth株、New YorkCity Board of Health(NYCBOH)株或减毒的NYCBOH株。

12.权利要求11的组合物，其中毒株是命名为ATCC VR-118或CJ-MVB-SPX的NYCBOH株，或源自其的毒株。

13.权利要求6的组合物，其中所述天花疫苗选自Dryvax、ACAM100、ACAM2000、Lister、EM63、LIVP、Tian Tan、Copenhagen、Western Reserve或Modified Vaccinia Ankara(MVA)株。

14.权利要求1-10任一项的组合物，其中肿瘤是实体瘤。

15.权利要求1-10任一项的组合物，其中所述实体瘤或恶性血液病选自膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、基底细胞癌、胆道癌、骨癌、脑癌、CNS癌症、神经胶质瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内瘤、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳腺肿瘤、肥大细胞瘤、腺鳞癌、类癌肺肿瘤、支气管腺瘤、细支气管腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头瘤、尤因氏肉瘤、维尔姆氏瘤、伯基特氏淋巴瘤、小胶质细胞瘤、破骨细胞瘤、口腔瘤、纤维肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、传染性性病肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利氏细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤、粒细胞肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、肺鳞状细胞癌、眼瘤、包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤形成、肝细胞癌、肺腺瘤病、鲁斯氏肉瘤、网状内皮增生症、肾母细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴系白细胞增生、肝瘤形成、类浆细胞白血病、胰岛瘤、唾液腺肿瘤、神经瘤、胰岛细胞瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。

16.权利要求1-10任一项的组合物，其中所述实体瘤或恶性血液病是实体瘤，选自胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈鳞状细胞癌和黑色素瘤。

17.一种制备权利要求1-13任一项的组合物的方法，其包括培养所述天花疫苗和所述载体细胞。

18.权利要求17的方法，其中所述天疫苗选自Dryvax、ACAM100、ACAM2000、Lister、EM63、LIVP、Tian Tan、Copenhagen、Western Reserve、Modified Vaccinia Ankara(MVA)、New York City Board of Health、Dairen、Ikeda、LC16M8、Tashkent、Wyeth、IHD-J、IHD-W、Brighton、MVA、Dairen I和Connaught株。

19.权利要求17的方法，其中所述载体细胞是干细胞。

20.权利要求17的方法，其中所述载体细胞是干细胞，其选自成体干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞、脂肪基质细胞、内皮干细胞、诱导多能干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、成体外周血干细胞、成肌细胞干细胞、小幼稚干细胞、皮肤成纤维细胞干细胞，及其组合。

21.权利要求17的方法，其中所述天疫苗是ACAM100或ACAM2000。

22.权利要求1-10任一项的组合物，其配制为用于治疗癌症的药物。

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