CN115190912A

CN115190912A - Rna指导核酸酶及其活性片段与变体以及使用方法

Info

Publication number: CN115190912A
Application number: CN202080097713.8A
Authority: CN
Inventors: A·B·克拉维利; P·博登; T·D·博文; M·寇伊勒; M·R·拉科尔; T·D·埃里驰
Original assignee: Life Editor Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Life Editor Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-10-14
Also published as: CA3163285A1; EP4085133A1; US20230203463A1; TW202134439A; JP2023508731A; AU2020417760A1; WO2021138247A1

Abstract

本发明提供了用于结合至所关注的目标序列的组合物及方法。该组合物可用于切割或修饰所关注的目标序列、检测所关注的目标序列和修饰所关注的序列的表达。组合物包含RNA指导核酸酶多肽、CRISPR RNA、反式活化的CRISPR RNA、指导RNA和编码其的核酸分子。还提供了包含该核酸分子的载体及宿主细胞。还提供了用于结合所关注的目标序列的CRISPR系统，其中该CRISPR系统包含RNA指导核酸酶多肽及一种或多种指导RNA。

Description

RNA指导核酸酶及其活性片段与变体以及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年12月30日提交的第62/955,014号美国临时申请及2020年7月29日提交的第63/058,169号美国临时申请的优先权，上述每一篇专利申请都通过引用整体并入本文。

关于序列表的声明

与本申请关联的序列表已通过ASCII格式代替纸质拷贝来提供，在此通过引用并入本说明书。该ASCII拷贝被命名为L103438_1180WO_(0077_8)_SL，其大小为558,899字节，其创建于2020年12月17日，且以电子方式通过EFS-Web提交。

发明领域

本发明与分子生物学及基因编辑领域有关。

发明背景

靶向基因组编辑或修饰正迅速成为基础及应用研究的重要工具。最初的方法涉及例如大范围核酸酶(meganuclease)、锌指融合蛋白或TALEN之类的工程核酸酶，这需要产生具有对每一种特定目标序列而言特异的工程化、可程序化、序列特异的DNA结合域的嵌合核酸酶。RNA指导核酸酶(例如，CRISPR-Cas细菌系统的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-关联(Cas)蛋白)通过将核酸酶与指导RNA(指导RNA与特定目标序列特异性杂交)复合而允许特异性序列的靶向。相较于为每一个目标序列产生嵌合核酸酶，产生目标特异性指导RNA的成本更低且更有效。这种RNA指导核酸酶可用于通过序列特异性断裂的引入来编辑基因组，该断裂通过易错的非同源末端连接(NHEJ)被修复，以在特异性基因组位置引入突变。作为另一种选择，可通过同源导向修复将异源DNA引入基因组位点。RNA指导核酸酶(RGN)也可当与脱氨酶融合时用于碱基编辑，或用于检测特异性核苷酸序列。

发明概述

提供了用于结合所关注的目标序列的组合物及方法。该组合物可用于切割或修饰所关注的目标序列、检测所关注的目标序列、以及修饰所关注的序列的表达。组合物包括RNA指导核酸酶(RGN)多肽、CRISPR RNA(crRNA)、反式活化的CRISPR RNA(tracrRNA)、指导RNA(gRNA)、编码其的核酸分子、包括核酸分子的载体及宿主细胞、以及包括RGN、gRNA及检测单链DNA的试剂盒。还提供了用于结合所关注的目标序列的CRISPR系统，其中该CRISPR系统包括RNA指导核酸酶多肽以及一种或多种指导RNA。因此，本文所公开的方法涉及用于结合所关注的目标序列，并且在一些实施方案中，用于切割或修饰所关注的目标序列。所关注的目标序列可例如由于非同源末端连接、引入的供体序列的同源导向修复或碱基编辑而被修饰。还提供了使用检测单链DNA检测DNA分子的目标DNA序列的方法和试剂盒。

附图简要说明

图1显示本发明的代表性RGN的细菌基因组基因座。

详述

受益于前述描述及相关附图中呈现的教导，本发明所属领域的技术人员将想到本文中阐述的本发明的许多修改及其他实施方案。因此，应该明白，本发明不限于所公开的具体实施方案，且修改以及其他实施方案预期被包括于所附实施方案的范畴内。虽然本文采用特定术语，但这些术语仅以一般性及描述性意义使用，而非出于限制性目的。

I.概述

RNA指导核酸酶(RGN)允许在基因组内的特异性位点的靶向操纵，并且在基因靶向的背景下有用于治疗及研究应用。在各种生物体(包括哺乳动物)中，例如，通过刺激非同源末端连接和同源重组，RNA指导核酸酶已被用于基因组工程。本文所述的组合物及方法有用于在多核苷酸中产生单链或双链断裂、修饰多核苷酸、检测多核苷酸内的特定位点、或修饰特定基因的表达。

本文所公开的RNA指导核酸酶可通过修饰目标序列来改变基因表达。在具体实施方案中，RNA指导核酸酶通过指导RNA(gRNA)作为成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)RNA指导核酸酶系统的局部(part)而被导向至目标序列。RGN之所以被认为是“RNA指导”的，是因为指导RNA与RNA指导核酸酶形成复合物，以将RNA指导核酸酶导向至与目标序列结合，并且在一些实施方案中，在该目标序列处引入单链或双链断裂。在目标序列被切割后，断裂可以被修复，使得该目标序列的DNA序列在修复过程期间被修饰。因此，本文提供了使用RNA指导核酸酶修饰宿主细胞的DNA中的目标序列的方法。例如，RNA指导核酸酶可用于修饰真核细胞或原核细胞的基因组基因座处的目标序列。

II.RNA指导核酸酶

本文提供了RNA指导核酸酶。术语“RNA指导核酸酶(RGN)”是指以序列特异性方式结合至特定目标核苷酸序列且通过与多肽复合并与该目标序列杂交的指导RNA分子而被导向至该目标核苷酸序列的多肽。虽然RNA指导核酸酶可以有能力在结合时切割目标序列，但术语“RNA指导核酸酶”还涵盖能够结合至目标序列但不切割目标序列的无核酸酶活性的RNA指导核酸酶。通过RNA指导核酸酶切割目标序列可导致单链或双链断裂。仅能切割双链核酸分子的单链的RNA指导核酸酶在本文中被称为切口酶。

本发明的RGN为2类CRISPR-Cas系统的成员。更具体地说，它们为V型CRISPR-Cas系统的成员。V型CRISPR-Cas系统广义上被定义为含有负责使用该指导RNA来靶向dsDNA(双链DNA)的单效应子核酸酶的系统；另外，该单效应子核酸酶含有造成催化活性的割裂RuvC核酸酶域(Jinek等人，2014，Science doi:10.1126/science.1247997；Zetsche等人，2015，Cell doi:10.1016/j.cell.2015.09.038；Shmakov等人，2017，Nat Rev Microbiol doi:10.1038/nrmicro.2016.184；Yan等人，2018，Science doi:10.1126/science.aav7271；Harrington等人，2018，Science doi:10.1126/science.aav4294；它们中的每一篇的全部内容通过引用并入本文)。大多数V型效应子也可靶向ssDNA(单链DNA)，而常常没有PAM要求(Zetsche等人，2015；Yan等人，2018；Harrington等人，2018)。

该V-A型特征蛋白(signature protein)为Cas12a。其长度为1,000-1,400个氨基酸，且除了RuvC域，还具有几个域，包括具有识别叶(recognition lobe)的楔入域(wedgedomain)(Yamano等人，(2016)Cell 165:949-962)。相对地，相较于大多数其他V型系统，V-U型系统的大小较小(长度为500-700个氨基酸)。V-U’也具有割裂RuvC域及带正电荷的桥式螺旋(Shmakov等人，2017)。尽管Cas12a与cas1、cas2且偶尔与cas4共定位，但该V-U蛋白常常不具有用效应子蛋白编码的辅助Cas蛋白，(Shmakov等人，2017)。基于V-U型系统与其他V型成员之间的这些不同，Shmakov等人(2017)建议在确定功能性时，该V-U型系统应当接收新型/子型命名。

例如，Cas14酶的长度为400-700个氨基酸(Harrington等人，2018)。在第一次公开时，这些系统被称为(tout)来自Vs型的规范Cas12效应子蛋白的分开的Cas酶。Yan等人后来的公开已于该V型命名规则内将Cas14a、-b和-c称为V-F子型。Cas14a及b与为V-U3型的c2c10最密切相关。Cas14c与分别为V-U2及V-U4型的c2c8及c2c9最密切相关(Harrington等人，2018；Yan等人，2018)。该Cas14 RGN的基因组基因座与辅助Cas蛋白关联，且该tracrRNA在该Cas14与该重复序列-间隔序列阵列之间被编码。与能够处理来自含有多个指导RNA的单转录物的个别指导的Cas12a不同，这些系统不能处理它们自己的指导RNA(Harrington等人，2018)。

除APG06369外，本发明的全部RGN都含有割裂RuvC域。然而，本发明的许多RGN具有唯一基因座排列，暗示这些RGN对2类CRISPR-Cas分类系统为新的。本发明的RGN所来源自的基因座(见实施例1中的表1)中没有一个含有Cas1或Cas2。

如本文所公开的，APG07339、APG09624、APG03003、APG05405、APG09777、APG05680、APG02119、APG03285、APG04998和APG07078为未用辅助基因编码且除了crRNA还可要求tracrRNA的独立Cas效应子。基于本文的公开，这些CRISPR-Cas系统需要接收新分类。另外，谱系分析揭示可将这些RGN分组为三个不同子类。一个子类含有APG07078。第二子类含有APG05680及APG03285。第三子类含有APG07339、APG09624、APG03003、APG05405、APG09777、APG02119和APG04998。

APG06369为唯一效应子核酸酶，该唯一效应子核酸酶缺少可区别RuvC域且坐落于具有不规范辅助基因、以前从未见过的CRISPR基因座中。APG06369具有四个辅助基因(该四个辅助蛋白如SEQ ID NO:178-181所示)，它们中没有一个具有注释域(annotated domain)或功能。APG06369为唯一Cas蛋白。

在谱系上，APG03847、APG05625、APG03759、APG05123和APG03524形成含有效应子核酸酶的唯一RuvC的支系(clade)。这些RGN具有至多3个辅助基因：一个为HNH核酸内切酶，一个为HTH转录调节子(regulator)，而第三个具有未知功能或域。APG03847的辅助蛋白如SEQ ID NO:182、183和184所示。APG05625的辅助蛋白如SEQ ID NO:185、186和187所示。APG03524的辅助蛋白如SEQ ID NO:188、189和190所示。APG03759及APG05123的辅助蛋白分别如SEQ ID NO:191及192所示。它们在它们的基因座处具有唯一CRISPR重复序列排列，其中与APG03847、APG05625、APG03759、APG05123和APG03524关联的重复序列对齐(flushwith)大量蛋白的编码序列。此为CRISPR-Cas系统的极不寻常特征，且暗示一种不需要前导序列的CRISPR表达形式。此CRISPR表达形式不同于迄今已知的任何系统。

本文所公开的RNA指导核酸酶包括表1中显示的RNA指导核酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1至109所示，且其活性片段或变体保持以RNA指导的序列特异性方式结合至目标核苷酸序列的能力。在一些实施方案中，RGN的此活性片段或变体能够切割单链或双链目标序列。在一些实施方案中，本发明的RGN的活性变体包含与如SEQ ID NO:1至109所示的氨基酸序列中任一个具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的RGN的活性片段包含如SEQ ID NO:1至109所示的氨基酸序列中任一个的至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050个或更多个连续氨基酸残基。本文提供的RNA指导核酸酶可包含至少一个核酸酶域(例如，DNase、RNase域)及至少一个RNA识别域和/或RNA结合域，以与指导RNA相互作用。可在本文提供的RNA指导核酸酶中发现的另外域包括但不限于：DNA结合域、解旋酶域、蛋白质－蛋白质相互作用域及二聚化域。在具体实施方案中，本文提供的RNA指导核酸酶可与DNA结合域、解旋酶域、蛋白质－蛋白质相互作用域及二聚化域中的一种或多种包括至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

在各种实施方案中，目标核苷酸序列被本文提供的RNA指导核酸酶结合，并与RNA指导核酸酶关联的指导RNA杂交。如果该多肽具有核酸酶活性，则可由RNA指导核酸酶随后切割该目标序列。术语“切割(cleave)”或“切割(cleavage)”是指目标核苷酸序列的主链内的至少一个磷酸二酯键的水解，其可导致该目标序列内的单链或双链断裂。在各种实施方案中，本发明公开的RGN可切割多核苷酸内的核苷酸，起核酸内切酶的作用，或者，本发明公开的RGN可为核酸外切酶，从多核苷酸的末端(5'末端和/或3'末端)移除连续的核苷酸。在一些实施方案中，所公开的RGN可在多核苷酸的任何位置内切割目标序列的核苷酸，且由此起核酸内切酶及核酸外切酶二者的作用。通过本发明公开的RGN对目标多核苷酸的切割可导致交错的断裂或钝末端。

在一些实施方案中，为结合至和/或切割目标多核苷酸，RGN需要至少一个RGN辅助蛋白的表达或存在。在这些实施方案中的一些实施方案中，RGN需要如SEQ ID NO:178-192所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG06369(SEQ ID NO:11)或其变体或片段的特定实施方案中，活性需要如SEQ ID NO:178-181所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在这些实施方案中其中该RGN为APG03847(SEQ ID NO:12)或其变体或片段的一些实施方案中，活性需要如SEQ ID NO:182-184所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG05625(SEQ ID NO:13)或其变体或片段的某些实施方案中，活性需要如SEQ ID NO:185-187所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG03524(SEQ ID NO:16)或其变体或片段的一些实施方案中，活性需要如SEQ ID NO:188-190所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG03759(SEQ ID NO:14)或其变体或片段的特定实施方案中，活性需要如SEQID NO:191所示的RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG05123(SEQ ID NO:15)或其变体或片段的某些实施方案中，活性需要如SEQ ID NO:192所示的RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。

在一些实施方案中，本发明公开的RNA指导核酸酶可为来源于细菌物种或古菌物种的野生型序列。在一些实施方案中，RNA指导核酸酶可为野生型多肽的变体或片段。例如，可修饰该野生型RGN以改变核酸酶活性或改变PAM特异性。在一些实施方案中，RNA指导核酸酶不是天然存在的。

在某些实施方案中，RNA指导核酸酶起切口酶的作用，仅切割目标核苷酸序列的单链。这样的RNA指导核酸酶具有单一作用的核酸酶域。在特定实施方案中，切口酶能够切割正链或负链。在这些实施方案中的一些实施方案中，额外的核酸酶域已经突变，使得核酸酶活性降低或消除。

在一些实施方案中，RNA指导核酸酶完全缺少核酸酶活性，且在本文中被称为无核酸酶活性(nuclease-dead)或核酸酶失活(nuclease inactive)。本领域中用于将突变引入氨基酸序列内的任何已知方法(诸如PCR介导的诱变及定点诱变)可用于产生无切口酶或无核酸酶活性的RGN。例如参见第2014/0068797号美国公开以及第9,790,490号美国专利；其每一篇的全部内容通过引用而被并入本文。

缺少核酸酶活性的RNA指导核酸酶可用于将融合多肽、多核苷酸或小分子载荷递送至特定基因组位置。在这些实施方案中的一些实施方案中，RGN多肽或指导RNA可与可检测标记融合，以允许特定序列的检测。作为非限制性实例，无核酸酶活性的RGN可与可检测标记(例如，荧光蛋白)融合且靶向至与疾病关联的特定序列，以允许该疾病关联序列的检测。

在一些实施方案中，无核酸酶活性的RGN可靶向至特定基因组位置，以改变期望序列的表达。在一些实施方案中，通过干扰所靶向的基因组区域内的RNA聚合酶或转录因子的结合，无核酸酶活性的RNA指导核酸酶与目标序列的结合导致该目标序列的或受该目标序列的转录控制的基因的表达减少。在其他实施方案中，RGN(例如，无核酸酶活性的RGN)或其复合的指导RNA还包含表达调控子(modulator)，其在与目标序列结合时用来阻遏或活化该目标序列或受该目标序列的转录控制的基因的表达。在这些实施方案中的一些实施方案中，表达调控子通过表观遗传机制调控该目标序列或所调节基因的表达。

在一些实施方案中，无核酸酶活性的RGN或仅有切口酶活性的RGN可靶向至特定基因组位置，以通过与碱基编辑多肽(例如，脱氨酶多肽)或其活性变体或片段融合(这直接化学修饰核碱基(例如，直接使核碱基脱氨基))来修饰目标多核苷酸的序列，导致从一种核碱基转化为另一种核碱基。该碱基编辑多肽可在其N端侧或C端侧与该RGN融合。另外，该碱基编辑多肽可通过肽接头而与该RGN融合。有用于此类组合物及方法的脱氨酶多肽的非限制性实例包括胞苷脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶(诸如，Gaudel l i等人，(2017)Nature 551：464-471、第2017/0121693号及第2018/0073012号美国专利公开、第WO/2018/027078号国际专利公开中描述的腺苷碱基编辑器，或者第WO 2020/139873号国际专利公开及第62/785,391号(2018年12月27日提交申请)、第62/932,169号(2019年11月7日提交申请)和第63/077,089号(2020年9月11日提交申请)的美国临时专利申请中公开的脱氨酶中任一个，上述每一篇的全部内容通过引用而被并入本文)。此外，本领域中已知RGN与碱基编辑酶之间的某些融合蛋白也可包含至少一个尿嘧啶稳定多肽，其通过脱氨酶增加胞苷、脱氧胞苷或胞嘧啶与核酸分子中的胸苷、脱氧胸苷或胸腺嘧啶的突变率。尿嘧啶稳定多肽的非限制性实例包括2020年7月15日提交申请的第63/052,175号美国临时专利申请公开的尿嘧啶稳定多肽及尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)域(SEQ ID NO:137)，该尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)域可增加碱基编辑效率。在特定实施方案中，本公开内容提供一种包含本文描述的RGN或其变体、脱氨酶和视情况而定的至少一个尿嘧啶稳定多肽(诸如，UGI)的融合蛋白。在某些实施方案中，融合至该碱基编辑多肽的RGN为切割该碱基编辑多肽不发挥作用的DNA链的切口酶(例如，脱氨酶)。与多肽或域融合的RNA指导核酸酶可通过接头而被分开或连接。如本文所使用的，术语“接头”是指连接两个分子或部分(例如，核酸酶的结合域及切割域)的化学基团或分子。在一些实施方案中，接头连接RNA指导核酸酶的gRNA结合域与诸如脱氨酶的碱基编辑多肽。在一些实施方案中，接头连接无核酸酶活性的RGN与脱氨酶。通常情况下，接头位于两个基团、分子或其他部分之间或侧边有两个基团、分子或其他部分，且通过共价键而被连接到每一个，由此连接二者。在一些实施方案中，接头为一个氨基酸或多个氨基酸(例如，肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头为有机分子、基团、聚合物或化学部分。在一些实施方案中，接头的长度为5-100个氨基酸，例如，长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、或150-200个氨基酸。也考虑了更长或更短的接头。

在各种实施方案中，本公开内容提供本发明公开的RNA指导核酸酶，包含至少一个核定位信号(NLS)，以增强该RGN向细胞核的运输。核定位信号为本领域中已知的且一般包含一段碱性氨基酸(参见，例如，Lange等人，J.Biol.Chem.(2007)282：5101-5105)。在特定实施方案中，RGN包含2、3、4、5、6或更多个核定位信号。核定位信号可为异源NLS。有用于本发明公开的RGN的核定位信号的非限制性实例为SV40大T抗原、核质素及c-Myc的核定位信号(参见，例如，Ray等人，(2015)Bioconjug Chem26(6)：1004-7)。在特定实施方案中，RGN包含如SEQ ID NO:149或150所示的NLS序列。该RGN可在其N端、C端、或在N端及C端二者包含一种或多种NLS序列。例如，该RGN可在N端区域处包含两个NLS序列，而在C端区域处包含四个NLS序列。

本领域中已知的将多肽定位于特定亚细胞位置的其他定位信号序列也可用于靶向该RGN，包括但不限于：质体定位序列、线粒体定位序列和靶向质体及线粒体二者的双靶向信号序列(参见，例如，Nassoury及Morse(2005)Biochim Biophys Acta 1743：5-19；Kunze及Berger(2015)Front Physiol dx.doi.org/10.3389/fphys.2015.00259；Herrmann及Neupert(2003)IUBMB Life 55：219-225；Soll(2002)Curr Opin Plant Biol 5：529-535；Carrie及Small(2013)Biochim Biophys Acta 1833：253-259；Carrie等人，(2009)FEBS J 276：1187-1195；Silva-Filho(2003)Curr Opin Plant Biol 6：589-595；Peeters及Small(2001)Biochim Biophys Acta 1541：54-63；Murcha等人，(2014)J Exp Bot 65：6301-6335；Mackenzie(2005)Trends Cell Biol 15：548-554；Glase等人，(1998)PlantMol Biol 38：311-338)。

在某些实施方案中，本发明公开的RNA指导核酸酶包含促进该RGN的细胞摄取的至少一个细胞穿透域。细胞穿透域为本领域中已知的且一般包含：数段带正电荷的氨基酸残基(即，聚阳离子细胞穿透域)、交替极性的氨基酸残基及非极性氨基酸残基(即，两亲性细胞穿透域)、或疏水性氨基酸残基(即，疏水性细胞穿透域)(参见，例如，Milletti F.(2012)Drug Discov Today 17：850-860)。细胞穿透域的非限制性实例为来自人免疫缺陷病毒1的反式活化转录激活子(TAT)。

核定位信号、质体定位信号、线粒体定位信号、双靶向定位信号和/或细胞穿透域可位于该RNA指导核酸酶的氨基端(N端)、羧基端(C端)、或内部位置中。

在某些实施方案中，本发明公开的RGN可通过接头肽而直接或间接地与诸如切割域、脱氨酶域、或表达调控域的效应域融合。此域可位于该RNA指导核酸酶的N端、C端或内部位置中。在这些实施方案中的一些实施方案中，融合蛋白的RGN组成为无核酸酶活性的RGN。

在一些实施方案中，RGN融合蛋白包含切割域，该切割域为能够切割多核苷酸(即，RNA、DNA或RNA/DNA杂合体)的任何域，并且包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶(homing endonuclease)，诸如IIS型核酸内切酶(例如，FokI)(参见，例如，Belfort等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Linn等人，(eds.)Nucleases(核酸酶)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1993)。

在一些实施方案中，RGN融合蛋白包含脱氨酶域，该脱氨酶域将核碱基脱去氨基，导致一种核碱基转化为另一种核碱基，且包括但不限于胞苷脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶碱基编辑器(参见，例如，Gaudelli等人，(2017)Nature551：464-471、第2017/0121693号及第2018/0073012号美国专利公开、第9,840,699号美国专利和第WO/2018/027078号国际公开、第PCT/US2019/068079号国际专利申请和第62/785,391号(2018年12月27日提交申请)及第62/932,169号(2019年11月7日提交申请)美国临时专利申请)。

在一些实施方案中，RGN融合蛋白的效应域可为表达调控域，该表达调控域为用来上调或下调转录的域。该表达调控域可为表观遗传修饰域、转录阻遏域或转录活化域。

在这些实施方案中的一些实施方案中，RGN融合蛋白的表达调控子包含表观遗传修饰域，该表观遗传修饰域共价修饰DNA或组蛋白以改变组蛋白结构和/或染色体结构，而不改变该DNA序列，引起基因表达的变化(即，上调或下调)。表观遗传修饰的非限制性实例包括赖氨酸残基的乙酰化或甲基化、精氨酸甲基化、丝氨酸及苏氨酸磷酸化和组蛋白的赖氨酸泛素化(ubiquitination)及SUMO化(sumoylation)和DNA中胞嘧啶残基的甲基化和羟甲基化。表观遗传修饰域的非限制性实例包括组蛋白乙酰基转移酶域、组蛋白去乙酰基酶域、组蛋白甲基转移酶域、组蛋白去甲基化酶域、DNA甲基转移酶域及DNA去甲基化酶域。

在一些实施方案中，融合蛋白的表达调控子包含转录阻遏域，该转录阻遏域与诸如RNA聚合酶及转录因子的转录控制元件和/或转录调节蛋白相互作用，以减少或终止至少一个基因的转录。转录阻遏域为本领域中已知且包括但不限于类Sp1阻遏物、IκB及Krüppel关联盒(KRAB)域。

在一些实施方案中，融合蛋白的表达调控子包含转录活化域，该转录活化域与诸如RNA聚合酶及转录因子的转录控制元件和/或转录调节蛋白相互作用，以增加或活化至少一个基因的转录。转录活化域为本领域中已知且包括但不限于单纯疱疹病毒VP16活化域及NFAT活化域。

在一些实施方案中，本发明公开的RGN多肽包含可检测标记或纯化标签。该可检测标记或纯化标签可直接地或通过接头肽间接地位于该RNA指导核酸酶的N端、C端或内部位置中。在这些实施方案中的一些实施方案中，融合蛋白的RGN组成为无核酸酶活性RGN。在其他实施方案中，融合蛋白的RGN组成为具切口酶活性RGN。

可检测标记为可直观的或可以其他方式观察的分子。可检测标记可与该RGN融合为融合蛋白(例如，荧光蛋白)，也可为与RGN多肽缀合的、可直观地或通过其他手段检测的小分子。可与本发明公开的RGN融合为融合蛋白的可检测标记包括任何可检测蛋白域，包括但不限于可用特异性抗体检测的荧光蛋白或蛋白域。荧光蛋白的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(例如，GFP、EGFP、ZsGreen1)及黄色荧光蛋白(例如，YFP、EYFP、ZsYellow1)。小分子可检测标记的非限制性实例包括放射性标记，诸如，³H以及³⁵S。

在一些实施方案中，本发明公开的RGN多肽包含纯化标签，该纯化标签可采用的任何分子，以从混合物(例如，生物样本、培养基)分离蛋白质或融合蛋白。纯化标签的非限制性实例包括生物素、myc、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。

III.指导RNA

本公开内容提供指导RNA及编码其的多核苷酸。术语“指导RNA”是指核苷酸序列，该核苷酸序列与目标核苷酸序列具有足够互补性，以与该目标序列杂交且将关联RNA指导核酸酶的序列特异性结合导向至该目标核苷酸序列。因此，RGN的各指导RNA为一种或多种RNA分子(一般而言，一种或两种)，其可与该RGN结合且指导RGN来与特定目标核苷酸序列结合，且在该RGN具有切口酶或核酸酶活性的那些实施方案中，还切割该目标核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA包含CRISPR RNA(crRNA)且在一些实施方案中，包含反式活化的CRISPR RNA(tracrRNA)。包含crRNA及tracrRNA二者的天然指导RNA一般包含两个分开的RNA分子，此两个分开的RNA分子通过该crRNA的重复序列及该tracrRNA的抗重复序列彼此杂交。

在一些实施方案中，CRISPR阵列内的天然直接重复序列在28至37个碱基对的长度范围内。在一些实施方案中，CRISPR阵列内的天然直接重复序列的长度在约23bp至约55bp(例如，23bp至55bp)的范围内。在一些实施方案中，CRISPR阵列内的间隔序列的长度在约32至约38bp的范围内。在一些实施方案中，CRISPR阵列内的间隔序列的长度在约21bp至约72bp(例如，21bp至72bp)的范围内。在一些实施方案中，本文所公开的CRISPR阵列包含少于50个单位的CRISPR重复序列-间隔序列。该CRISPR被转录为被称为初级CRISPR转录物的长转录物的局部，其包含该CRISPR阵列的大部分。该初级CRISPR转录物被Cas蛋白切割，以产生crRNA，或者在一些情况中，产生前体crRNA(pre-crRNA)，其被额外的Cas蛋白进一步处理为成熟的crRNA。成熟的crRNA包含间隔序列及CRISPR重复序列。在其中将前体crRNA处理为成熟(或经处理)crRNA的一些实施方案中，成熟涉及移除约1至约6个或更多个5'、3'或5'及3'核苷酸。出于基因组编辑或靶向所关注的特定目标核苷酸序列的目的，在前体crRNA分子成熟期间移除的这些核苷酸对于产生或设计指导RNA不是必需的。本发明公开的每一个RGN蛋白(SEQ ID NO:1-109)的共有重复序列分别示于SEQ ID NO:201-309中。APG07339(SEQID NO:1)、APG09624(SEQ ID NO:2)、APG03003(SEQ ID NO:3)、APG05405(SEQ ID NO:4)、APG09777(SEQ ID NO:5)、APG05680(SEQ ID NO:6)、APG06369(SEQ ID NO:11)、APG03847(SEQ ID NO:12)、APG05625(SEQ ID NO:13)和APG03524(SEQ ID NO:16)中的每一个的经处理crRNA重复序列分别公开于SEQ ID NO:110-119中。

CRISPR RNA(crRNA)包含间隔序列及CRISPR重复序列。“间隔序列”为与所关注的目标核苷酸序列直接杂交的核苷酸序列。该间隔序列被工程化为与所关注的目标序列完全地或部分地互补。在各种实施方案中，间隔序列可包含约8个核苷酸至约30个核苷酸或更多个核苷酸。例如，该间隔序列的长度可为约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，间隔序列的长度为约10至约26个核苷酸，或长度为约12至约30个核苷酸。在特定实施方案中，间隔序列的长度为约30个核苷酸。在一些实施方案中，当使用适合的比对(alignment)算法进行最佳比对时，间隔序列与其对应的目标序列之间的互补性程度为约或大于约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高。在特定实施方案中，间隔序列不含使用本领域中已知的任何适合的多核苷酸折叠算法可预测的二级结构，多核苷酸折叠算法包括但不限于mFold(参见，例如，Zuker及Stiegler(1981)Nucleic Acids Res.9：133-148)及RNAfold(参见，例如，Gruber等人，(2008)Cell 106(1)：23-24)。

CRISPR RNA重复序列包含核苷酸序列，该核苷酸序列或者独自地或者与所杂交tracrRNA配合形成通过该RGN分子识别的结构。在各种实施方案中，CRISPR RNA重复序列可包含约8个核苷酸至约30个核苷酸或更多个核苷酸。例如，CRISPR重复序列的长度可为约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，CRISPR重复序列的长度为约21个核苷酸。在一些实施方案中，当使用适合的比对算法进行最佳比对时，CRISPR重复序列与其对应的tracrRNA序列之间的互补性程度为约或大于约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高。在特定实施方案中，CRISPR重复序列包含SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309的核苷酸序列的任一个或其活性变体或片段，其当被包含于指导RNA内时能够将本文所提供的关联RNA指导核酸酶的序列特异性结合导向至所关注的目标序列。在某些实施方案中，野生型序列的活性CRISPR重复序列变体包含与如SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309所示的核苷酸序列中任一个具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，野生型序列的活性CRISPR重复序列片段包含如SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309所示的核苷酸序列中任一个的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。

在某些实施方案中，crRNA不是天然存在的。在这些实施方案中的一些实施方案中，特异性CRISPR重复序列在自然界中(in nature)不与该工程化间隔序列连接，且该CRISPR重复序列被认为与该间隔序列是异源的。在某些实施方案中，间隔序列为非天然存在的工程化序列。

在一些实施方案中，指导RNA还包含tracrRNA分子。反式活化的CRISPR RNA或tracrRNA分子包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含具有与crRNA的CRISPR重复序列杂交的足够互补性的区域，其在本文中被称为抗重复序列区域。在一些实施方案中，tracrRNA分子还包含具二级结构(例如，茎-环)的区域，或在与其对应的crRNA杂交时形成二级结构。在特定实施方案中，tracrRNA的与CRISPR重复序列完全地或部分地互补的区域处于分子的5'末端，且该tracrRNA的3'末端包含二级结构。此二级结构区域一般包含被发现与该抗重复序列相邻、包括连结(nexus)发夹的几个发夹结构。该tracrRNA的3'末端处常常存在端发夹，其结构及数量可变，但常常包括富含GC的Rho独立转录终止子发夹，其后在3'末端处具有一串U。参见，例如，Briner等人，(2014)Molecular Cell 56：333-339、Briner及Barrangou(2016)Cold Spring Harb Protoc；doi：10.1101/pdb.top090902及第2017/0275648号美国专利公开，上述每一篇的全部内容通过引用并入本文。

在各种实施方案中，与CRISPR重复序列完全地或部分地互补的tracrRNA的抗重复序列区域包含约6个核苷酸至约30个核苷酸或更多个核苷酸。例如，tracrRNA抗重复序列与该CRISPR重复序列之间的碱基配对区域的长度可为约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30个或更多个核苷酸。在特定实施方案中，与CRISPR重复序列完全地或部分地互补的tracrRNA的抗重复序列区域的长度为约10个核苷酸。在一些实施方案中，当使用适合的比对算法进行最佳比对时，CRISPR重复序列与其对应的tracrRNA抗重复序列之间的互补性程度为约或大于约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高。

在各种实施方案中，整个tracrRNA可包含约60个核苷酸至多约210个核苷酸。例如，该tracrRNA的长度可为约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210个或更多个核苷酸。在特定实施方案中，tracrRNA的长度为约100至约201个核苷酸，长度为包括约95、约96、约97、约98、约99、约100、约105、约106、约107、约108、约109个及约100个核苷酸。在某些实施方案中，tracrRNA的长度为约96个核苷酸。

在特定实施方案中，tracrRNA包含SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148的核苷酸序列的任一个或其活性变体或片段，其当被包含于指导RNA内时能够将本文提供的关联RNA指导核酸酶的序列特异性结合导向至所关注的目标序列。在某些实施方案中，野生型序列的活性tracrRNA序列变体包含与如SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148所示的核苷酸序列的任一个具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，野生型序列的活性tracrRNA序列片段包含如SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148所示的核苷酸序列的任一个的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80个或更多个连续核苷酸。

当两个序列在严格条件下彼此杂交时，可认为该两个多核苷酸序列实质上互补。同样，如果与RGN结合的指导RNA在严格条件下与目标序列结合，则认为该RGN以序列特异性方式结合至该特定目标序列。“严格条件”或“严格杂交条件”旨在指两个多核苷酸序列彼此杂交至可检测程度高于其他序列(例如，至少比背景高2倍)的条件。严格条件为序列依赖性的，且在不同环境下将会不同。通常情况下，严格条件将是这样的条件，其中：在pH 7.0至8.3，盐类浓度小于约1.5M Na离子，通常情况下约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，且针对短序列(例如，10至50个核苷酸)，温度为至少约30℃，而针对长序列(例如，大于50个核苷酸)，温度为至少约60℃。通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂也可达到严格条件。示例性的低严格条件包括在37℃下以30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交及在50至55℃以1X至2X SSC洗涤(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)。示例性的中等严格条件包括在37℃下在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交及在55至60℃下在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交及在60至65℃下在0.1X SSC中洗涤。视情况，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％的SDS。杂交持续时间一般小于约24小时，通常约4至约12小时。洗涤时间的持续时间至少为足以达到平衡的时间长度。

Tm为50％的互补目标序列与完全匹配的序列杂交的温度(在所定义的离子强度和pH下)。对于DNA-DNA杂合体，Tm可以由Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284中的等式：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L大致估计；其中M为单价阳离子的莫耳浓度，％GC为鸟苷和胞嘧啶核苷酸在该DNA中的百分比，％form为甲酰胺在杂交溶液中的百分比，及L为碱基对中的杂合体的长度。一般而言，严格条件被选择为比在所定义的离子强度和pH下的特异性序列及其互补序列的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极度严格条件可采用在比该热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比该热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的温度下的杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在比该热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的温度下的杂交和/或洗涤。本领域技术人员将明白，使用该等式、杂交及洗涤组合物以及要求的Tm，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化被固有地描述了。核酸杂交的充分指南可在Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with NucleicAcid Probes,Part I,Chapter 2(Elsevier，New York)；和Ausubel等人，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)中得到。参见Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。

术语“序列特异性”也可是指相较于与随机化背景序列的结合，以更高频率与目标序列结合。

在一些实施方案中，例如，其中该指导RNA包含crRNA及tracrRNA二者，该指导RNA可为单指导RNA或双指导RNA系统。单指导RNA包含单RNA分子上的crRNA及tracrRNA，而双指导RNA系统包含存在于两个不同的RNA分子上的crRNA及tracrRNA，其通过该crRNA的CRISPR重复序列的至少一部分及该tracrRNA的至少一部分而彼此杂交，其可与该crRNA的CRISPR重复序列完全地或部分地互补。在其中指导RNA为单指导RNA的那些实施方案中的一些实施方案中，crRNA与tracrRNA被接头核苷酸序列分开。一般而言，为避免二级结构在该接头核苷酸序列的核苷酸内的形成或避免包含该接头核苷酸序列的核苷酸的二级结构的形成，接头核苷酸序列为不包括互补碱基的核苷酸序列。在一些实施方案中，crRNA与tracrRNA之间的接头核苷酸序列的长度为至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12个或更多个核苷酸。在特定实施方案中，单指导RNA的接头核苷酸序列的长度为至少4个核苷酸。在某些实施方案中，接头核苷酸序列为如SEQ ID NO:136所示的核苷酸序列。在其他实施方案中，接头核苷酸序列的长度为至少6个核苷酸。

可化学合成或通过体外转录合成该单指导RNA或双指导RNA。用于确定RGN与指导RNA之间的序列特异性结合的测定为本领域中所知、并且包括但不限于所表达RGN与该指导RNA之间的体外结合测定，其可用可检测标记(如生物素)标记并用于下拉检测测定，其中，该指导RNA:RGN复合物是通过该可检测标记(例如，利用链霉抗生物素蛋白珠)捕获的。具与该指导RNA无关的序列或结构的对照指导RNA可用作该RGN与RNA之非特异性结合的阴性对照。在某些实施方案中，指导RNA为SEQ ID NO:129至135及310中任一个，其中该间隔序列可为任何序列且被指示为poly-N序列。

在某些实施方案中，指导RNA可作为RNA分子而被引入目标细胞、细胞器或胚胎中。可以体外转录或化学合成该指导RNA。在其他实施方案中，将编码该指导RNA的核苷酸序列引入该细胞、细胞器或胚胎中。在这些实施方案中的一些实施方案中，编码该指导RNA的核苷酸序列可操作地被连接至启动子(例如，RNA聚合酶III启动子)。该启动子可为天然启动子或与该指导RNA编码的核苷酸序列异源。

在各种实施方案中，如本文所述，指导RNA可作为核糖核蛋白复合物而被引入目标细胞、细胞器或胚胎中，其中该指导RNA与RNA指导核酸酶多肽结合。

指导RNA通过该指导RNA与该目标核苷酸序列的杂交而将关联RNA指导核酸酶导向至所关注的特定目标核苷酸序列。目标核苷酸序列可包含DNA、RNA或二者的组合，且可为单链或双链的。目标核苷酸序列可为基因组DNA(即，染色体DNA)、质粒DNA、或RNA分子(例如，信使RNA、核糖体RNA、转运RNA、微RNA、小干扰RNA)。该目标核苷酸序列可在体外或在细胞中被RNA指导核酸酶结合(而在一些实施方案中，被切割)。该RGN所靶向的染色体序列可为细胞核、质体或线粒体染色体序列。在一些实施方案中，目标核苷酸序列在该目标基因组中是唯一的。

在一些实施方案中，目标核苷酸序列与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻。在某些实施方案中，双链目标序列的切割依赖于PAM的存在，而单链目标序列的切割不依赖于PAM。前间隔序列邻近基序一般在距该目标核苷酸序列约1至约10个核苷酸内，包括距该目标核苷酸序列约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10个核苷酸。该PAM可为该目标序列的5'或3'。在一些实施方案中，该PAM为本发明公开的RGN的目标序列的5'。一般而言，该PAM是约3-4个核苷酸的共有序列，但在特定实施方案中，PAM的长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，PAM为该目标序列的5'，且富含T。

在一些实施方案中，RGN分别与包含SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309中任一个所示的CRISPR重复序列或其活性变体或片段及SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148中任一个分别所示的tracrRNA序列或其活性变体或片段的指导序列结合。该RGN系统被进一步描述于本说明书的实施例1及表1中。

本领域中众所周知，PAM序列对给定核酸酶的特异性受酶浓度的影响(参见，例如，Karvelis等人，(2015)Genome Biol 16：253)，其可以通过改变用于表达该RGN的启动子或被递送至该细胞、细胞器或胚胎的核糖核蛋白复合物的量来修饰。

在通过该RGN的结合及切割依赖于PAM序列的这些实施方案中，在识别其对应的PAM序列时，RGN可在特异性切割位点切割该目标核苷酸序列。如本文所使用的，切割位点是由目标核苷酸序列内的两个特定核苷酸组成，其之间的核苷酸序列被RGN切割。该切割位点可包含在5'或3'方向上自该PAM起的第1和第2、第2和第3、第3和第4、第4和第5、第5和第6、第7和第8、或第8和第9个核苷酸。在一些实施方案中，切割位点可在5'或3'方向上自该PAM起的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个以上的核苷酸。在一些实施方案中，切割位点距离该PAM 4个核苷酸。在其他实施方案中，切割位点距离该PAM至少15个核苷酸。因RGN可切割目标核苷酸序列，导致交错的末端，所以，在一些实施方案中，基于该多核苷酸的正(+)链上的两个核苷酸离开该PAM的距离及该多核苷酸的负(-)链上的两个核苷酸离开该PAM的距离来定义该切割位点。

IV.编码RNA指导核酸酶、CRISPR RNA和/或tracrRNA的核苷酸

本公开内容提供包含本发明公开的CRISPR RNA、tracrRNA和/或sgRNA的多核苷酸及包含编码本发明公开的RNA指导核酸酶、CRISPR RNA、tracrRNA和/或sgRNA的核苷酸序列的多核苷酸。本发明公开的多核苷酸包括包含或编码CRISPR重复序列的那些多核苷酸，该CRISPR重复序列包含SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309的核苷酸序列中任一个或其活性变体或片段，其当被包含于指导RNA内时能够将关联RNA指导核酸酶的序列特异性结合导向至所关注的目标序列。还公开了包含或编码tracrRNA的多核苷酸，该tracrRNA包含SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148的核苷酸序列中任一个或其活性变体或片段，其当被包含于指导RNA内时能够将关联RNA指导核酸酶的序列特异性结合导向至所关注的目标序列。还提供编码RNA指导核酸酶的多核苷酸，该RNA指导核酸酶包含如SEQ ID NO:1至109所示的氨基酸序列中任一个及其活性片段或变体，其保持以RNA指导的序列特异性方式结合至目标核苷酸序列的能力。

术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开内容局限于包含DNA的多核苷酸，但可考虑这样的DNA多核苷酸。本领域技术人员将认识到多核苷酸可包含核糖核苷酸(RNA)及核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子及合成类似物二者。这些包括例如肽核酸(PNA)、PNA-DNA嵌合体(chimer)、锁核酸(LNA)和硫代磷酸酯连接序列。本文所公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、DNA-RNA杂合体、三链螺旋结构、茎环结构、环状形式(例如，包括环状RNA)等等。

在一些实施方案中，编码RGN的核酸分子可针对在所关注的生物体中的表达而被密码子优化。“密码子优化的”编码序列为使其密码子使用频率设计成模拟优选密码子使用频率或特定宿主细胞的转录条件的多核苷酸编码序列。由于核酸水平上的一种或多种密码子的改变使得翻译的氨基酸序列未改变，所以该特定宿主细胞或生物体中的表达被增强。核酸分子可以全部或部分地被密码子优化。密码子表和提供一大范围生物体的偏好信息的其他参考文献在本领域中是可得的(参见，例如，Campbell及Gowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11，有关植物优选密码子使用的讨论)。本领域中用于合成植物优选基因的方法是可得的。参见，例如，第5,380,831号和第5,436,391号美国专利及Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，它们通过引用并入本文。

在一些实施方案中，可在表达盒中提供编码本文中提供的RGN、crRNA、tracrRNA和/或sgRNA的多核苷酸，以用于在体外表达或在所关注的细胞、细胞器、胚胎或生物体中表达。该盒可包括5'和3'调节序列，该5'和3'调节序列可操作地连接至编码本文中提供的允许该多核苷酸表达的RGN、crRNA、tracrRNA和/或sgRNA的多核苷酸。该盒可额外含有至少一种额外基因或基因元件，以共转化至该生物体内。如果包括额外基因或元件，则该组成被可操作地连接。术语“可操作地连接”旨在表达两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，启动子与所关注的编码区域(例如，对RGN、crRNA、tracrRNA和/或sgRNA编码的区域)之间的可操作地连接为允许所关注的编码区域表达的功能性连接。可操作地连接的元件可为连续的或非连续的。当用于指两个蛋白质编码区域的连接时，通过可操作地连接意指该编码区域在相同的阅读框中。作为另一种选择，可在多个表达盒上提供额外基因或元件。例如，编码本发明公开的RGN的核苷酸序列可存在于一个表达盒上，而编码crRNA、tracrRNA或完整指导RNA的核苷酸序列可在分开的表达盒上。这样的表达盒被提供有多个限制性位点和/或重组位点，以使该多核苷酸的插入受调节区域的转录调节。该表达盒可额外含有选择性标记基因。

该表达盒在该5'-3'转录方向上可包括：转录(而在一些实施方案中，翻译)起始区域(即，启动子)、本发明的RGN-、crRNA-、tracrRNA-和/或sgRNA-编码多核苷酸和在所关注的生物体中起作用的转录(而在一些实施方案中，翻译)终止区域(即，终止区域)。本发明的启动子能够在宿主细胞中导向或驱动编码序列的表达。该调节区域(例如，启动子、转录调节区域和翻译终止区域)可与该宿主细胞或彼此为内源的或异源的。如本文所使用的，关于序列的“异源”为源自外来物种的序列，或者，如果来自相同物种，则为通过精心的人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式被实质上修饰的序列。如本文中所使用的，嵌合基因包含与转录起始区域可操作地连接的编码序列，该转录起始区域与该编码序列是异源的。

方便的终止区域可从根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒获得，诸如，章鱼碱合酶及胭脂碱合酶终止区域。也可参见Guerineau等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人，(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人，(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等人，(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。

额外调节信号包括但不限于：转录起始初始位点(transcriptional initiationstart site)、操纵基因、激活子、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等等。参见，例如，第5,039,523号和第4,853,331号美国专利；EPO 0480762A2；Sambrook等人，(1992)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,ed.Maniatis等人，(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.))，后称“Sambrook 11”；Davis等人，eds.(1980)Advanced BacterialGenetics(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约((Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)))以及其中引用的参考文献。

在制备表达盒时，可操纵各种DNA片段，以便在适宜的取向上及恰当的情况下在适宜的阅读框中对该DNA序列进行提供。为此，可以运用衔接蛋白或接头来连接该DNA片段，或者可涉及其他操纵以对方便的限制位点、除去多余的DNA、除去限制位点等进行提供。为此目的，可涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、重新置换，例如，转换和颠换。

很多启动子可用于本发明的实施。可基于期望结局来选择启动子。该核酸可以与组成型、诱导型、生长阶段特异性、细胞类型特异性、组织优选、组织特异性的启动子或其他启动子组合，用于所关注的生物体中的表达。参见，例如，WO 99/43838中及第8,575,425号；第7,790,846号；第8,147,856号；第8,586832号；第7,772,369号；第7,534,939号；第6,072,050号；第5,659,026号；第5,608,149号；第5,608,144号；第5,604,121号；第5,569,597号；第5,466,785号；第5,399,680号；第5,268,463号；第5,608,142号；以及第6,177,611号美国专利中所示的启动子；它们通过引用并入本文。

对于在植物中的表达，组成型启动子也包括CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632及Christensen等人，(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；和MAS(Velten等人，(1984)EMBOJ.3：2723-2730)。

诱导型启动子的实例为：可通过缺氧或冷应激诱导的Adh1启动子、可通过热应激诱导的Hsp70启动子、可由光诱导的PPDK启动子及PEP羧化酶(pepcarboxylase)启动子。同样有用的为化学诱导型的启动子，诸如，安全剂诱导的In2-2启动子(第5,364,780号美国专利)、生长素诱导的且是绒毡层特异性的但在愈合组织中也有活性的Axig1激活子(PCTUS01/22169)、类固醇反应性启动子(参见，例如，Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425及McNellis等人，(1998)Plant J.14(2)：247-257中的雌激素诱导的ERE启动子和糖皮质激素诱导型启动子)和四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(参见，例如，Gatz等人，(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237及第5,814,618号和第5,789,156号美国专利)，它们通过引用并入本文。

可采用组织特异性或组织优选的启动子来靶向特定组织内的表达构建体的表达。在某些实施方案中，组织特异性或组织优选的启动子在植物组织中是有活性的。在植物中受发育控制的启动子的实例包括在诸如叶、根、果实、种子或花的某些组织中优选地起始转录的启动子。“组织特异性”启动子为仅在某些组织中起始转录的启动子。与基因的组成型表达不同，组织特异性表达是几种水平的基因调节相互作用的结果。因此，来自同源或密切相关的植物物种的启动子可优选地用于在特定组织中实现转基因的有效且可靠的表达。在一些实施方案中，表达包含组织优选的启动子。“组织优选的”启动子是优选地在，但不一定完全在或仅在某些组织中起始转录的启动子。

在一些实施方案中，编码RGN、crRNA和/或tracrRNA的核酸分子包含细胞类型特异性启动子。“细胞类型特异性”启动子为主要在一种或多种器官的某些细胞类型中驱动表达的启动子。例如，其中在植物中起作用的细胞类型特异性启动子可为主要活性的植物细胞的一些实例包括BETL细胞、根、叶中的维管细胞、柄细胞和茎细胞。核酸分子还可包括细胞类型优选的启动子。“细胞类型优选的”启动子为主要驱动大部分在，但不一定完全在或仅在一种或多种器官中的某些细胞类型中的表达的启动子。例如，其中在植物中起作用的细胞类型优选的启动子可具优选活性的植物细胞的一些实例包括BETL细胞、根、叶中的维管细胞、柄细胞和茎细胞。

编码该RGN、crRNA、tracrRNA和/或sgRNA的核酸序列可与例如通过用于体外mRNA合成的噬菌体RNA聚合酶识别的启动子序列可操作地连接。在此类实施方案中，可纯化该体外转录的RNA，以用于本文所述的方法。例如，该启动子序列可为T7、T3或SP6启动子序列，或T7、T3或SP6启动子序列的变体。在此类实施方案中，可纯化所表达蛋白和/或RNA，以用于本文所述的基因组修饰方法。

在某些实施方案中，编码该RGN、crRNA、tracrRNA和/或sgRNA的多核苷酸也可与多腺苷酸化信号(例如，SV40 polyA信号及植物中起作用的其他信号)和/或至少一个转录终止序列连接。另外，编码该RGN的序列也可与编码至少一个核定位信号、至少一个细胞穿透域和/或能够将蛋白质运输到特定亚细胞位置的至少一个信号肽的序列连接，如本文中别处所述。

编码该RGN、crRNA、tracrRNA和/或sgRNA的多核苷酸可存在于一个载体或多个载体中。“载体”是指用于将核酸转移、递送或引入宿主细胞内的多核苷酸组合物。适合的载体包括质粒载体、噬菌粒、粘粒、人工/微型染色体、转座子和病毒载体(例如，慢病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体)。该载体可包含额外的表达控制序列(例如，增强子序列、Kozak序列、多腺苷酸化序列、转录终止序列)、选择性标记序列(例如，抗生素抗性基因)、复制起点等等。额外信息可在“Current Protocols in Molecular Biology”Ausubel等人，John Wiley&Sons，纽约，2003；或“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”Sambrook&Russell，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,3rd edition,2001中找到。

该载体也可包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。对于转化的细胞或组织的选择采用选择性标记基因。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因，诸如，编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因；以及对诸如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮及2,4-二氯苯氧乙酸盐(2,4-D)的除草性化合物赋予抗性的基因。

在一些实施方案中，包含编码该RGN多肽的序列的表达盒或载体还可包含编码crRNA和/或tracrRNA或者被组合以产生指导RNA的crRNA及tracrRNA的序列。编码该crRNA和/或tracrRNA的序列可与至少转录控制序列可操作地连接，用于该crRNA和/或tracrRNA在所关注的生物体或宿主细胞中的表达。例如，编码该crRNA和/或tracrRNA的多核苷酸可与通过RNA聚合酶III(Pol III)识别的启动子序列可操作地连接。适合的Pol III启动子的实例包括但不限于哺乳动物U6、U3、H1及7SL RNA启动子及水稻U6及U3启动子。

如所指示的，包含编码该RGN、crRNA、tracrRNA和/或sgRNA的核苷酸序列的表达构建体可用于转化所关注的生物体。用于转化的方法涉及将核苷酸构建体引入所关注的生物体内。通过“引入”旨在将该核苷酸构建体引至该宿主细胞，由此使得该构建体进入该宿主细胞内部。本发明的方法不需要一种将核苷酸构建体引至宿主生物体，但是该核苷酸构建体进入宿主生物体的至少一个细胞内部的特定方法。该宿主细胞可为真核细胞或原核细胞。在特定实施方案中，真核宿主细胞为植物细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。用于将核苷酸构建体引入植物及其他宿主细胞内的方法为本领域中已知，其包括但不限于：稳定转化方法、瞬时转化方法及病毒介导方法。

这些方法得到转化的生物体，诸如植物，包括：整株植物以及植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚胎及其后代。植物细胞可被分化，也可不被分化(例如，愈合组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因生物体”或“转化生物体”或“稳定转化的”生物体或细胞或组织是指已并入或整合了编码本发明的RGN、crRNA和/或tracrRNA的多核苷酸的生物体。应当认识到，其他外源或内源核酸序列或DNA片段也可被并入该宿主细胞内。农杆菌介导及基因枪介导的转化仍然为用于植物细胞转化而主要采用的两种方法。然而，宿主细胞的转化可通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微投影(microprojection)、基因枪或粒子轰击、电穿孔、二氧化硅/碳纤维、超声介导的、PEG介导的、磷酸钙共沉淀、聚阳离子DMSO技术、DEAE葡聚糖程序和病毒介导的、脂质体介导的等等进行。编码RGN、crRNA和/或tracrRNA的多核苷酸的病毒介导的引入包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒介导的引入及表达，以及花椰菜花叶病毒、双生病毒和RNA植物病毒的使用。

转化操作流程以及用于将多肽或多核苷酸序列引入植物内的操作流程可随针对转化所靶向的宿主细胞的类型(例如，单子叶植物或双子叶植物细胞)而不同。用于转化的方法为本领域中已知，且包括第8,575,425号、第7,692,068号、第8,802,934号、第7,541,517号美国专利中阐述的那些方法，这些专利中的每一篇都通过引用并入本文。也可参见Rakoczy-Trojanowska,M.(2002)Cell Mol Biol Lett.7：849-858；Jones等人，(2005)Plant Methods 1：5；Rivera等人，(2012)Physics of Life Reviews 9：308-345；Bartlett等人，(2008)Plant Methods 4：1-12；Bates,G.W.(1999)Methods in Molecular Biology111：359-366；Binns及Thomashow(1988)，Microbiology 42：575-606中的Annual Reviews；Christou,P.(1992)The Plant Journal 2：275-281；Christou,P.(1995)Euphytica 85：13-27；Tzfira等人，(2004)TRENDS in Genetics 20：375-383；Yao等人，(2006)Journal ofExperimental Botany 57:3737-3746；Zupan和Zambryski(1995)Plant Physiology 107：1041-1047；Jones等人，(2005)Plant Methods 1：5。

转化可导致核酸稳定或瞬时并入细胞内。“稳定转化”旨在表达引入宿主细胞内的核苷酸构建体整合至该宿主细胞的基因组内，且能够被其后代遗传。“瞬时转化”旨在表达多核苷酸被引入该宿主细胞内而不整合至该宿主细胞的基因组内。

用于叶绿体转化的方法为本领域中已知。参见，例如，Svab等人，(1990)Proc.Nail.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab及Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：913-917；Svab及Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。该方法取决于含有选择性标记的DNA的粒子枪递送及通过同源重组将该DNA靶向至该质体基因组。另外，质体转化可通过细胞核编码的及质体导向的RNA聚合酶的组织优选表达来反式活化(transactivation)沉默质体携带的转基因来完成。McBride等人(1994)在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305已报导了此系统。

已经被转化的细胞可按照传统方式生长成转基因生物体，诸如，植物。参见，例如，McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后，可以使这些植物生长，且用相同转化品系或不同品系授粉，且鉴定出具有期望表型特征的组成型表达的所得杂合体。可生长两代或更多代，以确保稳定维持并遗传期望表型特征的表达，然后，收获种子，以确保已经达成期望表型特征的表达。以此方式，本发明提供具有稳定地并入其基因组内的本发明的核苷酸构建体(例如，本发明的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。

作为另一种选择，可将已被转化的细胞引入生物体内。这些细胞可源自该生物体，其中该细胞以离体措施被转化。

本文提供的序列可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物及双子叶植物。所关注的植物的实例包括但不限于：玉蜀黍(玉米)、高粱、小麦、向日葵、西红柿、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜、芸苔属物种(Brassica sp.)、苜蓿、黑麦、小米、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲胡桃、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物以及针叶树。

蔬菜包括但不限于：西红柿、莴苣、绿豆、青豆、豌豆和诸如黄瓜(cucumber)、哈密瓜(cantaloupe)及香瓜(musk melon)的黄瓜(Curcumis)属的成员。观赏植物包括但不限于：杜鹃花、绣球花、芙蓉、玫瑰、郁金香、水仙、矮牵牛、康乃馨、猩猩木和菊花。优选地，本发明的植物为农作物(例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、西红柿、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等)。

如本文所使用的，术语“植物”包括：植物细胞、植物原生质体、植物可再生所自的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物的诸如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶子、花、枝、果实、仁、穗、玉米穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等等的局部中是完整的植物细胞。谷物旨在表达出于种植或繁殖该物种之外的目的而由商业种植者生产的成熟种子。再生植物的后代、变体及突变体也包括于本发明的范围内，前提条件是这些局部包含所引入的多核苷酸。还提供了保持了本文中公开的序列的经处理的植物产品或副产物，例如，包括豆粕。

编码该RGN、crRNA和/或tracrRNA的多核苷酸也可用于转化任何原核物种，包括但不限于：古菌和细菌(例如，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、根瘤菌属(Rhizobiumsp.)、埃希氏菌属(Escherichiasp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、志贺氏杆菌属(Shigella sp.)、弧菌属(Vibriosp.)、耶尔森菌属(Yersinia sp.)、支原体菌属(Mycoplasma sp.)、农杆菌属(Agrobacterium)、乳酸乳杆菌属(Lactobacillus sp.))。

编码该RGN、crRNA和/或tracrRNA的多核苷酸可用于转化任何真核物种，包括但不限于：动物(例如，哺乳动物、昆虫、鱼类、鸟类和爬行动物)、真菌、变形虫、藻类和酵母。

传统的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将核酸引入哺乳动物细胞或目标组织中。这样的方法可用于将编码CRISPR系统组成的核酸施用培养中的细胞、或宿主生物体中的细胞。非病毒载体递送系统包括：DNA质粒、RNA(例如，本文描述的载体的转录物)、裸核酸和与诸如脂质体的递送载剂复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA及RNA病毒，其在递送至细胞后具有附加型或整合的基因组。有关基因治疗程序的综述，参见Anderson，Science 256：808-813(1992)；Nabel&Feigner，TIBTECH 11：211-217(1993)；Mitani&Caskey，TIBTECH 11：162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11：167-175(1993)；Miller，Nature357：455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology 6(10)：1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience 8：35-36(1995)；Kremer&Perricaudet，British Medical Bulletin 51(1)：31-44(1995)；Haddada等人，于Current Topics inMicrobiology and Immunology,Doerfler及Bohm(编者)(1995)；和Yu等人，Gene Therapy1：13-26(1994)。

核酸的非病毒递送方法包括脂质体转染(lipofection)、核转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒颗粒和DNA的药剂增强摄取。例如，第5,049,386号、第4,946,787号和第4,897,355号美国专利中描述了脂质体转染，且脂质体转染试剂是市售的(例如，Transfectam^TM及Lipofectin^TM)。适合用于多核苷酸的有效受体识别脂质体转染的阳离子及中性脂质包括Feigner的WO 91/17424；WO 91/16024中的那些阳离子和中性脂质。递送可为至细胞(例如，在体外或离体施用)或目标组织(例如，体内施用)。包括靶向的脂质体诸如免疫脂质复合物的脂质:核酸复合物的制备为本领域技术人员所熟知(参见，例如，Crystal，Science 270：404-410(1995)；Blaese等人，Cancer Gene Ther.2：291-297(1995)；Behr等人，Bioconjugate Chem.5：382-389(1994)；Remy等人，Bioconjugate Chem.5：647-654(1994)；Gao等人，Gene Therapy 2：710-722(1995)；Ahmad等人，Cancer Res.52：4817-4820(1992)；第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号和第4,946,787号美国专利)。

使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送核酸利用高度进化的过程将病毒靶向至体内的特异性细胞且将该病毒载荷运输至该细胞核。病毒载体可被直接施用患者(体内)，或者该病毒载体可用于体外处理细胞，并且可视情况将经修饰的细胞施用患者(离体)。传统的基于病毒的系统可包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺关联及单纯疱疹病毒载体。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法，在宿主基因组中的整合是可能的，常常导致所插入的转基因的长期表达。另外，在许多不同细胞类型及目标组织中已经观察到高转导效率。

可通过并入外来包膜蛋白而改变逆转录病毒的向性(tropism)，从而扩展目标细胞的潜在目标群体。慢病毒载体为能够转导或感染非分裂细胞并且通常情况下产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择将依赖于该目标组织。逆转录病毒载体由顺式作用长末端重复序列构成，该顺式作用长末端重复序列具有达到6-10kb外来序列的包装能力。最小顺式作用LTR足够用于载体的复制及包装，然后，使用其将治疗基因整合至该目标细胞内，以提供永久转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括：基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其组合的载体(参见，例如，Buchscher等人，J.Viral.66：2731-2739(1992)；Johann等人，J.Viral.66：1635-1640(1992)；Sommnerfelt等人，Viral.176：58-59(1990)；Wilson等人，J.Viral.63：2374-2378(1989)；Miller等人，1.Viral.65：2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。

在优选瞬时表达的应用中，可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中有非常高的转导效率，并且不需要细胞分裂。用这样的载体，已经获得了高滴度及高表达水平。此载体可在相对简单的系统中大量产生。腺相关病毒(“AAV”)载体也可例如在核酸及肽的体外产生中用于用目标核酸转导细胞，且用于体内及离体基因治疗程序(参见，例如，West等人，Virology 160：38-47(1987)；第4,797,368号美国专利；WO 93/24641；Katin，Human Gene Therapy 5：793-801(1994)；Muzyczka,1.Clin.Invest.94：1351(1994))。重组AAV载体的构建描述于很多出版物中，包括第5,173,414号美国专利；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.5：3251-3260(1985)；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.4：2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka，PNAS 81：6466-6470(1984)；和Samulski等人，1.Viral.63：03822-3828(1989)。包装细胞通常情况下用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这样的细胞包括包装腺病毒的293细胞和包装逆转录病毒的ψJ2细胞或PA317细胞。

基因治疗中使用的病毒载体通常通过产生将核酸载体包装于病毒颗粒内的细胞系而被产生。该载体通常情况下含有用于包装且随后整合至宿主内所需的最小病毒序列，其他病毒序列被用于要表达的多核苷酸的表达盒置换。缺失的病毒功能通常情况下通过该包装细胞系以反式提供。例如，基因治疗中使用的AAV载体通常情况下仅具有来自包装及整合至该宿主基因组内所需的AAV基因组的ITR序列。病毒DNA被包装于细胞系中，该细胞系含有辅助质粒，其编码其他AAV基因，即，rep和cap，但缺少ITR序列。

也可用腺病毒作为辅助病毒来感染该细胞系。该辅助病毒促进AAV载体的复制及来自该辅助质粒的AAV基因的表达。由于缺少ITR序列，未以显著量包装该辅助质粒。腺病毒的污染可通过例如热处理来降低，腺病毒对该热处理比AAV更敏感。将核酸递送至细胞的额外方法为本领域技术人员已知。参见，例如，US20030087817，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，用本文描述的一种或多种载体瞬时地或非瞬时地转染宿主细胞。在一些实施方案中，细胞如其天然存在于个体中那样被转染。在一些实施方案中，被转染的细胞取自个体。在一些实施方案中，细胞来源于取自个体的细胞，诸如细胞系。用于组织培养的各种细胞系为本领域中已知。细胞系的实例包括但不限于：C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLaS3、Huhl、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCel l、Panel、PC-3、TFl、CTLL-2、CIR、Rat6、CVI、RPTE、AlO、T24、182、A375、ARH-77、Calul、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388Dl、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、lurkat、145.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4.COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴肾上皮细胞、BALB/3T3小鼠胚胎成纤维细胞、3T3 Swiss、3T3-Ll、132-d5人胎儿成纤维细胞；10.1小鼠成纤维细胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-I细胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10Tl/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-Kl、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr-/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L235010、CORL23/R23、COS-7、COV-434、CML Tl、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepalclc7、HL-60、HMEC、HT-29、lurkat、lY细胞、K562细胞、Ku812、KCL22、KGl、KYOl、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-l0A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCKII、MDCKII、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-lA、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT细胞系、Peer、PNT-lA/PNT2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2细胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THPl细胞系、U373、U87、U937、VCaP、Vero细胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR和其转基因品种。细胞系可从本领域技术人员已知的各种来源获得(参见，例如，美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(马纳沙斯，VA.))。

在一些实施方案中，使用用本文描述的一种或多种载体转染的细胞建立包含一种或多种来源于载体的序列的新细胞系。在一些实施方案中，使用用如本文描述的CRISPR系统的组成瞬时转染(诸如，通过一种或多种载体的瞬时转染，或用RNA转染)并通过CRISPR复合物的活性修饰的细胞建立包含含有该修饰但缺少任何其他外源序列的细胞的新细胞系。在一些实施方案中，使用用本文描述的一种或多种载体瞬时或非瞬时转染的细胞或来源于这样的细胞的细胞系来评估一种或多种测试化合物。

在一些实施方案中，使用本文描述的一种或多种载体来产生非人的转基因动物或转基因植物。在一些实施方案中，转基因动物为哺乳动物，诸如，小鼠、大鼠或兔子。

V.多肽及多核苷酸的变体及片段

本公开内容提供天然存在的(即，野生型)RNA指导核酸酶的活性变体及片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1至109所示；以及天然存在的CRISPR重复序列的活性变体和片段，诸如，SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309所示的序列；和天然存在的tracrRNA的活性变体和片段，诸如，SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148所列的序列；和编码其的多核苷酸。还提供诸如SEQ ID NO:178-192所示的序列的天然存在的RGN辅助蛋白的活性变体及片段。

尽管与所关注的多核苷酸或多肽相较下可以改变变体或片段的活性，但该变体和片段应保持所关注的多核苷酸或多肽的功能。例如，当与所关注的多核苷酸或多肽相较时，变体或片段可具有增加的活性、降低的活性、不同的活性谱或活性的任何其他改变。

诸如本文所公开的天然存在的RGN多肽的片段及变体将保持序列特异性的RNA指导的DNA结合活性。在特定实施方案中，诸如本文所公开的天然存在的RGN多肽的片段及变体将保持核酸酶活性(单链或双链)。

当指导RNA(包含tracrRNA)的局部以序列特异性方式结合至RNA指导核酸酶(与指导RNA复合的)且将RNA指导核酸酶(与指导RNA复合的)指导至目标核苷酸序列时，诸如本文所公开的天然存在的CRISPR重复序列的片段及变体将保持该能力。

诸如本文所公开的天然存在的tracrRNA的片段及变体当作为指导RNA(包含CRISPR RNA)的局部时将保持以序列特异性方式将RNA指导核酸酶(与该指导RNA复合的)指导至目标核苷酸序列的能力。

诸如本文所公开的天然存在的RGN辅助蛋白的片段及变体(当RGN系统(即，RGN蛋白及指导RNA)的局部时)将保持允许该RGN系统以序列特异性方式与目标核苷酸序列结合的能力。

术语“片段”是指本发明的多核苷酸或多肽序列的部分。“片段”或“生物活性部分”包括多核苷酸，该多核苷酸包含足够数量的连续核苷酸，以保持该生物活性(即，当包含于指导RNA内时，结合RNA至并以序列特异性方式将RGN导向至目标核苷酸序列)。“片段”或“生物活性部分”包括多肽，该多肽包含足够数量的连续氨基酸残基，以保持该生物活性(即，当与指导RNA复合时，以序列特异性方式与目标核苷酸序列结合)。该RGN蛋白的片段包括由于替代的下游初始位点的使用而比全长序列短的那些。RGN蛋白的生物活性部分可为包含例如SEQ ID NO:1至109的10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600个或更多个连续氨基酸残基的多肽。可通过重组技术制备这些生物活性部分且评估其序列特异性的RNA指导的DNA结合活性。CRISPR重复序列的生物活性片段可包含SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309中任一个的至少8个连续氨基酸。CRISPR重复序列的生物活性部分可为包含例如SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309中任一个的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的多核苷酸。tracrRNA的生物活性部分可为包含例如SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148中任一个的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80个或更多个连续核苷酸的多核苷酸。该RGN辅助蛋白的片段包括由于替代的下游初始位点的使用而比该全长序列短的那些。RGN辅助蛋白的生物活性部分可为包含例如SEQ ID NO:178至192的10、25、50、100、150、200个或更多个连续氨基酸残基的多肽。可通过重组技术制备这些生物活性部分且评估其生物活性。

一般而言，“变体”旨在指实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含于天然多核苷酸内的一种或多种内部位点处的一种或多种核苷酸的缺失和/或添加和/或在天然多核苷酸中一种或多种位点处的一种或多种核苷酸的置换。如本文所使用的，“天然”或“野生型”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括因为该基因密码的简并性而编码所关注基因的天然氨基酸序列的那些序列。与例如用下面概述的聚合酶链式反应(PCR)及杂交技术一样，可用众所周知的分子生物学技术鉴定诸如这些的天然存在的等位基因变体。变体多核苷酸还包括合成取得的多核苷酸，诸如通过使用定点诱变产生的但其仍然编码所关注的多肽或多核苷酸的那些。一般而言，本文所公开的特定多核苷酸的变体与如通过本文别处描述的序列比对程序及参数所确定的那个特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。

本文所公开的特定多核苷酸(即，该参考多核苷酸)的变体还可通过比较通过变体多核苷酸所编码的多肽与通过该参考多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分比来评估。可使用本文别处描述的序列比对程序及参数来计算任何两个多肽之间的序列同一性百分比。当通过两个多肽共有的序列同一性百分比的比较来评估本文所公开的任何给定的多核苷酸对时(其编码该两个多肽)，该两个编码多肽之间的序列同一性百分比为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。

在特定实施方案中，本发明公开的多核苷酸编码RNA指导核酸酶多肽，该RNA指导核酸酶多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:1至109中任一个的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。

本发明的RGN多肽的生物活性变体可相差少至约1-15个氨基酸残基、少至约1-10个(诸如，约6-10个)、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个、或少至1个氨基酸残基。在具体实施方案中，多肽可包含N端或C端截短，该截短可至少包含从该多肽的N端或C端缺失10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600个或更多个氨基酸。

在某些实施方案中，本发明公开的多核苷酸编码RNA指导核酸酶辅助多肽，该RNA指导核酸酶辅助多肽包含与SEQ ID NO:178至192中任一个的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的核苷酸序列。

本发明的RGN辅助多肽的生物活性变体可相差少至约1-15个氨基酸残基、少至约1-10个(诸如，约6-10个)、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个、或少至1个氨基酸残基。在具体实施方案中，多肽可包含N端或C端截短，其可至少包含从该多肽的N端或C端缺失10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200个或更多个氨基酸。

在某些实施方案中，本发明公开的多核苷酸包含或编码CRISPR重复序列，该CRISPR重复序列包含与如SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309所示的核苷酸序列中任一个具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的核苷酸序列。

本发明公开的多核苷酸可包含或编码tracrRNA，该tracrRNA包含与如SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148所示的核苷酸序列中任一个具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的核苷酸序列。

本发明的CRISPR重复序列或tracrRNA的生物活性变体可相差少至约1-15个核苷酸、少至约1-10个(诸如，约6-10个)、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个、或少至1个核苷酸。在具体实施方案中，多核苷酸可包括5'或3'截短，该截短可至少包含从该多核苷酸的5'或3'端缺失10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80个或更多个核苷酸。

应当认识到，可对本文提供的RGN多肽、CRISPR重复序列及tracrRNA进行修饰，从而产生变体蛋白质及多核苷酸。可通过定点诱变技术的应用来引入人设计的变化。作为另一种选择，在结构上和/或功能上与本文所公开的序列有关的天然的、尚未知晓的或尚未被鉴定的多核苷酸和/或多肽也可被认为落入本发明的范围内。可在不改变该RGN蛋白功能的非保守区域中进行保守氨基酸置换。作为另一种选择，可进行改良该RGN的活性的修饰。

变体多核苷酸和蛋白质还涵盖自诸如DNA混编(DNA shuffling)的诱变及重组程序取得的序列及蛋白质。用这种程序，操纵本文所公开的一种或多种不同的RGN蛋白质(例如，SEQ ID NO:1至109)，以产生具有期望特性的新RGN蛋白质。以这种方式，重组多核苷酸文库是自包含序列区域的有关序列多核苷酸的群体产生的，该序列区域具有实质的序列同一性且可在体外或体内同源重组。例如，使用这种措施，编码所关注域的序列基序可在本文提供的RGN序列与其他已知RGN基因之间混编，以获得编码具有所关注的改良特性(诸如在酶的情况中，增加的K_m)的蛋白质的新基因。这种DNA混编的策略是本领域中已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Crameri等人，(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人，(1998)Nature 391：288-291；和第5,605,793号及第5,837,458号美国专利。“混编的”核酸为通过混编程序(诸如本文阐述的任何混编程序)产生的核酸。混编的核酸为通过例如以人工方式及视情况而定的递归方式(实体或虚拟地)重组两个或更多个核酸(或字符串)产生的。一般而言，混编过程中使用一种或多种筛选步骤来鉴定所关注的核酸；此筛选步骤可在任何重组步骤之前或之后进行。在一些(但不是全部)混编实施方案中，期望在选择之前进行多轮重组，以增加要筛选的池的多样性。重组及选择的整个过程可视情况递归地重复。依赖于背景，混编可是指重组及选择的整个过程，或者，作为另一种选择，可仅是指该整个过程的重组部分。

如本文在两个多核苷酸或多肽序列的背景中所使用的“序列同一性”或“同一性”涉及到当在指定的比较窗上比对最大对应性时为相同的两个序列中的残基。当使用与蛋白质有关的序列同一性百分比时，应当认识到，不相同的残基位置常常通过保守氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基置换具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，且因此不改变分子的功能性质。当序列在保守置换方面不同时，可上调序列同一性百分比，以校正该置换的保守性质。通过这种保守置换而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调整的手段为本领域技术人员所熟知。通常情况下，此涉及将保守置换作为一部分错配而非完全错配进行评分，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，当对相同的氨基酸给予1分，而对非保守置换给予零分时，对保守置换给予0与1之间的得分。例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中所实施的那样，计算保守置换的得分。

如本文所使用的，“序列同一性百分比”是指通过在比较窗上比较两个最佳比对序列所确定的值，其中该多核苷酸序列在该比较窗中的部分可包含相较于用于该两个序列的最佳比对的参考序列(不包含添加或缺失)的添加或缺失(即，空位)。通过确定在两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目来求得匹配位置的数目；将匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数；且将该结果乘以100，求得序列同一性百分比，来计算该百分比。

除非另有说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10使用以下参数获得的值：使用GAP权重50及长度权重3及nwsgapdna.cmp评分矩阵的核苷酸序列的同一性％及相似性％；使用GAP权重8及长度权重2及BLOSUM62评分矩阵的氨基酸序列的同一性％及相似性％；或其任何等效程序。通过“等效程序”是指：对于所涉及的任何两个序列，当与GAP版本10产生的对应比对相较时，产生具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配及相同的序列同一性百分比的比对的任何序列比较程序。

当为了进行相似性评分而使用所定义的氨基酸置换矩阵(例如，BLOSUM62)、空位存在罚分及空位延伸罚分比对两个序列，以达到那个序列对可能的最高分数时，两个序列被“最佳比对”。氨基酸置换矩阵及其在定量两个序列之间的相似性中的使用在本领域中是众所周知的，并且被描述于例如Dayhoff等人，(1978)“A model of evolutionary changein proteins(蛋白质中的进化变迁模型)”中；“Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白质序列及结构的图谱)”，Vol.5,Suppl.3(ed.M.O.Dayhoff)，pp.345-352；Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C.；和Henikoff等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919中。BLOSUM62矩阵常常用作序列比对操作流程中的默认评分置换矩阵。空位存在罚分是针对单氨基酸空位在其中一个比对序列中的引入而施加的，而空位延伸罚分是针对被插入已经打开的空位处的每一个额外空氨基酸位置而施加的。该比对通过比对开始和结束处的每一个序列的氨基酸位置定义，并且可视情况通过在一个或两个序列中插入一个空位或多个空位来定义，以便达到最高可能分数。尽管可以手动完成最佳比对和评分，但是可通过使用计算机实施的比对算法(例如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述并且在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站(在ncbi.nlm.nih.gov的万维网)向大众开放的gapped BLAST 2.0)而促进该过程。可以使用例如可通过www.ncbi.nlm.nih.gov获得的和Altschul等人在(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述的PSI-BLAST来准备包括多重比对的最佳比对。

关于与参考序列最佳比对的氨基酸序列，氨基酸残基“对应于”该参考序列中在该比对中与该残基配对的位置。该“位置”由数字标示，该数字基于其相对于N端的位置依序鉴定该参考序列中的每一个氨基酸。归因于在确定最佳比对时必须考虑的缺失、插入、截短、融合等，所以，一般而言，通过简单地从N端计数所确定的测试序列中的氨基酸残基数目不一定与其在该参考序列中的对应位置的数目相同。例如，在所比对的测试序列中存在缺失的情况中，将不存在与缺失位点处的参考序列中的位置对应的氨基酸。当在所比对的参考序列中存在插入时，该插入将不对应于该参考序列中的任何氨基酸位置。在截短或融合的情况中，该参考序列或所比对的序列中可存在不对应于相应序列中的任何氨基酸的氨基酸段(stretch)。

VI.抗体

还涵盖针对本发明的RGN多肽或包含本发明该RGN多肽的核糖核蛋白，包括具有SEQ ID NO:1至109所述的氨基酸序列中任一个或其活性变体或其片段的那些RGN多肽或核糖核蛋白，或本发明该RGN辅助蛋白，包括具有SEQ ID NO:178至192所示的氨基酸序列中任一个或其活性变体或片段的那些RGN辅助蛋白的抗体。产生抗体的方法在本领域中是众所周知的(参见，例如，Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)；和第4,196,265号美国专利)。这些抗体可用于试剂盒中，用于RGN多肽或核糖核蛋白的检测及分离。因此，本公开内容提供了包含特异性结合至本文描述的多肽或核糖核蛋白的抗体的试剂盒，该多肽或核糖核蛋白包括例如具有SEQ ID NO:1至109或178至192中任一个的序列的多肽。

VII.用于结合所关注的目标序列的系统和核糖核蛋白复合物及其制备方法

本公开内容提供一种用于结合所关注的目标序列的系统，其中该系统包含至少一个指导RNA或编码该至少一个指导RNA的核苷酸序列以及至少一个RNA所指导核酸酶或编码该至少一个RNA指导核酸酶的核苷酸序列。该指导RNA与所关注的目标序列杂交，且也与该RGN多肽形成复合物，从而将该RGN多肽导向至与该目标序列结合。在这些实施方案中的一些实施方案中，RGN包含SEQ ID NO:1至109中任一个的氨基酸序列或其活性变体或片段。在各种实施方案中，指导RNA包含CRISPR重复序列，该CRISPR重复序列包含SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309中任一个的核苷酸序列或其活性变体或片段。在一些特定实施方案中，指导RNA包含tracrRNA，该tracrRNA包含SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148中任一个的核苷酸序列或其活性变体或片段。该系统的指导RNA可为单指导RNA或双指导RNA。在一些特定实施方案中，系统包含与该指导RNA异源的RNA所指导核酸酶，其中未发现该RGN与指导RNA在自然界中彼此复合(即，彼此结合)。

在一些实施方案中，为结合至和/或切割目标多核苷酸，系统还包含至少一个RGN辅助蛋白。在这些实施方案中的一些实施方案中，系统还包含如SEQ ID NO:178-192所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG06369(SEQ ID NO:11)或其变体或片段的特定实施方案中，系统还可包含如SEQ ID NO:178-181所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG03847(SEQ ID NO:12)或其变体或片段的这些实施方案中的一些实施方案中，系统还可包含如SEQ ID NO:182-184所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG05625(SEQ ID NO:13)或其变体或片段的某些实施方案中，系统还可包含如SEQ ID NO:185-187所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG03524(SEQ ID NO:16)或其变体或片段的一些实施方案中，系统还可包含如SEQ ID NO:188-190所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG03759(SEQ ID NO:14)或其变体或片段的特定实施方案中，系统还可包含如SEQ ID NO:191所示的RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。在其中该RGN为APG05123(SEQ ID NO:15)或其变体或片段的某些实施方案中，系统还可包含如SEQ ID NO:192所示的RGN辅助蛋白或其活性变体或片段。

本文提供的用于结合所关注的目标序列的系统可为核糖核蛋白复合物，其是与至少一个蛋白质结合的RNA的至少一个分子。本文提供的核糖核蛋白复合物包含作为该RNA组成的至少一个指导RNA及作为该蛋白质组成的RNA所指导核酸酶。此类核糖核蛋白复合物可自天然表达RGN多肽的细胞或生物体中纯化，且已经被工程化，以表达对所关注的目标序列特异的特定指导RNA。作为另一种选择，该核糖核蛋白复合物可自已用编码RGN多肽及指导RNA的多核苷酸转化且在允许该RGN多肽和指导RNA表达的条件下培养的细胞或生物体中纯化。因此，提供用于制造RGN多肽或RGN核糖核蛋白复合物的方法。此类方法包括：在该RGN多肽(而在一些实施方案中，指导RNA)被表达的条件下，培养包含编码RGN多肽的核苷酸序列的细胞，而且在一些实施方案中，培养包含编码指导RNA的核苷酸序列的细胞。然后，可自所培养的细胞的裂解物中纯化该RGN多肽或RGN核糖核蛋白。

用于自生物样本的裂解物中纯化RGN多肽或RGN核糖核蛋白复合物的方法在本领域中是已知的(例如，尺寸排阻和/或亲和性层析法、2D-PAGE、HPLC、反相层析法、免疫沉淀法)。在一些特定方法中，该RGN多肽为重组产生的且包含纯化标签以帮助其纯化，其包括但不限于：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、串连亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、10xHis、生物素羧基运载蛋白(BCCP)及钙调蛋白。一般而言，所标记的RGN多肽或RGN核糖核蛋白复合物是使用固定化金属亲和性层析法纯化。应当理解，可单独地或组合地使用本领域中已知的其他类似方法，包含其他形式的层析法或例如免疫沉淀法。

“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分基本上或实质上不含在其天然存在的环境中发现的、正常情况下与该多肽相伴或交互作用的组成。因此，分离的或纯化的多肽当通过重组技术被产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或当被化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％、5％、或1％(以干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当重组产生本发明的蛋白质或其生物活性部分时，培养基最佳地呈现少于约30％、20％、10％、5％、或1％(以干重计)的化学前体或所关注的非蛋白质化学物质。

本文所提供的用于结合和/或切割所关注的目标序列的特定方法涉及使用体外组装的RGN核糖核蛋白复合物。RGN核糖核蛋白复合物的体外组装可使用本领域中已知的方法，其中允许该RGN多肽与该指导RNA结合的条件下使RGN多肽与指导RNA接触。如本文中所使用的，“接触(contact、contacting、contacted)”是指在适合进行期望反应的条件下，将期望反应的组成放在一起。该RGN多肽可自生物样本、细胞裂解物或培养基中纯化，通过体外转换产生，或被化学合成。该指导RNA可自生物样本、细胞裂解物或培养基中纯化，在体外被翻译，或被化学合成。可使该RGN多肽及指导RNA在溶液(例如，缓冲盐溶液)中产生接触以允许该RGN核糖核蛋白复合物的体外组装。

VIII.结合、切割或修饰目标序列的方法

本公开内容提供用于结合、切割和/或修饰所关注的目标核苷酸序列的方法。该方法包括向该目标序列或包含该目标序列的细胞、细胞器或胚胎，递送包含至少一个指导RNA或编码该至少一个指导RNA的多核苷酸及至少一个RGN多肽或编码该至少一个RGN多肽的多核苷酸的系统。在这些实施方案中的一些实施方案中，RGN包含SEQ ID NO:1到109的氨基酸序列中任一个或其活性变体或片段。在各种实施方案中，指导RNA包含CRISPR重复序列，该CRISPR重复序列包含SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309的核苷酸序列中任一个或其活性变体或片段。在特定实施方案中，指导RNA包含tracrRNA，该tracrRNA包含SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148的核苷酸序列中任一个或其活性变体或片段。该系统的指导RNA可为单指导RNA或双指导RNA。该系统的RGN可为无核酸酶活性的RGN，具有切口酶活性，也可为融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽包含碱基编辑多肽，例如，胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶。在其他实施方案中，RGN融合蛋白包含逆转录酶。在其他实施方案中，RGN融合蛋白包含多肽，该多肽募集功能性核酸修复复合物的成员，诸如，核苷酸切除修复(NER)或转录偶联-核苷酸切除修复(TC-NER)途径的成员(Wei等人，2015，PNAS USA112(27)：E3495-504；Troelstra等人，1992,Cell 71：939-953；Marnef等人，2017,J MolBiol 429(9)：1277-1288)，如2020年1月27日提交申请的第62/966,203号美国临时专利申请中所描述的，且其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，RGN融合蛋白包括CSB(van den Boom等人，2004，J Cell Biol 166(1)：27-36；van Gool等人，1997，EMBO J 16(19)：5955-65；其实例如SEQ ID NO:138所示)，CSB为该TC-NER(核苷酸切除修复)途径的成员且在其他成员的募集中产生功用。在进一步实施方案中，RGN融合蛋白包含CSB的活性域，诸如，包含SEQ ID NO:138的氨基酸残基356-394的CSB的酸性域(Teng等人，2018，NatCommun 9(1)：4115)。

在特定实施方案中，RGN和/或指导RNA对于该RGN和/或指导RNA(或编码该RGN及指导RNA中的至少一个的多核苷酸)被引入到的细胞、细胞器或胚胎为异源的。

在一些实施方案中，该方法还需要递送至少一个RGN辅助蛋白或编码该至少一个RGN辅助蛋白的多核苷酸，以便该RGN结合至和/或切割目标多核苷酸。在这些实施方案中的一些实施方案中，方法还需要递送如SEQ ID NO:178-192所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段或编码该至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段的多核苷酸。在其中该RGN为APG06369(SEQ ID NO:11)或其变体或片段的特定实施方案中，该方法还包含递送如SEQ ID NO:178-181所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段或编码该至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段的多核苷酸。在其中该RGN为APG03847(SEQ ID NO:12)或其变体或片段的这些实施方案中的一些实施方案中，该方法还包含递送如SEQ ID NO:315-317所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段或编码该至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段的多核苷酸。在其中该RGN为APG05625(SEQ ID NO:13)或其变体或片段的某些实施方案中，该方法还包含递送如SEQ ID NO:185-187所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段或编码该至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段的多核苷酸。在其中该RGN为APG03524(SEQ ID NO:16)或其变体或片段的一些实施方案中，该方法还包含递送如SEQ ID NO:188-190所示的至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段或编码该至少一个RGN辅助蛋白或其活性变体或片段的多核苷酸。在其中该RGN为APG03759(SEQ IDNO:14)或其变体或片段的特定实施方案中，该方法还包含递送如SEQ ID NO:191所示的RGN辅助蛋白或其活性变体或片段或编码该RGN辅助蛋白或其活性变体或片段的多核苷酸。在其中该RGN为APG05123(SEQ ID NO:15)或其变体或片段的某些实施方案中，该方法还包含递送如SEQ ID NO:192所示的RGN辅助蛋白或其活性变体或片段或编码该RGN辅助蛋白或其活性变体或片段的多核苷酸。

在其中该方法包括递送编码指导RNA和/或RGN多肽的多核苷酸的那些实施方案中，细胞或胚胎可之后在该指导RNA和/或RGN多肽被表达的条件下培养。在各种实施方案中，该方法包括使目标序列与RGN核糖核蛋白复合物接触。该RGN核糖核蛋白复合物可包含无核酸酶活性或具有切口酶活性的RGN。在一些实施方案中，核糖核蛋白复合物的RGN为包含碱基编辑多肽的融合多肽。在某些实施方案中，该方法包括将RGN核糖核蛋白复合物引入包含目标序列的细胞、细胞器或胚胎内。该RGN核糖核蛋白复合物可为已自生物样本被纯化、重组产生并随后纯化、或如本文所描述的体外组装的复合物。在其中与该目标序列或细胞、细胞器或胚胎接触的RGN核糖核蛋白复合物已经在体外被组装的那些实施方案中，该方法还可包含该复合物在与该目标序列、细胞、细胞器或胚胎接触之前的体外组装。

可使用本领域中已知的、包括但不限于电穿孔的任何方法将纯化的或体外组装的RGN核糖核蛋白复合物引入细胞、细胞器或胚胎内。作为另一种选择，可使用本领域中已知的任何方法(例如，电穿孔)将编码或包含该指导RNA的RGN多肽和/或多核苷酸引入细胞、细胞器或胚胎内。

在递送至该目标序列或包含该目标序列的细胞、细胞器或胚胎，或与该目标序列或包含该目标序列的细胞、细胞器或胚胎接触后，该指导RNA将该RGN导向至以序列特异性方式与该目标序列结合。在其中该RGN具有核酸酶活性的那些实施方案中，RGN多肽在结合时切割所关注的目标序列。该目标序列随后可通过诸如非同源末端连接或用所提供的供体多核苷酸的同源导向修复的内源修复机制而被修饰。

测量RGN多肽与目标序列的结合的方法在本领域中是已知的，且包括：染色质免疫沉淀测定、凝胶迁移率变动测定、DNA下拉测定、报导子测定(reporter assay)、微孔板捕获及检测测定。同样，测量目标序列的切割或修饰的方法在本领域中是已知的，且包括体外或体内切割测定，其中在为了促进降解产物的检测而将恰当标签(例如，放射性同位素、荧光物质)附接至该目标序列的情况下或在未为了促进降解产物的检测而将恰当标签(例如，放射性同位素、荧光物质)附接至该目标序列的情况下，使用PCR、测序或凝胶电泳来确认切割。作为另一种选择，可使用切口触发的指数扩增反应(NTEXPAR)测定(参见，例如，Zhang等人(2016)Chem.Sci.7：4951-4957)。可使用Surveyor测定来评估体内切割(Guschin等人(2010)Methods Mol Biol 649：247-256)。

在一些实施方案中，方法涉及使用与一个以上的指导RNA复合的单一类型RGN。该一个以上的指导RNA可靶向单基因的不同区域，也可靶向多个基因。

在其中未提供供体多核苷酸的那些实施方案中，通过RGN多肽引入的双链断裂可通过非同源末端连接(NHEJ)修复过程修复。由于NHEJ的易错性质，该双链断裂的修复可导致对该目标序列的修饰。如本文所使用的，关于核酸分子的“修饰”是指该核酸分子的核苷酸序列的变化，其可为一种或多种核苷酸的缺失、插入或置换或它们的组合。该目标序列的修饰可导致改变的蛋白质产物的表达或编码序列的灭活。

在其中存在供体多核苷酸的那些实施方案中，供体多核苷酸中的供体序列可在所引入的双链断裂的修复历程期间被整合至该目标核苷酸序列内或与该目标核苷酸序列交换，导致外源供体序列的引入。因此，供体多核苷酸包含期望被引入所关注的目标序列内的供体序列。在一些实施方案中，供体序列改变该原始目标核苷酸序列，使得该新整合的供体序列将不被该RGN识别及切割。该供体序列的整合可通过在该供体多核苷酸内包括与该目标核苷酸序列侧翼的序列具有基本序列同一性、本文中被称为“同源臂”的侧翼序列来增强，以允许同源导向的修复过程。在一些实施方案中，同源臂具有至少50个碱基对、100个碱基对及多达2000个碱基对或更多个碱基对的长度，且与其在该目标核苷酸序列内的对应序列具有至少90％、至少95％或更高序列同源性。

在其中该RGN多肽引入双链交错断裂的那些实施方案中，供体多核苷酸可包含侧翼为相容突出部的供体序列，以允许在该双链断裂的修复期间通过非同源修复过程将供体序列直接连接至包含突出部的经切割的目标核苷酸序列。

在其中该方法涉及使用为切口酶(即，仅能够切割双链多核苷酸中的单链)的RGN的那些实施方案中，该方法可包含引入靶向相同的或重叠的目标序列且切割该多核苷酸的不同链的两个RGN切口酶。例如，可将仅切割双链多核苷酸的正(+)链的RGN切口酶与仅切割双链多核苷酸的负(-)链的第二RGN切口酶一起引入。

在各种实施方案中，提供一种用于结合目标核苷酸序列且检测该目标序列的方法，其中该方法包括将至少一个指导RNA或编码该至少一个指导RNA的多核苷酸及至少一个RGN多肽或编码该至少一个RGN多肽的多核苷酸引入细胞、细胞器或胚胎中；表达该指导RNA和/或RGN多肽(如果编码序列被引入)，其中该RGN多肽为无核酸酶活性的RGN且还包含可检测标记，并且该方法还包含检测该可检测标记。该可检测标记可与该RGN融合为融合蛋白(例如，荧光蛋白)，也可为与该RGN多肽缀合或被并入该RGN多肽内、可通过视觉或通过其他手段检测的小分子。

本文还提供用于在目标序列的调节下调控所关注的目标序列或基因的表达的方法。这些方法包括：将至少一个指导RNA或编码该至少一个指导RNA的多核苷酸及至少一个RGN多肽或编码该至少一个RGN多肽的多核苷酸引入细胞、细胞器或胚胎内；表达该指导RNA和/或RGN多肽(如果编码序列被引入)，其中该RGN多肽为无核酸酶活性的RGN。在这些实施方案中的一些实施方案中，无核酸酶活性的RGN为包含如本文所描述的表达调控域(即，表观遗传修饰域、转录活化域或转录阻遏域)的融合蛋白。

本公开内容还提供用于结合和/或修饰所关注的目标核苷酸序列的方法。这些方法包括递送系统至该目标序列或包含该目标序列的细胞、细胞器或胚胎，该系统包含至少一个指导RNA或编码该至少一个指导RNA的多核苷酸及至少一个融合多肽，该至少一个融合多肽包含本发明的RGN及碱基编辑多肽(例如，胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶)或编码该融合多肽的多核苷酸。

本领域技术人员将理解，本发明公开的任一方法可用于靶向单个目标序列或多个目标序列。因此，这些方法包括与多个不同的指导RNA组合地使用单RGN多肽，其可靶向单个基因和/或多个基因内的多个不同的序列。本文还涵盖其中与多个不同的RGN多肽组合地引入多个不同的指导RNA的方法。这些指导RNA及指导RNA/RGN多肽系统可靶向单个基因和/或多个基因内的多个不同的序列。

在一个方面，本发明提供含有上述方法及组合物中所公开的任何一种或多种元件的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含载体系统及使用该试剂盒的说明。在一些实施方案中，载体系统包含：(a)第一调节元件，该第一调节元件与编码该crRNA序列的DNA系列及用于在指导序列的上游插入经编码的crRNA序列的一种或多种插入位点可操作地连接，其中当表达时，该指导序列在真核细胞中将CRISPR复合物导向至与目标序列序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(a)指导RNA多核苷酸复合的CRISPR酶；和/或(b)第二调节元件，该第二调节元件与酶编码序列可操作地连接，该酶编码序列编码包含核定位序列的所述CRISPR酶。

在一些实施方案中，试剂盒包含与用于插入载体的指导序列对应的一种或多种寡核苷酸，以便可操作地连接该指导序列与调节元件。在一些实施方案中，试剂盒包含同源重组模板多核苷酸。在一个方面，本发明提供用于使用CRISPR系统的一种或多种元件的方法。本发明的CRISPR复合物提供用于修饰目标多核苷酸的有效手段。本发明的CRISPR复合物具有种类繁多的功用，包括在多种细胞类型中修饰(例如，缺失、插入、易位、灭活、活化、碱基编辑)目标多核苷酸。就其本身而言，本发明的CRISPR复合物在例如基因治疗、药物筛选、疾病诊断以及预后中具有广泛的应用。示例性的CRISPR复合物包含与指导序列复合的CRISPR酶，该指导序列与该目标多核苷酸内的目标序列杂交。

IX.目标多核苷酸

在一个方面，本发明提供修饰真核细胞中的目标多核苷酸的方法，其可为在体内、离体或在体外。在一些实施方案中，该方法包括：自人或非人动物或植物(包括微藻类)取样细胞或细胞群体；和修饰该细胞或这些细胞。培养可以在任何阶段离体发生。甚至可以将该细胞或这些细胞重新引入该非人动物或植物(包含微藻类)中。

使用自然变异性，植物育种者将关于诸如产量、质量、均匀性、耐寒性以及抗害虫性的可期望质量的大多数有用基因组合起来。这些可期望质量还包括生长、日长度偏好、温度要求、花卉或生殖发育的起始日期、脂肪酸含量、抗虫性、抗病性、线虫抗性、真菌抗性、除草剂抗性、对各种环境因素(包括干旱、热、湿、冷、风及包括高盐度的不利土壤条件)的耐受性。这些有用基因的来源包括天然或外来品种、原生种(heirloom variety)、野生植物近源种和例如以诱变剂处理植物材料的诱导突变。使用本发明，向植物育种者提供诱导突变的新工具。因此，本领域技术人员可以分析基因组以获得有用基因的来源，且在具有所期望特征或性状的品种中采用本发明以诱导有用基因的增加，同时比先前的诱变剂更精确，且因此加速并改良植物育种计划。

RGN系统的目标多核苷酸可为对真核细胞是内源或外源的任何多核苷酸。例如，该目标多核苷酸可为驻留于真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该目标多核苷酸可为编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。在一些实施方案中，该目标序列与PAM(前间隔序列邻近基序)相关联；即，该CRISPR复合物识别的短序列。该PAM的精确序列和长度要求随所使用的CRISPR酶而不同(并且在一些实施方案中，RGN不需要PAM系列)，但该PAM通常情况下是与该前间隔序列(即，该目标序列)相邻的2-5个碱基对序列。

CRISPR复合物的目标多核苷酸可包括很多疾病关联基因及多核苷酸以及信号传导生化途径相关基因及多核苷酸。目标多核苷酸的实例包括与信号传导生化途径相关联的序列，例如，信号传导生化途径相关基因或多核苷酸。目标多核苷酸的实例包括疾病关联基因或多核苷酸。“疾病关联”基因或多核苷酸是指：与非疾病对照的组织或细胞相较下，在来源于感染疾病的组织的细胞中以异常水平或以异常形式产出转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。其可为一种变得以异常高水平表达的基因；其可为一种变得以异常低水平表达的基因，其中改变的表达与疾病的发生和/或进展相关。疾病关联基因也指具有突变或基因变异的基因，该具有突变或基因变异的基因为直接造成疾病病因(例如，因果突变)，或为与造成疾病病因(例如，因果突变)的基因呈连锁不平衡(linkage disequilibrium)。该转录或翻译产物可为已知的或未知的，且还可处于正常或异常水平。疾病关联基因及多核苷酸的实例可自在万维网上找到的约翰·霍普金斯大学(马里兰州巴尔的摩)麦库席克–内森斯遗传医学研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine)和美国国家医学图书馆(马里兰州贝塞斯达)(National Library of Medicine(Bethesda,Md.))的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)找到。

虽然CRISPR系统在对于其相对容易靶向所关注的基因组序列方面格外有用，但仍然存在该RGN做什么可解决因果突变的问题。一种措施为在RGN(优选地，该RGN的无活性或切口酶变体)与碱基编辑酶或碱基编辑酶(诸如，胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶基编辑器)的活性域之间产生融合蛋白(第9,840,699号美国专利，该美国专利通过引用并入本文)。在一些实施方案中，这些方法包括使DNA分子与：(a)包含本发明的RGN及诸如脱氨酶的碱基编辑多肽的融合蛋白；和(b)将(a)的融合蛋白靶向至该DNA链的目标核苷酸序列的gRNA接触；其中该DNA分子以有效量并且在适于核碱基脱氨化的条件下与该融合蛋白及gRNA接触。在一些实施方案中，该目标DNA序列包含与疾病或病症关联的序列，并且其中该核碱基的脱氨化导致与疾病或病症无关联的序列。在一些实施方案中，该目标DNA序列驻留于农作物的等位基因中，其中所关注的性状的特定等位基因导致具有较低农艺价值的植物。该核碱基的脱氨化导致改良性状并增加植物的农艺价值的等位基因。

在一些实施方案中，该DNA序列包含与疾病或病症关联的T→C或A→G点突变，并且其中突变体C或G碱基的脱氨化导致与疾病或病症无关联的序列。在一些实施方案中，该脱氨化校正与该疾病或病症关联的序列中的点突变。

在一些实施方案中，与该疾病或病症关联的序列编码蛋白质，且其中该脱氨化将终止密码子引入与该疾病或病症关联的序列中，导致编码蛋白质的截短。在一些实施方案中，该接触在易患有、患有或诊断患有该疾病或病症的个体体内进行。在一些实施方案中，疾病或病症为与该基因组中的点突变或单碱基突变关联的疾病。在一些实施方案中，该疾病为基因疾病、癌症、代谢疾病或溶酶体贮积病。

X.药物组合物及治疗方法

提供药物组合物，该药物组合物包含：本发明公开的RGN多肽及其变体或片段以及编码该RGN多肽及其变体或片段的多核苷酸、本发明公开的gRNA或编码该gRNA的多核苷酸、本发明公开的系统、或包含该RGN多肽或RGN编码多核苷酸、gRNA或gRNA编码多核苷酸、或该RGN系统中任一个的细胞及药学上可接受的载剂。

药物组合物为被运用于防止、降低程度、治愈或治疗目标病况或疾病的组合物，该组合物包含活性成分(即，RGN多肽、RGN编码多核苷酸、gRNA、gRNA编码多核苷酸、RGN系统、或包含这些中任一个的细胞)及药学上可接受的载剂。

如本文中使用的，“药学上可接受的载剂”是指不对生物体引起显著刺激且不消除该活性成分(即，RGN多肽、RGN编码多核苷酸、gRNA、gRNA编码多核苷酸、RGN系统、或包含这些中任一个的细胞)的活性及特性的材料。载剂必须具有足够高的纯度及足够低的毒性，以使它们合适施用于正被治疗的个体。该载剂可为惰性的，其也可具有医药效益。在一些实施方案中，药学上可接受的载剂包含合适对人或其他脊椎动物施用的一种或多种兼容固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。在一些实施方案中，药学上可接受的载剂不是天然存在的。在一些实施方案中，未发现该药学上可接受的载剂在自然界中与该活性成分在一起。

本发明公开的方法中使用的药学组合物可用提供合适转移、递送、耐受性等等的合适载剂、赋形剂和其他药剂配制。众多恰当制剂为本领域技术人员所知。参见，例如，Remington，The Science and Practice of Pharmacy(21st ed.2005)。合适的制剂例如包括：粉剂、糊剂、膏剂、胶冻剂、蜡、油类、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(诸如，LIPOFECTIN囊泡)、脂质纳米颗粒、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油及油包水乳液、乳液卡波蜡(emulsions carbowax)(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有卡波蜡的半固体混合物。经口或肠胃外使用的药学组合物可被制备为适合供给某个剂量的活性成分的单位剂量的剂型。这些单位剂量的剂型例如包括片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。

在其中包括或以本发明公开的RGN、gRNA、RGN系统或编码该RGN、gRNA、RGN系统的多核苷酸修饰的细胞被施用个体的一些实施方案中，细胞与药学上可接受的载剂一起作为悬浮剂被施用。本领域技术人员将认识到将被使用于细胞组合物中的药学上可接受的载剂将不包括实质上干扰将被递送至该个体的细胞的存活率的量的缓冲液、化合物、冷冻保存药剂、保存剂、或其他药剂。包括细胞的制剂可包含例如允许细胞膜保持完整性的渗透压缓冲液，且视情况地，在施用时保持细胞存活率或增强植入的营养剂。此类制剂及悬浮剂为本领域技术人员所知，和/或使用常规实验可适用于与本文公开的细胞一起使用。

细胞组合物也可被乳化为或呈现为脂质体组合物，前提条件为该乳化程序不会不利地影响细胞存活率。该细胞及其他活性成分可以与药学上可接受且与该活性成分兼容的赋形剂和以适合在本文公开的治疗方法中使用的量混合。

包含在细胞组合物中的额外药剂可包含其内的组成的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包含与诸如例如盐酸或磷酸的无机酸、或与诸如乙酸、酒石酸、苦杏仁酸等等的有机酸形成的酸加成盐(与多肽的自由氨基基团形成)。与自由羧基基团形成的盐也可衍生自诸如例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物的无机碱和诸如异丙胺、三甲胺、2-乙胺乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的有机碱。

生理学上可耐受且药学上可接受的载剂为本领域中所知。示例性液体载剂为无菌水溶液，其除了活性成分及水外不含有其他材料，或其含有诸如在生理pH值、生理盐水或二者的磷酸钠的缓冲液(诸如，磷酸盐缓冲盐水)。更进一步地，水性载剂可含有一种以上的缓冲盐以及诸如氯化钠及氯化钾、右旋糖、聚乙二醇及其他溶质的盐。液体组合物也可含有除了水及排除水的液相。这种额外液相的实例为甘油、诸如棉花籽油的植物油和水油乳液。在特定病症或病况的治疗中有效的细胞组合物中使用的活性化合物的量可依赖于该病症或病况的本质，且可通过标准临床技术决定。

本发明公开的RGN多肽、指导RNA、RGN系统、或编码该RGN多肽、指导RNA、RGN系统的多核苷酸可依赖于施用的特定方式及剂型以诸如载剂、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等的药学上可接受的赋形剂配制。在一些实施方案中，这些药学组合物被配制以达成生理学上相容的pH，且依赖于制剂及施用途径，其pH范围为约3的pH至约11的pH、约pH3至约pH7。在一些实施方案中，可将该pH调整至约pH5.0至约pH8的范围。在一些实施方案中，组合物可包括本文描述的治疗有效量的至少一个化合物，连同一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物包括本文描述的化合物的组合，或包含在治疗或防止细菌生长中有用的第二活性成分(例如而不限于，抗菌或抗微生物药剂)，或包含本公开内容的试剂的组合。

例如，适合的赋形剂包含载剂分子，该载剂分子包含大的缓慢代谢的大分子，诸如，蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。其他示例性赋形剂可包含：抗氧化剂(例如而不限于，抗坏血酸)、螯合剂(例如而不限于，EDTA)、碳水化合物(例如而不限于，糊精、羟烷基纤维素和羟烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如而不限于，油、水、盐水、甘油及乙醇)、润湿或乳化剂、pH缓冲物质等等。

在一些实施方案中，在单位剂量或多剂量容器(例如，密封安瓿及小瓶)中提供制剂，且可被储存于冻干(冷冻干燥)条件下，需要在立即使用之前，添加无菌液体载剂(例如，盐水、注射用水、半液体泡沫或凝胶)。实时注射溶液及悬浮剂可自前面描述种类的无菌粉剂、颗粒及片剂制备。在一些实施方案中，活性成分溶解于缓冲液体溶液中，其在单位剂量或多剂量容器中被冷冻，且之后被解冻用于注射或被保持/稳定在冷冻下直到使用。

治疗剂可包含在控释系统中。为延长药物的作用，常常期望自皮下、鞘内或肌肉内注射减缓药物的吸收。这可通过使用具水难溶性的结晶或非结晶材料的液体悬浮剂来完成。然后，药物的吸收速率依赖于其溶解速率，而其溶解速率又可依赖于结晶大小及结晶的方式。作为另一种选择，通过该药物溶解或悬浮于油运载体中完成肠胃外施用药物的延迟吸收。在一些实施方案中，长期缓释植入剂的使用特别适合用于慢性病况的治疗。长期缓释植入剂是本领域技术人员众所周知的。

本文提供治疗有需要的个体的疾病的方法。该方法包括以有效量对有需要的个体施用本发明公开的RGN多肽或其活性变体或片段或编码该RGN多肽或其活性变体或片段的多核苷酸、本发明公开的gRNA或编码该gRNA的多核苷酸、本发明公开的RGN系统、或通过这些组合物中任一个修饰的或包括这些组合物中任一个的细胞。

在一些实施方案中，治疗包括通过施用本发明公开的RGN多肽、gRNA、或RGN系统、或编码该RGN多肽、gRNA、或RGN系统的多核苷酸的体内基因编辑。在一些实施方案中，治疗包括离体基因编辑，其细胞是以本发明公开的RGN多肽、gRNA、或RGN系统、或编码该RGN多肽、gRNA、或RGN系统的多核苷酸离体基因修饰，且然后将经修饰细胞施用至个体。在一些实施方案中，经基因修饰细胞源于之后被施用该修饰细胞的该个体，且所移植细胞在本文中被称为自体的。在一些实施方案中，经基因修饰细胞源自与被施用该经修饰细胞的个体(即，受者)属相同物种的不同个体(即，供体)，且该所移植细胞在本文中被称为异体的。在本文描述的一些实例中，该细胞在对有需要的个体施用之前可在培养中被扩增。

在一些实施方案中，将要用本发明公开的组合物治疗的疾病为可用免疫疗法(诸如，用嵌合抗原受体(CAR)T细胞)治疗的疾病。此类疾病包括但不限于癌症。

在一些实施方案中，将要用本发明公开的组合物治疗的疾病与被突变的序列(即，该序列为对于该疾病或病症是因果的或为对于与该疾病或病症关联的症状是因果的)关联，以便治疗该疾病或病症或与该疾病或病症关联的症状的降低。在一些实施方案中，将要用本发明公开的组合物治疗的疾病与因果突变关联。如本文中使用的，“因果突变”是指对个体中疾病或病症的严重程度或出现有贡献的基因组中的特殊核苷酸、多个核苷酸或核苷酸序列。因果突变的校正引起由疾病或病症导致的至少一个症状改良。在一些实施方案中，因果突变与本文公开的RGN所识别的PAM位点相邻。该因果突变可用本发明公开的RGN或包括本发明公开的RGN及碱基编辑的多肽(即，碱基编辑器)的融合多肽来校正。与因果突变关联的疾病的非限制性实例包含：囊肿纤维化、赫尔勒综合征、弗里德赖希共济失调、亨廷顿病和镰形细胞疾病。疾病关联基因及突变的额外非限制性实例可自在万维网上找到的约翰·霍普金斯大学(马里兰州巴尔的摩)麦库席克–内森斯遗传医学研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine)和美国国家医学图书馆(马里兰州贝塞斯达)(National Library of Medicine(Bethesda,Md.))的国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)找到。

在一些实施方案中，本文提供的方法使用于将去活化点突变引入将与疾病或病症关联的基因产物编码的基因或等位基因内。例如，在一些实施方案中，本文提供运用本发明公开的组合物将去活化点突变引入致癌基因(例如在增生性疾病的治疗中)内的方法。在一些实施方案中，去活化突变可在编码序列中产生提前终止密码子，这导致经截短基因产物(例如缺少全长蛋白的功能的经截短蛋白)的表达。在一些实施方案中，本文提供的方法的目的为通过基因组编辑来恢复功能不良性基因的功能。本发明公开的RGN多肽及包含该RGN多肽的系统可对例如通过在人细胞培养中校正疾病关联突变的体外基于基因编辑的人疗法有效。

如本文中使用的，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”、或“缓和”或“改善”可被互换地使用。这些术语是指用于获得有益或期望结果的措施，该有益结果或期望结果包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。通过治疗性益处意味着对治疗中的一种或多种疾病、病况或症状之中的任何治疗相关改良或对治疗中的一种或多种疾病、病况或症状的作用。对于预防性益处，该组合物可被施用处于特殊疾病、病况或症状的发展风险中的个体，或被施用报告疾病的一种或多种生理症状的个体，即使该疾病、病症或症状可能尚未呈现征兆。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或期望结果的药剂量。治疗有效量可取决于如下的一种或多种而变化：被治疗的个体及疾病病况、该个体的体重及年龄、疾病病况的严重性、施用方式等等，本领域技术人员可容易地对此做出决定。特定剂量可取决于如下一种或多种而变化：所选的特殊药剂、将要遵循的给药方案、是否与其他化合物组合地施用、施用时机和输送其的递送系统。

术语“施用”是指通过导致所引入的活性成分至少部分地定位于期望位点(诸如，受伤或修复的位点)处的方法或途径，将活性成分置于个体内，使得产生期望效应。在其中细胞被施用的那些实施方案中，可通过导致递送至个体中的期望位置的任何恰当途径施用该细胞，其中至少一部分所移植细胞或该细胞的组成维持存活。施用个体后的细胞的存活期可短至几小时(例如，二十四小时)、至几天、至长至若干年、甚或患者的一生，即，长期植入。例如，在本文描述的一些方面中，光受体细胞或视网膜前体细胞的有效量是通过身体的施用途径(诸如腹膜内或静脉内途径)施用的。

在一些实施方案中，施用包括通过病毒递送的施用。在一些实施方案中，施用包括通过电穿孔的施用。在一些实施方案中，施用包括通过纳米颗粒递送的施用。在一些实施方案中，施用包括通过脂质体递送的施用。施用的任何有效途径均可用于施用本文描述的药学组合物的有效量。在一些实施方案中，施用包括通过选自由以下组成的组的方法的施用：静脉内地、皮下地、肌肉内地、口服地、经直肠地、通过气溶胶、肠胃外地、经眼地、经肺地、经皮地、经阴道地、经耳地、经鼻地和通过局部施用、或其任意组合。在一些实施方案中，对于细胞的递送，使用通过注射或灌注的施用。

如本文中使用的，术语“个体(subject)”是指期望对其进行诊断、治疗(treatment)或治疗(therapy)的任何个体(individual))。在一些实施方案中，个体为动物。在一些实施方案中，个体为哺乳动物。在一些实施方案中，个体为人。

治疗功效可由熟练的临床医师决定。然而，如果疾病或病症的症候或症状的任何一个或全部是以有益方式被改变(例如，至少减少10％)、或其他临床上接受的疾病的症状或标记被改良或改善，则该治疗被认为“有效治疗”。还可通过个体未发生如通过住院评估的恶化、或不需要医学介入(例如，疾病的进展被停止或至少减慢)来测量功效。本领域技术人员知晓测量这些指标的方法。治疗包括：(1)抑制疾病，例如，停止或减慢症状的进展；或(2)减缓疾病，例如，引起症状消退；和(3)预防或降低症状发展的可能性。

A.使用碱基编辑修饰因果突变

在一些实施方案中，本发明的RGN被使用于使用碱基编辑来修饰因果突变。可使用取决于本发明的RGN-碱基编辑器融合蛋白的措施而校正的基因遗传性疾病的实例是赫尔勒综合征。赫尔勒综合征(也称为MPS-1)为α-L-艾杜糖苷酶(IDUA)缺乏而导致在分子水平上由溶酶体中硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的累积表征的溶酶体贮积症的结果。此疾病一般是由编码α-L-艾杜糖苷酶的IDUA基因中的突变引起的遗传性基因病症。常见的IDUA突变是W402X和Q70X，两者都是无义突变导致翻译的提前终止。通过精确的基因组编辑(PGE)措施很好地解决了这种突变，由于单核苷酸的回复突变(例如，通过碱基编辑措施)将恢复野生型编码序列并导致由基因座的内源性调节机制控制的蛋白质表达。另外，由于已知杂合子是无症状的，所以靶向这些突变中的一个的PGE疗法对于大部分患有此疾病的患者是有用的，因为突变的等位基因中只有一个需被校正(Bunge等人(1994)Hum.Mol.Genet.3(6)：861-866，通过引用并入本文)。

目前对赫尔勒综合征的目前治疗包括酶替代疗法及骨髓移植(Vellodi等人，((1997))Arch.Dis.Child.76(2)：92-99；Peters等人，((1998))Blood 91(7)：2601-2608，通过引用并入本文)。尽管酶替代疗法对赫尔勒综合征患者的生存和生活质量已具有显著效应，但该措施需要昂贵且耗时的每周灌注。额外措施包含在表达载体上IDUA基因的递送或将该基因插入高度表达的基因座内，诸如，血清白蛋白的基因座内(第9,956,247号美国专利，通过引用并入本文)。然而，这些措施不能将原始IDUA基因座恢复至正确的编码序列。基因组编辑策略可具有很多优点，最显著的是基因表达的调节将受健康个体中存在的天然机制的控制。另外，使用碱基编辑不一定引起双链DNA断裂，这可能由肿瘤阻遏机制的破坏引起大规模染色体重排、细胞死亡或致癌性。一般策略可涉及使用本发明的RGN碱基编辑器融合蛋白来靶向并校正人基因组中的某些疾病引起的突变。应理解，还可寻求类似措施来靶向通过碱基编辑可校正的疾病。还应进一步理解，也可使用本发明的RGN来部署以靶向其他物种(特别是一般家庭宠物或家畜)中疾病引起的突变的类似措施。常见家庭宠物和家畜包含狗、猫、马、猪、牛、羊、鸡、驴、蛇、雪貂和包括鲑鱼的鱼和虾。

B.通过靶向缺失修饰因果突变

本发明的RGN在因果突变更复杂的人治疗措施中也有用。例如，诸如弗里德赖希共济失调和亨廷顿病的一些疾病是在基因特定区域处的三个核苷酸基序的重复序列中显著增加的结果，这会影响表达蛋白起作用或被表达的能力。弗里德赖希共济失调(FRDA)为一种导致脊髓中神经组织渐进性退化的常染色体隐性遗传病。线粒体中共济蛋白(FXN)蛋白质的降低水平引起细胞水平的氧化损伤及铁缺乏。降低的FXN表达已被联系至体细胞和生殖系FXN基因的内含子1内的GAA三联体扩增。在FRDA患者中，GAA重复序列往往由超过70个、有时甚至超过1000个(最常见的是600-900个)三联体组成，而未受影响的个体具有约40个或更少的重复序列(Pandolfo等人，(2012)Handbook of Clinical Neurology 103：275-294；Campuzano等人，(1996)Science 271：1423-1427；Pandolfo(2002)Adv.Exp.Med.Biol.516：99-118；全部通过引用并入本文)。

引起弗里德赖希共济失调(FRDA)的三核苷酸重复序列的扩增发生在FXN基因内定义的基因座中，被称为FRDA不稳定区域。RNA指导核酸酶(RGN)可用于切除FRDA患者细胞中的不稳定区域。此措施需要：1)可被程序化以靶向人基因组中的等位基因的RGN及指导RNA序列；以及2)对于RGN及指导序列的递送措施。特别是当除了功能性表达盒所需的其他基因元件之外，还要考虑到SpCas9基因及指导RNA的长度时，用于基因组编辑的许多核酸酶(诸如，常用的来自化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9核酸酶(SpCas9))太大而无法包装到腺相关病毒(AAV)载体内。这使得使用SpCas9的措施更加困难。

本发明的某些RNA指导核酸酶极适合随指导RNA一起被包装到AAV载体内。包装两个指导RNA可能需要第二个载体，但该措施与诸如SpCas9的较大核酸酶所需要的相较仍然是有利的，这可能需要在两个载体之间割裂蛋白质序列。本发明涵盖使用本发明的RGN的策略，其中移除了基因组不稳定区域。这种策略适用于具有类似基因基础的其他疾病及病症，诸如亨廷顿病。使用本发明的RGN的类似策略也可适用于具有农艺或经济重要性的非人动物(包含：狗、猫、马、猪、牛、羊、鸡、驴、蛇、雪貂、以及包含鲑鱼的鱼和虾)的类似疾病及病症。

C.通过靶向诱变修饰因果突变

本发明的RGN也可引入可导致有益效应的破坏性突变。编码血红蛋白的基因(特别是β球蛋白链(HBB基因))中的基因缺陷可造成很多称为血红蛋白病变的疾病(包括镰状细胞贫血和地中海贫血)。

在成年人中，血红蛋白为包括两个α样球蛋白链及两个β样球蛋白链及4个血红素基团的异四聚体。在成人中，α2β2四聚体被称为血红蛋白A(HbA)或成人血红蛋白。通常情况下，α及β球蛋白链以大约1:1的比例合成，并且此比例就血红蛋白和红细胞(RBC)稳定而言似乎是关键的。在发育中的胎儿中，产生了不同形式的血红蛋白(胎儿血红蛋白(HbF))，其对氧的结合亲和力高于血红蛋白A，使得氧可通过母亲的血流递送到婴儿的系统。胎儿血红蛋白也含有两个α球蛋白链，但是代替成人β球蛋白链，其具有两个胎儿γ球蛋白链(即，胎儿血红蛋白为α2γ2)。自γ球蛋白的产生转换至β球蛋白的产生的调节相当复杂，且主要涉及γ球蛋白转录的下调与β球蛋白转录的同时上调。在妊娠约30周时，胎儿中γ球蛋白的合成开始下降，而β球蛋白的产生增加。到约10个月龄时，新生儿的血红蛋白几乎都是α2β2，但是一些HbF持续到成年期(约为总血红蛋白的1-3％)。在大多数具有血红蛋白病变的患者中，编码γ球蛋白的基因仍然存在，但由于如上所述在临近分娩时发生正常的基因阻遏，表达相对较低。

镰状细胞疾病是由β球蛋白基因(HBB)中的V6E突变(DNA水平的GAG至GTG)引起的，其中所得的血红蛋白被称为“血红蛋白S”或“HbS”。在低氧条件下，HbS分子聚集并形成纤维状沉淀物。这些聚集物引起RBC异常或“变成镰状细胞”，导致细胞的灵活性丧失。变成镰状细胞的RBC不再能够挤入毛细血管床，且可能导致镰状细胞患者的血管阻塞性危机。除此之外，变成镰状细胞的RBC比正常RBC更脆弱，且倾向于溶血，最终引起患者贫血。

镰状细胞患者的治疗及管理是终生的课题，其涉及抗生素治疗、疼痛管理及急性发作期间的输液。一种措施为使用羟基脲，其通过增加γ球蛋白的产生来部分地发挥其效应。然而，长期羟基脲疗法的长期副作用仍然是未知的，而且治疗产生不想要的副作用且可能在患者之间具有不同的功效。尽管镰状细胞治疗的功效有所增加，但患者的预期寿命仍然仅在50岁至60岁的中期至晚期，并且关联的疾病发病对患者的生活质量具有深远的影响。

地中海贫血(α地中海贫血及β地中海贫血)也是与血红蛋白有关的疾病，并且通常情况下涉及减少的球蛋白链表达。这可以通过基因调节区域中的突变或从导致减少的表达或减少的水平或功能性球蛋白蛋白质的球蛋白编码序列中的突变发生。地中海贫血的治疗通常涉及血液输液及祛铁疗法。如果适当的供体可被鉴定，则骨髓移植也被使用于治疗有严重地中海贫血的人，但这种手术可能具有重大风险。

已经提出用于治疗镰状细胞病(SCD)及β地中海贫血的一种措施为增加γ球蛋白的表达，使得HbF在功能上取代异常的成人血红蛋白。如上所提及，用羟基脲治疗SCD患者由于其在增加γ球蛋白表达上的效应而被认为是部分成功的(DeSimone(1982)Proc Nat'lAcad Sci USA 79(14)：4428-31；Ley等人(1982)N.Engl.J.Medicine,307：1469-1475；Ley等人(1983)Blood 62：370-380；Cons tantoulakis等人(1988)Blood 72(6)：1961-1967，均通过引用并入本文)。增加HbF的表达涉及鉴定其产物在γ球蛋白表达的调节中起作用的基因。一种这样的基因为BCL11A。BCL11A编码在成人红细胞前体细胞中表达的锌指蛋白，且其表达的下调引起γ球蛋白表达增加(Sankaran等人(2008)Science 322：1839，通过引用并入本文)。已经提出使用靶向至BCL11A基因的抑制性RNA(例如，第2011/0182867号美国专利公开，通过引用并入本文)，但此技术具有若干潜在的缺点，包含可能无法实现完全敲减，这种RNA的递送可能是有问题的，且RNA必须连续存在且终生需要多次治疗。

本发明的RGN可用于靶向BCL11A增强子区域，以破坏BCL11A的表达，从而增加γ球蛋白表达。这种靶向的破坏可通过非同源末端连接(NHEJ)来实现，由此本发明的RGN靶向至BCL11A增强子区域内的特殊序列，使双链断裂，且细胞的机械修复该断裂，通常同时引入有害突变。类似于针对其他疾病目标所描述的，本发明的RGN由于其相对小的尺寸，使得能够将RGN及其指导RNA的表达盒包装至用于体内递送的单一AAV载体中，从而具有优于其他已知RGN的优点。使用本发明的RGN的类似策略还可应用于人和农艺或经济重要性的非人动物中的类似疾病和病症。

XI.包括多核苷酸基因修饰的细胞

本文提供了包括已使用通过如本文所描述的RGN、crRNA和/或tracrRNA介导的过程修饰的所关注的目标序列的细胞和生物体。在这些实施方案中的一些实施方案中，RGN包括SEQ ID NO:1至109的氨基酸序列中任一个、或其活性变体或片段。在各种实施方案中，指导RNA包括CRISPR重复序列，该CRISPR重复序列包括SEQ ID NO:110至119、139、141、143、146和201至309的核苷酸序列中任一个、或其活性变体或片段。在具体实施方案中，指导RNA包括tracrRNA，该tracrRNA包括SEQ ID NO:120至128、140、142、145、147和148的核苷酸序列中任一个、或其活性变体或片段。该系统的指导RNA可为单指导RNA或双指导RNA。

经修饰的细胞可为真核细胞(例如，哺乳动物、植物、昆虫细胞)或原核细胞。还提供包括至少一种核苷酸序列的细胞器和胚胎，该核苷酸序列已通过利用如本文所描述的RGN、crRNA和/或tracrRNA的过程进行了修饰。经基因修饰的细胞、生物体、细胞器和胚胎对于经修饰的核苷酸序列可为杂合的或纯合的。

该细胞、生物体、细胞器或胚胎的染色体修饰可导致改变的表达(上调或下调)、灭活、或改变的蛋白质产物或整合的序列的表达。在其中染色体修饰导致基因灭活或非功能性蛋白质产物表达的那些实施方案中，经基因修饰的细胞、生物体、细胞器或胚胎被称为“敲除”。该敲除表型可为缺失突变(即，至少一个核苷酸的缺失)、插入突变(即，至少一个核苷酸的插入)或无义突变(即，至少一个核苷酸的置换，使得终止密码子被引入)的结果。

在一些实施方案中，细胞、生物体、细胞器或胚胎的染色体修饰可产生“敲入”，该“敲入”由编码蛋白质的核苷酸序列的染色体整合导致。在这些实施方案中的一些实施方案中，编码序列被整合至该染色体内，使得编码野生型蛋白质的染色体序列被灭活，但表达出外源引入的蛋白质。

在一些实施方案中，染色体修饰导致变体蛋白质产物的产生。表达的变体蛋白质产物可具有至少一个氨基酸置换和/或至少一个氨基酸的添加或缺失。当与野生型蛋白质比较时，由改变的染色体序列所编码的变体蛋白质产物可呈现出经修饰的特征或活性，包括但不限于改变的酶活性或基质特异性。

在一些实施方案中，染色体修饰可导致改变的蛋白质表达模式。作为非限制性实例，控制蛋白质产物表达的调节区域中的染色体改变可导致蛋白质产物过度表达或下调或改变的组织或时间表达模式。

已经被修饰的细胞可按照传统方式生长成生物体，诸如，植物。参见，例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后，可使这些植物生长，且用相同修饰品系或不同品系授粉，且所得杂合体具有基因修饰。本发明提供基因修饰种子。再生植物的后代、变体及突变体也包含于本发明的范围内，前提条件是这些部分包括基因修饰。还提供了保持了基因修饰的经加工的植物产品或副产物，例如，包含豆粕。

本文提供的方法可用于修饰任何植物物种，包括但不限于单子叶植物及双子叶植物。所关注的植物的实例包括但不限于：玉蜀黍(玉米)、高粱、小麦、向日葵、西红柿、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜、芸苔属物种、苜蓿、黑麦、小米、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲胡桃、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物以及针叶树。

蔬菜包括但不限于：西红柿、莴苣、绿豆、青豆、豌豆和诸如黄瓜、哈密瓜及香瓜的黄瓜属的成员。观赏植物包括但不限于：杜鹃花、绣球花、芙蓉、玫瑰、郁金香、水仙、矮牵牛、康乃馨、猩猩木及菊花。优选地，本发明的植物为农作物(例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、西红柿、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等)。

本文提供的方法还可用于基因修饰任何原核物种，包括但不限于：古菌及细菌(例如，芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、链霉菌属、根瘤菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、志贺氏杆菌属、弧菌属、耶尔森菌属、支原体菌属、农杆菌属、乳酸乳杆菌属)。

本文提供的方法可用于基因修饰任何真核物种或来自于其的细胞，包括但不限于：动物(例如，哺乳动物、昆虫、鱼类、鸟类和爬行动物)、真菌、变形虫、藻类和酵母。在一些实施方案中，本发明公开的方法修饰的细胞包含造血源的细胞，诸如，免疫系统的细胞(即，免疫细胞)，包括但不限于：B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、包含多能干细胞及经诱导的多能干细胞的干细胞、嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。

可将经修饰的细胞可被引入生物体内。在自体细胞移植的情况中，这些细胞可源自同一个生物体(例如，人)，其中该细胞以离体措施被修饰。作为另一种选择，在异体细胞移植的情况中，该细胞源自同一个物种中的另一个生物体(例如，另一个人)。

XII.用于检测目标DNA或切割单链DNA群体的试剂盒和方法

本发明公开的RGN，特别是APG09624及APG05405(如SEQ ID NO:2及4所示)一旦通过目标DNA的缺失而被活化则可不加区分地切割未靶向的单链DNA(ssDNA)。因此，本文提供用于检测样本中的目标DNA(双链或单链)的组合物及方法。

检测DNA分子的目标DNA的方法包括：使样本与RGN(或编码其的多核苷酸)、能够与DNA分子中的RGN及目标DNA杂交的指导RNA(或编码其的多核苷酸)和不与该指导RNA杂交的检测单链DNA(检测ssDNA)接触，随后，测量通过该RGN切割该ssDNA产生的可检测信号，从而检测该DNA分子的目标DNA序列。在一些实施方案中，方法可包含在与RGN及指导RNA接触之前或同时进行的样本中的核酸分子的扩增步骤。在这些实施方案中的一些实施方案中，为增加检测方法的灵敏度，该指导RNA将与之杂交的特异性序列可被扩增。

在其中样本与编码RGN多肽的多核苷酸和/或编码该指导RNA的多核苷酸接触的那些实施方案中，样本包含完整细胞且该多核苷酸被引入细胞内，其中它们然后被表达。在这些实施方案中的一些实施方案中，至少一个多核苷酸还包含启动子，该启动子可操作地连接至编码该RGN多肽和/或指导RNA的核苷酸序列。

在一些实施方案中，期望目标可作为RNA(诸如，例如诸如冠状病毒的RNA病毒的基因组或基因组的局部)存在。在一些实施方案中，冠状病毒可为SARS样冠状病毒。在进一步的实施方案中，冠状病毒可为SARS-CoV-2、SARS-CoV或诸如bat-SL-CoVZC45(寄存编号：MG772933)的蝙蝠SARS样冠状病毒。在其中该目标作为RNA存在的实施方案中，目标可被逆转录为可通过RGN有效靶向的DNA分子。逆转录之后可为诸如本领域中已知的涉及热循环的RT-PCR方法的扩增步骤，或可为诸如RT-LAMP(逆转录-环介导等温扩增)的等温方法(Notomi等人Nucleic Acids Res 28:E63,(2000))。

该核酸扩增可在该样本与该RGN、指导RNA及检测ssDNA接触之前发生，或扩增可与该接触步骤同时地发生。

在某些实施方案中，该方法涉及使样本与RGN及一个以上的指导RNA接触。为扩增该可检测信号且引起对那个DNA分子的检测，每一个均能够与RGN杂交的指导RNA可与单DNA分子的唯一目标序列结合。

这些组合物及方法涉及不与该指导RNA杂交且为非目标ssDNA的检测ssDNA的使用。在一些实施方案中，检测ssDNA包含可检测标记，该可检测标记在切割该检测ssDNA后提供可检测信号。非限制性实例为包含荧光团/淬灭剂对的检测ssDNA，其中该荧光团当该检测ssDNA为完整的(即，未被切割)时因其信号通过紧密相邻的淬灭剂的存在被阻遏而不发荧光。检测ssDNA的切割导致淬灭剂的移除，且然后该荧光标记可被检测。荧光标记或荧光染料的非限制性实例包括Cy5、荧光素(例如，FAM、6FAM、5(6)FAM、FITC)、Cy3、Alexa

染剂和得克萨斯红。淬灭剂的非限制性实例包括Iowa

FQ、Iowa

RQ、Qx1淬灭剂、ATT0淬灭剂和QSY染剂。在一些实施方案中，检测ssDNA包含第二淬灭剂，诸如，比如ZEN^TM、TAO^TM和黑洞淬灭剂(Black Hole

)的内部淬灭剂，其可降低背景而增加信号检测。

在其他实施方案中，检测ssDNA包含可检测标记，该可检测标记在切割检测ssDNA之前提供可检测信号，而ssDNA的切割抑制或防止该信号的检测。这种情况的非限制性实例为包含荧光共振能量转移(FRET)对的检测ssDNA。FRET为通过其能量的无辐射转移自第一(供体)荧光团的激发态至紧密相邻的第二(受体)荧光团发生的过程。该供体荧光团的发射光谱与受体荧光团的激发光谱重叠。因此，当检测ssDNA为完整的(即，未被切割)时，受体荧光团将发荧光，而当检测ssDNA被切割时，因为供体与受体荧光团不再彼此紧密相邻，所以受体荧光团不再发荧光。FRET供体及受体荧光团为本领域中所知，且包括但不限于青色荧光蛋白(CFP)/绿色荧光蛋白(GFP)、Cy3/Cy5和GFP/黄色荧光蛋白(YFP)。

在一些实施方案中，检测ssDNA具有的长度为约2个核苷酸至约30个核苷酸，包括但不限于：约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25个核苷酸、约26个核苷酸、约27个核苷酸、约28个核苷酸、约29个核苷酸和约30个核苷酸。

其中使用包含检测ssDNA的这些组合物及方法可检测目标DNA的样本包括包含或据信包含核酸(例如，DNR或RNA分子)的任何样本。该样本可来源于包含纯化核酸的合成组合或诸如呼吸拭子(例如，鼻咽拭子)提取物、细胞裂解物、患者样本、细胞、组织、唾液、血液、血清、血浆、尿液、抽吸物、活检样本、脑脊液或生物体(例如，细菌、病毒)的生物样本的任何来源。

使样本与RGN、指导RNA和检测ssDNA接触可包括在体外、离体或在体内接触。在一些实施方案中，检测ssDNA和/或RGN和/或指导RNA被固定在例如横向流动装置上，其中该样本接触经固定化检测ssDNA和/或RGN和/或指导RNA。在一些实施方案中，针对检测ssDNA上的抗原部分的抗体以自完整检测ssDNA允许分化经切割的检测ssDNA的方式被固定在例如横向流动装置上。还提供了装置(例如，横向流动装置、微流体装置)，诸如，第WO 2020/028729号国际专利公开所描述的装置，该国际专利公开的全部内容通过引用并入本文，该装置包含经固定化检测ssDNA。可在对该装置添加该样本之前、同时或之后，对该样本添加该RGN及指导RNA，而当该目标DNA存在于该样本内时，该RGN将切割该目标DNA以及该检测ssDNA，引起可检测信号的增加或减少，该可检测信号可被测量，以检测该目标DNA序列的存在。作为另一种选择，该RGN和/或指导RNA固定在该装置(例如，横向流动装置、微流体装置)上，且将该样本及检测ssDNA添加至该装置。可在对该装置添加该样本之前、期间或之后，对该样本添加该检测ssDNA。另一种替代装置(例如，横向流动装置、微流体装置)包含针对该检测ssDNA上的抗原部分的经固定化抗体，且对该装置添加该样本、检测ssDNA、RGN及指导RNA。在一些实施方案中，方法还可包含确定样本中存在的目标DNA的量。可将测试样本中的可检测信号的测量值与参考测量值(例如，参考样本的或其包含已知量的目标DNA的系列的测量值)进行比较。

该组合物及方法的应用的非限制性实例包括单核苷酸多态性(SNP)检测、癌症筛查、细菌感染的检测、抗生素抗性的检测和病毒感染的检测。

使用本领域已知的任何适合方法可测量通过RGN切割该ssDNA产生的可检测信号，该方法包括但不限于测量荧光信号、凝胶上的带的视觉分析、比色变化以及电信号的存在或不存在。

本发明提供用于检测样本中的DNA分子的目标DNA的试剂盒，其中该试剂盒包含：本发明的RGN多肽(或包含编码该RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸)、能够与该RGN及DNA分子中的目标DNA序列杂交的指导RNA(或包含编码该指导RNA的核苷酸序列的多核苷酸)和不与该指导RNA杂交的检测ssDNA。在要检测的目标为RNA的那些实施方案中，试剂盒还可包含逆转录酶。在其中使用核酸扩增的那些实施方案中，包含该RGN及指导RNA(或编码其的多核苷酸)及检测ssDNA的试剂盒还可包含核酸扩增试剂(例如，DNA聚合酶、多核苷酸、缓冲液)。在其中该试剂盒包含编码RGN多肽的多核苷酸和/或编码该指导RNA的多核苷酸的那些实施方案中，多核苷酸被引入细胞内，其中它们然后被表达。在这些实施方案中的一些实施方案中，至少一个多核苷酸还包含启动子，该启动子可操作地连接至编码该RGN多肽和/或指导RNA的核苷酸序列。在某些实施方案中，试剂盒包含一个以上的指导RNA(或编码一个以上的指导RNA的多核苷酸)，每一个指导RNA都能够与该RGN杂交。为扩增该可检测信号且引起对那个DNA分子的检测，该指导RNA可与单DNA分子的唯一目标序列结合。该试剂盒的组件可个别地或组合地被提供，且可以被提供在任何适合的容器中，例如小瓶、瓶子或管子。在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种语言的说明。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或更多种试剂，其在利用本文描述的一种或多种组件的过程中使用。试剂可被提供于任何适合的容器中。例如，试剂盒可以提供一种或多种反应或储存缓冲液。试剂可为以可用于特别测定的形式、或以在使用前需要添加一种或多种其他组成的形式(例如，以浓缩或冷冻干燥形式)被提供。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。在一些实施方案中，缓冲剂为碱性的。在一些实施方案中，缓冲液具有约7至约10的pH。

本文还提供了通过接触核酸群体切割单链DNA的方法，其中该群体包括DNA分子的目标DNA序列及多个非目标ssDNA，该非目标ssDNA具有RGN和能够与该RGN及该目标DNA序列杂交的指导RNA。在这些实施方案中的一些实施方案中，核酸群体在细胞裂解物内。在这些实施方案中的一些实施方案中，非目标ssDNA非该细胞所原有，且在这些实施方案中的一些实施方案中，非目标ssDNA为病毒DNA。在特别实施方案中，目标DNA序列为病毒序列。可在体外、体内、或离体进行该方法。例如，可在体内进行该方法，其中对个体施用RGN多肽及指导RNA或一种或多种包含编码该RGN多肽和/或该指导RNA的核苷酸序列的多核苷酸，且病毒目标DNA序列通过该RGN的结合及切割可导致所感染的细胞内的非目标病毒ssDNA的切割。

冠词“a”和“an”在本文中用于指该冠词的语法对象中的一种或一种以上(即，至少一种)的语法对象。作为实例，“多肽”表示一种或多种多肽。

本说明书中提及的所有出版物及专利申请表示本公开内容所属领域中具有通常知识者的水平。所有出版物及专利申请通过引用并入本文，如同每一个单独出版物或专利申请被具体且单独地指示通过引用而被并入本文。

虽然为了清楚理解的目的已经作为示例及实例一定程度上详细地描述了前述发明，但显然可在所附实施方案的范围内实践某些改变及修改。

非限制性实施方案包括：

1.一种核酸分子，包含编码RNA指导核酸酶(RGN)多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码RGN多肽的核苷酸序列，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

其中当与能够与该目标DNA序列杂交的指导RNA(gRNA)结合时，该RGN多肽能够以RNA指导的序列特异性方式结合DNA分子的目标DNA序列，且

其中编码RGN多肽的该多核苷酸可操作地连接至与该多核苷酸异源的启动子。

2.如实施方案1的核酸分子，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

3.如实施方案1的核酸分子，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

4.如实施方案1-3中任一实施方案的核酸分子，其中该目标DNA序列位于为单链的该DNA分子的区域内。

5.如实施方案4的核酸分子，其中该RGN多肽能够在结合时切割该目标DNA序列。

6.如实施方案1-3中任一实施方案的核酸分子，其中该目标DNA序列位于为双链的该DNA分子的区域内。

7.如实施方案6的核酸分子，其中该RGN多肽能够在结合时切割该目标DNA序列。

8.如实施方案7的核酸分子，其中通过该RGN多肽的切割产生双链断裂。

9.如实施方案7的核酸分子，其中通过该RGN多肽的切割产生单链断裂。

10.如实施方案1-9中任一实施方案的核酸分子，其中该RGN多肽与碱基编辑多肽可操作地融合。

11.如实施方案10的核酸分子，其中该碱基编辑多肽为脱氨酶。

12.如实施方案1-11中任一实施方案的核酸分子，其中该目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

13.如实施方案1-12中任一实施方案的核酸分子，其中该RGN多肽包含一种或多种核定位信号。

14.如实施方案1-13中任一实施方案的核酸分子，其中该RGN多肽针对在真核细胞中的表达而被密码子优化。

15.一种包含如实施方案1-14中任一实施方案的核酸分子的载体。

16.如实施方案15的载体，还包含至少一个核苷酸序列，该至少一个核苷酸序列编码选自以下组成的组的RGN辅助蛋白：

a)与SEQ ID NO:178-181中任一个具有至少90％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:182-184中任一个具有至少90％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:185-187中任一个具有至少90％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:191具有至少90％序列同一性的RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:14具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:192具有至少90％序列同一性的RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:15具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

f)与SEQ ID NO:188-190中任一个具有至少90％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

17.如实施方案16的载体，其中该RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:178-181中任一个具有至少95％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:182-184中任一个具有至少95％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:185-187中任一个具有至少95％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:191具有至少95％序列同一性的RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:192具有至少95％序列同一性的RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和

f)与SEQ ID NO:188-190中任一个具有至少95％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

18.如实施方案16的载体，其中该RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:178-181中任一个具有100％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:182-184中任一个具有100％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有100％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:185-187中任一个具有100％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有100％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:191具有100％序列同一性的RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:14具有100％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:192具有100％序列同一性的RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:15具有100％序列同一性的氨基酸序列；和

f)与SEQ ID NO:188-190中任一个具有100％序列同一性的至少一个RGN辅助蛋白，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的氨基酸序列。

19.如实施方案15-18中任一实施方案的载体，还包含至少一个核苷酸序列，该至少一个核苷酸序列编码能够与该目标DNA序列杂交的该gRNA。

20.如实施方案19的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，且该gRNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列。

21.如实施方案19的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，且该gRNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

22.如实施方案19的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列，且该gRNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有100％序列同一性的CRISPR重复序列。

23.如实施方案19的载体，其中该gRNA包含tracrRNA。

24.如实施方案23的载体，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:120具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:121具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:122具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:123具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

25.如实施方案23的载体，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

26.如实施方案23的载体，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPRRNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有100％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPRRNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有100％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPRRNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有100％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPRRNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPRRNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有100％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPRRNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPRRNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有100％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPRRNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有100％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该gRNA还包含CRISPRRNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的氨基酸序列。

27.如实施方案23-26中任一实施方案的载体，其中该gRNA为单指导RNA。

28.如实施方案23-26中任一实施方案的载体，其中该gRNA为双指导RNA。

29.一种包含如实施方案1-14中任一实施方案的核酸分子或如实施方案15-28中任一实施方案的载体的细胞。

30.一种制备RGN多肽的方法，包含在该RGN多肽被表达的条件下，培养实施方案29的细胞。

31.一种制备RGN多肽的方法，包含将异源核酸分子引入细胞内，该异源核酸分子包含编码RNA指导核酸酶(RGN)多肽的核苷酸序列，该RNA指导核酸酶(RGN)多肽包含与SEQID NO:1-109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

其中当与能够与该目标DNA序列杂交的指导RNA(gRNA)结合时，该RGN多肽以RNA指导的序列特异性方式结合DNA分子的目标DNA序列；

且在该RGN多肽被表达的条件下，培养该细胞。

32.如实施方案31的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1-109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

33.如实施方案31的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1-109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

34.如实施方案30-33中任一实施方案的方法，还包括纯化该RGN多肽。

35.如实施方案30-33中任一实施方案的方法，其中该细胞还表达一种或多种指导RNA，该一种或多种指导RNA与该RGN多肽结合，以形成RGN核糖核蛋白复合物。

36.如实施方案35的方法，还包括纯化该RGN核糖核蛋白复合物。

37.一种分离的RNA指导核酸酶(RGN)多肽，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1-109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

其中当与能够与该目标DNA序列杂交的指导RNA(gRNA)结合时，该RGN多肽能够以RNA指导的序列特异性方式结合DNA分子的目标DNA序列。

38.如实施方案37的分离的RGN多肽，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1-109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

39.如实施方案37的分离的RGN多肽，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1-109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

40.如实施方案37-39中任一实施方案的分离的RGN多肽，其中该目标DNA序列位于为单链的该DNA分子的区域内。

41.如实施方案40的分离的RGN多肽，其中该RGN多肽能够在结合时切割该目标DNA序列。

42.如实施方案37-39中任一实施方案的分离的RGN多肽，其中该目标DNA序列位于为双链的该DNA分子的区域内。

43.如实施方案42的分离的RGN多肽，其中该RGN多肽能够在结合时切割该目标DNA序列。

44.如实施方案43的分离的RGN多肽，其中通过该RGN多肽的切割产生双链断裂。

45.如实施方案43的分离的RGN多肽，其中通过该RGN多肽的切割产生单链断裂。

46.如实施方案37-45中任一实施方案的分离的RGN多肽，其中该RGN多肽与碱基编辑多肽可操作地融合。

47.如实施方案46的分离的RGN多肽，其中该碱基编辑多肽为脱氨酶。

48.如实施方案37-47中任一实施方案的分离的RGN多肽，其中该目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

49.如实施方案37-48中任一实施方案的分离的RGN多肽，其中该RGN多肽包含一种或多种核定位信号。

50.一种包含编码CRISPR RNA(crRNA)的多核苷酸的核酸分子，其中该crRNA包含间隔序列及CRISPR重复序列，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；

其中指导RNA包含：

a)该crRNA；或

b)该crRNA及能够与该crRNA的该CRISPR重复序列杂交的反式活化的CRISPR RNA(tracrRNA)；

当该指导RNA与RNA指导核酸酶(RGN)多肽结合时，通过该crRNA的间隔序列，能够以序列特异性方式与DNA分子的目标DNA序列杂交，且

其中编码crRNA的该多核苷酸被可操作地连接至与该多核苷酸异源的启动子。

51.如实施方案50的核酸分子，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

52.如实施方案50的核酸分子，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有100％序列同一性的核苷酸序列。

53.一种包含实施方案50-52中任一个的核酸分子的载体。

54.如实施方案53的载体，其中该载体还包含编码该tracrRNA的多核苷酸。

55.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:110具有至少90％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

56.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:110具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

57.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:110具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120具有100％序列同一性的核苷酸序列。

58.如实施方案55-57中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

59.如实施方案58的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

60.如实施方案58的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有100％序列同一性的氨基酸序列。

61.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:111具有至少90％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:121具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

62.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:111具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

63.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:111具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:121具有100％序列同一性的核苷酸序列。

64.如实施方案61-63中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

65.如实施方案64的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

66.如实施方案64的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有100％序列同一性的氨基酸序列。

67.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:112具有至少90％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:122具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

68.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:112具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:122具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

69.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:112具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:122具有100％序列同一性的核苷酸序列。

70.如实施方案67-69中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

71.如实施方案70的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

72.如实施方案70的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的氨基酸序列。

73.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:113具有至少90％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:123具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

74.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:123具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

75.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:113具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:123具有100％序列同一性的核苷酸序列。

76.如实施方案73-75中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

77.如实施方案76的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

78.如实施方案76的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有100％序列同一性的氨基酸序列。

79.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:114具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:124具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

80.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:114具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:124具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

81.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:114具有100％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:124具有100％序列同一性的核苷酸序列。

82.如实施方案79-81中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

83.如实施方案82的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

84.如实施方案82的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有100％序列同一性的氨基酸序列。

85.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:115具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:125具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

86.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:125具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

87.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:115具有100％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:125具有100％序列同一性的核苷酸序列。

88.如实施方案85-87中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

89.如实施方案88的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

90.如实施方案88的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的氨基酸序列。

91.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:117具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:126具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

92.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:126具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

93.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:117具有100％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:126具有100％序列同一性的核苷酸序列。

94.如实施方案91-93中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

95.如实施方案94的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

96.如实施方案94的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有100％序列同一性的氨基酸序列。

97.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:118具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:127具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

98.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:118具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:127具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

99.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:118具有100％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:127具有100％序列同一性的核苷酸序列。

100.如实施方案97-99中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

101.如实施方案100的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

102.如实施方案100的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有100％序列同一性的氨基酸序列。

103.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:119具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

104.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:128具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

105.如实施方案54的载体，其中该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:119具有100％序列同一性的核苷酸序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:128具有100％序列同一性的核苷酸序列。

106.如实施方案103-105中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

107.如实施方案106的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

108.如实施方案106的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的氨基酸序列。

109.如实施方案54-108中任一实施方案的载体，其中编码该crRNA的该多核苷酸及编码该tracrRNA的该多核苷酸可操作地连接至同一个启动子，且被编码为单指导RNA。

110.如实施方案54-109中任一实施方案的载体，其中编码该crRNA的该多核苷酸及编码该tracrRNA的该多核苷酸可操作地连接至各别启动子。

111.一种包含编码反式活化的CRISPR RNA(tracrRNA)的多核苷酸的核酸分子，该反式活化的CRISPR RNA(tracrRNA)包含与SEQ ID NO:120至128中任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；

其中指导RNA包含：

a)该tracrRNA；和

b)crRNA，该crRNA包含间隔序列及CRISPR重复序列，其中该tracrRNA能够与该crRNA的该CRISPR重复序列杂交；

当该指导RNA与RNA指导核酸酶(RGN)多肽结合时，通过该crRNA的间隔序列，能够以序列特异性方式与目标DNA序列杂交，且

其中编码tracrRNA的该多核苷酸被可操作地连接至与该多核苷酸异源的启动子。

112.如实施方案111的核酸分子，其中该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120至128中任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

113.如实施方案111的核酸分子，其中该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120至128中任一个具有1000％序列同一性的核苷酸序列。

114.一种包含实施方案111-113中任一个的核酸分子的载体。

115.如实施方案114的载体，其中该载体还包含编码该crRNA的多核苷酸。

116.如实施方案115的载体，其中该crRNA包含与SEQ ID NO:110具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

117.如实施方案116的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:110具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

118.如实施方案116的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:110具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120具有100％序列同一性的核苷酸序列。

119.如实施方案116-118中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

120.如实施方案119的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

121.如实施方案119的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有100％序列同一性的氨基酸序列。

122.如实施方案115的载体，其中该crRNA包含与SEQ ID NO:111具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:121具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

123.如实施方案122的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:111具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

124.如实施方案122的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:111具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:121具有100％序列同一性的核苷酸序列。

125.如实施方案122-124中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

126.如实施方案125的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

127.如实施方案125的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有100％序列同一性的氨基酸序列。

128.如实施方案115的载体，其中该crRNA包含与SEQ ID NO:112具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:122具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

129.如实施方案128的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:112具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:122具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

130.如实施方案128的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:112具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:122具有100％序列同一性的核苷酸序列。

131.如实施方案128-130中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

132.如实施方案131的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

133.如实施方案131的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的氨基酸序列。

134.如实施方案115的载体，其中该crRNA包含与SEQ ID NO:113具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:123具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

135.如实施方案134的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:123具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

136.如实施方案134的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:113具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:123具有100％序列同一性的核苷酸序列。

137.如实施方案134-136中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

138.如实施方案137的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

139.如实施方案137的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有100％序列同一性的氨基酸序列。

140.如实施方案115的载体，其中该crRNA包含与SEQ ID NO:114具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:124具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

141.如实施方案140的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:114具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:124具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

142.如实施方案140的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:114具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:124具有100％序列同一性的核苷酸序列。

143.如实施方案140-142中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

144.如实施方案143的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

145.如实施方案143的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有100％序列同一性的氨基酸序列。

146.如实施方案115的载体，其中该crRNA包含与SEQ ID NO:115具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:125具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

147.如实施方案146的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:125具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

148.如实施方案146的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:115具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:125具有100％序列同一性的核苷酸序列。

149.如实施方案146-148中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

150.如实施方案149的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

151.如实施方案149的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的氨基酸序列。

152.如实施方案115的载体，其中该crRNA包含与SEQ ID NO:117具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:126具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

153.如实施方案152的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:126具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

154.如实施方案152的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:117具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:126具有100％序列同一性的核苷酸序列。

155.如实施方案152-154中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

156.如实施方案155的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

157.如实施方案155的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的氨基酸序列。

158.如实施方案115的载体，其中该crRNA包含与SEQ ID NO:118具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:127具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

159.如实施方案158的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:118具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:127具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

160.如实施方案158的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:118具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:127具有100％序列同一性的核苷酸序列。

161.如实施方案158-160中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

162.如实施方案161的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

163.如实施方案161的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有100％序列同一性的氨基酸序列。

164.如实施方案115的载体，其中该crRNA包含与SEQ ID NO:119具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

165.如实施方案164的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:128具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

166.如实施方案164的载体，其中该CRISPR重复序列与SEQ ID NO:119具有100％序列同一性，且该tracrRNA包含与SEQ ID NO:128具有100％序列同一性的核苷酸序列。

167.如实施方案164-166中任一实施方案的载体，其中该载体还包含编码该RGN多肽的多核苷酸，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

168.如实施方案167的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

169.如实施方案167的载体，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的氨基酸序列。

170.如实施方案115-169中任一实施方案的载体，其中编码该crRNA的该多核苷酸及编码该tracrRNA的该多核苷酸可操作地连接至同一个启动子，且被编码为单指导RNA。

171.如实施方案115-169中任一实施方案的载体，其中编码该crRNA的该多核苷酸及编码该tracrRNA的该多核苷酸可操作地连接至各别启动子。

172.一种用于结合DNA分子的目标DNA序列的系统，该系统包含：

a)能够与该目标DNA序列杂交的一种或多种指导RNA，或包含编码该一种或多种指导RNA(gRNA)的一种或多种核苷酸序列的一种或多种多核苷酸；和

b)包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的RNA指导核酸酶(RGN)多肽，或包含编码该RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸；

其中编码该一种或多种指导RNA的至少一个该核苷酸序列及编码该RGN多肽的该核苷酸序列可操作地连接至与该核苷酸序列异源的启动子；且

其中该一种或多种指导RNA能够与该RGN多肽形成复合物，以便将该RGN多肽导向至与该DNA分子的该目标DNA序列结合。

173.一种用于结合DNA分子的目标DNA序列的系统，该系统包含：

b)包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的RNA指导核酸酶(RGN)多肽；

其中该一种或多种指导RNA能够与该目标DNA序列杂交，且

174.如实施方案173的系统，其中编码该一种或多种指导RNA的至少一个该核苷酸序列可操作地连接至与该核苷酸序列异源的启动子。

175.如实施方案172-174中任一实施方案的系统，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:1至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

176.如实施方案172-174中任一实施方案的系统，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:1至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

177.如实施方案172-176中任一实施方案的系统，其中未发现该RGN多肽与该一种或多种指导RNA在自然界中彼此复合。

178.如实施方案172-177中任一实施方案的系统，其中该目标DNA序列为真核目标DNA序列。

179.如实施方案172-178中任一实施方案的系统，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列且该一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列。

180.如实施方案172-178中任一实施方案的系统，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列且该一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

181.如实施方案172-178中任一实施方案的系统，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列且该一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有100％序列同一性的CRISPR重复序列。

182.如实施方案172-181中任一实施方案的系统，其中该一种或多种指导RNA包含tracrRNA。

183.如实施方案182的系统，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:120具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:121具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:122具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:123具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

184.如实施方案182的系统，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:122具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:123具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

185.如实施方案182的系统，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:120具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有100％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:121具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有100％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:122具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:123具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有100％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有100％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有100％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有100％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的氨基酸序列。

186.如实施方案182-185中任一实施方案的系统，其中该一种或多种指导RNA为单指导RNA(sgRNA)。

187.如实施方案182-185中任一实施方案的系统，其中该一种或多种指导RNA为双指导RNA。

188.如实施方案172-187中任一实施方案的系统，其中该系统还包含至少一个RGN辅助蛋白或包含编码其的核苷酸序列的多核苷酸，其选自以下组成的组：

189.如实施方案188的系统，其中该至少一个RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

190.如实施方案188的系统，其中该至少一个RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

191.如实施方案172-190中任一实施方案的系统，其中该目标DNA序列位于细胞内。

192.如实施方案191的系统，其中该细胞为真核细胞。

193.如实施方案192的系统，其中该真核细胞为植物细胞。

194.如实施方案192的系统，其中该真核细胞为哺乳动物细胞。

195.如实施方案194的系统，其中该哺乳动物细胞为人细胞。

196.如实施方案195的系统，其中该人细胞为免疫细胞。

197.如实施方案196的系统，其中该人细胞为干细胞。

198.如实施方案197的系统，其中该干细胞为经诱导的多能干细胞。

199.如实施方案192的系统，其中该真核细胞为昆虫细胞。

200.如实施方案191的系统，其中该细胞为原核细胞。

201.如实施方案172-200中任一实施方案的系统，其中该目标DNA序列位于为单链的该DNA分子的区域内。

202.如实施方案201的系统，其中当被转录时，该一种或多种指导RNA能够与该目标DNA序列杂交，且该指导RNA能够与该RGN多肽形成复合物，以导向该目标DNA序列的切割。

203.如实施方案172-200中任一实施方案的系统，其中该目标DNA序列位于为双链的该DNA分子的区域内。

204.如实施方案203的系统，其中当被转录时，该一种或多种指导RNA能够与该目标DNA序列杂交，且该指导RNA能够与该RGN多肽形成复合物，以导向该目标DNA序列的切割。

205.如实施方案204的系统，其中该RGN多肽能够产生双链断裂。

206.如实施方案204的系统，其中该RGN多肽能够产生单链断裂。

207.如实施方案172-206中任一实施方案的系统，其中该RGN多肽可操作地连接至碱基编辑多肽。

208.如实施方案207的系统，其中该碱基编辑多肽为脱氨酶。

209.如实施方案172-208中任一实施方案的系统，其中该目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

210.如实施方案172-209中任一实施方案的系统，其中该RGN多肽包含一种或多种核定位信号。

211.如实施方案172-210中任一实施方案的系统，其中该RGN多肽针对在真核细胞中的表达而被密码子优化。

212.如实施方案172-211中任一实施方案的系统，其中包含编码一种或多种指导RNA的核苷酸序列的多核苷酸及包含编码RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸位于一个载体上。

213.如实施方案172-212中任一实施方案的系统，其中该系统还包含一种或多种供体多核苷酸或包含编码该一种或多种供体多核苷酸的一种或多种核苷酸序列的一种或多种多核苷酸。

214.一种药物组合物，包含实施方案1-14、50-52和111-113中任一实施方案的核酸分子、实施方案15-28、53-110和114-171中任一实施方案的载体、实施方案29的细胞、实施方案37-49中任一实施方案的分离的RGN多肽、或实施方案172-213中任一实施方案的系统及药学上可接受的载剂。

215.一种结合DNA分子的目标DNA序列的方法，包含将根据实施方案172-213中任一实施方案的系统递送至该目标DNA序列或包含该目标DNA序列的细胞。

216.如实施方案215的方法，其中该RGN多肽或该指导RNA还包含可检测标记，从而允许对该目标DNA序列的检测。

217.如实施方案215的方法，其中该指导RNA或该RGN多肽还包含表达调控子，从而调控该目标DNA序列的或受该目标DNA序列的转录控制的基因的表达。

218.一种切割DNA分子的目标DNA序列的方法，包含将根据实施方案172-213中任一实施方案的系统递送至该目标DNA序列或包含该目标DNA序列的细胞。

219.如实施方案218的方法，其中该经修饰的目标DNA序列包含异源DNA在该目标DNA序列内的插入。

220.如实施方案218的方法，其中该经修饰的目标DNA序列包含至少一个核苷酸自该目标DNA序列的缺失。

221.如实施方案218的方法，其中该经修饰的目标DNA序列包含该目标DNA序列中的至少一个核苷酸的突变。

222.一种用于结合DNA分子的目标DNA序列的方法，该方法包括：

a)在适合形成RGN核糖核苷酸复合物的条件下，通过组合以下，以在体外组装RNA指导核酸酶(RGN)核糖核苷酸复合物：

i)能够与该目标DNA序列杂交的一种或多种指导RNA；和

ii)RGN多肽，该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1-109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

b)使该目标DNA序列或包含该目标DNA序列的细胞与该在体外组装的RGN核糖核苷酸复合物接触；

其中该一种或多种指导RNA与该目标DNA序列杂交，从而将该RGN多肽导向至与该目标DNA序列结合。

223.如实施方案222的方法，其中该目标DNA序列位于为单链的该DNA分子的区域内。

224.如实施方案222的方法，其中该目标DNA序列位于为双链的该DNA分子的区域内。

225.如实施方案222-224中任一实施方案的方法，其中该目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

226.如实施方案222-225中任一实施方案的方法，其中该RGN多肽或该指导RNA还包含可检测标记，从而允许对该目标DNA序列的检测。

227.如实施方案222-225中任一实施方案的方法，其中该指导RNA或该RGN多肽还包含表达调控子，从而允许对该目标DNA序列的表达的调控。

228.一种用于切割和/或修饰DNA分子的目标DNA序列的方法，包含使该DNA分子与以下接触：

a)RNA指导核酸酶(RGN)多肽，其中该RGN包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

b)能够将(a)的RGN靶向至该目标DNA序列的一种或多种指导RNA；

其中该一种或多种指导RNA与该目标DNA序列杂交，从而将该RGN多肽导向至与该目标DNA序列结合，并且发生该目标DNA序列的切割和/或修饰。

229.如实施方案228的方法，其中该目标DNA序列位于为单链的该DNA分子的区域内。

230.如实施方案228的方法，其中该目标DNA序列位于为双链的该DNA分子的区域内。

231.如实施方案230的方法，其中通过该RGN多肽的切割产生双链断裂。

232.如实施方案230的方法，其中通过该RGN多肽的切割产生单链断裂。

233.如实施方案228-232中任一实施方案的方法，其中该RGN多肽可操作地连接至碱基编辑多肽。

234.如实施方案233的方法，其中该碱基编辑多肽包括脱氨酶。

235.如实施方案228-234中任一实施方案的方法，其中该目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

236.如实施方案228-235中任一实施方案的方法，其中该经修饰的目标DNA序列包含异源DNA在该目标DNA序列内的插入。

237.如实施方案228-235中任一实施方案的方法，其中该经修饰的目标DNA序列包含至少一个核苷酸自该目标DNA序列的缺失。

238.如实施方案228-235中任一实施方案的方法，其中该经修饰的目标DNA序列包含该目标DNA序列中的至少一个核苷酸的突变。

239.如实施方案222-238中任一实施方案的方法，其中该RGN包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

240.如实施方案222-238中任一实施方案的方法，其中该RGN包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

241.如实施方案222-240中任一实施方案的方法，其中未发现该RGN多肽与该一种或多种指导RNA在自然界中彼此复合。

242.如实施方案222-241中任一实施方案的方法，其中该目标DNA序列为真核目标DNA序列。

243.如实施方案222-242中任一实施方案的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列且该一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列。

244.如实施方案222-242中任一实施方案的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列且该一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

245.如实施方案222-242中任一实施方案的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列且该一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有100％序列同一性的CRISPR重复序列。

246.如实施方案222-242中任一实施方案的方法，其中该一种或多种指导RNA包含tracrRNA。

247.如实施方案246的方法，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

248.如实施方案246的方法，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

249.如实施方案246的方法，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

250.如实施方案246-249中任一实施方案的方法，其中该一种或多种指导RNA为单指导RNA(sgRNA)。

251.如实施方案246-249中任一实施方案的方法，其中该一种或多种指导RNA为双指导RNA。

252.如实施方案222-251中任一实施方案的方法，其中该方法还包含使DNA分子与选自以下组成的组的一种或多种RGN辅助蛋白接触：

253.如实施方案252的方法，其中该一种或多种RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

254.如实施方案252的方法，其中该一种或多种RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

255.如实施方案215-254中任一实施方案的方法，其中该目标DNA序列位于细胞内。

256.如实施方案255的方法，其中该细胞为真核细胞。

257.如实施方案256的方法，其中该真核细胞为植物细胞。

258.如实施方案256的方法，其中该真核细胞为哺乳动物细胞。

259.如实施方案258的方法，其中该哺乳动物细胞为人细胞。

260.如实施方案259的方法，其中该人细胞为免疫细胞。

261.如实施方案260的方法，其中该人细胞为干细胞。

262.如实施方案261的方法，其中该干细胞为经诱导的多能干细胞。

263.如实施方案256的方法，其中该真核细胞为昆虫细胞。

264.如实施方案255的方法，其中该细胞为原核细胞。

265.一种根据实施方案228-254中任一实施方案的方法包括经修饰的目标DNA序列的细胞。

266.如实施方案265的细胞，其中该细胞为真核细胞。

267.如实施方案266的细胞，其中该真核细胞为植物细胞。

268.一种包含实施方案267的细胞的植物。

269.一种包含实施方案267的细胞的种子。

270.如实施方案266的细胞，其中该真核细胞为哺乳动物细胞。

271.如实施方案270的细胞，其中该哺乳动物细胞为人细胞。

272.如实施方案271的细胞，其中该人细胞为免疫细胞。

273.如实施方案272的细胞，其中该人细胞为干细胞。

274.如实施方案273的细胞，其中该干细胞为经诱导的多能干细胞。

275.如实施方案266的细胞，其中该真核细胞为昆虫细胞。

276.如实施方案265的细胞，其中该细胞为原核细胞。

277.一种包含实施方案266及270-274中任一实施方案的细胞的药物组合物及药学上可接受的载剂。

278.一种用于检测样本中的DNA分子的目标DNA序列的试剂盒，该试剂盒包含：

a)包含与SEQ ID NO:1-109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的RNA指导核酸酶(RGN)多肽或包含编码该RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸，其中当与能够与该目标DNA序列杂交的指导RNA结合时，该RGN多肽能够以RNA指导的序列特异性方式结合及切割DNA分子的该目标DNA序列；

b)该指导RNA或包含编码该指导RNA的核苷酸序列的多核苷酸；和

c)不与指导RNA杂交的检测单链DNA(ssDNA)。

279.如实施方案278的试剂盒，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

280.如实施方案278的试剂盒，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

281.如实施方案278-280中任一实施方案的试剂盒，其中编码该指导RNA的至少一个该核苷酸序列及编码该RGN多肽的该核苷酸序列可操作地连接至与该核苷酸序列异源的启动子。

282.如实施方案278-281中任一实施方案的试剂盒，其中未发现该RGN多肽与该一种或多种指导RNA在自然界中彼此复合。

283.如实施方案278-282中任一实施方案的试剂盒，其中该目标DNA序列为真核目标DNA序列。

284.如实施方案278-283中任一实施方案的试剂盒，其中该检测ssDNA包含荧光团/淬灭剂对。

285.如实施方案278-283中任一实施方案的试剂盒，其中该检测ssDNA包含荧光共振能量转移(FRET)对。

286.如实施方案278-285中任一实施方案的试剂盒，其中该试剂盒还包含选自以下组成的组的至少一个RGN辅助蛋白：

287.如实施方案286的试剂盒，其中该至少一个RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

288.如实施方案286的试剂盒，其中该至少一个RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

289.如实施方案278-288中任一实施方案的试剂盒，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，且该一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列。

290.如实施方案278-288中任一实施方案的试剂盒，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，且该一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

291.如实施方案278-288中任一实施方案的试剂盒，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列，且该一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有100％序列同一性的CRISPR重复序列。

292.如实施方案278-288中任一实施方案的试剂盒，其中该一种或多种指导RNA包含tracrRNA。

293.如实施方案292的试剂盒，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

294.如实施方案292的试剂盒，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

295.如实施方案292的试剂盒，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

296.如实施方案292-295中任一实施方案的试剂盒，其中该一种或多种指导RNA为单指导RNA(sgRNA)。

297.如实施方案292-295中任一实施方案的试剂盒，其中该一种或多种指导RNA为双指导RNA。

298.如实施方案278-297中任一实施方案的试剂盒，其中该目标DNA序列位于为单链的该DNA分子的区域内。

299.如实施方案278-297中任一实施方案的试剂盒，其中该目标DNA序列位于为双链的该DNA分子的区域内。

300.如实施方案299的试剂盒，其中通过该RGN多肽的切割产生双链断裂。

301.如实施方案299的试剂盒，其中通过该RGN多肽的切割产生单链断裂。

302.如实施方案278-301中任一实施方案的试剂盒，其中该目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

303.一种检测样本中的DNA分子的目标DNA序列的方法，该方法包括：

a)使样本接触：

i)包含与SEQ ID NO:1-109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的RNA指导核酸酶(RGN)多肽，其中当与能够与该目标DNA序列杂交的指导RNA结合时，该RGN多肽能够以RNA指导的序列特异性方式结合及切割DNA分子的该目标DNA序列；

ii)该指导RNA；和

iii)不与指导RNA杂交的检测单链DNA(ssDNA)；和

b)测量通过RGN切割检测ssDNA产生的可检测信号，从而测量目标DNA序列。

304.如实施方案303的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

305.如实施方案303的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

306.如实施方案303-305中任一实施方案的方法，其中该样本包含来自细胞裂解物的DNA分子。

307.如实施方案303-305中任一实施方案的方法，其中该样本包含细胞。

308.如实施方案307的方法，其中该细胞为真核细胞。

309.如实施方案303-305中任一实施方案的方法，其中包含目标DNA序列的DNA分子通过存在于包含RNA的样本中的RNA模板分子的逆转录产生。

310.如实施方案309的方法，其中该RNA模板分子为RNA病毒。

311.如实施方案310的方法，其中该RNA病毒为冠状病毒。

312.如实施方案311的方法，其中该冠状病毒为蝙蝠SARS样冠状病毒、SARS-CoV或SARS-CoV-2。

313.如实施方案309-312中任一实施方案的方法，其中包括RNA的样本为自包含细胞的样本取得的。

314.如实施方案303-313中任一实施方案的方法，其中该检测ssDNA包含荧光团/淬灭剂对。

315.如实施方案303-313中任一实施方案的方法，其中该检测ssDNA包括荧光共振能量转移(FRET)对。

316.如实施方案303-315中任一实施方案的方法，其中该方法还包含在步骤a)的接触之前或与步骤a)的接触一起扩增样本中的核酸。

317.如实施方案303-316中任一实施方案的方法，其中该方法还包含使样本与选自以下组成的组的一种或多种RGN辅助蛋白接触：

318.如实施方案317的方法，其中该一种或多种RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

319.如实施方案317的方法，其中该一种或多种RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

320.一种切割单链DNA(ssDNA)的方法，该方法包括使核酸群体与以下接触，其中该群体包含DNA分子，该DNA分子包含目标DNA序列及多个非目标ssDNA：

a)包含与SEQ ID NO:1-109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的RNA指导核酸酶(RGN)多肽，其中当与能够与该目标DNA序列杂交的指导RNA结合时，该RGN多肽能够以RNA指导的序列特异性方式结合及切割该目标DNA序列；以及

b)该指导RNA；

其中该RGN多肽切割该多个的非目标ssDNA。

321.如实施方案320的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

322.如实施方案320的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

323.如实施方案320-322中任一实施方案的方法，其中该核酸群体在细胞裂解物内。

324.如实施方案320-323中任一实施方案的方法，其中包含目标DNA序列的DNA分子通过RNA模板分子的逆转录产生。

325.如实施方案320-324中任一实施方案的方法，其中该方法还包含使群体与选自以下组成的组的一种或多种RGN辅助蛋白接触：

326.如实施方案325的方法，其中该一种或多种RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

327.如实施方案325的方法，其中该一种或多种RGN辅助蛋白选自以下组成的组：

328.如实施方案303-327中任一实施方案的方法，其中未发现该RGN多肽与该指导RNA在自然界中彼此复合。

329.如实施方案303-328中任一实施方案的方法，其中该目标DNA序列为真核目标DNA序列。

330.如实施方案303-329中任一实施方案的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列且该指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列。

331.如实施方案303-329中任一实施方案的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列且该指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

332.如实施方案303-329中任一实施方案的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列且该指导RNA包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有100％序列同一性的CRISPR重复序列。

333.如实施方案303-329中任一实施方案的方法，其中该指导RNA包含tracrRNA。

334.如实施方案333的方法，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:120具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:121具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:122具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:123具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

335.如实施方案333的方法，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:122具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:123具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

336.如实施方案333的方法，其中该tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:120具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有100％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:121具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有100％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:122具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:123具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有100％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有100％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有100％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有100％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有100％序列同一性的tracrRNA，其中该指导RNA还包含CRISPR RNA，该CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的氨基酸序列。

337.如实施方案333-336中任一实施方案的方法，其中该指导RNA为单指导RNA(sgRNA)。

338.如实施方案333-336中任一实施方案的方法，其中该指导RNA为双指导RNA。

339.如实施方案303-338中任一实施方案的方法，其中该目标DNA序列位于为单链的该DNA分子的区域内。

340.如实施方案303-338中任一实施方案的方法，其中该目标DNA序列位于为双链的该DNA分子的区域内。

341.如实施方案340的方法，其中该目标DNA序列通过该RGN多肽的切割产生双链断裂。

342.如实施方案340的方法，其中该目标DNA序列通过该RGN多肽的切割产生单链断裂。

343.如实施方案303-342中任一实施方案的方法，其中该目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

344.一种利用针对基因遗传性疾病的因果突变的校正来产生基因修饰细胞的方法，该方法包括将以下引入该细胞内：

a)RNA指导核酸酶(RGN)多肽或编码该RGN多肽的多核苷酸，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中编码该RGN多肽的该多核苷酸可操作地连接至启动子，以赋能该RGN多肽在该细胞中的表达；和

b)指导RNA(gRNA)或编码该gRNA的多核苷酸，其中该gRNA包含CRISPR重复序列，该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中编码该gRNA的该多核苷酸可操作地连接至启动子，以赋能该gRNA在该细胞中的表达，

由此该RGN和gRNA靶向该因果突变的基因组位置且修饰该基因组序列以除去该因果突变。

345.如实施方案344的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，且该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

346.如实施方案344的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少100％序列同一性的氨基酸序列，且该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有至少100％序列同一性的核苷酸序列。

347.如实施方案344-346中任一实施方案的方法，其中该RGN可操作地连接至碱基编辑多肽。

348.如实施方案347的方法，其中该碱基编辑多肽为脱氨酶。

349.如实施方案344-348中任一实施方案的方法，其中该细胞为动物细胞。

350.如实施方案344-348中任一实施方案的方法，其中该细胞为哺乳动物细胞。

351.如实施方案349的方法，其中该细胞为从狗、猫、小鼠、大鼠、兔、马、牛、猪或人取得的。

352.如实施方案349的方法，其中该基因遗传性疾病是单核苷酸多态性引起的。

353.如实施方案351的方法，其中该基因遗传性疾病为赫尔勒综合征。

354.如实施方案353的方法，其中该gRNA还包含靶向靠近该因果单核苷酸多态性的区域的间隔序列。

355.一种利用引起疾病的不稳定基因组区域中的缺失来产生基因修饰细胞的方法，该方法包括将以下引入该细胞内：

a)RNA指导核酸酶(RGN)多肽或编码该RGN多肽的多核苷酸，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中编码该RGN多肽的该多核苷酸可操作地连接至启动子，以赋能该RGN多肽在该细胞中的表达；以及

b)第指导RNA(gRNA)或编码该第一gRNA的多核苷酸，其中该第一gRNA包含CRISPR重复序列，该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中编码该第一gRNA的该多核苷酸可操作地连接至启动子，以赋能该第一gRNA在该细胞中的表达，且进一步地其中该第一gRNA包含靶向该不稳定基因组区域的5'侧翼的间隔序列；和

c)第二指导RNA(gRNA)或编码该第二gRNA的多核苷酸，其中该第二gRNA包含CRISPR重复序列，该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中编码该第二gRNA的该多核苷酸可操作地连接至启动子，以赋能该第二gRNA在该细胞中的表达，并且进一步地其中该第二gRNA包含靶向该不稳定基因组区域的3'侧翼的间隔序列；

由此该RGN及该第一及第二gRNA靶向该不稳定基因组区域，并且该不稳定基因组区域的至少一部分被除去。

356.如实施方案355的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，且该第一gRNA及该第二gRNA的该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

357.如实施方案355的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列，且该第一gRNA及该第二gRNA的该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有100％序列同一性的核苷酸序列。

358.如实施方案355-357中任一实施方案的方法，其中该细胞为动物细胞。

359.如实施方案355-357中任一实施方案的方法，其中该细胞为哺乳动物细胞。

360.如实施方案359的方法，其中该细胞是从狗、猫、小鼠、大鼠、兔、马、牛、猪或人取得的。

361.如实施方案358的方法，其中该基因遗传性疾病为弗里德赖希共济失调或亨廷顿病。

362.如实施方案358的方法，其中该第一gRNA的间隔序列还靶向该不稳定基因组区域内的或靠近该不稳定基因组区域的区域。

363.如实施方案362的方法，其中该第二gRNA的间隔序列还靶向该不稳定基因组区域内的或靠近该不稳定基因组区域的区域。

364.一种用于产生具有降低的BCL11A mRNA和蛋白质表达的基因修饰的哺乳动物造血祖细胞的方法，该方法包括将以下引入分离的人造血祖细胞内：

a)RNA指导核酸酶(RGN)多肽或编码该RGN多肽的多核苷酸，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1-109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中编码该RGN多肽的该多核苷酸可操作地连接至启动子，以赋能该RGN多肽在该细胞中的表达；和

b)指导RNA(gRNA)或编码该gRNA的多核苷酸，其中该gRNA包含CRISPR重复序列，该CRISPR重复序列包括与SEQ ID NO:110-119中任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中编码该gRNA的该多核苷酸可操作地连接至启动子，以赋能该gRNA在该细胞中的表达，

由此该RGN和gRNA在细胞中表达并在BCL11A增强子区域处切割，导致该人造血祖细胞的基因修饰且降低BCL11A的mRNA和/或蛋白质表达。

365.如实施方案364的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，且该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

366.如实施方案364的方法，其中该RGN多肽包含与SEQ ID NO:1至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列，且该CRISPR重复序列包含与SEQ ID NO:110至119中任一个具有100％序列同一性的核苷酸序列。

367.如实施方案364-366中任一实施方案的方法，其中该gRNA还包含靶向位于该BCL11A增强子区域内的或靠近该BCL11A增强子区域的区域的间隔序列。

368.如实施方案344-367中任一实施方案的方法，其中该指导RNA、第指导RNA和第二指导RNA包含tracrRNA。

369.如实施方案368的方法，其中该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120至128中任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

370.如实施方案368的方法，其中该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120至128中任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

371.如实施方案368的方法，其中该tracrRNA包含与SEQ ID NO:120至128中任一个具有100％序列同一性的核苷酸序列。

372.一种治疗疾病的方法，该方法包括对需要治疗的个体施用有效量的实施方案214或277的药物组合物。

373.如实施方案372的方法，其中该疾病与因果突变关联，且该有效量的该药物组合物校正该基因突变。

374.实施方案1-14、50-52和111-113中任一个的核酸分子、实施方案15-28、53-110和114-171中任一个的载体、实施方案29、266和270-274中任一个的细胞、实施方案37-49中任一个的分离的RGN多肽、或实施方案172-213中任一个的系统对于治疗个体的疾病的用途。

375.如实施方案374的用途，其中该疾病与因果突变关联，且该治疗包含校正该因果突变。

376.实施方案1-14、50-52和111-113中任一个的核酸分子、实施方案15-28、53-110和114-171中任一个的载体、实施方案29、266和270-274中任一个的细胞、实施方案37-49中任一个的分离的RGN多肽、或实施方案172-213中任一个的系统对于制造有用于治疗个体的药品的用途。

377.如实施方案376的用途，其中该疾病与因果突变关联，且有效量的该药品校正该因果突变。

提供以下实施例为示例而非限制。

实验

实施例1.RNA指导核酸酶的鉴定

在所关注的基因组中鉴定与转座酶具序列相似性的CRISPR关联序列。CRISPR重复序列在被设置为2的阵列中用最少数目的重复序列通过minCED(探勘环境数据集(Environmental Datasets)中的CRISPR重复序列)被鉴定。仅考虑对与同一个重叠群(contig)上的重复序列共定位的推定RNA指导核酸酶做进一步调查。使用重叠群上重复序列与推定cas基因之间距离的若干渐增的严格截断(100kb、50kb、20kb、10kb)。选择5kb的最终过滤器。

在该文献中，活性系统中的CRISPR重复序列的长度介于27与47个核苷酸之间。该特征被用于过滤且移除非CRISPR重复特征。为对阵列扩展提供适宜的化学性质，CRISPR阵列中的新间隔序列的一部分获得需要重复序列的第一核苷酸为G。作为此步骤的一部分，共有重复序列以及重复序列-间隔序列阵列的取向被预测。包括此过滤器以优先考虑可能的功能性RGN。阵列中所需重复序列的最小数目被增加至3。

一些蛋白质(主要是DNA结合蛋白质)在其一级结构中具有重复氨基酸，其可能被错误地检测为CRISPR基因座。自身重复特征发生于蛋白质内部的推定RGN被弃去。仅考虑对基因间重复序列做进一步分析。

为确定同源物的簇，蛋白质及共有重复序列被排列且基于它们的谱系被分类为簇。重复序列及蛋白质在谱系上往往共簇，对同源物的簇的概念提供支持。蛋白质簇信息也显示于表1中。使用cdhit，以95％的同一性，使蛋白质成簇。

品系关系(relatedness)可通过比较它们的间隔序列内容跟踪。如果系统具有相同的重复序列及类似的蛋白质序列，则称它们有关系，且它们的间隔序列内容可提供有关于它们的共享历史的信息。相同的簇中的同源物往往共享保留的祖间隔序列。趋异品系(Divergent strain)彼此具有整体唯一的间隔序列内容。克隆分离物将完全共享完全相同的间隔序列内容。自身重复序列被保留但自身间隔序列内容在基因组之间不同的系统可促进更可能为活性的且这些被优先考虑。

鉴定了109种不同的CRISPR关联的RNA指导核酸酶(RGN)并描述于下表1中。表1提供每一个RGN的名称、其氨基酸序列、其被取得所自的来源和经处理的crRNA及tracrRNA序列。

对围绕每一个推定核酸酶的基因座搜索CRISPR免疫可能需要的潜在辅助基因。若干推定核酸酶出现在具潜在辅助基因的操纵子结构中，但没有基因座含有cas1、cas2、cas4或其他已知cas基因的同源物(图1)。另外，若干系统含有对齐该核酸酶的末端且在CRISPR重复序列的上游缺少期望的前导序列的重复序列，这表明CRISPR RNA表达的一种新机制。

表1：RGN系统信息

ND＝未定

实施例2：蛋白质分析

通过在interpro数据库中搜索域，预测核酸酶域。使用建立于割裂RuvC域上的hmm核酸酶域概况从已知Cas蛋白预测割裂Ruvc核酸酶域。所预测的核酸酶残基可见于表2中(ND＝未定)。

表2：核酸酶残基

实施例3：指导RNA预测及确认

使天然表达了调查中的RNA指导核酸酶系统的细菌培养物生长至对数中期(约0.600的OD600)、成粒状物并快速冷冻。使用mirVANA miRNA分离试剂盒(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)从粒状物中分离RNA，并使用NEBNext Small RNA LibraryPrep试剂盒(NEB，Beverly，MA)从分离的RNA制备测序文库。将文库制备物在6％聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，以捕获小于200nt的RNA物质，从而分别检测crRNA和tracrRNA。由服务提供商(MoGene，St.Louis，MO)在Next Seq 500(高输出试剂盒)上进行深度测序(75bp配对末端)。使用Cutadapt对读数进行质量修整，并使用Bowtie2将读数映射到参考基因组。用python编写定制RNAseq管线(pipeline)来检测crRNA和tracrRNA转录物。通过天然重复序列间隔序列阵列的序列覆盖来确定经处理的crRNA边界。使用允许的BLASTn参数鉴定tracrRNA的抗重复序列部分。通过鉴定含有抗重复序列的转录物，RNA测序深度确认经处理的tracrRNA的边界。使用RNAfold(RNA折叠软件)进行的二级结构预测来进行RNA的手动管理(manual curation)。sgRNA盒是通过DNA合成而被制备的，并且一般如下设计(5'->3')：经处理的tracrRNA，在其3’末端可操作地连接至4bp非互补接头(AAAG；SEQ ID NO:136)、在其3’末端可操作地连接至crRNA的经处理的重复序列部分，在其3’末端可操作地连接至20-30bp间隔序列。也可以使用其他4bp非互补接头。

对于体外测定，通过用TranscriptAid T7高产率转录试剂盒(ThermoFisher)的sgRNA盒的体外转录来合成sgRNA及一些tracrRNA。以合成方式产生crRNA及一些tracrRNA。

对于蛋白质表达及纯化，含有与C端His 10标签融合的推定RGN的质粒被构建且被转化到大肠杆菌的BL21(DE3)菌株中。使用补加了卡那霉素的Magic Media自诱导培养基进行表达。裂解以及澄清后，通过固定化金属亲和层析法纯化蛋白质。使用Heparin层析法，进行APG05405的进一步纯化。

使用在tracrRNA的上游具T7启动子的dsDNA模板，通过体外转录(IVT)产生tracrRNA(SEQ ID NO:140、145和147)的较长的tracrRNA。用于IVT的模板通过PCR自合成gBlock模板(Integrated DNA Technologies)扩增。以合成方式产生较短的tracrRNA及crRNA。

通过差示扫描荧光测定确认RNA结合(Niesen,F.H.,H.Berglund,andM.Vedadi.2007.Nat.Protoc.2:2212–2221)。通过在Annealing Buffer(Synthego,60mMKCl 6mM HEPES pH 7)中使过量crRNA与tracrRNA混合来产生双RNA复合物。在磷酸盐缓冲盐水(PBS,Thermo Fisher)中，以0.5μM效应子蛋白及1μM指导RNA的最终浓度，孵育候选效应子蛋白及指导RNA(或双RNA复合物或sgRNA)。在室温下，将它们孵育20分钟，且然后与已在PBS中被稀释的Sypro Orange染剂溶液以1:1混合。解链曲线通过测量为温度的函数的荧光强度(FI)来获得，且计算该解链曲线的一次导数(dFI/dT)。为推定RNP的温度的函数的dFI/dT的曲线图相对于原始核酸酶的位移指示RNA结合，且被用于评估推定指导RNA组合。在所鉴定的原始指导组合中，对于RGN APG09624及APG05405，仅观察到全长推定tracrRNA及crRNA诱发dFI/dT与温度的函数显著位移。对于其他蛋白质/RNA组合观察到此函数的小位移，且相较于以前对功能性RNP形成观察到的位移，该小位移的幅度较小，且不被解释为功能性复合物的形成的指示。第1峰是指对于给定样本与所观察到的最高峰关联的温度。如果第二峰被观察到，则其被指示在第2峰列中。关于复合物的形成的数据的解释被指示于表3的“结合？”列中。“是”指示结合被观察到。“N/A”指示没有足够的资料可用于确定结合是否发生。

表3：RGN与指导RNA的结合

实施例4：导向ssDNA目标切割

经纯化的APG09624、APG05405及催化灭活的APG05405(如SEQ ID NO:173所示的dAPG05405)与单指导RNA(sgRNA)Gsg.2(如SEQ ID NO:194所示的)在Cutsmart缓冲液(NewEngland Biolabs B7204S)中在200nM核酸酶及400nM sgRNA的最终浓度下一起孵育20分钟。然后，以100nM核酸酶的最终浓度将它们添加至以5'Cy5示踪的ssDNA溶液中，该以5'Cy5示踪的ssDNA在本文中被称为以10nM位于1.5X Cutsmart缓冲液(New England BiolabsB7204S)中的LE111(如SEQ ID NO:195所示)或LE113(如SEQ ID NO:196所示)。

样本通过分别以0.1mg/mL及45mM的最终浓度添加RNase及EDTA而被淬灭，且在以下时间点置于冰上：0、40、80和120分钟。淬灭全部样本后，将它们在50℃下孵育30分钟，然后，在95℃下孵育5分钟。将五分之一体积的上样缓冲液(1x TBE、12％Ficoll、7M尿素)添加至每一个反应物中，且在95℃下孵育15分钟，且在15％TBE-尿素丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad3450092)上分析5μl的每一个反应物。

随时间、核酸酶及指导RNA的变化的切割产物的定量显示于下面的表4中。LE111(SEQ ID NO:195)的序列用作阴性对照，而LE113(SEQ ID NO:196)的序列承载被装载于核酸酶上的sgRNA的目标序列。

表4：目标寡核苷酸的切割

凝胶分析揭示主要位于样本中通过sgRNA靶向且具有催化活性核酸酶的切割产物依时间的形成，其证明这些蛋白质的RNA指导核酸酶活性，且提供关键催化残基被正确定义的证据。当APG09624 RNP与LE111一起孵育时，观察到一些非特异性活性，这可能是由于该批次的dAPG05405及APG05405是通过额外层析法步骤纯化的，且因此，由于未完全去除由表达宿主取得的核酸酶，该批次的APG09624可具有一定水平的背景活性。

实施例5：可程序化的DNA结合及基因活化

RGN基因活化及gRNA哺乳动物表达质粒的构建

哺乳动物表达的核酸酶构建体被合成。在巨细胞病毒(CMV)启动子(SEQ ID NO:152)的控制下具N端SV40(SEQ ID NO:149)及C端核质素NLS序列(分别是，SEQ ID NO:149及150)、N端3xFLAG标签(SEQ ID NO:151)和C或N端VPR活化域(SEQ ID NO:154；Chavez等人2015，Nature Methods,12(4):326-328)的人密码子优化的APG05405被产生且被引入哺乳动物表达载体内。使用APG05405的推测具催化活性的及被催化灭活的(“dAPG5405”)两种形式。编码单gRNA的指导RNA表达构建体的每一个也都在人RNA聚合酶III U6启动子(SEQ IDNO:153)的控制下被产生。核酸酶构建体指示于下面的表5中。

表5：RGN构建体

核酸酶构建体	SEQ ID NO.
		APG05405	155
dAPG05405	156
		APG05405-VPR	157
dAPG05405-VPR	158
		VPR-APG05405	159
VPR-dAPG05405	160

哺乳动物细胞的转染及表达

转染前一天，将1x10⁴个HEK293T细胞(Sigma)铺板于杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)加10％(vol/vol)胎牛血清(Gibco)及1％青霉素-链霉素(Gibco)的96孔培养皿中。当细胞达到50-60％汇合时的第二天，按照制造商的说明，使用每孔0.3μL的Lipofectamine3000(Thermo Scientific)共转染100ng的RGN表达质粒加100ng的单gRNA表达质粒。生长48小时后，使用Cells-to-Ct One Step试剂盒(ThermoFisher)来收获总RNA。

目标基因表达的Taqman测定

挑选正常情况下在HEK细胞中具有低表达但在CRISPR活化时可被诱导的内源基因。出于此目的，挑选RHOXF2及CD2。TaqMan基因表达测定是作为标准化对照通过对RHOXF2及CD2使用FAM示踪探针且对ACTB使用VIC示踪探针(全部探针都来自ThermoFisher)进行的。TaqMan测定是按照制造商的说明在BioRad CFX96 Real Time热循环仪中在Cells-to-CT^TMOne Step试剂盒(Thermofisher)中进行的。在不存在gRNA的类似实验中测量背景。使用2^-ΔΔCt方法(Livak等人2001,Methods,25(4):402-8)计算基因表达相对于背景的倍数变化，将表达针对ACTB转录物水平进行标准化。

表6：目标基因表达的指导RNA

实施例6：可程序化DNA结合及碱基编辑

寡核苷酸及PCR

下面描述的全部PCR反应都是在包括0.5uM的每一种引物的20μL反应物中使用10μL的2X Master Mix Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(Thermo Scientific)进行的。首先，使用PCR#1引物，使用以下程序：98℃，1分钟；[98℃，10秒；62℃，15秒；72℃，5分钟]的30个循环；72℃，5分钟；12℃，永远，来扩增涵盖每一个目标基因的大基因组区域。然后，使用对每一个指导特异的引物(PCR#2引物)，使用以下程序：98℃，1分钟；[98℃，10秒；67℃，15秒；72℃，30秒]的35个循环；72℃，5分钟；12℃，永远，来进一步扩增1微升的此PCR反应物。PCR#2的引物包括用于Illumina测序的Nextera Read 1和Read 2转座酶衔接蛋白突出部序列。

RGN碱基编辑及gRNA哺乳动物表达质粒的构建

哺乳动物表达的核酸酶构建体被合成。在巨细胞病毒(CMV)启动子(SEQ ID NO:152)的控制下具N端SV40(SEQ ID NO:149)及C端核质素NLS序列(分别为SEQ ID NO:149及150)、N端3xFLAG标签(SEQ ID NO:151)和N端脱氨酶(例如，hAPOBEC3A；SEQ ID NO:177)的人密码子优化的APG05405被产生且被引入哺乳动物表达载体内。使用催化去活性形式的APG05405(“dAPG5405”)。编码单gRNA的指导RNA表达构建体的每一个也都在人RNA聚合酶III U6启动子(SEQ ID NO:153)的控制下被产生。

哺乳动物细胞的转染及表达

转染前一天，将1x10⁵个HEK293T细胞(Sigma)铺板于杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)加10％(vol/vol)胎牛血清(Gibco)及1％青霉素-链霉素(Gibco)中的24孔培养皿中。当细胞达到50-60％汇合时，按照制造商的说明，使用每孔1.5μL的Lipofectamine 3000(Thermo Scientific)共转染500ng的APG05405表达质粒加500ng的单gRNA表达质粒。生长48小时后，按照制造商的说明，使用基因组DNA分离试剂盒(Machery-Nagel)来收获总基因组DNA。

下一代测序

来自含有Illumina突出端序列的PCR#2的产物遵循Illumina 16S宏基因组测序文库操作流程进行文库制备。深度测序由服务提供商(MOGene)在Illumina Mi-Seq平台上进行。通常情况下，每扩增子产生200,000个250bp的配对末端读数(2×100,000个读数)。使用CRISPResso(Pinello等人，2016，Nature Biotech 34：695-697)分析读数以计算碱基编辑率。手动管理输出比对，以确认碱基编辑窗口以及鉴定插入或缺失。横跨该目标的每一个位置都被分析，以确定编辑率及在每一个位置发生的特异性核苷酸变化。

实施例7：反式ssDNA切割

7.1确定反式DNA切割的测定条件

在Cutsmart缓冲液(New England Biolabs B7204S)中，将经纯化的APG05405与单指导RNA(sgRNA)以或者50nM的核酸酶及100nM的sgRNA或者200nM的核酸酶及400nM的sgRNA的最终浓度一起孵育10分钟。将这些RNP溶液添加至在1.5X Cutsmart缓冲液(New EnglandBiolabs B7204S)中ssDNA(目标或错配阴性对照ssDNA)的最终浓度为10nM且报导子ssDNA探针的最终浓度为250nM的溶液。报导子探针(如SEQ ID NO:197及198分别所示的TB0125及TB0089)在5’末端含有荧光染料(56-FAM用于TB0125且Cy5用于TB0089)，在3’末端含有淬灭剂(3IABkFQ用于TB0125且3IAbRQSp用于TB0089)，并且视情况含有内部淬灭剂(内部淬灭剂ZEN仅存在于TB0125上)。报导子探针的切割导致荧光染料去淬灭，且由此导致荧光信号增大。为监测荧光强度，在酶标仪(CLARIOstar Plus)中在30℃下在Corning的小体积384孔微孔板中孵育10μl的每一个反应物。

为对此测定确定适合的参数，探测很多条件。为确定是否有淬灭的探针设计或荧光团特性的效应，在每一个反应物中作为混合物包含两个这种报导子。在任何给定的反应物中，它们彼此在相同的浓度。在所有情况中，对照或目标ssDNA的浓度(SEQ ID NO:199及200分别所示的LE201或LE205)为10nM。RNP名称示意了如下面的表7所指示的核酸酶及目标。

表7.核糖核蛋白复合物

核酸酶	sgRNA(SEQ ID NO)	预期目标	RNP名称
				APG05405	Gsg.1(193)	LE201	APG05405.1
APG05405	Gsg.2(194)	LE205	APG05405.2

结果显示于下面的表8中。

表8.反式DNA切割测定结果

由此实验得出的结论是，相较于25nM的RNP浓度，100nM浓度的RNP一般导致较高的报导子探针切割率。一般而言，最多到250nM的报导子浓度，报导子寡核苷酸浓度越高，则报导子切割率越高，几乎没有从报导子浓度的进一步升高观察到什么益处。显然，对于TB0089报导子(在Cy5通道中检测的)，尤其是在报导子浓度高于250nM时，存在干扰目标分化的显著较高位准的背景活性。因此，得出结论，报导子浓度高于250nM没有益处，且一般而言，双淬灭TB0125探针(在FAM通道检测的)更适合未来的实验，因为在宽报导子浓度范围内，其对背景活性提供较高比率的特异性。

7.2 APG09624反式DNA切割及纯化对非特异性活性的效应

经纯化的APG05405及APG09624与单指导RNA(sgRNA)如以下所示一起在37℃下在1X Cutsmart缓冲液(New England Biolabs B7204S)中以200nM的核酸酶及400nM的sgRNA的最终浓度孵育10分钟。

表9.核糖核蛋白复合物

核酸酶	核酸酶批次	sgRNA	预期目标	RNP名称
					APG09624	N/A	Gsg.2	LE113	APG09624.2
APG05405	A	Gsg.2	LE113	APG05405.2A
					APG05405	B	Gsg.2	LE113	APG05405.2B

然后，将这些RNP溶液添加至在1.5X Cutsmart缓冲液(New England BiolabsB7204S)中ssDNA(目标或错配阴性对照ssDNA)的最终浓度为10nM且报导子探针(TP0003；如SEQ ID NO:314所示)的最终浓度为250nM的溶液中。报导子探针在5’末端含有荧光染料，且在3’末端含有淬灭剂。报导子探针的切割导致荧光染料去淬灭，且由此导致荧光信号增大。为监测荧光强度，在酶标仪(CLARIOstar Plus)中在37℃下在Corning的小体积384孔微孔板中孵育10μl的每一个反应物。

相对于阴性对照，与目标序列一起孵育导致以时间为函数的荧光强度实质升高。切割率被得当地概括为荧光对时间函数的线性部分的斜率，如表10所显示。

表10.反式DNA切割测定结果

RNP	ssDNA目标序列	斜率(任意单位/分钟)
			APG09624.2	LE111	182
APG09624.2	LE113	561
			APG05405.2A	LE111	197
APG05405.2A	LE113	1625
			APG05405.2B	LE111	73
APG05405.2B	LE113	1054

这些数据显示通过APG05405及APG09624二者形成的RNP引起目标序列的分化。

7.3通过PCR产物的反式DNA切割活化

含有目标的简并核苷酸5'的寡核苷酸被PCR扩增，以产生目标序列。目标dsPCR2及dsPCR3在指导RNA编码的目标的5'侧含有分别如SEQ ID NO:311及312所示的目标序列ACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGG(dsPCR2)及TGGAATGGGAACTAAAGTAATGG(dsPCR3)，其分别含有8bp及5bp的简并区域。用恰当的引物，寡核苷酸对发生退火且被PCR扩增。除此之外，ssDNA目标被包括于该实验中-寡核苷酸含有上面描述的目标序列的反向互补序列CCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGT(LE205；SEQ ID NO:200)及CCATTACTTTAGTTCCCATTCCA(LE501；SEQ ID NO:174)。

RNP溶液是通过孵育在1X NEBuffer 2(New England Biolabs)中分别为0.5μM及1μM的核酸酶及sgRNA形成的，且在室温下被孵育20分钟。

表11.核糖核蛋白复合物

sgRNA	预期目标	RNP名称
			Gsg.3(SEQ ID NO:175)	dsPCR3,LE501	APG05405.3
Gsg.2(SEQ ID NO:194)	dsPCR2,LE205	APG05405.2

在1.5X NEBuffer 2中与具有5’TEX615标记及3’Iowa Black FQ淬灭剂的1.5μM报导子及100nM的分别的PCR产物或ssDNA寡核苷酸LE501或LE205(分别如SEQ ID NO:174及200所示；LE501包含5’FAM荧光团)进行切割反应。报导子探针的切割导致荧光染料去淬灭，且由此导致荧光信号升高。为监测荧光强度，在酶标仪(CLARIOstar Plus)中在37℃下在Corning的小体积384孔微孔板中孵育10μl的每一个反应物。动力学分析的结果显示于表12中。

表12.反式DNA切割测定的结果

这些结果证实ssDNA的非序列特异性切割的目标序列特异性活化。dsDNA PCR产物及目标ssDNA寡核苷酸二者均能够诱导此活性。

7.4通过经诱导的非特异性ssDNA切割的PAM确定

如果给定系统需要用于DNA结合、修饰或切割的PAM，则含有DNA目标(包括PAM文库)的三元复合物与RNP的分离及由其回收的DNA的测序可用于鉴定PAM序列。该复合物可通过很多方法捕获，诸如，免疫下拉(immuno-pulldown)、固定化金属亲和树脂(诸如，Ni-NTA琼脂糖)捕获、或通过尺寸排阻层析法的分离。

作为另一种选择，具与固定目标相邻的不同的PAM序列的DNA片段的平行文库被产生。含有推定核酸酶及适合指导RNA(靶向固定目标的单指导或双RNA指导)的RNP与文库中的每一个片段一起孵育，且使用DNA片段的电泳迁移率位移、尺寸排阻液体层析法、或使用对任一组成亲和的固体支持物的共沉淀而被评估。

7.5使用平行质粒DNA文库的PAM确定

产生含有前面为8bp简并序列(如SEQ ID NO:176所示的NNNNNNNN)的目标序列(ACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGG(如SEQ ID NO:313所示的))的质粒文库。在转化为感受态细胞且铺板于具选择性培养基的琼脂板上时，自此反应物的转化得到的每一个菌落都原则上与克隆质粒DNA序列对应，且由此来自来源于单菌落的培养物的质粒DNA的制剂为自原始文库取样的唯一质粒制剂。自取样96个菌落获得质粒制剂。对这些制剂个别地进行Sanger测序，以验证它们的PAM序列。

在室温下，在1X Cutsmart缓冲液(New England Biolabs B7204S)中，将经纯化的APG05405与单指导RNA(sgRNA)Gsg.2(如SEQ ID NO:194所示的)以200nM的核酸酶及400nM的sgRNA的最终浓度一起孵育20分钟。

将这些RNP溶液以100nM的最终浓度添加至在1.5X Cutsmart缓冲液(New EnglandBiolabs B7204S)中质粒DNA及包含荧光团及淬灭剂的ssDNA报导子链为50nM的溶液中。为监测以时间为函数的荧光强度，在酶标仪(CLARIOstar Plus)中在37℃下在Corning的小体积384孔微孔板中孵育10μl的每一个反应物。每一个孔对应于具特异性PAM序列的个别消化反应物。在数据收集完成时，将确定荧光的增加率。通过分析与荧光增加率高的孔对应的序列，建立共有PAM序列。如果尚无定论，则可产生且评估额外文库。

实施例8：使用ssDNA切割作为诊断

由于这些核酸酶在存在目标DNA序列的情况下产生光学可检测信号的能力，它们有希望将功用实施于检测基因疾病的诊断装置或诸如细菌、病毒或真菌的传染性疾病的药剂内。

诊断程序可包括对待测试的样本中的核酸的分离或扩增。在不对核酸进行任何分离或纯化的情况下，使用一些样本也可以是适合的，因为它们可以相当高的量存在于样本中，在没有扩增(诸如PCR)或在没有干扰检测或信号产生的材料的情况下，足以被检测。

然后，如其他实施例中所描述而形成的RNP和报导子(诸如，前面的实施例中使用的荧光团及淬灭剂修饰的ssDNA寡核苷酸，或当被切割时产生可见的或以其他方式容易检测的信号的某个其他种类的ssDNA基质)一起被暴露于样本(或前面的段落中描述的经处理的样本)中。如果使用荧光团-淬灭剂缀合的DNA寡核苷酸(与前面描述的实施例中相同)，则使用在前面的实施例中描述的荧光计可将其检测。为简化检测，可进行终点测定，代替前面描述的动力学测定，意味着该测定可相对于阳性及阴性对照进行固定时间，且在此经过时间结束时读出。

这些试剂还可被整合于横向流动测试装置内，这样允许利用非常小的仪器对给定致病剂或特异性核酸序列(诸如，个体中的患病等位基因)进行检测。在此测定中，ssDNA报导子会与多种适合抗体或亲和试剂捕获的诸如荧光素、生物素和/或地高辛的分子缀合。

实施例8.1-COVID19诊断测定

根据标准做法，在通用运输培养基(UTM)中使用鼻咽拭子，自患者收集样本，且提取RNA。类似于Broughton等人2020(Nat.Biotechnol.38:870-874)使用逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)来扩增基因材料，。在一些实施方案中，通过RT-LAMP产生的单链DNA(ssDNA)足可用于通过本文公开的RGN进行PAM独立的检测。在一些实施方案中，使用通过仅位于目标链上的硫代磷酸脂引物的扩增，RT-LAMP产生ssDNA，这允许非目标链的T7核酸外切酶消化。

类似于Broughton等人2020，作为对样本收集及制备的质量控制检查，用恰当的引物进行RT-LAMP扩增，以扩增SARS-CoV2基因组的N基因及E基因以及人RNase P。两个LAMP内部引物(常称为FIP或BIP)中一个会含有硫代磷酸脂基团。在用T7核酸外切酶处理所完成的PCR反应物时，自硫代磷酸脂引物延伸的ssDNA为存在于溶液中的主要物质。关于特异性及有效活化，使用上面描述的荧光测定来评估针对此系列的指导。关于特异性，为确保没有交叉反应性，可针对其他冠状病毒中的同源基因测试该检测方案，诸如，HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63、MERS-CoV和/或SARS-CoV。通过利用含有FAM及生物素的寡核苷酸，可将该测定转换为横向流动测定。

序列表

<110> 生命编辑制药股份有限公司

<120> RNA指导核酸酶及其活性片段与变体以及使用方法

<130> L103438 1180TW (000076.0)

<140>

<141>

<150> 63/058,169

<151> 2020-07-29

<150> 62/955,014

<151> 2019-12-30

<160> 314

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 506

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 1

Met Ser Thr Pro Leu Gln Gln Pro His Gln Lys Ser Lys Lys Thr Ser

1 5 10 15

Gln Met Ile Thr Thr Arg Lys Phe Lys Leu Ala Ile Val Ser Asp Asn

20 25 30

Arg Asn Glu Ala Tyr Ser Phe Ile Arg Asn Glu Ile Arg Asn Gln Asn

35 40 45

Lys Ala Leu Asn Ala Ala Tyr Asn His Leu Tyr Phe Glu His Ile Ala

50 55 60

Thr Glu Lys Leu Lys His Ser Asp Ala Glu Tyr Gln Lys His Leu Thr

65 70 75 80

Lys Tyr Arg Glu Val Ala Thr Asn Lys Tyr Gln Asp Tyr Leu Lys Ala

85 90 95

Lys Glu Lys Val Asn Ala Ser Lys Asp Asp Glu Lys Leu Gln Lys Arg

100 105 110

Val Asp Lys Ala Arg Glu Ala Tyr Asn Lys Ala Gln Glu Lys Val Tyr

115 120 125

Lys Ile Glu Lys Glu Phe Asn Lys Lys Ser Met Glu Thr Tyr Gln Lys

130 135 140

Val Val Gly Leu Ser Lys Gln Thr Arg Ile Gly Lys Leu Leu Lys Ser

145 150 155 160

Gln Phe Thr Leu His Tyr Asp Thr Glu Asp Arg Ile Thr Ser Thr Val

165 170 175

Leu Ser His Phe Asn Asn Asp Met Lys Thr Gly Val Leu Arg Gly Asp

180 185 190

Arg Ser Leu Arg Thr Tyr Lys Asn Ser His Pro Leu Leu Val Arg Ala

195 200 205

Arg Ser Met Lys Val Tyr Glu Glu Asn Gly Asp Tyr Phe Ile Lys Trp

210 215 220

Val Lys Gly Ile Val Phe Lys Ile Val Ile Ser Ala Gly Ser Lys Gln

225 230 235 240

Lys Ala Asn Ile Gly Glu Leu Lys Ser Val Leu Ile Asn Ile Leu Asn

245 250 255

Gly His Tyr Lys Val Cys Asp Ser Ser Ile Ser Leu Asn Lys Asp Leu

260 265 270

Ile Leu Asn Leu Ser Leu Asn Ile Pro Val Ser Lys Glu Asn Val Phe

275 280 285

Val Pro Gly Arg Val Val Gly Val Asp Leu Gly Leu Lys Ile Pro Ala

290 295 300

Tyr Val Ser Leu Asn Asp Thr Pro Tyr Ile Lys Lys Gly Ile Gly Asn

305 310 315 320

Ile Asp Asp Phe Leu Arg Val Arg Thr Gln Leu Gln Ser Gln Arg Lys

325 330 335

Arg Leu Gln Lys Thr Leu Glu Cys Thr Ser Gly Gly Lys Gly Arg Ser

340 345 350

Lys Lys Leu Lys Gly Leu Asp Arg Leu Lys Ala Lys Glu Lys Asn Phe

355 360 365

Val Asn Thr Tyr Asn His Phe Leu Ser Lys Lys Ile Ile Gln Phe Ala

370 375 380

Val Lys Asn Asn Ala Gly Val Ile His Leu Glu Glu Leu Gln Phe Asp

385 390 395 400

Lys Leu Lys His Lys Ser Leu Leu Arg Asn Trp Ser Tyr Tyr Gln Leu

405 410 415

Gln Thr Met Ile Glu Tyr Lys Ala Glu Arg Glu Gly Ile Glu Val Lys

420 425 430

Tyr Val Asp Ala Ser Tyr Thr Ser Gln Thr Cys Ser Lys Cys Gly His

435 440 445

Tyr Glu Glu Gly Gln Arg Val Leu Gln Asp Thr Phe Thr Cys Lys Asn

450 455 460

Lys Glu Cys Lys Gly Tyr Val His Lys Val Asn Ala Asp Phe Asn Ala

465 470 475 480

Ser Gln Asn Ile Ala Lys Ser Thr Asp Ile Ile Arg Cys Thr Glu Met

485 490 495

Ala Lys Asn Asn Asp Ile Glu Lys Asn Ala

500 505

<210> 2

<211> 506

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 2

Met Ser Thr Pro Leu Gln Gln Pro His Gln Lys Ser Lys Lys Thr Ser

1 5 10 15

Gln Met Ile Thr Thr Arg Lys Phe Lys Leu Ala Ile Val Ser Asp Asn

20 25 30

Arg Asn Glu Ala Tyr Ser Phe Ile Arg Asn Glu Ile Arg Asn Gln Asn

35 40 45

Lys Ala Leu Asn Ala Ala Tyr Asn His Leu Tyr Phe Glu His Ile Ala

50 55 60

Thr Glu Lys Leu Lys His Ser Asp Glu Glu Tyr Gln Lys His Leu Thr

65 70 75 80

Lys Tyr Arg Glu Val Ala Thr Asn Lys Tyr Gln Asp Tyr Leu Lys Val

85 90 95

Lys Glu Lys Val Asn Ala Ser Lys Asp Asp Glu Lys Leu Gln Lys Arg

100 105 110

Val Asp Lys Ala Arg Glu Ala Tyr Asn Lys Ala Gln Glu Lys Val Tyr

115 120 125

Lys Ile Glu Lys Glu Phe Asn Lys Lys Ser Met Glu Thr Tyr Gln Lys

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Pro Ile Asp Leu His Asn Asn Ser Val Glu Val Thr Lys Glu Lys Asn

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Gly Asp Tyr Ile Ala Gly Leu Ser Leu Phe Ser Arg Asp Phe His Lys

145 150 155 160

Glu Asn Ser Asp Val Pro Lys Gly Lys Ile Phe Val Lys Leu Ala Thr

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Lys Lys Gln Lys Ser Met Lys Val Ile Leu Asp Arg Leu Ile Ser Gly

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Tyr Leu Ser Ile Thr Tyr Lys Phe Asn Ser Ile Thr Glu Asn Lys Phe

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Tyr Phe Ala Phe Asn Glu Gly Phe Val Arg Ser Asn Ile Arg Ser Asp

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Glu Ile Arg Ala Phe Asn Glu Arg Ile Arg Gln Arg Arg Ile Asn Leu

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Leu Asn Gln Ser Lys Tyr Cys Ser Asp Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg

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Arg Leu His Ser Lys Lys Tyr Met Glu Asp His Ile Glu Glu Leu Gly

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Tyr Ser Gly

450

<210> 11

<211> 599

<212> PRT

<213> 戈登氏菌属

<400> 11

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Trp Ser Ser Phe Pro Asp Val Ala Ala Thr Glu Asp Arg Leu Thr Ala

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Ala Ile Ala Ala Val Arg Asp Thr Ala Lys Ala Gln Leu Asn Glu Leu

115 120 125

Ser Asp Glu Leu Lys Ala Ala His Lys Arg Leu Tyr Ala Glu Tyr Cys

130 135 140

Gln Ser Gly His Leu Tyr Trp Ala Thr Phe Asn Ala Thr Leu Asp His

145 150 155 160

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275 280 285

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305 310 315 320

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340 345 350

Arg Thr Gly Thr Val Val Ile Pro Thr Arg Ile Val Asp Arg Ile Glu

355 360 365

Ser Ala Ala Gly Ile Ala Ser Gln Arg Gly Asp Ala Gln Asn Glu Met

370 375 380

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405 410 415

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Arg Ser Ala Ala Val Arg Asp Gly Val Gly Val Glu Val Val Ala His

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<210> 12

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<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 12

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50 55 60

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Glu Arg Gly Ala Ser Ala Leu Ala Arg

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<210> 13

<211> 553

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 13

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1 5 10 15

Lys His Arg Leu Asp Pro Asn Pro Ala Gln Ala Thr Leu Leu Ala Gln

20 25 30

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Arg Ala Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Arg Arg Thr Glu Leu Ala Glu

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65 70 75 80

Ala Ala Asp Pro Thr Leu Arg Val Ala Ser Tyr Gln Ser Tyr Ser Thr

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Ala His Leu Thr Pro Leu Ile Arg Arg His Arg Glu Ala Ala Ala Ala

100 105 110

Ile Ala Ala Gly Ala Asp Pro Ala Glu Ala Trp Thr Asp Glu Arg Tyr

115 120 125

Ala Glu Pro Trp Met His Thr Val Pro Arg Arg Val Leu Val Ser Gly

130 135 140

Leu Gln Asn Ala Ala Lys Ala Thr Glu Asn Trp Met Ala Ser Ala Ser

145 150 155 160

Gly Thr Arg Ala Gly Ala Arg Val Gly Leu Pro Arg Phe Lys Lys Lys

165 170 175

Gly Arg Ser Arg Asp Ser Phe Thr Ile Pro Ala Pro Glu Val Ile Gly

180 185 190

Ala Ala Gly Thr Pro Tyr Lys Arg Gly Glu Pro Arg Arg Gly Val Ile

195 200 205

Thr Asp His Arg His Leu Arg Leu Ala Ser Leu Gly Thr Ile Arg Thr

210 215 220

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245 250 255

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Gln Pro Gly Ser Asn Arg Arg Glu Arg Val Arg Arg Gln Ile Ala Ala

325 330 335

Leu Gln His Gly Ile Ala Leu Arg Arg Ala Gly Leu Leu His Gln Val

340 345 350

Ser Thr Arg Leu Ala Thr Asp Phe Ala Val Val Ala Leu Glu Asp Leu

355 360 365

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370 375 380

Gly Arg Asn Val Ala Ala Lys Ser Gly Leu Asn Arg Ala Ile Leu Asp

385 390 395 400

Ala Gly Leu Gly Met Leu Arg Arg Gln Leu Asp Tyr Lys Thr Ser Trp

405 410 415

Ala Gly Ser Gln Val Lys Met Ile Asp Arg Phe Ala Pro Ser Ser Lys

420 425 430

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435 440 445

Arg Thr Phe Glu Cys Glu Ala Cys His Leu Val Ile Asp Arg Asp Val

450 455 460

Asn Ala Ala Ile Asn Ile Arg Ala Trp Ala Val Gln Glu Glu Arg Gly

465 470 475 480

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485 490 495

Gly Ala Ala Val Ser Gly Pro Pro Ser Gly Gly Ala Ala Arg Gln Gly

500 505 510

Arg Gly Ser Val Lys Pro Ala Pro Gln Gly Val Gly Met Ser Ser Arg

515 520 525

Ala Thr Gly Trp Ser Ser Gln Pro Pro Ser Thr Glu Gly Glu Ser Ala

530 535 540

Glu Arg Gly Ala Ser Ala Leu Ala Arg

545 550

<210> 14

<211> 505

<212> PRT

<213> Paeniglutamicibacter菌属

<400> 14

Met Ser Val Gln Ala Ala Met Ala Thr Thr Val Ile His Arg Ala Tyr

1 5 10 15

Arg Leu Thr Leu Asp Pro Thr Pro Gln Gln Ala Gln Lys Leu Ser Gln

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Trp Ala Gly Ala Ala Arg Ala Met Tyr Asn His Ala Ile Ala Ala Lys

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Gln Ala Ser His Arg Ser Trp Leu Gln Glu Val Ala Phe Ala Thr Tyr

50 55 60

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Ile Pro Thr Ala Tyr Gly Phe Asn Ala Trp Leu Thr Glu Thr Arg Asn

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100 105 110

Gly Arg Glu His Glu Pro Trp Leu His Ala Val Asn Arg Ser Ala Leu

115 120 125

Met Gly Ala Met Arg His Ala Asp Asp Ala Trp Thr Asn Trp Ile Asp

130 135 140

Ser Leu Thr Gly Thr Arg Ala Gly Arg Lys Ile Gly Tyr Pro Arg Phe

145 150 155 160

Lys Lys Arg Gly Val Ala Arg Asp Ser Phe Thr Ile Thr His Asp Arg

165 170 175

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180 185 190

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225 230 235 240

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245 250 255

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Pro Asn Pro Arg Val Lys Ala Ser His Ala Lys Lys Leu Ala Arg Leu

275 280 285

Gln Lys Ala Leu Ala Lys Ser Gln Lys Gly Ser Arg Asn Arg Ala Gln

290 295 300

Leu Val Gln Lys Ile Gly Cys Leu Thr His Leu Glu Ala Arg Gln Arg

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Glu Gly His Ala His Asn Leu Ala Asn Arg Leu Val His Thr Trp Ala

325 330 335

Ile Ile Gly Ile Glu Asp Leu Asn Val Ala Gly Met Thr Arg Ser Ser

340 345 350

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Leu Asn Arg Ser Ile Leu Asp Val Ala Pro Ala Gln Ile Arg His Leu

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Leu Asp Tyr Lys Thr Ala Trp Ser Gly Thr Gln Leu Val Val Ile Asp

385 390 395 400

Arg Trp Ala Pro Thr Ser Lys Lys Cys Ser Thr Cys Gly Ala Val Lys

405 410 415

Ala Lys Leu Thr Leu Ala Glu Arg Thr Phe Glu Cys Glu Ala Cys Gly

420 425 430

Leu Val Leu Asp Arg Asp Ile Asn Ala Ala Arg Asn Ile Ala Ala Leu

435 440 445

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450 455 460

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Lys Arg Glu Asp Pro Pro Gly Ser Ser Pro Pro Ser Asn Gly Arg Thr

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500 505

<210> 15

<211> 515

<212> PRT

<213> 链霉菌属

<400> 15

Met Glu Arg Glu Val Leu Arg Ala Phe Lys Phe Ala Leu Asp Pro Thr

1 5 10 15

Pro Ala Gln Ala Glu Ala Leu Ala Arg His Ala Gly Ala Ala Arg Trp

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Ala Phe Asn Tyr Ala Leu Ala Val Lys Val Ser Ala His Gln Arg Trp

35 40 45

Arg Ala Glu Val Ala Gly Leu Val Ala Gln Gly Ile Glu Glu Ala Glu

50 55 60

Ala Arg Arg Arg Val Lys Val Pro Val Pro Ser Lys Pro Gln Ile Gln

65 70 75 80

Lys Arg Leu Asn Glu Val Lys Gly Asp Ser Arg Ile Asp Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Glu Gly Thr Phe Gly Pro Glu Arg Pro Cys Pro Trp Trp Tyr Glu

100 105 110

Val Asn Thr Tyr Ala Phe Gln Ser Ala Phe Ile Asp Ala Asp Arg Ala

115 120 125

Trp Lys Asn Trp Leu Asp Ser Leu Arg Gly Val Arg Ala Gly Arg Lys

130 135 140

Val Gly Tyr Pro Arg Phe Lys Lys Lys Gly Arg Ser Arg Asp Ser Phe

145 150 155 160

Arg Leu His His Asp Val Lys Arg Pro Gly Ile Arg Leu Ala Thr Tyr

165 170 175

Arg Arg Leu Arg Leu Pro Thr Ile Gly Glu Val Arg Leu His Asp Ser

180 185 190

Gly Lys Arg Leu Gly Arg Leu Val Asp Arg Ser Leu Ala Val Val Gln

195 200 205

Ser Val Thr Val Ser Arg Ala Gly His Arg Trp Tyr Ala Ser Val Leu

210 215 220

Cys Lys Val Thr Met Thr Val Pro Asp Gln Pro Ser Arg Arg Gln Arg

225 230 235 240

Glu Arg Gly Thr Ile Gly Val Asp Leu Gly Val Lys Thr Leu Ala Ala

245 250 255

Leu Ser Gln Pro Leu Asp Pro Thr Asp Pro Asp Ser Asp Leu Ile Ala

260 265 270

Asn Pro Arg His Leu Ala Arg Ala Gln Gln Arg Leu Leu Lys Ala Gln

275 280 285

Arg Ala Leu Ser Arg Thr Glu Lys Gly Ser Arg Arg Arg Asp Arg Ala

290 295 300

Arg Arg Lys Val Ala Arg Leu His His Glu Val Ala Leu Arg Arg Glu

305 310 315 320

Ser Ala Leu His Ala Val Thr Lys Arg Leu Ala Thr Ala Phe Ala Val

325 330 335

Val Ala Val Glu Asp Leu His Val Ala Gly Met Thr Ala Ser Ala Arg

340 345 350

Gly Thr Leu Glu Lys Pro Gly Arg Arg Val Arg Gln Lys Ala Gly Leu

355 360 365

Asn Arg Ala Val Leu Asp Ala Ala Pro Gly Glu Phe Arg Arg Gln Leu

370 375 380

Thr Tyr Lys Thr Ser Trp Tyr Gly Ser Lys Leu Ala Val Cys Asp Arg

385 390 395 400

Trp Phe Pro Ser Ser Lys Thr Cys Ser Ala Cys Gly Trp Gln Asn Pro

405 410 415

His Leu Thr Leu Thr Asp Arg Thr Phe His Cys Pro Asp Cys Gly Leu

420 425 430

Thr Ile Asp Arg Asp Leu Asn Ala Ala Arg Asn Ile Ala Arg His Ala

435 440 445

Thr Val Ala Asp Ala Pro Pro Val Ala Pro Gly Arg Gly Glu Thr Gln

450 455 460

Asn Ala Arg Arg Ala Pro Val Arg Pro Asp Asp Arg Lys Ala Ala Arg

465 470 475 480

His Gly Ala Met Lys Arg Glu Asp Thr Arg Pro Leu Gly Gln Val Pro

485 490 495

Pro Gln Arg Ser Asn Pro Leu Ala Ser Pro Pro Thr Gln Lys Gln Ala

500 505 510

Thr Leu Phe

515

<210> 16

<211> 553

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 16

Met Thr Thr Thr Thr Gly Thr Asp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Ala Phe

1 5 10 15

Lys His Arg Leu Asp Pro Asn Pro Ala Gln Ala Thr Leu Leu Ala Gln

20 25 30

Tyr Ala Gly Ala Ala Arg Val Ala Tyr Asn Met Leu Ile Ala His Asn

35 40 45

Arg Ala Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Arg Arg Thr Glu Leu Ala Glu

50 55 60

Ser Gly Leu Ala Gly Pro Glu Leu Ala Ala Arg Met Lys Ala Glu Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asp Pro Thr Leu Arg Val Ala Ser Tyr Gln Ser Tyr Ser Thr

85 90 95

Ala His Leu Thr Pro Leu Ile Arg Arg His Arg Glu Ala Ala Ala Ala

100 105 110

Ile Ala Ala Gly Ala Asp Pro Ala Glu Ala Trp Thr Asp Glu Arg Tyr

115 120 125

Ala Glu Pro Trp Met His Thr Val Pro Arg Arg Val Leu Val Ser Gly

130 135 140

Leu Gln Asn Ala Ala Lys Ala Thr Glu Asn Trp Met Ala Ser Ala Ser

145 150 155 160

Gly Thr Arg Ala Gly Ala Arg Val Gly Leu Pro Arg Phe Lys Lys Lys

165 170 175

Gly Arg Ser Arg Asp Ser Phe Thr Ile Pro Ala Pro Glu Val Ile Gly

180 185 190

Ala Ala Gly Thr Pro Tyr Lys Arg Gly Glu Pro Arg Arg Gly Val Ile

195 200 205

Thr Asp His Arg His Leu Arg Leu Ala Ser Leu Gly Thr Ile Arg Thr

210 215 220

Tyr Asp Lys Thr Ser Arg Leu Val Arg Ala Cys Arg Arg Gly Ala Gln

225 230 235 240

Ile Arg Ser Met Thr Ile Ser Gln Ala Gly Gly Arg Trp Tyr Ala Ser

245 250 255

Ile Leu Val Ala Asp Pro Thr Pro Ile Arg Thr Gly Pro Ser Arg Arg

260 265 270

Gln Arg Ala Asn Gly Ala Val Gly Val Asp Leu Gly Val Lys His Leu

275 280 285

Ala Ala Leu Ser Thr Gly Glu Val Ile Asp Asn Gly Arg Pro Gly Ala

290 295 300

Arg Gln Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Gln Arg Ala Tyr Ala Arg Thr

305 310 315 320

Gln Pro Gly Ser Asn Arg Arg Glu Arg Val Arg Arg Gln Ile Ala Ala

325 330 335

Leu His His Gly Ile Ala Leu Arg Arg Ala Gly Leu Leu His Gln Val

340 345 350

Ser Thr Arg Leu Ala Thr Asp Phe Ala Val Val Ala Leu Glu Asp Leu

355 360 365

Asn Val Ala Gly Met Thr Arg Ser Ala Arg Gly Thr Leu Glu Ala Pro

370 375 380

Gly Arg Asn Val Ala Ala Lys Ser Gly Leu Asn Arg Ala Ile Leu Asp

385 390 395 400

Ala Gly Leu Gly Met Leu Arg Arg Gln Leu Asp Tyr Lys Thr Ser Trp

405 410 415

Ala Gly Ser Gln Val Lys Met Ile Asp Arg Phe Ala Pro Ser Ser Lys

420 425 430

Ala Cys Ser Arg Cys Gly Thr Val Lys Ser Thr Leu Ser Leu Ala Glu

435 440 445

Arg Thr Phe Glu Cys Glu Ala Cys His Leu Val Ile Asp Arg Asp Val

450 455 460

Asn Ala Ala Ile Asn Ile Arg Ala Trp Ala Val Gln Glu Glu Arg Gly

465 470 475 480

Ala Gly Val Glu Leu Ala Arg Gly Arg Arg Glu Ser Arg Asn Gly Arg

485 490 495

Gly Ala Ala Val Ser Gly Pro Pro Ser Gly Gly Ala Ala Gly Gln Gly

500 505 510

Arg Gly Ser Val Lys Pro Ala Pro Gln Gly Val Gly Met Ser Ser Arg

515 520 525

Ala Thr Gly Trp Ser Ser Gln Pro Pro Ser Thr Glu Gly Glu Ser Ala

530 535 540

Glu Arg Gly Ala Ser Ala Leu Ala Arg

545 550

<210> 17

<211> 557

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 17

Met Thr Thr Arg Glu Ile Leu Arg Ala Tyr Arg Val Pro Leu Asp Pro

1 5 10 15

Thr Asp Ala Gln Thr Ala Ala Leu Ala Ser His Ala Gly Ala Ser Arg

20 25 30

Ala Ala Phe Asn Trp Ala Leu Gly Ala Lys Val His Ala His Arg Met

35 40 45

Trp Ser Ala Cys Val Ala Asp Leu Thr Tyr Thr Arg Tyr Gly His Leu

50 55 60

Asp Ala Asp Gln Ala Leu Ala Ala Ala Lys Lys Asp Ala Ser Arg Tyr

65 70 75 80

Tyr Arg Ile Pro Thr Ser Gln Thr Asn Glu Lys Ala Phe Asp Arg Asp

85 90 95

Pro Asp Tyr Ala Trp Arg Thr Glu Val Asn Arg Arg Ser Trp Val Ser

100 105 110

Gly Met Arg Gln Ala Asp Thr Ala Trp Gln Asn Trp Leu Asp Ser Leu

115 120 125

Thr Gly Arg Arg Ala Gly Arg Arg Val Gly Tyr Pro Arg Phe Lys Ser

130 135 140

Lys Gly Arg Cys Arg Asp Ser Phe Thr Leu Ala His Asp Val Lys Arg

145 150 155 160

Pro Ser Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Arg Arg Leu Thr Leu Pro Lys Lys

165 170 175

Ile Ser Val Thr Gly Ser Ile Arg Leu Lys Gly Asn Ile Arg His Leu

180 185 190

Ala Arg Arg Ile Arg Arg Gly Val Ala Arg Ile Gln Ser Ala Thr Ile

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<210> 18

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 18

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

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450

<210> 20

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

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<213> 芽孢杆菌属

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

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<210> 23

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 23

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<210> 24

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 24

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Lys Ala Asn Ile Gly Glu Leu Lys Ser Val Leu Ile Asn Ile Leu Asn

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Gly His Tyr Lys Val Cys Asp Ser Ser Ile Ser Leu Asn Lys Asp Leu

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Ile Asp Asp Phe Leu Arg Val Arg Thr Gln Leu Gln Ser Gln Arg Lys

325 330 335

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Lys Lys Leu Lys Gly Leu Asp Arg Leu Lys Ala Lys Glu Lys Asn Phe

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Val Asn Thr Tyr Asn His Phe Leu Ser Lys Lys Ile Ile Gln Phe Ala

370 375 380

Val Lys Asn Asn Ala Gly Val Ile His Leu Glu Glu Leu Gln Phe Asp

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Lys Leu Lys His Lys Ser Leu Leu Arg Asn Trp Ser Tyr Tyr Gln Leu

405 410 415

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Tyr Val Asp Ala Ser Tyr Thr Ser Gln Thr Cys Ser Lys Cys Gly His

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<210> 25

<211> 377

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 25

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Lys Lys Leu Lys Arg Glu Gln Arg Lys Leu Ser Arg Arg Ala Leu His

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Gln Lys Arg Lys Val Ala Arg Leu His Glu Arg Val Leu Asn Gln Arg

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Asp Asp Phe Leu Asn Lys Leu Ser Thr Glu Ile Ile Lys Asn His Asp

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Leu Ile Cys Ile Glu Asn Leu Asn Thr Lys Gly Met Leu Arg Asn His

275 280 285

Lys Leu Ala Lys Ser Ile Ser Asp Val Ser Trp Ser Ala Phe Val Ser

290 295 300

Lys Leu Glu Tyr Lys Ala Thr Trp Tyr Gly Lys Ala Ile Met Lys Val

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Ser Lys Trp Phe Pro Ser Ser Gln Ile Cys Ser Asp Cys Gly His Gln

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Asp Cys Lys Lys Ser Leu Ala Ile Arg Glu Trp Thr Cys Pro Ile Cys

340 345 350

His Gln His His Asp Arg Asp Ile Asn Ala Ser Lys Asn Ile Leu Ala

355 360 365

Glu Gly Leu Arg Thr Leu Ala Leu Ala

370 375

<210> 26

<211> 445

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 26

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1 5 10 15

Asn Val Asp Trp Thr Ile Phe Glu Lys His Leu Arg Asn Leu Thr Tyr

20 25 30

Gln Val Arg Thr Ile Ser Asn Arg Thr Ile Gln Gln Leu Trp Glu Phe

35 40 45

Asp Ala Leu Ser Phe Asp Tyr Phe Lys Glu Arg Gly Thr Tyr Pro Thr

50 55 60

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65 70 75 80

Tyr His Thr Leu Gln Ser Lys Tyr Pro Asp Ile His Lys Gly Asn Met

85 90 95

Ser Thr Thr Leu Gln Lys Ile Ile Lys Thr Trp Lys Ser Arg Arg Asn

100 105 110

Glu Ile Arg Lys Gly Glu Met Ser Ile Pro Ser Phe Arg Asn Arg Ile

115 120 125

Pro Ile Asp Leu His Asn Asn Ser Val Asp Ile Thr Lys Glu Lys Asn

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Gly Asp Tyr Ile Ala Gly Ile Ser Leu Phe Ser Arg Asp Phe His Lys

145 150 155 160

Glu Asn Asp Asp Val Pro Lys Gly Lys Ile Phe Val Lys Leu Ala Thr

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Gln Lys Gln Lys Ser Met Lys Val Ile Leu Asp Arg Leu Ile Asn Gln

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Tyr Leu Ser Ile Thr Tyr Lys Phe Asn Ala Ile Lys Glu Asn Lys Phe

210 215 220

Asp Lys Glu Leu Ile Met Gly Ile Asp Leu Gly Gly Ile Asn Thr Val

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Tyr Phe Ala Phe Asn Glu Gly Phe Ile Arg Ser Asn Ile Lys Ser Asp

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Glu Ile Ile Arg Gln Arg Arg Ile Asn Leu Leu Lys Gln Ser Lys Tyr

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340 345 350

Gln Ala Glu Ile His Gly Ile Glu Val Ile Lys Val Ala Pro Ala Tyr

355 360 365

Thr Ser Gln Arg Cys Ser Gln Cys Gly Tyr Ile Cys Lys Glu Asn Arg

370 375 380

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<210> 27

<211> 448

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 27

Met Thr Phe Phe Gly Val Thr Ile Lys Ile Met Lys Tyr Gln Ile Leu

1 5 10 15

Cys Pro Leu Asn Val Asp Trp Thr Ile Phe Glu Lys His Leu Arg Asn

20 25 30

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65 70 75 80

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85 90 95

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Arg Arg Asn Glu Ile Arg Lys Gly Glu Met Ser Ile Pro Ser Phe Arg

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Asn Arg Ile Pro Ile Asp Leu His Asn Asn Ser Val Asp Ile Thr Lys

130 135 140

Glu Lys Asn Gly Asp Tyr Ile Ala Gly Ile Ser Leu Phe Ser Arg Asp

145 150 155 160

Phe His Lys Glu Asn Asp Asp Val Pro Lys Gly Lys Ile Phe Val Lys

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Asn Lys Phe Asp Lys Glu Leu Ile Met Gly Ile Asp Leu Gly Gly Ile

225 230 235 240

Asn Thr Val Tyr Ser Ala Phe Asn Glu Gly Phe Ile Arg Ser Asn Ile

245 250 255

Lys Ser Asp Glu Ile Ile Arg Gln Arg Arg Ile Asn Leu Leu Lys Gln

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Ser Lys Tyr Cys Ser Asn Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg Thr Lys Arg

275 280 285

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Ser Thr Asn His Lys Tyr Ala Asn Tyr Ile Val Lys Gln Cys Leu Lys

305 310 315 320

His Asn Cys Gly Arg Ile Gln Met Glu Leu Leu Lys Gly Ile Ser Lys

325 330 335

Asn Asp Arg Ile Leu Lys Asp Trp Thr Tyr Phe Asp Leu Gln Glu Lys

340 345 350

Ile Lys Asn Gln Ala Glu Ile His Gly Ile Glu Val Ile Lys Val Ala

355 360 365

Pro Ala Tyr Thr Ser Gln Arg Cys Ser Gln Cys Gly Tyr Ile Cys Lys

370 375 380

Glu Asn Arg Cys Thr Gln Ala Thr Phe Glu Cys Lys Gln Cys Gly Tyr

385 390 395 400

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405 410 415

Ile Glu Asn Ile Ile Asn Lys Gln Leu Ala Val Gln Ser Lys Leu His

420 425 430

Ser Lys Lys Cys Met Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Gly Tyr Leu Asp

435 440 445

<210> 28

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 28

Met Gly Val Thr Ile Lys Ile Met Lys Tyr Gln Ile Leu Cys Pro Met

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Gln Val Arg Thr Ile Ser Asn Arg Thr Ile Gln Gln Leu Trp Glu Phe

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65 70 75 80

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85 90 95

Ser Thr Thr Leu Gln Lys Ile Ile Lys Thr Trp Lys Ser Arg Arg Asn

100 105 110

Glu Ile Arg Lys Gly Glu Met Ser Ile Pro Ser Phe Arg Asn Arg Ile

115 120 125

Pro Ile Asp Leu His Asn Asn Ser Val Asp Ile Thr Lys Glu Lys Asn

130 135 140

Gly Asp Tyr Ile Ala Gly Ile Ser Leu Phe Ser Arg Asp Phe His Lys

145 150 155 160

Glu Asn Asp Asp Val Pro Lys Gly Lys Ile Phe Val Lys Leu Ala Thr

165 170 175

Gln Lys Gln Lys Ser Met Lys Val Ile Leu Asp Arg Leu Ile Asn Gln

180 185 190

Thr Tyr Ser Lys Gly Ala Cys Met Ile His Lys Tyr Lys Asn Lys Trp

195 200 205

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210 215 220

Asp Lys Glu Leu Ile Met Gly Ile Asp Leu Gly Gly Ile Asn Thr Val

225 230 235 240

Tyr Phe Ala Phe Asn Glu Gly Phe Ile Arg Ser Asn Ile Lys Ser Asp

245 250 255

Glu Ile Lys Met Phe Asn Glu Arg Ile Arg Gln Arg Arg Ile Asn Leu

260 265 270

Leu Lys Gln Ser Lys Tyr Cys Ser Asn Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg

275 280 285

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290 295 300

Phe Arg Asn Ser Thr Asn His Lys Tyr Ala Asn Tyr Ile Val Lys Gln

305 310 315 320

Cys Leu Lys His Asn Cys Gly Arg Ile Gln Met Glu Leu Leu Lys Gly

325 330 335

Ile Ser Lys Asn Asp Arg Ile Leu Lys Asp Trp Thr Tyr Phe Asp Leu

340 345 350

Gln Glu Lys Ile Lys Asn Gln Ala Glu Ile His Gly Ile Glu Val Ile

355 360 365

Lys Val Ala Pro Ala Tyr Thr Ser Gln Arg Cys Ser Gln Cys Gly Tyr

370 375 380

Ile Cys Lys Glu Asn Arg Cys Thr Gln Ala Thr Phe Glu Cys Lys Gln

385 390 395 400

Cys Gly Tyr Lys Thr His Ala Asp Tyr Asn Ala Ala Lys Asn Ile Ser

405 410 415

Thr Tyr Asp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Lys Gln Leu Ala Val Gln Ser

420 425 430

Lys Leu His Ser Lys Lys Cys Met Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Gly

435 440 445

Tyr Leu Asp

450

<210> 29

<211> 471

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 29

Met Ile Ile Ala Arg Lys Ile Lys Leu Ile Ile Ile Gly Glu Asp Arg

1 5 10 15

Asp Thr Gln Tyr Lys Phe Ile Arg Glu Glu Arg Tyr Lys Gln Asn Lys

20 25 30

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Glu Lys Ile Arg Leu Leu Asp Asn Lys Phe Leu Gln Asp Glu Lys Lys

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Val Ile Ser Lys Gln Phe Asp Leu Ile Ser Asp Thr Lys Asp Arg Ile

130 135 140

Thr Gln Lys Val Tyr Gln Asp Phe Lys Ser Asp Leu Lys Asn Gly Leu

145 150 155 160

Leu Ser Gly Glu Arg Val Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Asn Asn Pro Leu

165 170 175

Leu Ile Arg Gly Arg Ala Leu Asn Phe Tyr Arg Glu Gly Lys Asp Val

180 185 190

Met Ile Lys Trp Phe Gly Gly Ile Ile Phe Lys Cys Met Leu Gly Gln

195 200 205

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Glu Gly Ser Tyr Lys Val Cys Asp Ser Ser Ile Ser Val Gly Lys Glu

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Leu Ile Leu Asn Ile Ser Leu Asp Ile Gly Glu Val Asn Ser Asn Val

245 250 255

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275 280 285

Gly Ser Leu Asp Asp Phe Leu Arg Ile Arg Val Gln Met Gln Lys Arg

290 295 300

Arg Arg Asn Leu His Lys Thr Leu Val Ser Val Lys Gly Gly Lys Gly

305 310 315 320

Arg Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Asp Arg Leu Lys Glu Lys Asn Phe

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Gln Gln Phe Val Glu Asp Lys Ala Lys Arg Glu Gly Ile Asp Val Lys

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<210> 30

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<220>

<221> MOD_RES

<222> (160)..(160)

<223> 任何氨基酸

<400> 30

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Leu Lys Gln Ser Lys Tyr Cys Ser Asn Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg

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450

<210> 31

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 31

Met Gly Val Thr Ile Lys Ile Met Lys Tyr Gln Ile Leu Cys Pro Met

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Tyr Phe Ala Phe Asn Glu Gly Phe Ile Arg Ser Asn Ile Lys Ser Asp

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Glu Ile Lys Met Phe Asn Glu Arg Ile Arg Gln Arg Arg Ile Asn Leu

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Leu Lys Gln Ser Lys Tyr Cys Ser Asn Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg

275 280 285

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Phe Arg Asn Ser Thr Asn His Lys Tyr Ala Asn Tyr Ile Val Lys Gln

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Cys Leu Lys His Asn Cys Gly Arg Ile Gln Met Glu Leu Leu Lys Gly

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405 410 415

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435 440 445

Tyr Leu Asp

450

<210> 32

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 32

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Gly Asp Tyr Ile Ala Gly Ile Ser Leu Phe Ser Arg Asp Phe His Lys

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Glu Asn Gly Asp Val Pro Lys Gly Lys Ile Phe Val Lys Leu Gly Thr

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Gln Lys Gln Lys Ser Met Lys Val Ile Leu Asp Arg Leu Ile Asn Gln

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Asp Lys Glu Leu Ile Met Gly Ile Asp Met Gly Gly Ile Asn Thr Val

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Tyr Phe Ala Phe Asn Glu Gly Phe Ile Arg Ser Asn Ile Lys Ser Asp

245 250 255

Glu Ile Lys Met Phe Asn Glu Arg Ile Arg Gln Arg Arg Ile Asn Leu

260 265 270

Leu Lys Gln Ser Lys Tyr Cys Ser Asn Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg

275 280 285

Thr Lys Arg Leu Gln Pro Ile Asp Val Leu Ser Asn Lys Ile Ala Lys

290 295 300

Phe Arg Asn Ser Thr Asn His Lys Tyr Ala Asn Tyr Ile Val Lys Gln

305 310 315 320

Cys Leu Lys His Asn Cys Gly Arg Ile Gln Met Glu Leu Leu Lys Gly

325 330 335

Ile Ser Lys Asn Asp Lys Val Leu Lys Asp Trp Thr Tyr Phe Asp Leu

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Gln Glu Lys Ile Lys Asn Gln Ala Glu Ile Tyr Gly Ile Glu Val Ile

355 360 365

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Ile Cys Lys Glu Asn Arg Cys Thr Gln Ala Met Phe Glu Cys Lys Gln

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420 425 430

Lys Leu His Ser Lys Lys Cys Met Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Gly

435 440 445

Tyr Leu Asp

450

<210> 33

<211> 471

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 33

Met Ile Ile Ala Arg Lys Ile Lys Leu Ile Ile Ile Gly Glu Asp Arg

1 5 10 15

Asp Thr Gln Tyr Lys Phe Ile Arg Glu Glu Arg Tyr Lys Gln Asn Lys

20 25 30

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85 90 95

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100 105 110

Ile Leu Gln Glu Ala Ile Lys Ile Asn Leu Ser Ser Thr Thr Arg Glu

115 120 125

Val Ile Ser Lys Gln Phe Asp Leu Ile Ser Asp Thr Lys Asp Arg Ile

130 135 140

Thr Gln Lys Val Tyr Gln Asp Phe Lys Ser Asp Leu Lys Asn Gly Leu

145 150 155 160

Leu Ser Gly Glu Arg Val Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Asn Asn Pro Leu

165 170 175

Leu Ile Arg Gly Arg Ala Leu Asn Phe Tyr Arg Glu Gly Lys Asp Val

180 185 190

Met Ile Lys Trp Phe Gly Gly Ile Ile Phe Lys Cys Met Leu Gly Gln

195 200 205

His Lys Asn Asn Ala Gln Glu Leu Lys Ala Thr Leu Asn Lys Val Leu

210 215 220

Glu Gly Ser Tyr Lys Val Cys Asp Ser Ser Ile Ser Val Gly Lys Glu

225 230 235 240

Leu Ile Leu Asn Ile Ser Leu Asp Ile Gly Glu Val Asn Ser Asn Val

245 250 255

Ser Cys Lys Lys Gly Arg Val Leu Gly Val Asp Leu Gly Met Lys Val

260 265 270

Pro Ala Tyr Met Ser Ile Asn Asp Lys Pro Tyr Ile Arg Lys Ser Leu

275 280 285

Gly Ser Leu Asp Asp Phe Leu Arg Ile Arg Val Gln Met Gln Lys Arg

290 295 300

Arg Arg Asn Leu His Lys Thr Leu Val Ser Val Lys Gly Gly Lys Gly

305 310 315 320

Arg Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Asp Arg Leu Lys Glu Lys Asn Phe

325 330 335

Ala Thr Thr Tyr Asn His Phe Leu Ser Tyr Asn Ile Val Lys Phe Ala

340 345 350

Lys Asp Asn Leu Ala Glu Gln Ile Asn Met Glu Phe Leu Ala Leu Ala

355 360 365

Gly Glu Asp Lys Asn Ile Ile Leu Arg Asn Trp Ser Tyr Tyr Gln Leu

370 375 380

Gln Gln Phe Val Glu Asp Lys Ala Lys Arg Glu Gly Ile Asp Val Lys

385 390 395 400

Tyr Val Asp Pro Tyr Arg Thr Ser Gln Met Cys Ser Lys Cys Arg Asn

405 410 415

Tyr Glu Pro Gly Gln Arg Glu Ser Gln Glu Lys Phe Ile Cys Lys Ser

420 425 430

Cys His Leu Glu Ile Asn Ala Asp Tyr Asn Ala Ser Gln Asn Ile Ala

435 440 445

His Ser Thr Lys Tyr Ile Thr Asn Lys Asn Gln Ser Glu Tyr Phe Lys

450 455 460

Lys Leu Gln His Thr Thr Glu

465 470

<210> 34

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 34

Met Gly Val Thr Ile Lys Ile Met Lys Tyr Gln Ile Leu Cys Pro Met

1 5 10 15

Asn Val Asp Trp Thr Ile Phe Glu Lys Gln Leu Arg Asn Leu Thr Tyr

20 25 30

Gln Val Arg Thr Ile Ser Asn Arg Thr Ile Gln Gln Leu Trp Glu Phe

35 40 45

Asp Ala Leu Ser Phe Asp Tyr Phe Lys Glu Arg Gly Thr Tyr Pro Thr

50 55 60

Val Gln Asp Leu Tyr Gly Cys Thr Gln Lys Lys Ile Asp Gly Tyr Ile

65 70 75 80

Tyr His Thr Leu Gln Ser Lys Tyr Pro Asp Ile His Lys Gly Asn Met

85 90 95

Ser Thr Thr Leu Gln Lys Ile Ile Lys Thr Trp Lys Ser Arg Arg Asn

100 105 110

Glu Ile Arg Lys Gly Glu Met Ser Ile Pro Ser Phe Arg Thr Arg Ile

115 120 125

Pro Ile Asp Leu His Asn Asn Ser Val Asp Ile Ile Lys Glu Lys Asn

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Gly Asp Tyr Ile Ala Gly Ile Ser Leu Phe Ser Arg Asp Phe His Lys

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Glu Asn Gly Asp Val Pro Lys Gly Lys Ile Phe Val Lys Leu Gly Thr

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Tyr Leu Ser Ile Thr Tyr Lys Phe Asn Ala Ile Lys Glu Asn Lys Phe

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Tyr Phe Ala Phe Asn Glu Gly Phe Ile His Ser Asn Ile Lys Ser Asp

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Leu Lys Gln Ser Lys Tyr Cys Ser Asn Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg

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Lys Leu His Ser Lys Lys Cys Met Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Gly

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450

<210> 35

<211> 196

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 35

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Lys Lys Ser Ala Gln Arg Asp Met Ser Arg Arg Phe Lys Asn Gly Val

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130 135 140

Ser Lys Ile Cys Ser Cys Cys Gly Val Lys Tyr Asp His Ser Val Gln

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Arg Trp Val Lys

195

<210> 36

<211> 445

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 36

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<210> 37

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 37

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<210> 38

<211> 362

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 38

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<210> 39

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 39

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450

<210> 40

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 40

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Thr Tyr Asp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Lys Gln Leu Ala Val Gln Ser

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450

<210> 41

<211> 450

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 41

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Ser Phe Lys Val His Ala Asp Tyr Asn Ala Ala Lys Asn Ile Ser Leu

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435 440 445

Ile Asn

450

<210> 42

<211> 450

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 42

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Phe Ala Phe Asn Lys Gly Leu Val Arg Gly Ala Ile Ser Gly Glu Glu

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Ile Glu Ala Phe Arg Lys Lys Ile Glu His Arg Arg Ile Ser Leu Leu

260 265 270

Arg Gln Gly Lys Tyr Cys Ser Gly Asn Arg Ile Gly Lys Gly Arg Glu

275 280 285

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Arg Asn Ala Thr Asn His Lys Tyr Ala Asn Tyr Ile Val Gln Gln Cys

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Leu Lys Tyr Asn Cys Gly Thr Ile Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gly Ile

325 330 335

Ser Lys Glu Gln Thr Phe Leu Lys Asn Trp Thr Tyr Phe Asp Leu Gln

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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Ser Phe Lys Val His Ala Asp Tyr Asn Ala Ala Lys Asn Ile Ser Leu

405 410 415

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Ile Asn

450

<210> 43

<211> 444

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 43

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Ser Ile Ala Asp Val Gly Trp Gly Met Phe Lys Thr Phe Val Ser Tyr

325 330 335

Lys Ala Asn Trp Ala Asn Lys Ile Leu Ile Leu Ile Asn Arg Phe Phe

340 345 350

Pro Ser Ser Lys Gln Cys Asn Gly Cys Lys Glu Lys Asn Thr Leu Leu

355 360 365

Ser Leu Ser Asp Arg Leu Trp Met Cys Pro Ser Cys Gly Thr His His

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Asp Arg Asp Asp Asn Ala Ala Leu Asn Ile Lys Glu Glu Gly Ile Arg

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Leu Leu Leu Asn Ala

405

<210> 52

<211> 252

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 52

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Phe Ile Arg Ser Asn Ile Lys Ser Asp Glu Ile Lys Ala Phe Asn Glu

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<210> 53

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 53

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65 70 75 80

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195 200 205

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450

<210> 54

<211> 445

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 54

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<210> 55

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 55

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<210> 56

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 56

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450

<210> 57

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 57

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Lys Leu His Ser Lys Lys Cys Met Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Gly

435 440 445

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450

<210> 58

<211> 445

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 58

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Cys Met Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Gly Tyr Leu Asp

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<210> 59

<211> 445

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 59

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Cys Met Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Gly Tyr Leu Asp

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<210> 60

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 60

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Tyr Phe Ala Phe Asn Glu Gly Phe Ile Arg Ser Asn Ile Lys Ser Asp

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Leu Lys Gln Ser Lys Tyr Cys Ser Asn Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg

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450

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<211> 451

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<213> 芽孢杆菌属

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450

<210> 62

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 63

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 64

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

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<210> 67

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 67

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<210> 68

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 68

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Leu Lys Gln Ser Lys Tyr Cys Ser Asn Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg

275 280 285

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290 295 300

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Cys Leu Lys His Asn Cys Gly Arg Ile Gln Met Glu Leu Leu Lys Gly

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Gln Glu Lys Ile Lys Asn Gln Ala Glu Phe His Gly Ile Glu Val Ile

355 360 365

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450

<210> 69

<211> 496

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 69

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<400> 71

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<213> 芽孢杆菌属

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

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<212> PRT

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<210> 77

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 77

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Tyr Phe Ala Phe Asn Glu Gly Phe Ile Arg Ser Asn Ile Lys Ser Asp

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450

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<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 78

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Tyr Leu Asp

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<210> 79

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 79

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<210> 80

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 80

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450

<210> 81

<211> 444

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 81

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<210> 82

<211> 448

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 82

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<210> 83

<211> 444

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 83

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<210> 84

<211> 448

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 84

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275 280 285

Leu Gln Pro Ile Asp Val Leu Ser Asn Lys Ile Ala Lys Phe Arg Asn

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<210> 85

<211> 486

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 85

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Asn Asn Leu Arg Lys Ser Arg Ser Lys Asp Ser Phe Gln Glu Tyr Lys

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450 455 460

Ser Thr Arg Tyr Ile Thr Asn Lys Glu Glu Ser Glu Tyr Tyr Arg Lys

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Asn Asn Asn Glu Ile Ala

485

<210> 86

<211> 264

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 86

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<210> 87

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 87

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195 200 205

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<210> 88

<211> 450

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 88

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Ile Asn

450

<210> 89

<211> 487

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 89

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<210> 90

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 90

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450

<210> 91

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 91

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450

<210> 92

<211> 496

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 92

Met Ile Leu Thr Arg Lys Ile Gln Leu Val Ile Ile Ser Glu Asn Gln

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Leu Val Arg Gly Arg Ser Leu Lys Phe Tyr Lys Glu Asn Gly Glu Tyr

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Arg Arg Gln Leu Gln Glu Ser Leu Ser Ala Val Lys Gly Gly Lys Gly

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Arg Lys Lys Lys Leu Lys Ala Leu Glu His Leu Lys Glu Lys Glu Ala

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405 410 415

Asp Tyr Tyr Glu Glu Gly Gln Arg Glu Thr Gln Glu Arg Phe Met Cys

420 425 430

Lys Ser Cys Gly Phe Glu Val Asn Ala Asp Tyr Asn Ala Ser Gln Asn

435 440 445

Ile Ala Lys Ser Thr Arg Tyr Ile Ser Asp Ser Thr Glu Ser Glu Tyr

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His Lys Lys Lys Gln Glu Ala Leu Lys Gly Ile Leu Gly Glu Asn Asp

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Thr Ile Asn Glu Gln Leu Ser Leu Phe Asn Asn Cys Asp Asp Ile Ala

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<210> 93

<211> 445

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 93

Met Gly Val Thr Ile Lys Ile Met Lys Tyr Gln Ile Leu Cys Pro Leu

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Gly Asp Tyr Ile Ala Gly Ile Ser Leu Phe Ser Arg Asp Phe His Lys

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Glu Asn Asp Asp Val Pro Lys Gly Lys Ile Phe Val Lys Leu Ala Thr

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Gln Lys Gln Lys Ser Met Lys Val Ile Leu Asp Arg Leu Ile Asn Gln

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Thr Tyr Ser Lys Gly Ala Cys Met Ile His Lys Tyr Lys Asn Lys Trp

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Tyr Leu Ser Ile Thr Tyr Lys Phe Asn Ala Ile Lys Glu Asn Lys Phe

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Asp Lys Glu Leu Ile Met Gly Ile Asp Leu Gly Gly Ile Asn Thr Val

225 230 235 240

Tyr Phe Ala Phe Asn Glu Gly Phe Ile Arg Ser Asn Ile Lys Ser Asp

245 250 255

Glu Ile Ile Arg Gln Arg Arg Ile Asn Leu Leu Lys Gln Ser Lys Tyr

260 265 270

Cys Ser Asn Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg Thr Lys Arg Leu Gln Pro

275 280 285

Ile Asp Val Leu Ser Asn Lys Ile Ala Lys Phe Arg Asn Ser Thr Asn

290 295 300

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305 310 315 320

Gly Arg Ile Gln Met Glu Leu Leu Lys Gly Ile Ser Lys Asn Asp Arg

325 330 335

Ile Leu Lys Asp Trp Thr Tyr Phe Asp Leu Gln Glu Lys Ile Lys Asn

340 345 350

Gln Ala Glu Ile His Gly Ile Glu Val Ile Lys Val Ala Pro Ala Tyr

355 360 365

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370 375 380

Cys Thr Gln Ala Thr Phe Glu Cys Lys Gln Cys Gly Tyr Lys Thr His

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Ala Asp Tyr Asn Ala Ala Lys Asn Ile Ser Thr Tyr Asp Ile Glu Asn

405 410 415

Ile Ile Asn Lys Gln Leu Ala Val Gln Ser Lys Leu His Ser Lys Lys

420 425 430

Cys Met Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Gly Tyr Leu Asp

435 440 445

<210> 94

<211> 506

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 94

Met Ser Thr Pro Leu Gln Gln Pro His Gln Lys Ser Lys Lys Thr Ser

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Gln Met Ile Thr Thr Arg Lys Phe Lys Leu Ala Ile Val Ser Asp Asn

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Lys Ile Glu Lys Glu Phe Asn Lys Lys Ser Met Glu Thr Tyr Gln Lys

130 135 140

Val Val Gly Leu Ser Lys Gln Thr Arg Ile Gly Lys Leu Leu Lys Ser

145 150 155 160

Gln Phe Thr Leu His Tyr Asp Thr Glu Asp Arg Ile Thr Ser Thr Val

165 170 175

Leu Ser His Phe Asn Asn Asp Met Lys Thr Gly Val Leu Arg Gly Asp

180 185 190

Arg Ser Leu Arg Thr Tyr Lys Asn Ser His Pro Leu Leu Val Arg Ala

195 200 205

Arg Ser Met Lys Val Tyr Glu Glu Asn Gly Asp Tyr Phe Ile Lys Trp

210 215 220

Val Lys Gly Ile Val Phe Lys Ile Val Ile Ser Ala Gly Ser Lys Gln

225 230 235 240

Lys Ala Asn Ile Gly Glu Leu Lys Ser Val Leu Ile Asn Ile Leu Asn

245 250 255

Gly His Tyr Lys Val Cys Asp Ser Ser Ile Ser Leu Asn Lys Asp Leu

260 265 270

Ile Leu Asn Leu Ser Leu Asn Ile Pro Val Ser Lys Glu Asn Val Phe

275 280 285

Val Pro Gly Arg Val Val Gly Val Asp Leu Gly Leu Lys Ile Pro Ala

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Tyr Val Ser Leu Asn Asp Thr Pro Tyr Ile Lys Lys Gly Ile Gly Asn

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Lys Lys Leu Lys Gly Leu Asp Arg Leu Lys Ala Lys Glu Lys Asn Phe

355 360 365

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Val Lys Asn Asn Ala Gly Val Ile His Leu Glu Glu Leu Gln Phe Asp

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Lys Leu Lys Asn Lys Ser Leu Leu Arg Asn Trp Ser Tyr Tyr Gln Leu

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Tyr Val Asp Ala Ser Tyr Thr Ser Gln Thr Cys Ser Lys Cys Gly His

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<210> 95

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 95

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450

<210> 96

<211> 445

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 96

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Cys Met Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Gly Tyr Leu Asp

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<210> 97

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 97

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325 330 335

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Cys Lys Gln Cys Gly Tyr Lys Thr His Ala Asp Tyr Asn Ala Ala Lys

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Asn Ile Ser Thr Tyr Asp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Lys Gln Leu Ala

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435

<210> 98

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 98

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<210> 99

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 99

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<210> 100

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 100

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<210> 101

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<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 101

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Asp Thr Gln Lys Lys Ser Leu Leu Arg Asn Trp Ser Tyr Tyr Gln Leu

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Gln Gln Phe Ile Glu Tyr Lys Ala Asn Arg Glu Gly Ile Leu Ile Lys

405 410 415

Tyr Val Asp Pro Phe His Thr Ser Gln Thr Cys Ser Lys Cys Ser His

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Tyr Glu Asp Gly Gln Arg Glu Lys Gln Asp Thr Phe Cys Cys Lys Ser

435 440 445

Cys Gly Phe Lys Asp Asn Ala Asp Tyr Asn Ala Ala Arg Asn Ile Ala

450 455 460

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465 470 475 480

Gln Asn Asn Asn Glu Ile Ala

485

<210> 102

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 102

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Asp Lys Glu Leu Ile Met Gly Ile Asp Met Gly Gly Ile Asn Thr Val

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Glu Ile Lys Met Phe Asn Glu Arg Ile Arg Gln Arg Arg Ile Asn Leu

260 265 270

Leu Lys Gln Ser Lys Tyr Cys Ser Asn Ser Arg Thr Gly Lys Gly Arg

275 280 285

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Cys Leu Lys His Asn Cys Gly Arg Ile Gln Met Glu Leu Leu Lys Gly

325 330 335

Ile Ser Lys Asn Asp Lys Val Leu Lys Asp Trp Thr Tyr Phe Asp Leu

340 345 350

Gln Glu Lys Ile Lys Asn Gln Ala Glu Ile Tyr Gly Ile Glu Val Ile

355 360 365

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Cys Gly Tyr Lys Thr His Ala Asp Tyr Asn Ala Ala Lys Asn Ile Ser

405 410 415

Thr Tyr Asp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Lys Gln Leu Ala Val Gln Ser

420 425 430

Lys Leu His Ser Lys Lys Cys Met Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Leu Gly

435 440 445

Tyr Leu Asp

450

<210> 103

<211> 377

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 103

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Leu Pro Lys Leu Gly Phe Val Thr Phe Ala Lys Ser Arg Glu Val Asp

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Gly Arg Ile Met Asn Ala Thr Val Arg Arg Asn Ser Ser Gly Lys Tyr

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Phe Val Ala Ile Leu Thr Glu Val Glu Ile Gln Pro Leu Lys Lys Ala

165 170 175

Asp Ser Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Ile Thr Asp Phe Ala Ile Leu

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Ser Asp Gly His Lys Ile Asp Asn Asn Lys Phe Thr Ser Lys Met Glu

195 200 205

Lys Lys Leu Lys Arg Glu Gln Arg Lys Leu Ser Lys Arg Ala Leu Leu

210 215 220

Ala Lys Asn Lys Gly Ile His Leu Leu Asp Ala Gln Asn Tyr Gln Lys

225 230 235 240

Gln Lys Cys Lys Val Ala Arg Leu His Glu Arg Val Ile Asn Gln Arg

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Asp Asp Phe Leu Asn Lys Leu Ser Thr Glu Ile Ile Lys Asn His Asp

260 265 270

Ile Ile Cys Ile Glu Asp Leu Asn Thr Lys Gly Met Leu Arg Asn His

275 280 285

Lys Leu Ala Lys Ser Ile Ser Asp Val Ser Trp Ser Ala Phe Val Ser

290 295 300

Lys Leu Glu Tyr Lys Ala Thr Trp Tyr Gly Lys Thr Ile Val Lys Val

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Ser Arg Trp Phe Pro Ser Ser Gln Ile Cys Ser Asp Cys Gly His His

325 330 335

Asp Gly Lys Lys Ser Leu Glu Ile Arg Gly Trp Thr Cys Pro Ile Cys

340 345 350

His Ala Asn His Asp Arg Asp Phe Asn Ala Ser Lys Asn Ile Leu Ala

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Glu Gly Leu Arg Thr Leu Ala Leu Val

370 375

<210> 104

<211> 450

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 104

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210 215 220

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225 230 235 240

Phe Ala Phe Asn Lys Ser Leu Val Arg Gly Ala Ile Ser Gly Glu Glu

245 250 255

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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Ile Asn

450

<210> 105

<211> 451

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 105

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1 5 10 15

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<211> 450

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 106

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275 280 285

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305 310 315 320

Leu Lys Tyr Asn Cys Gly Thr Ile Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gly Ile

325 330 335

Ser Lys Glu Gln Thr Phe Leu Lys Asn Trp Thr Tyr Phe Asp Leu Gln

340 345 350

Glu Lys Ile Lys Asn Gln Ala Asn Gln Tyr Gly Val Lys Val Val Lys

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405 410 415

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435 440 445

Ile Asn

450

<210> 107

<211> 450

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 107

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Glu Asp Leu Ile Met Gly Ile Asp Met Gly Lys Ile Asn Val Leu Tyr

225 230 235 240

Phe Ala Phe Asn Lys Ser Leu Val Arg Gly Ala Ile Ser Gly Glu Glu

245 250 255

Ile Glu Ala Phe Arg Lys Lys Ile Glu His Arg Arg Ile Ser Leu Leu

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Leu Lys Tyr Asn Cys Gly Thr Ile Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gly Ile

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450

<210> 108

<211> 450

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 108

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245 250 255

Ile Glu Ala Phe Arg Lys Lys Ile Glu Tyr Arg Arg Ile Ser Leu Leu

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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450

<210> 109

<211> 450

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 109

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1 5 10 15

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35 40 45

Asp Asn Leu Ser Leu Asn His Phe Lys Glu Thr Gly Glu Tyr Pro Ser

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65 70 75 80

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85 90 95

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145 150 155 160

Glu Asn Asp Leu Pro Asn Gly Lys Ile Leu Val Lys Leu Ser Thr Arg

165 170 175

Lys Gln Asn Ser Met Lys Val Ile Leu Asp Arg Leu Ile Asn Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Lys Gly Ala Cys Met Leu His Lys His Lys Asn Lys Trp Tyr

195 200 205

Leu Ser Ile Thr Tyr Lys Ala Thr Lys Lys Glu Gly His Lys Phe Asp

210 215 220

Glu Glu Leu Ile Met Gly Ile Asp Met Gly Lys Ile Asn Val Leu Tyr

225 230 235 240

Phe Ala Tyr Asn Lys Gly Leu Val Arg Gly Ala Ile Ser Gly Glu Glu

245 250 255

Ile Glu Ala Phe Arg Lys Lys Ile Glu Tyr Arg Arg Ile Ser Leu Leu

260 265 270

Arg Gln Gly Lys Tyr Cys Ser Glu Asn Arg Ile Gly Lys Gly Arg Lys

275 280 285

Lys Arg Ile Lys Pro Ile Glu Val Leu Asn Asp Lys Ile Thr Lys Phe

290 295 300

Arg Asn Ala Thr Asn His Lys Tyr Ala Asn Tyr Ile Val Gln Gln Cys

305 310 315 320

Leu Lys Tyr Asn Cys Gly Thr Ile Gln Leu Glu Asp Leu Gln Gly Ile

325 330 335

Ser Lys Glu Gln Thr Phe Leu Lys Asn Trp Thr Tyr Phe Asp Leu Gln

340 345 350

Glu Lys Ile Lys Asn Gln Ala Asn Gln Tyr Gly Ile Lys Val Val Lys

355 360 365

Ile Asp Pro Ser Tyr Thr Ser Gln Arg Cys Ser Glu Cys Gly Tyr Ile

370 375 380

His Lys Asn Asn Arg Gln Asp Gln Ser Thr Phe Glu Cys Gln His Cys

385 390 395 400

Ser Phe Lys Val His Ala Asp Tyr Asn Ala Ala Lys Asn Ile Ser Ile

405 410 415

Tyr Asn Ile Glu Lys Val Ile Gln Lys Gln Leu Glu Leu Gln Glu Lys

420 425 430

Leu Asn Leu Thr Lys Tyr Lys Glu Gln Tyr Ile Glu Gln Met Glu Asn

435 440 445

Ile Asn

450

<210> 110

<211> 11

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 110

aggauugaaa u 11

<210> 111

<211> 11

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 111

aggauugaaa u 11

<210> 112

<211> 11

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 112

uggauugaaa u 11

<210> 113

<211> 11

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 113

aggauugaaa u 11

<210> 114

<211> 11

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 114

uggauugaaa u 11

<210> 115

<211> 18

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 115

caauagaugu auugaaau 18

<210> 116

<211> 37

<212> RNA

<213> 戈登氏菌属

<400> 116

gucgugagua cgacgcccuc acgcuggcgu ugcgacc 37

<210> 117

<211> 13

<212> RNA

<213> 微球菌菌属

<400> 117

cagggaugag ccc 13

<210> 118

<211> 13

<212> RNA

<213> 微球菌菌属

<400> 118

cagggaugag ccc 13

<210> 119

<211> 13

<212> RNA

<213> 微球菌菌属

<400> 119

cagggaugag ccc 13

<210> 120

<211> 201

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 120

aaacagcuag aauguaacuu aaaguagguc aauguuuaaa uucgauguug caauuuguuu 60

ggacaagugg auuaaaacgu uccuugaaaa ucauauaaag cagccaguuu acgggcuugg 120

gcgaauuugc guccaaaggg ugaggccagg uguaaguaag aaccuacaaa agcacucacc 180

aaagggucaa cucgauacau u 201

<210> 121

<211> 201

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 121

aaacagcuag aauguaacuu aaaguagguc aauguuuaaa uucgauguug caauuuguuu 60

ggacaagugg auuaaaacgu uccuugaaaa ucauauaaag cagccaguuu acgggcuugg 120

gcgaauuugc guccaaaggg ugaggccagg uguaaguaag aaccuacaaa agcacucacc 180

aaagggucaa cucgauacau u 201

<210> 122

<211> 201

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 122

aaacagcuag aauguaacuu aaaguagguc aauguuuaaa uucgauauug caauuuguuu 60

ggacaagugg auuaaaacgu uccuugaaaa ucauauaaag cagccaguuu acgggcuugg 120

gcgaauuugc guccaaaggg ugaggccagg uguaaguaag aaccuacaaa agcacucacc 180

aaagggucaa cucgauacau u 201

<210> 123

<211> 201

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 123

aaacagcuag aauguaacuu aaaguagguc aauguuuaaa uucgauguug caauuuguuu 60

ggacaagugg auuaaaacgu uccuugaaaa ucauauaaag cagccaguuu acgggcuugg 120

gcgaauuugc guccaaaggg ugaggccagg uguaaguaag aaccuacaaa agcacucacc 180

aaagggucaa cucgauacau u 201

<210> 124

<211> 201

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 124

aaacagcuag aauguaacuu aaaguagguc aauguuuaaa uucgauauug caauuuguuu 60

ggacaagugg auuaaaacgu uccuugaaaa ucauauaaag cagccaguuu acgggcuugg 120

gcgaauuugc guccaaaggg ugaggccagg uguaaguaag aaccuacaaa agcacucacc 180

aaagggucaa cucgauacau u 201

<210> 125

<211> 124

<212> RNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 125

acggucuuug uguuacaccc uucaaagcau ccaggaugcu uauguaucaa uguuuuuuua 60

acauucgaua cuaccuuaug gagcguuuac acuugguaaa uucaccuugu auuacuucuc 120

cauu 124

<210> 126

<211> 97

<212> RNA

<213> 微球菌菌属

<400> 126

uucugggcgc caggcagagc gaagcccucc cggcgcggag gggggauggc caggagggcu 60

ucuaagucgc aggcccugcg ggaugggcuc acguucg 97

<210> 127

<211> 96

<212> RNA

<213> 微球菌菌属

<400> 127

guuuacacag gucgaacgug agcccauccc guagggccug cgacuuagaa gcccuccugg 60

ccaucccccc uccgcgccgg gagggcuucg cucugc 96

<210> 128

<211> 97

<212> RNA

<213> 微球菌菌属

<400> 128

uucugggcgc caggcagagc gaagcccucc cggcgcggag gggggauggc caggagggcu 60

ucuaagucgc aggcccugcg ggaugggcuc acguucg 97

<210> 129

<211> 221

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 129

aaacagcuag aauguaacuu aaaguagguc aauguuuaaa uucgauguug caauuuguuu 60

ggacaagugg auuaaaacgu uccuugaaaa ucauauaaag cagccaguuu acgggcuugg 120

gcgaauuugc guccaaaggg ugaggccagg uguaaguaag aaccuacaaa agcacucacc 180

aaagggucaa aaagauccua cauggaugug aggauugaaa u 221

<210> 130

<211> 221

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 130

aaacagcuag aauguaacuu aaaguagguc aauguuuaaa uucgauguug caauuuguuu 60

ggacaagugg auuaaaacgu uccuugaaaa ucauauaaag cagccaguuu acgggcuugg 120

gcgaauuugc guccaaaggg ugaggccagg uguaaguaag aaccuacaaa agcacucacc 180

aaagggucaa aaagauccua cauggaugug aggauugaaa u 221

<210> 131

<211> 221

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 131

aaacagcuag aauguaacuu aaaguagguc aauguuuaaa uucgauguug caauuuguuu 60

ggacaagugg auuaaaacgu uccuugaaaa ucauauaaag cagccaguuu acgggcuugg 120

gcgaauuugc guccaaaggg ugaggccagg uguaaguaag aaccuacaaa agcacucacc 180

aaagggucaa aaagauccua cauggaugug aggauugaaa u 221

<210> 132

<211> 216

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 132

aaacagcuag aauguaacuu aaaguagguc aauguuuaaa uucgauauug caauuuguuu 60

ggacaagugg auuaaaacgu uccuugaaaa ucauauaaag cagccaguuu acgggcuugg 120

gcgaauuugc guccaaaggg ugaggccagg uguaaguaag aaccuacaaa agcacucacc 180

aaagggucaa cucgauacau uaaaguggau ugaaau 216

<210> 133

<211> 114

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 133

uucugggcgc caggcagagc gaagcccucc cggcgcggag gggggauggc caggagggcu 60

ucuaagucgc aggcccugcg ggaugggcuc acguucgaaa gcagggauga gccc 114

<210> 134

<211> 113

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 134

guuuacacag gucgaacgug agcccauccc guagggccug cgacuuagaa gcccuccugg 60

ccaucccccc uccgcgccgg gagggcuucg cucugcaaag cagggacgag ccc 113

<210> 135

<211> 114

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 135

uucugggcgc caggcagagc gaagcccucc cggcgcggag gggggauggc caggagggcu 60

ucuaagucgc aggcccugcg ggaugggcuc acguucgaaa gcagggauga gccc 114

<210> 136

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成胜

<400> 136

Ala Ala Ala Gly

1

<210> 137

<211> 82

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多肽

<400> 137

Thr Asn Leu Ser Asp His Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val Ile

1 5 10 15

Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile Gly

20 25 30

Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu Ser

35 40 45

Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr Lys

50 55 60

Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile Lys

65 70 75 80

Met Leu

<210> 138

<211> 1493

<212> PRT

<213> 智人

<400> 138

Met Pro Asn Glu Gly Ile Pro His Ser Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asp

1 5 10 15

Cys Leu Gln Ser Gln Pro Val Ser Asn Asn Glu Glu Met Ala Ile Lys

20 25 30

Gln Glu Ser Gly Gly Asp Gly Glu Val Glu Glu Tyr Leu Ser Phe Arg

35 40 45

Ser Val Gly Asp Gly Leu Ser Thr Ser Ala Val Gly Cys Ala Ser Ala

50 55 60

Ala Pro Arg Arg Gly Pro Ala Leu Leu His Ile Asp Arg His Gln Ile

65 70 75 80

Gln Ala Val Glu Pro Ser Ala Gln Ala Leu Glu Leu Gln Gly Leu Gly

85 90 95

Val Asp Val Tyr Asp Gln Asp Val Leu Glu Gln Gly Val Leu Gln Gln

100 105 110

Val Asp Asn Ala Ile His Glu Ala Ser Arg Ala Ser Gln Leu Val Asp

115 120 125

Val Glu Lys Glu Tyr Arg Ser Val Leu Asp Asp Leu Thr Ser Cys Thr

130 135 140

Thr Ser Leu Arg Gln Ile Asn Lys Ile Ile Glu Gln Leu Ser Pro Gln

145 150 155 160

Ala Ala Thr Ser Arg Asp Ile Asn Arg Lys Leu Asp Ser Val Lys Arg

165 170 175

Gln Lys Tyr Asn Lys Glu Gln Gln Leu Lys Lys Ile Thr Ala Lys Gln

180 185 190

Lys His Leu Gln Ala Ile Leu Gly Gly Ala Glu Val Lys Ile Glu Leu

195 200 205

Asp His Ala Ser Leu Glu Glu Asp Ala Glu Pro Gly Pro Ser Ser Leu

210 215 220

Gly Ser Met Leu Met Pro Val Gln Glu Thr Ala Trp Glu Glu Leu Ile

225 230 235 240

Arg Thr Gly Gln Met Thr Pro Phe Gly Thr Gln Ile Pro Gln Lys Gln

245 250 255

Glu Lys Lys Pro Arg Lys Ile Met Leu Asn Glu Ala Ser Gly Phe Glu

260 265 270

Lys Tyr Leu Ala Asp Gln Ala Lys Leu Ser Phe Glu Arg Lys Lys Gln

275 280 285

Gly Cys Asn Lys Arg Ala Ala Arg Lys Ala Pro Ala Pro Val Thr Pro

290 295 300

Pro Ala Pro Val Gln Asn Lys Asn Lys Pro Asn Lys Lys Ala Arg Val

305 310 315 320

Leu Ser Lys Lys Glu Glu Arg Leu Lys Lys His Ile Lys Lys Leu Gln

325 330 335

Lys Arg Ala Leu Gln Phe Gln Gly Lys Val Gly Leu Pro Lys Ala Arg

340 345 350

Arg Pro Trp Glu Ser Asp Met Arg Pro Glu Ala Glu Gly Asp Ser Glu

355 360 365

Gly Glu Glu Ser Glu Tyr Phe Pro Thr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

370 375 380

Asp Asp Glu Val Glu Gly Ala Glu Ala Asp Leu Ser Gly Asp Gly Thr

385 390 395 400

Asp Tyr Glu Leu Lys Pro Leu Pro Lys Gly Gly Lys Arg Gln Lys Lys

405 410 415

Val Pro Val Gln Glu Ile Asp Asp Asp Phe Phe Pro Ser Ser Gly Glu

420 425 430

Glu Ala Glu Ala Ala Ser Val Gly Glu Gly Gly Gly Gly Gly Arg Lys

435 440 445

Val Gly Arg Tyr Arg Asp Asp Gly Asp Glu Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg

450 455 460

Leu Arg Arg Trp Asn Lys Leu Arg Leu Gln Asp Lys Glu Lys Arg Leu

465 470 475 480

Lys Leu Glu Asp Asp Ser Glu Glu Ser Asp Ala Glu Phe Asp Glu Gly

485 490 495

Phe Lys Val Pro Gly Phe Leu Phe Lys Lys Leu Phe Lys Tyr Gln Gln

500 505 510

Thr Gly Val Arg Trp Leu Trp Glu Leu His Cys Gln Gln Ala Gly Gly

515 520 525

Ile Leu Gly Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Ile Ile Ala

530 535 540

Phe Leu Ala Gly Leu Ser Tyr Ser Lys Ile Arg Thr Arg Gly Ser Asn

545 550 555 560

Tyr Arg Phe Glu Gly Leu Gly Pro Thr Val Ile Val Cys Pro Thr Thr

565 570 575

Val Met His Gln Trp Val Lys Glu Phe His Thr Trp Trp Pro Pro Phe

580 585 590

Arg Val Ala Ile Leu His Glu Thr Gly Ser Tyr Thr His Lys Lys Glu

595 600 605

Lys Leu Ile Arg Asp Val Ala His Cys His Gly Ile Leu Ile Thr Ser

610 615 620

Tyr Ser Tyr Ile Arg Leu Met Gln Asp Asp Ile Ser Arg Tyr Asp Trp

625 630 635 640

His Tyr Val Ile Leu Asp Glu Gly His Lys Ile Arg Asn Pro Asn Ala

645 650 655

Ala Val Thr Leu Ala Cys Lys Gln Phe Arg Thr Pro His Arg Ile Ile

660 665 670

Leu Ser Gly Ser Pro Met Gln Asn Asn Leu Arg Glu Leu Trp Ser Leu

675 680 685

Phe Asp Phe Ile Phe Pro Gly Lys Leu Gly Thr Leu Pro Val Phe Met

690 695 700

Glu Gln Phe Ser Val Pro Ile Thr Met Gly Gly Tyr Ser Asn Ala Ser

705 710 715 720

Pro Val Gln Val Lys Thr Ala Tyr Lys Cys Ala Cys Val Leu Arg Asp

725 730 735

Thr Ile Asn Pro Tyr Leu Leu Arg Arg Met Lys Ser Asp Val Lys Met

740 745 750

Ser Leu Ser Leu Pro Asp Lys Asn Glu Gln Val Leu Phe Cys Arg Leu

755 760 765

Thr Asp Glu Gln His Lys Val Tyr Gln Asn Phe Val Asp Ser Lys Glu

770 775 780

Val Tyr Arg Ile Leu Asn Gly Glu Met Gln Ile Phe Ser Gly Leu Ile

785 790 795 800

Ala Leu Arg Lys Ile Cys Asn His Pro Asp Leu Phe Ser Gly Gly Pro

805 810 815

Lys Asn Leu Lys Gly Leu Pro Asp Asp Glu Leu Glu Glu Asp Gln Phe

820 825 830

Gly Tyr Trp Lys Arg Ser Gly Lys Met Ile Val Val Glu Ser Leu Leu

835 840 845

Lys Ile Trp His Lys Gln Gly Gln Arg Val Leu Leu Phe Ser Gln Ser

850 855 860

Arg Gln Met Leu Asp Ile Leu Glu Val Phe Leu Arg Ala Gln Lys Tyr

865 870 875 880

Thr Tyr Leu Lys Met Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Ser Arg Gln Pro

885 890 895

Leu Ile Thr Arg Tyr Asn Glu Asp Thr Ser Ile Phe Val Phe Leu Leu

900 905 910

Thr Thr Arg Val Gly Gly Leu Gly Val Asn Leu Thr Gly Ala Asn Arg

915 920 925

Val Val Ile Tyr Asp Pro Asp Trp Asn Pro Ser Thr Asp Thr Gln Ala

930 935 940

Arg Glu Arg Ala Trp Arg Ile Gly Gln Lys Lys Gln Val Thr Val Tyr

945 950 955 960

Arg Leu Leu Thr Ala Gly Thr Ile Glu Glu Lys Ile Tyr His Arg Gln

965 970 975

Ile Phe Lys Gln Phe Leu Thr Asn Arg Val Leu Lys Asp Pro Lys Gln

980 985 990

Arg Arg Phe Phe Lys Ser Asn Asp Leu Tyr Glu Leu Phe Thr Leu Thr

995 1000 1005

Ser Pro Asp Ala Ser Gln Ser Thr Glu Thr Ser Ala Ile Phe Ala

1010 1015 1020

Gly Thr Gly Ser Asp Val Gln Thr Pro Lys Cys His Leu Lys Arg

1025 1030 1035

Arg Ile Gln Pro Ala Phe Gly Ala Asp His Asp Val Pro Lys Arg

1040 1045 1050

Lys Lys Phe Pro Ala Ser Asn Ile Ser Val Asn Asp Ala Thr Ser

1055 1060 1065

Ser Glu Glu Lys Ser Glu Ala Lys Gly Ala Glu Val Asn Ala Val

1070 1075 1080

Thr Ser Asn Arg Ser Asp Pro Leu Lys Asp Asp Pro His Met Ser

1085 1090 1095

Ser Asn Val Thr Ser Asn Asp Arg Leu Gly Glu Glu Thr Asn Ala

1100 1105 1110

Val Ser Gly Pro Glu Glu Leu Ser Val Ile Ser Gly Asn Gly Glu

1115 1120 1125

Cys Ser Asn Ser Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ser Met Pro Ser Gly

1130 1135 1140

Asp Glu Ser Ile Asp Glu Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Lys Arg Glu

1145 1150 1155

Arg Pro Ser Gln Ala Gln Thr Glu Ala Phe Trp Glu Asn Lys Gln

1160 1165 1170

Met Glu Asn Asn Phe Tyr Lys His Lys Ser Lys Thr Lys His His

1175 1180 1185

Ser Val Ala Glu Glu Glu Thr Leu Glu Lys His Leu Arg Pro Lys

1190 1195 1200

Gln Lys Pro Lys Asn Ser Lys His Cys Arg Asp Ala Lys Phe Glu

1205 1210 1215

Gly Thr Arg Ile Pro His Leu Val Lys Lys Arg Arg Tyr Gln Lys

1220 1225 1230

Gln Asp Ser Glu Asn Lys Ser Glu Ala Lys Glu Gln Ser Asn Asp

1235 1240 1245

Asp Tyr Val Leu Glu Lys Leu Phe Lys Lys Ser Val Gly Val His

1250 1255 1260

Ser Val Met Lys His Asp Ala Ile Met Asp Gly Ala Ser Pro Asp

1265 1270 1275

Tyr Val Leu Val Glu Ala Glu Ala Asn Arg Val Ala Gln Asp Ala

1280 1285 1290

Leu Lys Ala Leu Arg Leu Ser Arg Gln Arg Cys Leu Gly Ala Val

1295 1300 1305

Ser Gly Val Pro Thr Trp Thr Gly His Arg Gly Ile Ser Gly Ala

1310 1315 1320

Pro Ala Gly Lys Lys Ser Arg Phe Gly Lys Lys Arg Asn Ser Asn

1325 1330 1335

Phe Ser Val Gln His Pro Ser Ser Thr Ser Pro Thr Glu Lys Cys

1340 1345 1350

Gln Asp Gly Ile Met Lys Lys Glu Gly Lys Asp Asn Val Pro Glu

1355 1360 1365

His Phe Ser Gly Arg Ala Glu Asp Ala Asp Ser Ser Ser Gly Pro

1370 1375 1380

Leu Ala Ser Ser Ser Leu Leu Ala Lys Met Arg Ala Arg Asn His

1385 1390 1395

Leu Ile Leu Pro Glu Arg Leu Glu Ser Glu Ser Gly His Leu Gln

1400 1405 1410

Glu Ala Ser Ala Leu Leu Pro Thr Thr Glu His Asp Asp Leu Leu

1415 1420 1425

Val Glu Met Arg Asn Phe Ile Ala Phe Gln Ala His Thr Asp Gly

1430 1435 1440

Gln Ala Ser Thr Arg Glu Ile Leu Gln Glu Phe Glu Ser Lys Leu

1445 1450 1455

Ser Ala Ser Gln Ser Cys Val Phe Arg Glu Leu Leu Arg Asn Leu

1460 1465 1470

Cys Thr Phe His Arg Thr Ser Gly Gly Glu Gly Ile Trp Lys Leu

1475 1480 1485

Lys Pro Glu Tyr Cys

1490

<210> 139

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 139

gtcacatcct acatggatgt gtggattgaa attggaatgg gaactaaagt aatgg 55

<210> 140

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 140

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatattg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa ctcgatacat t 201

<210> 141

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 141

gtttaaacat aacaatagat gtattgaaat tggaatggga actaaagtaa tgg 53

<210> 142

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 142

acggtctttg tgttacaccc ttcaaagcat ccaggatgct tatgtatcaa tgttttttta 60

acattcgata ctaccttatg gagcgtttac acttggtaaa ttcaccttgt attacttctc 120

catt 124

<210> 143

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 143

gtcacatcct acatggatgt gaggattgaa attggaatgg gaactaaagt aatgg 55

<210> 144

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 144

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg 70

<210> 145

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 145

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa ctcgatacat t 201

<210> 146

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 146

gtcacatcct acatggatgt gtggattgaa attggaatgg gaactaaagt aatgg 55

<210> 147

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 147

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatattg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa ctcgatacat t 201

<210> 148

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 148

cagccagttt acgggcttgg gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag 60

aacctacaaa agcactcacc aaagggtcaa ctcgatacat t 101

<210> 149

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 149

cctaagaaga aaagaaaggt g 21

<210> 150

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 150

aaaagacctg ccgctacaaa gaaggccggc caggccaaga aaaagaag 48

<210> 151

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 151

gactacaagg accacgacgg cgactacaaa gatcacgata tcgactacaa ggacgacgat 60

gataag 66

<210> 152

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 152

tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 60

caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 120

ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 180

gggaggtcta tataagcaga gct 203

<210> 153

<211> 318

<212> DNA

<213> 智人

<400> 153

tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc 60

gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 120

gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 180

tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 240

gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 300

tggaaaggac gaaacacc 318

<210> 154

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 154

gacgcattgg acgattttga tctggatatg ctgggaagtg acgccctcga tgattttgac 60

cttgacatgc ttggttcgga tgcccttgat gactttgacc tcgacatgct cggcagtgac 120

gcccttgatg atttcgacct ggacatgctg attaactcta gaagttccgg atctggtagc 180

cagtacctgc ccgacaccga cgaccggcac cggatcgagg aaaagcggaa gcggacctac 240

gagacattca agagcatcat gaagaagtcc cccttcagcg gccccaccga ccctagacct 300

ccacctagaa gaatcgccgt gcccagcaga tccagcgcca gcgtgccaaa acctgccccc 360

cagccttacc ccttcaccag cagcctgagc accatcaact acgacgagtt ccctaccatg 420

gtgttcccca gcggccagat ctctcaggcc tctgctctgg ctccagcccc tcctcaggtg 480

ctgcctcagg ctcctgctcc tgcaccagct ccagccatgg tgtctgcact ggctcaggca 540

ccagcacccg tgcctgtgct ggctcctgga cctccacagg ctgtggctcc accagcccct 600

aaacctacac aggccggcga gggcacactg tctgaagctc tgctgcagct gcagttcgac 660

gacgaggatc tgggagccct gctgggaaac agcaccgatc ctgccgtgtt caccgacctg 720

gccagcgtgg acaacagcga gttccagcag ctgctgaacc agggcatccc tgtggcccct 780

cacaccaccg agcccatgct gatggaatac cccgaggcca tcacccggct cgtgacaggc 840

gctcagaggc ctcctgatcc agctcctgcc cctctgggag caccaggcct gcctaatgga 900

ctgctgtctg gcgacgagga cttcagctct atcgccgata tggatttctc agccttgctg 960

ggctctggca gcggcagccg ggattccagg gaagggatgt ttttgccgaa gcctgaggcc 1020

ggctccgcta ttagtgacgt gtttgagggc cgcgaggtgt gccagccaaa acgaatccgg 1080

ccatttcatc ctccaggaag tccatgggcc aaccgcccac tccccgccag cctcgcacca 1140

acaccaaccg gtccagtaca tgagccagtc gggtcactga ccccggcacc agtccctcag 1200

ccactagatc cagcgcccgc agtgactccc gaggccagtc acctgttgga agatcccgat 1260

gaagagacga gccaggctgt caaagccctt cgggagatgg ccgatactgt gattccccag 1320

aaggaagagg ctgcaatctg tggccaaatg gacctttccc atccgccccc aaggggccat 1380

ctggatgagc tgacaaccac acttgagtcc atgaccgagg atctgaacct ggactcaccc 1440

ctgaccccgg aattgaacga gattctggat accttcctga acgacgagtg cctcttgcat 1500

gccatgcata tcagcacagg actgtccatc ttcgacacat ctctgttttc cggaggatct 1560

agcggaggct cctctggctc tgagacacct ggcacaagcg agagcgcaac acctgaaagc 1620

agcgggggca gcagcggggg gtca 1644

<210> 155

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 155

atgagcaccc ctctgcagca gcctcaccag aaatccaaga agaccagcca gatgataaca 60

acacgcaagt tcaagctcgc catcgttagc gacaaccgga acgaggccta cagcttcatc 120

cggaacgaga tcagaaacca gaacaaggcc ctgaacgccg cttataacca cctgtacttc 180

gagcacatcg caaccgagaa actgaagcac agcgatgagg aataccagaa gcacctgaca 240

aagtacagag aggtggccac caacaagtac caggactacc tgaaggtgaa agaaaaagtg 300

aacgacagca aggacgacga gaagctgcag aagcgggtgg ataaggctag agaggcctac 360

aacaaggccc aggagaaagt gtacaagatc gagaaggaat tcaacaaaaa gagcatggaa 420

acctaccaga aggtggtcgg cctgagcaaa cagacaagaa tcggaaagct gctcaagagc 480

cagttcaccc tgcactacga caccgaagat agaatcacca gcacagtgat cagccacttt 540

aacaatgata tgaagacagg agtgctgaga ggcgatagaa gcctgagaac atacaagaac 600

agccatcctc tgctggttag agccagatct atgaaggtgt acgaggaaaa cggcgactac 660

ttcatcaagt gggtcaaggg gatcgtgttt aagatcgtga tcagcgccgg cagcaagcag 720

aaagctaata tcggcgagct gaaatctgtg cttatcaaca tcctgaatgg ccactataag 780

gtgtgcgaca gcagcatcag cctgaataaa gacctgatcc tgaacctgtc tctgaacatc 840

cctgtgtcta aggagaacgt gttcgtgccc ggcagagtgg tgggcgtgga cctgggcctg 900

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ctgaaggcca aggaaaaaaa cttcgtgaac acctacaacc acttcctgag caagaaaatc 1140

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aagctgaaac ataagtccct gctgcggaac tggtcctact accaactgca gacaatgatc 1260

gagtacaagg ctgaacggga aggcatcgag gtgaagtacg tggacgccag ctacaccagc 1320

cagacctgta gcaagtgcgg ccactacgag gaaggccagc gggtgctgca agacaccttc 1380

acctgcaaga acaaagagtg caagggctac gtgcacaagg ttaacgccga cttcaacgcc 1440

tctcagaata tcgccaagtc taccgacatc atccggtgca ccgagatggc caagaacaac 1500

gatatcgaga agaatgcc 1518

<210> 156

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 156

atgagcaccc ctctgcagca gcctcaccag aaatccaaga agaccagcca gatgataaca 60

acacgcaagt tcaagctcgc catcgttagc gacaaccgga acgaggccta cagcttcatc 120

cggaacgaga tcagaaacca gaacaaggcc ctgaacgccg cttataacca cctgtacttc 180

gagcacatcg caaccgagaa actgaagcac agcgatgagg aataccagaa gcacctgaca 240

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aacaaggccc aggagaaagt gtacaagatc gagaaggaat tcaacaaaaa gagcatggaa 420

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aacaatgata tgaagacagg agtgctgaga ggcgatagaa gcctgagaac atacaagaac 600

agccatcctc tgctggttag agccagatct atgaaggtgt acgaggaaaa cggcgactac 660

ttcatcaagt gggtcaaggg gatcgtgttt aagatcgtga tcagcgccgg cagcaagcag 720

aaagctaata tcggcgagct gaaatctgtg cttatcaaca tcctgaatgg ccactataag 780

gtgtgcgaca gcagcatcag cctgaataaa gacctgatcc tgaacctgtc tctgaacatc 840

cctgtgtcta aggagaacgt gttcgtgccc ggcagagtgg tgggcgtggc cctgggcctg 900

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atccagtttg ccgtgaagaa caacgccggc gtgatccacc tggccgagct gcagttcgac 1200

aagctgaaac ataagtccct gctgcggaac tggtcctact accaactgca gacaatgatc 1260

gagtacaagg ctgaacggga aggcatcgag gtgaagtacg tggacgccag ctacaccagc 1320

cagacctgta gcaagtgcgg ccactacgag gaaggccagc gggtgctgca agacaccttc 1380

acctgcaaga acaaagagtg caagggctac gtgcacaagg ttaacgccgc cttcaacgcc 1440

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gatatcgaga agaatgcc 1518

<210> 157

<211> 7494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 157

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ggtcataaca gcagcttcag ctacctctca attcaaaaaa cccctcaaga cccgtttaga 120

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<210> 158

<211> 7494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 158

gcgatcgcgg ctcccgacat cttggaccat tagctccaca ggtatcttct tccctctagt 60

ggtcataaca gcagcttcag ctacctctca attcaaaaaa cccctcaaga cccgtttaga 120

ggccccaagg ggttatgcta tcaatcgttg cgttacacac acaaaaaacc aacacacatc 180

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cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 420

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accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 720

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ctcgacacac ccgccagcgg ccgcgccacc atggccccta agaagaaaag aaaggtggac 900

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tcactgaccc cggcaccagt ccctcagcca ctagatccag cgcccgcagt gactcccgag 3840

gccagtcacc tgttggaaga tcccgatgaa gagacgagcc aggctgtcaa agcccttcgg 3900

gagatggccg atactgtgat tccccagaag gaagaggctg caatctgtgg ccaaatggac 3960

ctttcccatc cgcccccaag gggccatctg gatgagctga caaccacact tgagtccatg 4020

accgaggatc tgaacctgga ctcacccctg accccggaat tgaacgagat tctggatacc 4080

ttcctgaacg acgagtgcct cttgcatgcc atgcatatca gcacaggact gtccatcttc 4140

gacacatctc tgttttaatg aggatccgca ggcctctgct agcttgactg actgagatac 4200

agcgtacctt cagctcacag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac 4260

tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt 4320

aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca 4380

ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat 4440

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ggttttttgt gcccctcggg ccggattgct atctaccggc attggcgcag aaaaaaatgc 4560

ctgatgcgac gctgcgcgtc ttatactccc acatatgcca gattcagcaa cggatacggc 4620

ttccccaact tgcccacttc catacgtgtc ctccttacca gaaatttatc cttaaggtcg 4680

tcagctatcc tgcaggcgat ctctcgattt cgatcaagac attcctttaa tggtcttttc 4740

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taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 5220

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 5280

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tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 5460

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tcctctcagt gcgagtctcg acgatccata tcgttgcttg gcagtcagcc agtcggaatc 6180

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gtaccgatct gtttaaacct agatattgat agtctgatcg gtcaacgtat aatcgagtcc 6300

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acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgcg cgagtgggtt 6480

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caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 6720

ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatt ggaggaccga 6780

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cgactctggc tctatcgaat ctccgtcgtt tcgagcttac gcgaacagcc gtggcgctca 7440

tttgctcgtc gggcatcgaa tctcgtcagc tatcgtcagc ttaccttttt ggca 7494

<210> 159

<211> 7512

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 159

gcgatcgcgg ctcccgacat cttggaccat tagctccaca ggtatcttct tccctctagt 60

ggtcataaca gcagcttcag ctacctctca attcaaaaaa cccctcaaga cccgtttaga 120

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catcttcgat ggatagcgat tttattatct aactgctgat cgagtgtagc cagatctagt 240

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ggccagcggg tgctgcaaga caccttcacc tgcaagaaca aagagtgcaa gggctacgtg 4020

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cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa 4440

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ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 5700

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caacgattgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 6840

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 6900

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacct tgcgtaaact attaactggc gaactactta 6960

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ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 7200

taggtgcctc actgattaag cattggtaac cgattctagg tgcattggcg cagaaaaaaa 7260

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gaacagccgt ggcgctcatt tgctcgtcgg gcatcgaatc tcgtcagcta tcgtcagctt 7500

acctttttgg ca 7512

<210> 160

<211> 7512

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 160

gcgatcgcgg ctcccgacat cttggaccat tagctccaca ggtatcttct tccctctagt 60

ggtcataaca gcagcttcag ctacctctca attcaaaaaa cccctcaaga cccgtttaga 120

ggccccaagg ggttatgcta tcaatcgttg cgttacacac acaaaaaacc aacacacatc 180

catcttcgat ggatagcgat tttattatct aactgctgat cgagtgtagc cagatctagt 240

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cagccactag atccagcgcc cgcagtgact cccgaggcca gtcacctgtt ggaagatccc 2220

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tccaagaaga ccagccagat gataacaaca cgcaagttca agctcgccat cgttagcgac 2700

aaccggaacg aggcctacag cttcatccgg aacgagatca gaaaccagaa caaggccctg 2760

aacgccgctt ataaccacct gtacttcgag cacatcgcaa ccgagaaact gaagcacagc 2820

gatgaggaat accagaagca cctgacaaag tacagagagg tggccaccaa caagtaccag 2880

gactacctga aggtgaaaga aaaagtgaac gacagcaagg acgacgagaa gctgcagaag 2940

cgggtggata aggctagaga ggcctacaac aaggcccagg agaaagtgta caagatcgag 3000

aaggaattca acaaaaagag catggaaacc taccagaagg tggtcggcct gagcaaacag 3060

acaagaatcg gaaagctgct caagagccag ttcaccctgc actacgacac cgaagataga 3120

atcaccagca cagtgatcag ccactttaac aatgatatga agacaggagt gctgagaggc 3180

gatagaagcc tgagaacata caagaacagc catcctctgc tggttagagc cagatctatg 3240

aaggtgtacg aggaaaacgg cgactacttc atcaagtggg tcaaggggat cgtgtttaag 3300

atcgtgatca gcgccggcag caagcagaaa gctaatatcg gcgagctgaa atctgtgctt 3360

atcaacatcc tgaatggcca ctataaggtg tgcgacagca gcatcagcct gaataaagac 3420

ctgatcctga acctgtctct gaacatccct gtgtctaagg agaacgtgtt cgtgcccggc 3480

agagtggtgg gcgtggccct gggcctgaag atcccagcct atgtgtccct gaacgacaca 3540

ccctacatca agaagggcat cggcaacatc gacgatttcc tgaaggtgcg gacccaactg 3600

cagagccaga gaaagagact gcaaaagacc ctggaatgta cctccggcgg caagggcaga 3660

aacaagaagc tgaagggact ggacagactg aaggccaagg aaaaaaactt cgtgaacacc 3720

tacaaccact tcctgagcaa gaaaatcatc cagtttgccg tgaagaacaa cgccggcgtg 3780

atccacctgg ccgagctgca gttcgacaag ctgaaacata agtccctgct gcggaactgg 3840

tcctactacc aactgcagac aatgatcgag tacaaggctg aacgggaagg catcgaggtg 3900

aagtacgtgg acgccagcta caccagccag acctgtagca agtgcggcca ctacgaggaa 3960

ggccagcggg tgctgcaaga caccttcacc tgcaagaaca aagagtgcaa gggctacgtg 4020

cacaaggtta acgccgcctt caacgcctct cagaatatcg ccaagtctac cgacatcatc 4080

cggtgcaccg agatggccaa gaacaacgat atcgagaaga atgccaaaag acctgccgct 4140

acaaagaagg ccggccaggc caagaaaaag aagtaatgag gatccgcagg cctctgctag 4200

cttgactgac tgagatacag cgtaccttca gctcacagac atgataagat acattgatga 4260

gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga 4320

tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg 4380

cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa 4440

cctctacaaa tgtggtattg gcccatctct atcggtatcg tagcataacc ccttggggcc 4500

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgtgc ccctcgggcc ggattgctat ctaccggcat 4560

tggcgcagaa aaaaatgcct gatgcgacgc tgcgcgtctt atactcccac atatgccaga 4620

ttcagcaacg gatacggctt ccccaacttg cccacttcca tacgtgtcct ccttaccaga 4680

aatttatcct taaggtcgtc agctatcctg caggcgatct ctcgatttcg atcaagacat 4740

tcctttaatg gtcttttctg gacaccacta ggggtcagaa gtagttcatc aaactttctt 4800

ccctccctaa tctcattggt taccttgggc tatcgaaact taattaacca gtcaagtcag 4860

ctacttggcg agatcgactt gtctgggttt cgactacgct cagaattgcg tcagtcaagt 4920

tcgatctggt ccttgctatt gcacccgttc tccgattacg agtttcattt aaatcatgtg 4980

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 5040

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 5100

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 5160

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 5220

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 5280

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 5340

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 5400

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 5460

cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 5520

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 5580

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 5640

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 5700

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 5760

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 5820

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgca tttaaatttc cgaactctcc 5880

aaggccctcg tcggaaaatc ttcaaacctt tcgtccgatc catcttgcag gctacctctc 5940

gaacgaacta tcgcaagtct cttggccggc cttgcgcctt ggctattgct tggcagcgcc 6000

tatcgccagg tattactcca atcccgaata tccgagatcg ggatcacccg agagaagttc 6060

aacctacatc ctcaatcccg atctatccga gatccgagga atatcgaaat cggggcgcgc 6120

ctggtgtacc gagaacgatc ctctcagtgc gagtctcgac gatccatatc gttgcttggc 6180

agtcagccag tcggaatcca gcttgggacc caggaagtcc aatcgtcaga tattgtactc 6240

aagcctggtc acggcagcgt accgatctgt ttaaacctag atattgatag tctgatcggt 6300

caacgtataa tcgagtccta gcttttgcaa acatctatca agagacagga tcagcaggag 6360

gctttcgcat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 6420

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 6480

tgggtgcgcg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 6540

ttcgccccga agaacgcttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 6600

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 6660

atgacttggt tgagtattca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 6720

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 6780

caacgattgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 6840

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 6900

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacct tgcgtaaact attaactggc gaactactta 6960

ctctagcttc ccggcaacag ttgatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 7020

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 7080

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 7140

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 7200

taggtgcctc actgattaag cattggtaac cgattctagg tgcattggcg cagaaaaaaa 7260

tgcctgatgc gacgctgcgc gtcttatact cccacatatg ccagattcag caacggatac 7320

ggcttcccca acttgcccac ttccatacgt gtcctcctta ccagaaattt atccttaaga 7380

tcccgaatcg tttaaactcg actctggctc tatcgaatct ccgtcgtttc gagcttacgc 7440

gaacagccgt ggcgctcatt tgctcgtcgg gcatcgaatc tcgtcagcta tcgtcagctt 7500

acctttttgg ca 7512

<210> 161

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 161

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa taagctctcg gggtgtgga 239

<210> 162

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 162

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tactgtaaaa gatgtaaag 239

<210> 163

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 163

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tatgttttat gttactgta 239

<210> 164

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 164

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tacagtaaca taaaacata 239

<210> 165

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 165

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tggcaaagga gcacatcag 239

<210> 166

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 166

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tgccaaagca gatgtgttt 239

<210> 167

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 167

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tgtcctgtag acaggcatg 239

<210> 168

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 168

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tggtggtgtg gggggggag 239

<210> 169

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 169

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tccacactca cgcatgcct 239

<210> 170

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 170

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tcagcacagc agcttcccc 239

<210> 171

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 171

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tgcccggatg agggagagc 239

<210> 172

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 172

aaacagctag aatgtaactt aaagtaggtc aatgtttaaa ttcgatgttg caatttgttt 60

ggacaagtgg attaaaacgt tccttgaaaa tcatataaag cagccagttt acgggcttgg 120

gcgaatttgc gtccaaaggg tgaggccagg tgtaagtaag aacctacaaa agcactcacc 180

aaagggtcaa aaagatccta catggatgtg aggattgaaa tacccctccc cccccacac 239

<210> 173

<211> 506

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多肽

<400> 173

Met Ser Thr Pro Leu Gln Gln Pro His Gln Lys Ser Lys Lys Thr Ser

1 5 10 15

Gln Met Ile Thr Thr Arg Lys Phe Lys Leu Ala Ile Val Ser Asp Asn

20 25 30

Arg Asn Glu Ala Tyr Ser Phe Ile Arg Asn Glu Ile Arg Asn Gln Asn

35 40 45

Lys Ala Leu Asn Ala Ala Tyr Asn His Leu Tyr Phe Glu His Ile Ala

50 55 60

Thr Glu Lys Leu Lys His Ser Asp Glu Glu Tyr Gln Lys His Leu Thr

65 70 75 80

Lys Tyr Arg Glu Val Ala Thr Asn Lys Tyr Gln Asp Tyr Leu Lys Val

85 90 95

Lys Glu Lys Val Asn Asp Ser Lys Asp Asp Glu Lys Leu Gln Lys Arg

100 105 110

Val Asp Lys Ala Arg Glu Ala Tyr Asn Lys Ala Gln Glu Lys Val Tyr

115 120 125

Lys Ile Glu Lys Glu Phe Asn Lys Lys Ser Met Glu Thr Tyr Gln Lys

130 135 140

Val Val Gly Leu Ser Lys Gln Thr Arg Ile Gly Lys Leu Leu Lys Ser

145 150 155 160

Gln Phe Thr Leu His Tyr Asp Thr Glu Asp Arg Ile Thr Ser Thr Val

165 170 175

Ile Ser His Phe Asn Asn Asp Met Lys Thr Gly Val Leu Arg Gly Asp

180 185 190

Arg Ser Leu Arg Thr Tyr Lys Asn Ser His Pro Leu Leu Val Arg Ala

195 200 205

Arg Ser Met Lys Val Tyr Glu Glu Asn Gly Asp Tyr Phe Ile Lys Trp

210 215 220

Val Lys Gly Ile Val Phe Lys Ile Val Ile Ser Ala Gly Ser Lys Gln

225 230 235 240

Lys Ala Asn Ile Gly Glu Leu Lys Ser Val Leu Ile Asn Ile Leu Asn

245 250 255

Gly His Tyr Lys Val Cys Asp Ser Ser Ile Ser Leu Asn Lys Asp Leu

260 265 270

Ile Leu Asn Leu Ser Leu Asn Ile Pro Val Ser Lys Glu Asn Val Phe

275 280 285

Val Pro Gly Arg Val Val Gly Val Ala Leu Gly Leu Lys Ile Pro Ala

290 295 300

Tyr Val Ser Leu Asn Asp Thr Pro Tyr Ile Lys Lys Gly Ile Gly Asn

305 310 315 320

Ile Asp Asp Phe Leu Lys Val Arg Thr Gln Leu Gln Ser Gln Arg Lys

325 330 335

Arg Leu Gln Lys Thr Leu Glu Cys Thr Ser Gly Gly Lys Gly Arg Asn

340 345 350

Lys Lys Leu Lys Gly Leu Asp Arg Leu Lys Ala Lys Glu Lys Asn Phe

355 360 365

Val Asn Thr Tyr Asn His Phe Leu Ser Lys Lys Ile Ile Gln Phe Ala

370 375 380

Val Lys Asn Asn Ala Gly Val Ile His Leu Ala Glu Leu Gln Phe Asp

385 390 395 400

Lys Leu Lys His Lys Ser Leu Leu Arg Asn Trp Ser Tyr Tyr Gln Leu

405 410 415

Gln Thr Met Ile Glu Tyr Lys Ala Glu Arg Glu Gly Ile Glu Val Lys

420 425 430

Tyr Val Asp Ala Ser Tyr Thr Ser Gln Thr Cys Ser Lys Cys Gly His

435 440 445

Tyr Glu Glu Gly Gln Arg Val Leu Gln Asp Thr Phe Thr Cys Lys Asn

450 455 460

Lys Glu Cys Lys Gly Tyr Val His Lys Val Asn Ala Ala Phe Asn Ala

465 470 475 480

Ser Gln Asn Ile Ala Lys Ser Thr Asp Ile Ile Arg Cys Thr Glu Met

485 490 495

Ala Lys Asn Asn Asp Ile Glu Lys Asn Ala

500 505

<210> 174

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 174

ctacgaattc gtttgccatt actttagttc ccattccaaa aaccggatcc atatgg 56

<210> 175

<211> 242

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 175

gggaaacagc uagaauguaa cuuaaaguag gucaauguuu aaauucgaug uugcaauuug 60

uuuggacaag uggauuaaaa cguuccuuga aaaucauaua aagcagccag uuuacgggcu 120

ugggcgaauu ugcguccaaa gggugaggcc agguguaagu aagaaccuac aaaagcacuc 180

accaaagggu caaaaagauc cuacauggau gugaggauug aaauuggaau gggaacuaaa 240

gu 242

<210> 176

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<220>

<221> 经修饰_碱基

<222> (1)..(8)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 176

nnnnnnnn 8

<210> 177

<211> 199

<212> PRT

<213> 智人

<400> 177

Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His

1 5 10 15

Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr

20 25 30

Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met

35 40 45

Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys

50 55 60

Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro

65 70 75 80

Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile

85 90 95

Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala

100 105 110

Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg

115 120 125

Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg

130 135 140

Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His

145 150 155 160

Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp

165 170 175

Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala

180 185 190

Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn

195

<210> 178

<211> 173

<212> PRT

<213> 戈登氏菌属

<400> 178

Met Ser Gly Met Lys Ile Arg Ala Tyr Ala Pro Ala Gly Gly Pro Ser

1 5 10 15

Leu Ala Glu Val Ala Leu Ser Asn Val Thr Ala Leu Cys Asn Arg Trp

20 25 30

Leu Asp Gln Pro Ala Ser Glu Val Trp Arg Glu Gln Ala Ala Asn Glu

35 40 45

Ile Leu Ala Ala Met Asp Thr Asp Pro Val Ser Asp Leu Gly Ile Val

50 55 60

Gly Leu Asn Val Lys Asn Gly Glu Ala Thr Leu Asp Val Ala Ser Cys

65 70 75 80

Gly Pro Ala Ser Gln Ala Thr Leu Leu Ala Val Val Ala Ala Ile Gly

85 90 95

Asp Leu Leu His Thr Glu Asn Pro Pro Asn Tyr Val Glu Phe Glu Val

100 105 110

Ile Gln Gly Thr Arg Ser Tyr Ile Ala His Val Arg Thr Gly Asp Arg

115 120 125

Pro Ser Pro His Thr Leu Arg Arg Gln Ala Glu Gln Arg Ile Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Asp Val Leu Asp Asp His Ala Asp Asp Pro Thr Glu Val Ile

145 150 155 160

Ala Arg Ala Arg Ala Val Leu Arg Glu Gln Ala Glu Gln

165 170

<210> 179

<211> 135

<212> PRT

<213> 戈登氏菌属

<400> 179

Met Thr Ala Thr Pro Pro Ala Ala Glu Thr Val Trp Ala Val Gln Phe

1 5 10 15

Thr Gly Val Gly Gly Glu Pro Val Val His Thr Arg Asp Leu Arg Gly

20 25 30

Val Pro Phe Ala Asp Asp Ala His Ala Ala Ala His Ala Thr His Leu

35 40 45

Gln Gly Leu Gly Arg Arg Asp Ala Arg Thr Val Tyr Gln Ala Asn Gly

50 55 60

Ser Thr Gly Trp Met Asp Pro Thr Pro Gln Pro Pro Gln Gly Gln Pro

65 70 75 80

Pro Asp Arg Ala Ala Asp Val Thr Glu Val Ala Ser Ala Leu His Arg

85 90 95

His Ser Gly Gly Arg Leu Ala Val Thr Asp Ala His Ser Ile Ala Ala

100 105 110

Val Ala Leu Arg Met Ala Ala Ala Val Thr Glu Ala Arg Ala Pro Ala

115 120 125

Ala Arg Ser Arg His Ser Ile

130 135

<210> 180

<211> 191

<212> PRT

<213> 戈登氏菌属

<400> 180

Met Thr Asp Pro Thr Ala Ser Ala Gly Thr His Pro Ala Ala Leu Ala

1 5 10 15

Ala Val Ala Val Ala Asn Ser Thr Ala Ala Thr Val Gln Ala Ile Cys

20 25 30

Val Asp Gly Val Arg Arg His Met His Val Arg Thr His Phe Glu Thr

35 40 45

Ala Leu Pro His Arg Thr Gln His Ala Gly Arg Arg Phe Arg Ile Val

50 55 60

Ala Glu His Asp Asp Arg Val Ala Ile Glu Phe Thr Asp Arg Gly Asp

65 70 75 80

Arg Met Leu Ala Tyr Pro Glu Glu Ile Thr Ala Asp Thr Tyr Gly Tyr

85 90 95

Pro Glu Gly Ala His Leu Ile Arg Ala Met Tyr Ala Glu Ala Ala Glu

100 105 110

Ser Leu Ser His Arg Ile Phe Met Leu Glu Phe Thr Arg Glu Trp Trp

115 120 125

Leu Glu Leu Ser Glu Gly Arg Gly Gly Pro Leu Asp Thr Ala Pro Gln

130 135 140

Ser Val Val Leu Leu Gly Ser Arg Met Val Arg Ala Ala Asp Gly Gly

145 150 155 160

Arg Ala Val Arg Leu Tyr Arg Arg Ala Ala Asp Gly Ala Pro Asp Val

165 170 175

Gly Met Leu Arg Ser Ala Ala Arg Asp Phe Val Gly Cys Leu His

180 185 190

<210> 181

<211> 234

<212> PRT

<213> 戈登氏菌属

<400> 181

Met Thr Ala Ala Ala Asp Pro Val Asp Met Phe Val Val Val Ile Glu

1 5 10 15

His Arg Tyr Gly Thr Asn Val Gly Val His Ala Ser Arg Gly Asp Ala

20 25 30

Val Thr Glu Val Ala Gln Phe Ala Arg Asn Trp Trp Asn Asp Gln Pro

35 40 45

Pro Ala Thr Met Ser Pro Asp Ser Arg Arg Pro Glu Ile Pro Ala Asp

50 55 60

Asp Gly Ala Val Ile Asp Ala Tyr Phe His Ala Met Ala Gly Gln Glu

65 70 75 80

Ser Tyr Thr Ile Thr Ser Thr Pro Leu Ala Arg Ala Thr Val Asp Gly

85 90 95

Leu Met Phe Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ser Thr

100 105 110

Ile Asp Ala Val Arg Ala Glu Tyr Thr Ala Gln Lys Ala Arg Gln Asp

115 120 125

Gln Ala Arg Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Ala Val Leu Leu Leu Val Asp

130 135 140

Val Leu Ala Arg Arg Leu Pro Asp Val Lys Gln Leu Leu Val Glu Gly

145 150 155 160

Asp Ser Glu Glu Asp Trp Trp Asn Ile Arg Trp Pro Val Ala Ser Gly

165 170 175

Thr Pro Asp Thr Glu Ile Ser Gln Ile Asn Ala Asp Ile Gly Ala Leu

180 185 190

Pro Thr Asp Val Gly Tyr Lys Val Trp Gly His Ile Cys Thr Arg Ala

195 200 205

Ser Glu Asp Arg Asn Gln Leu Val Val Asp Val Ala Glu Leu Gln Lys

210 215 220

Tyr Ala Ala Asn Gly Gly Asp Arg Arg Lys

225 230

<210> 182

<211> 99

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 182

Met Thr Thr Phe Tyr Tyr Ser Val Asn Glu Met Ala Arg Gln Ala Gly

1 5 10 15

Phe Thr Ser Pro Ser Thr Trp Thr Arg Ile Lys Asn Asp Leu Arg Ala

20 25 30

Pro Asp Ala Val Met Val Ser Lys Ile Gln Gly Ala Gly Trp Thr Leu

35 40 45

Asp Ser Trp Glu Asp Ala Ala Asn Asn Glu Leu His Thr Arg Arg Glu

50 55 60

Pro Leu Met Lys Ala Ile Thr Arg Leu Arg Leu Glu Glu Glu Ala Leu

65 70 75 80

Arg Gln Glu Tyr Gly Val Thr Asp Gln Asp Glu Pro Ala Asp Gln Lys

85 90 95

Ala Glu Gly

<210> 183

<211> 149

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 183

Met Asn Ala Ile Glu Leu Lys Cys Arg Arg Glu Ala Leu Gly Leu Ser

1 5 10 15

Arg Asp Ala Leu Ala Asp Thr Leu Gly Val Ala Glu Lys Ser Ile Thr

20 25 30

Arg Trp Glu Phe Gly Lys Asn Pro Pro Arg Asp Trp Ser Trp Ile Asp

35 40 45

Ser Ala Met Thr Arg Leu Glu Asp Tyr Arg Glu Arg Leu Val Glu Glu

50 55 60

Leu Ile Ala Glu Thr Leu Arg Val His Glu Gln Ala Gly Ala Ala Leu

65 70 75 80

Met Leu Thr Tyr Ala Ser Arg Gly Ser Phe Tyr Arg Trp Leu Pro Glu

85 90 95

Met Glu Glu Pro Asp Met Gly Asp Gly Ile Glu Val Ile Pro Val Glu

100 105 110

Leu His Arg Ala Ala Thr Ala Glu Ala Ala Arg Arg Leu Arg Val Ser

115 120 125

His Gly Leu His Ala Val Ile Glu Ala Val Pro Thr Pro Gln Glu Gly

130 135 140

Glu Gly Ala Gly Ser

145

<210> 184

<211> 245

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 184

Met Ser Val Arg Arg Trp Val Ser Ser Val Val Ala Val Val Ala Ala

1 5 10 15

Leu Gly Val Val Gly Ala Val Gly Gly Gly His Val Gln Gly Val Gln

20 25 30

Val Pro Glu Val Lys Leu Pro Lys Val Ala Leu Pro Ser Gly Val Glu

35 40 45

Leu Pro Ser Leu Gly Asp Thr Ser Pro Thr Pro Ala Ala Gly Pro Val

50 55 60

Gly Gly Gln Leu Glu Gln Leu Ala Leu Thr Ser Ala Ala Pro Ala Ser

65 70 75 80

Ala Tyr Thr Arg Asp Ala Phe Gly Gln Arg Trp Ala Asp Val Asp Arg

85 90 95

Asn Gly Cys Asp Thr Arg Asn Asp Val Leu Arg Arg Asp Leu Thr Gln

100 105 110

Val Gln Ile Lys Pro Gly Thr Gln Gly Cys Lys Val Leu Ser Gly Gln

115 120 125

Leu Val Asp Pro Tyr Ser Gly Ala Thr Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp

130 135 140

Ser Gln Ala Val His Ile Asp His Thr Val Ser Leu Ala Asp Ala Trp

145 150 155 160

Ala Ser Gly Ala Trp Ala Trp Asp Glu Ser Gln Arg Thr Ala Phe Ala

165 170 175

Asn Asp Pro Ala Asn Leu Leu Ala Val Asp Gly Pro Ala Asn Thr Ser

180 185 190

Lys Ser Asp Ala Thr Ala Ala Asp Trp Leu Pro Asp Thr Val Ala Gly

195 200 205

Arg Cys Glu Leu Val Glu His Gln Val Val Val Lys Ala Lys Trp Gly

210 215 220

Leu Ser Val Thr Glu Arg Glu Arg Ala Ala Met Arg Arg Val Leu Ala

225 230 235 240

Ser Cys Pro Ser Gly

245

<210> 185

<211> 99

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 185

Met Thr Thr Phe Tyr Tyr Ser Val Asn Glu Met Ala Arg Gln Ala Gly

1 5 10 15

Phe Thr Ser Pro Ser Thr Trp Thr Arg Ile Lys Asn Asp Leu Arg Ala

20 25 30

Pro Asp Ala Val Met Val Ser Lys Ile Gln Gly Ala Gly Trp Thr Leu

35 40 45

Asp Ser Trp Glu Asp Ala Ala Asn Asn Glu Leu His Thr Arg Arg Glu

50 55 60

Pro Leu Met Lys Ala Ile Thr Arg Leu Arg Leu Glu Glu Glu Ala Leu

65 70 75 80

Arg Gln Glu Tyr Gly Val Thr Asp Gln Asp Glu Pro Ala Asp Gln Lys

85 90 95

Ala Glu Gly

<210> 186

<211> 123

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<220>

<221> MOD_RES

<222> (107)..(107)

<223> 任何氨基酸

<400> 186

Met Asn Ala Ile Glu Leu Lys Cys Arg Arg Glu Ala Leu Gly Leu Ser

1 5 10 15

Arg Asp Ala Leu Ala Asp Thr Leu Gly Val Ala Glu Lys Ser Ile Thr

20 25 30

Arg Trp Glu Phe Gly Lys Asn Pro Pro Arg Asp Trp Ser Trp Ile Asp

35 40 45

Ser Ala Met Thr Arg Leu Glu Asp Tyr Arg Glu Arg Leu Val Glu Glu

50 55 60

Leu Ile Ala Glu Thr Leu Arg Val His Glu Gln Ala Gly Ala Ala Leu

65 70 75 80

Met Leu Thr Tyr Ala Ser Arg Gly Ser Phe Tyr Arg Trp Leu Pro Glu

85 90 95

Met Glu Glu Pro Asp Met Gly Asp Gly Ile Xaa Val Ile Glu Ala Val

100 105 110

Pro Thr Pro Gln Glu Arg Glu Gly Ala Gly Ser

115 120

<210> 187

<211> 245

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 187

Met Ser Val Arg Arg Trp Val Ser Ser Val Val Ala Val Val Ala Ala

1 5 10 15

Leu Gly Val Ala Gly Ala Val Gly Gly Gly His Val Gln Gly Val Gln

20 25 30

Val Pro Glu Val Lys Leu Pro Lys Val Ala Leu Pro Ser Gly Val Glu

35 40 45

Leu Pro Ser Leu Gly Asp Thr Ser Pro Thr Pro Ala Ala Gly Pro Val

50 55 60

Gly Gly Gln Leu Glu Gln Leu Ala Leu Thr Ser Ala Ala Pro Ala Ser

65 70 75 80

Ala Tyr Thr Arg Asp Ala Phe Gly Gln Arg Trp Ala Asp Val Asp Arg

85 90 95

Asn Gly Cys Asp Thr Arg Asn Asp Val Leu Arg Arg Asp Leu Thr Gln

100 105 110

Val Gln Ile Lys Pro Gly Thr Gln Gly Cys Lys Val Leu Ser Gly Gln

115 120 125

Leu Val Asp Pro Tyr Ser Gly Ala Thr Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp

130 135 140

Ser Gln Ala Val Gln Ile Asp His Thr Val Ser Leu Ala Asp Ala Trp

145 150 155 160

Ala Ser Gly Ala Trp Ala Trp Asp Glu Ser Gln Arg Thr Ala Phe Ala

165 170 175

Asn Asp Pro Ala Asn Leu Leu Ala Val Asp Gly Pro Ala Asn Asn Ser

180 185 190

Lys Ser Asp Ala Thr Ala Ala Asp Trp Leu Pro Asp Thr Val Ala Gly

195 200 205

Arg Cys Glu Leu Val Glu His Gln Val Val Val Lys Ala Lys Trp Gly

210 215 220

Leu Ser Val Thr Glu Arg Glu Arg Ala Ala Met Arg Arg Val Leu Ala

225 230 235 240

Ser Cys Pro Ala Gly

245

<210> 188

<211> 99

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 188

Met Thr Thr Phe Tyr Tyr Ser Val Asn Glu Met Ala Arg Gln Ala Gly

1 5 10 15

Phe Thr Ser Pro Ser Thr Trp Thr Arg Ile Lys Asn Asp Leu Arg Ala

20 25 30

Pro Asp Ala Val Met Val Ser Lys Ile Gln Gly Ala Gly Trp Thr Leu

35 40 45

Asp Ser Trp Glu Asp Ala Ala Asn Asn Glu Leu His Thr Arg Arg Glu

50 55 60

Pro Leu Met Lys Ala Ile Thr Arg Leu Arg Leu Glu Glu Glu Ala Leu

65 70 75 80

Arg Gln Glu Tyr Gly Val Thr Asp Gln Asp Glu Pro Ala Asp Gln Lys

85 90 95

Ala Glu Gly

<210> 189

<211> 149

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 189

Met Asn Ala Ile Glu Leu Lys Cys Arg Arg Glu Ala Leu Gly Leu Ser

1 5 10 15

Arg Asp Ala Leu Ala Asp Thr Leu Gly Val Ala Glu Lys Ser Ile Thr

20 25 30

Arg Trp Glu Phe Gly Lys Asn Pro Pro Arg Asp Trp Ser Trp Ile Asp

35 40 45

Ser Ala Met Thr Arg Leu Glu Asp Tyr Arg Glu Arg Leu Val Glu Glu

50 55 60

Leu Ile Ala Glu Thr Leu Arg Val His Glu Gln Ala Gly Ala Ala Leu

65 70 75 80

Met Leu Thr Tyr Ala Ser Arg Gly Ser Phe Tyr Arg Trp Leu Pro Glu

85 90 95

Met Glu Glu Pro Asp Met Gly Asp Gly Ile Glu Val Ile Pro Val Glu

100 105 110

Leu His Arg Ala Ala Thr Ala Glu Ala Ala Arg Arg Leu Arg Val Ser

115 120 125

His Gly Leu His Ala Val Ile Glu Ala Val Pro Thr Pro Gln Glu Arg

130 135 140

Glu Gly Ala Gly Ser

145

<210> 190

<211> 245

<212> PRT

<213> 微球菌菌属

<400> 190

Met Ser Val Arg Arg Trp Val Ser Gly Val Val Ala Val Val Ala Ala

1 5 10 15

Leu Gly Val Ala Gly Ala Val Gly Gly Gly His Val Gln Gly Val Gln

20 25 30

Val Pro Glu Val Lys Leu Pro Lys Val Ala Leu Pro Ser Gly Val Glu

35 40 45

Leu Pro Ser Leu Gly Asp Thr Ser Pro Thr Pro Ala Ala Gly Pro Val

50 55 60

Gly Gly Gln Leu Glu Gln Leu Ala Leu Thr Ser Ala Ala Pro Ala Ser

65 70 75 80

Ala Tyr Thr Arg Asp Ala Phe Gly Gln Arg Trp Ala Asp Val Asp Arg

85 90 95

Asn Gly Cys Asp Thr Arg Asn Asp Val Leu Arg Arg Asp Leu Thr Gln

100 105 110

Val Gln Ile Lys Pro Gly Thr Gln Gly Cys Lys Val Leu Ser Gly Gln

115 120 125

Leu Val Asp Pro Tyr Ser Gly Ala Thr Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp

130 135 140

Ser Gln Ala Val His Ile Asp His Thr Val Ser Leu Ala Asp Ala Trp

145 150 155 160

Ala Ser Gly Ala Trp Ala Trp Asp Glu Ser Gln Arg Thr Ala Phe Ala

165 170 175

Asn Asp Pro Ala Asn Leu Leu Ala Val Asp Gly Pro Ala Asn Thr Ser

180 185 190

Lys Ser Asp Ala Thr Ala Ala Asp Trp Leu Pro Gly Thr Val Ala Gly

195 200 205

Arg Cys Glu Leu Val Glu His Gln Val Val Val Lys Ala Lys Trp Gly

210 215 220

Leu Ser Val Thr Glu Arg Glu Arg Ala Ala Met Arg Arg Val Leu Ala

225 230 235 240

Ser Cys Pro Ala Gly

245

<210> 191

<211> 206

<212> PRT

<213> Paeniglutamicibacter菌属

<400> 191

Met Leu Gly Gln Gly Phe Asp Gln Gly Leu Glu Phe Gly Phe Val Leu

1 5 10 15

Gly Lys Gly Leu Val Gln Gln Leu Leu Ala Cys Pro Val Gln Gly His

20 25 30

Arg Val Val Val Gly Leu Ala Asp Ile Asp Ala Asp Glu His Val Asp

35 40 45

Gly Phe Val Val Leu Asp His Cys Ala Pro His Ser Trp Gly His Arg

50 55 60

Arg Val Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Ala Cys Pro Ala Ala Pro Arg

65 70 75 80

Leu Gly Ile His Val Thr Thr Asp Asn Trp Thr Gly Ala Val Pro Ser

85 90 95

Arg Ser Gly Pro Tyr Leu Arg Tyr Pro Arg Cys Leu Ser Val Pro Val

100 105 110

Thr Ala Pro Pro Gly Ser Trp Met Thr Gly Gly Val Asn His Ala Gly

115 120 125

Thr Asp Arg Pro Ala Ile Pro Ile Leu Ala His Gly Ala Arg Leu Arg

130 135 140

Asp Tyr Lys Lys Gly Asn Gly Gly Gly Ala Asp Ala Pro Leu Asn Ala

145 150 155 160

Ala Ser Cys Gly Gly Gln Trp Arg Met Ala Cys Asp Arg Thr Ser Val

165 170 175

Ala Cys Gly Arg Gln Arg Pro Leu Ser Ser Gly Ser Arg Arg Leu Pro

180 185 190

Arg His Trp Ser Leu Pro His Pro Gly Cys Thr Phe Ile Pro

195 200 205

<210> 192

<211> 106

<212> PRT

<213> 链霉菌属

<220>

<221> MOD_RES

<222> (65)..(66)

<223> 任何氨基酸

<400> 192

Met Gly Ser Ser Ala Val Arg Ala Leu Arg Val Leu Pro Pro Gly Ala

1 5 10 15

Val Asp Thr Thr Pro Pro Pro Ala Ala Asn Arg Pro Ala Ser Gly Pro

20 25 30

Ala Ala Ala Pro Ala Gly Pro Val Lys Thr Arg Glu Thr Ala Ser Ala

35 40 45

Gly Tyr Arg Leu Ala Leu Asp Ala His Arg Ala Ala Val Asp Pro Ala

50 55 60

Xaa Xaa Ser Arg Ile Pro Ala Asp Ala Gln Ala Ala Phe Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Arg Ala Gln Ala Arg Glu Thr Ala Ser Ala Val Gln Asp Ala Ala Ile

85 90 95

Arg Arg Ala Arg Val Glu Arg Thr Ala Ala

100 105

<210> 193

<211> 244

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 193

gggaaacagc uagaauguaa cuuaaaguag gucaauguuu aaauucgaug uugcaauuug 60

uuuggacaag uggauuaaaa cguuccuuga aaaucauaua aagcagccag uuuacgggcu 120

ugggcgaauu ugcguccaaa gggugaggcc agguguaagu aagaaccuac aaaagcacuc 180

accaaagggu caaaaagauc cuacauggau gugaggauug aaauguacga gauauaggaa 240

gcug 244

<210> 194

<211> 242

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 194

gggaaacagc uagaauguaa cuuaaaguag gucaauguuu aaauucgaug uugcaauuug 60

uuuggacaag uggauuaaaa cguuccuuga aaaucauaua aagcagccag uuuacgggcu 120

ugggcgaauu ugcguccaaa gggugaggcc agguguaagu aagaaccuac aaaagcacuc 180

accaaagggu caaaaagauc cuacauggau gugaggauug aaauacuaca acagccacaa 240

cg 242

<210> 195

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 195

aggagcggac agcagcttcc tatatctcgt acaggaccgt caacatggtt 50

<210> 196

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 196

agccatgata tagacgttgt ggctgttgta gtaggaccgt caacatggtt 50

<210> 197

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 197

agcggtggga aaggaatccc 20

<210> 198

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 198

ttcgattccg gagagggagc ct 22

<210> 199

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 199

aggagcggac agcagcttcc tatatctcgt acagggaact caacatggtt 50

<210> 200

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 200

agccatgata tagacgttgt ggctgttgta gtagggaact caacatggtt 50

<210> 201

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 201

gtcacatcct acatggatgt gaggattgaa at 32

<210> 202

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 202

gtcacatcct acatggatgt gaggattgaa at 32

<210> 203

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 203

gtcacatcct acatgggtgt gtggattgaa at 32

<210> 204

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 204

gtcacatcct acatggatgt gaggattgaa at 32

<210> 205

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 205

gtcacaccct acatgggtgt aaggattgaa at 32

<210> 206

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 206

gttwaaacat aacaatagat gtwttgaaat 30

<210> 207

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 207

gtcacatcct acatgggtgt gtggattgaa at 32

<210> 208

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 208

gttaaaacaa aacaatagat gtattgaaat 30

<210> 209

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 209

gtttaaactt aacaatagat gtattgaaat 30

<210> 210

<211> 31

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 210

gtttactatt aacattggat gtatttaaat t 31

<210> 211

<211> 37

<212> DNA

<213> 戈登氏菌属

<400> 211

gtcgtgagta cgacgccctc acgctggcgt tgcgacc 37

<210> 212

<211> 29

<212> DNA

<213> 微球菌菌属

<400> 212

ggaagccccg cgcacgcagg gatgagccc 29

<210> 213

<211> 29

<212> DNA

<213> 微球菌菌属

<400> 213

ggaagccccg cgcacgcagg gatgagccc 29

<210> 214

<211> 29

<212> DNA

<213> Paeniglutamicibacter菌属

<400> 214

gtccttcccg ggcgcgcgcg gaatggctc 29

<210> 215

<211> 29

<212> DNA

<213> 链霉菌属

<400> 215

gtacggccca cacgcgcagg ggacgaccg 29

<210> 216

<211> 29

<212> DNA

<213> 微球菌菌属

<400> 216

ggaagccccg cgcacgcagg gatgagccc 29

<210> 217

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 217

gtcggccccg cgcacgcgga gatgagccc 29

<210> 218

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 218

gtttgacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 219

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 219

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 220

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 220

gtttaacatt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 221

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 221

gtcgcacctt atataggtgc gtggattgaa at 32

<210> 222

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 222

gtttastact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 223

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 223

gtttaatact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 224

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 224

gtcacatcct acatggatgt gaggattgaa at 32

<210> 225

<211> 22

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 225

tactcatgaa cacctcatgw gt 22

<210> 226

<211> 33

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 226

gtttactayt aacataagat gtatttaaat ggt 33

<210> 227

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 227

gtttastayt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 228

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 228

gtttagtact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 229

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 229

gttttgaata aactatgtag aatgtgaat 29

<210> 230

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 230

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 231

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 231

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 232

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 232

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 233

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 233

gttttgaata aactatgtag aatgtgaat 29

<210> 234

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 234

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 235

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 经修饰_碱基

<222> (1)..(19)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 235

nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19

<210> 236

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 236

gtttagtact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 237

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 237

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 238

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 经修饰_碱基

<222> (1)..(19)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 238

nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19

<210> 239

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 239

gtttartact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 240

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 240

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 241

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 241

gttaaaacat aacaatagat gtattgaaat 30

<210> 242

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 242

gttaaaacat aacaatagat gtattgaaat 30

<210> 243

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 243

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 244

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 244

gtttracact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 245

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 245

gtttaacatt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 246

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 246

gtcacatcct acatggatgt gaggattgaa at 32

<210> 247

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 247

gtcacatcct acatggatgt gtggattgaa at 32

<210> 248

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 248

gtttagtact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 249

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 249

gtttaacatt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 250

<211> 33

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 250

gtcacatcct acatggatgt gaggattgaa att 33

<210> 251

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 经修饰_碱基

<222> (1)..(19)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 251

nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19

<210> 252

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 252

gtttaacatt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 253

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 253

gtttaacatt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 254

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 254

gtttastayt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 255

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 255

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 256

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<220>

<221> 经修饰_碱基

<222> (7)..(7)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 256

gkttganact aayataagat gtatttaaat 30

<210> 257

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 257

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 258

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 258

gtttactayt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 259

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 259

gtttastayt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 260

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 260

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 261

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 261

gtttaatact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 262

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 262

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 263

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 263

gtttartact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 264

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 264

gtttagtayt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 265

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 265

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 266

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 266

gtttaatact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 267

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 267

gtttascatt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 268

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 268

gtttgacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 269

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 269

rtttgatatc aactatgtgg aatgtaaat 29

<210> 270

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 270

rtttgatatc aactatgtgg aatgtaaat 29

<210> 271

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 271

rtttgatatc aactatgtgg aatgtaaat 29

<210> 272

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 272

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 273

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 273

gtttartact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 274

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 274

gtttagtact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 275

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 275

gttttgaata aactatgtag aatgtgaat 29

<210> 276

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 276

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 277

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 277

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 278

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 278

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 279

<211> 34

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 279

agtaacaata cgtatagcta cgttaattgt agga 34

<210> 280

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 280

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 281

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 281

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 282

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 282

gtttagtact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 283

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 283

gtttastact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 284

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 284

gtttagtact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 285

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 285

gttttaatca caatatgtat tgttagaat 29

<210> 286

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 286

gtttagyact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 287

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 287

gtttastact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 288

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 288

gtttaaacat aacaatagat gtattgaaat 30

<210> 289

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 289

rttttaaata caatatgtat tgttagaat 29

<210> 290

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 290

gtttastayt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 291

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 291

gtttastayt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 292

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 292

gtttgatatc aactatatgg aatgtaaat 29

<210> 293

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 293

gtttastayt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 294

<211> 32

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 294

gtcacatcct acatgggtgt gaggattgaa at 32

<210> 295

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 295

gtttaahatt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 296

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 296

gtttastayt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 297

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 297

gtttastayt aacataagat gtatttaaat 30

<210> 298

<211> 21

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 298

ggtcatgttg tcattacatt g 21

<210> 299

<211> 18

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 299

atcccaaaaa cgttaggt 18

<210> 300

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 300

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 301

<211> 29

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 301

gtcttaatta caatatgtat tgttagaat 29

<210> 302

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 302

gtttaacact aacataagat gtatttaaat 30

<210> 303

<211> 19

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<220>

<221> 经修饰_碱基

<222> (5)..(5)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 303

gatanaaagt gtttcatat 19

<210> 304

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 经修饰_碱基

<222> (1)..(19)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 304

nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19

<210> 305

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 305

gtttactrtt aacawtggat gtatttaaat 30

<210> 306

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 306

gttaaaacaa aacaatagat gtattgaaat 30

<210> 307

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 307

gttaaaacaw aacaatagat gtattgaaat 30

<210> 308

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 308

gttwaaacat aacaatagat gtwttgaaat 30

<210> 309

<211> 30

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 309

gttwaaacat aacaatagat gtwttgaaat 30

<210> 310

<211> 146

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<400> 310

acggucuuug uguuacaccc uucaaagcau ccaggaugcu uauguaucaa uguuuuuuua 60

acauucgaua cuaccuuaug gagcguuuac acuugguaaa uucaccuugu auuacuucuc 120

cauuaaagca auagauguau ugaaau 146

<210> 311

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<220>

<221> 经修饰_碱基

<222> (52)..(59)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 311

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaacgacg gccagtgaat tnnnnnnnna 60

ctacaacagc cacaacgtct atatcatggg atcctctaga gtcgacctgc tgtctcttat 120

acacatctcc gagcccacga gac 143

<210> 312

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸

<220>

<221> 经修饰_碱基

<222> (52)..(56)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 312

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaacgacg gccagtgaat tnnnnntgga 60

atgggaacta aagtaatggc aaacgaattc gtaggatcct ctagagtcga cctgctgtct 120

cttatacaca tctccgagcc cacgagac 148

<210> 313

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 313

actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 30

<210> 314

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成寡核苷酸

<400> 314

acacctgtaa tcccagca 18

Claims

1.一种核酸分子，包含编码RNA指导核酸酶(RGN)多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码RGN多肽的核苷酸序列，所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

其中当与能够与DNA分子的目标DNA序列杂交的指导RNA(gRNA)结合时，所述RGN多肽能够以RNA指导的序列特异性方式结合所述目标DNA序列，且

其中编码RGN多肽的所述多核苷酸可操作地连接至与所述多核苷酸异源的启动子。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

4.如权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述目标DNA序列位于为单链的所述DNA分子的区域内。

5.如权利要求4所述的核酸分子，其中所述RGN多肽能够在结合时切割所述目标DNA序列。

6.如权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述目标DNA序列位于为双链的所述DNA分子的区域内。

7.如权利要求6所述的核酸分子，其中所述RGN多肽能够在结合时切割所述目标DNA序列。

8.如权利要求7所述的核酸分子，其中通过所述RGN多肽的切割产生双链断裂。

9.如权利要求7所述的核酸分子，其中通过所述RGN多肽的切割产生单链断裂。

10.如权利要求6至9中任一项所述的核酸分子，其中所述RGN多肽与碱基编辑多肽可操作地融合。

11.如权利要求10所述的核酸分子，其中所述碱基编辑多肽为脱氨酶。

12.如权利要求6至11中任一项所述的核酸分子，其中所述目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

13.如权利要求1至12中任一项所述的核酸分子，其中所述RGN多肽包含一种或多种核定位信号。

14.如权利要求1至13中任一项所述的核酸分子，其中所述RGN多肽针对在真核细胞中的表达而被密码子优化。

15.一种包含如权利要求1至14中任一项所述的核酸分子的载体。

16.如权利要求15所述的载体，还包含至少一个核苷酸序列，所述至少一个核苷酸序列编码能够与所述目标DNA序列杂交的所述gRNA。

17.如权利要求16所述的载体，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，且所述gRNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列。

18.如权利要求16所述的载体，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，且所述gRNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

19.如权利要求16所述的载体，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列，且所述gRNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有100％序列同一性的CRISPR重复序列。

20.如权利要求16所述的载体，其中所述gRNA包含tracrRNA。

21.如权利要求20所述的载体，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

22.如权利要求20所述的载体，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

23.如权利要求20所述的载体，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有100％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有100％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有100％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有100％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有100％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有100％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述gRNA还包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的氨基酸序列。

24.如权利要求20至23中任一项所述的载体，其中所述gRNA为单指导RNA。

25.如权利要求20至23中任一项所述的载体，其中所述gRNA为双指导RNA。

26.一种包含如权利要求1至14中任一项所述的核酸分子或如权利要求15至25中任一项所述的载体的细胞。

27.一种制备RGN多肽的方法，包含在所述RGN多肽被表达的条件下，培养如权利要求26所述的细胞。

28.一种制备RGN多肽的方法，包含将异源核酸分子引入细胞内，所述异源核酸分子包含编码RNA指导核酸酶(RGN)多肽的核苷酸序列，所述RNA指导核酸酶(RGN)多肽包含与SEQID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

其中当与能够与DNA分子的目标DNA序列杂交的指导RNA(gRNA)结合时，所述RGN多肽以RNA指导的序列特异性方式结合所述目标DNA序列；

且在所述RGN多肽被表达的条件下，培养所述细胞。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

30.如权利要求28所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

31.如权利要求28至30中任一项所述的方法，还包括纯化所述RGN多肽。

32.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述细胞还表达一种或多种指导RNA，其与所述RGN多肽结合，以形成RGN核糖核蛋白复合物。

33.如权利要求32所述的方法，还包括纯化所述RGN核糖核蛋白复合物。

34.一种分离的RNA指导核酸酶(RGN)多肽，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

其中当与能够与DNA分子的目标DNA序列杂交的指导RNA(gRNA)结合时，所述RGN多肽能够以RNA指导的序列特异性方式结合所述目标DNA序列。

35.如权利要求34所述的分离的RGN多肽，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

36.如权利要求34所述的分离的RGN多肽，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

37.如权利要求34至36中任一项所述的分离的RGN多肽，其中所述目标DNA序列位于为单链的所述DNA分子的区域内。

38.如权利要求37所述的分离的RGN多肽，其中所述RGN多肽能够在结合时切割所述目标DNA序列。

39.如权利要求34至36中任一项所述的分离的RGN多肽，其中所述目标DNA序列位于为双链的所述DNA分子的区域内。

40.如权利要求39所述的分离的RGN多肽，其中所述RGN多肽能够在结合时切割所述目标DNA序列。

41.如权利要求40所述的分离的RGN多肽，其中通过所述RGN多肽的切割产生双链断裂。

42.如权利要求40所述的分离的RGN多肽，其中通过所述RGN多肽的切割产生单链断裂。

43.如权利要求39至42中任一项所述的分离的RGN多肽，其中所述RGN多肽与碱基编辑多肽可操作地融合。

44.如权利要求43所述的分离的RGN多肽，其中所述碱基编辑多肽为脱氨酶。

45.如权利要求34至44中任一项所述的分离的RGN多肽，其中所述目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

46.如权利要求34至45中任一项所述的分离的RGN多肽，其中所述RGN多肽包含一种或多种核定位信号。

47.一种用于结合DNA分子的目标DNA序列的系统，所述系统包含：

a)能够与所述目标DNA分子杂交的一种或多种指导RNA，或包含编码所述一种或多种指导RNA(gRNA)的一种或多种核苷酸序列的一种或多种多核苷酸；和

b)包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的RNA指导核酸酶(RGN)多肽，或包含编码所述RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸；

其中编码所述一种或多种指导RNA的至少一个所述核苷酸序列及编码所述RGN多肽的所述核苷酸序列可操作地连接至与所述核苷酸序列异源的启动子；且

其中所述一种或多种指导RNA能够与所述RGN多肽形成复合物，以便将所述RGN多肽导向至与所述DNA分子的所述目标DNA序列结合。

48.一种用于结合DNA分子的目标DNA序列的系统，所述系统包含：

b)包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的RNA指导核酸酶(RGN)多肽；

其中所述一种或多种指导RNA能够与所述目标DNA序列杂交，且

49.如权利要求48所述的系统，其中编码所述一种或多种指导RNA的至少一个所述核苷酸序列可操作地连接至与所述核苷酸序列异源的启动子。

50.如权利要求47至49中任一项所述的系统，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

51.如权利要求47至49中任一项所述的系统，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

52.如权利要求47至51中任一项所述的系统，其中未发现所述RGN多肽与所述一种或多种指导RNA在自然界中彼此复合。

53.如权利要求47至51中任一项所述的系统，其中所述目标DNA序列为真核目标DNA序列。

54.如权利要求47至53中任一项所述的系统，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列且所述一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列。

55.如权利要求47至53中任一项所述的系统，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列且所述一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

56.如权利要求47至53中任一项所述的系统，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列且所述一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPRRNA包含与SEQ ID NO:116具有100％序列同一性的CRISPR重复序列。

57.如权利要求47至53中任一项所述的系统，其中所述一种或多种指导RNA包含tracrRNA。

58.如权利要求57所述的系统，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

59.如权利要求57所述的系统，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

60.如权利要求57所述的系统，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有100％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有100％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有100％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有100％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有100％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有100％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述一种或多种指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的氨基酸序列。

61.如权利要求57至60中任一项所述的系统，其中所述一种或多种指导RNA为单指导RNA(sgRNA)。

62.如权利要求57至60中任一项所述的系统，其中所述一种或多种指导RNA为双指导RNA。

63.如权利要求47至62中任一项所述的系统，其中所述目标DNA序列位于细胞内。

64.如权利要求63所述的系统，其中所述细胞为真核细胞。

65.如权利要求64所述的系统，其中所述真核细胞为植物细胞。

66.如权利要求64所述的系统，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。

67.如权利要求64所述的系统，其中所述真核细胞为昆虫细胞。

68.如权利要求63所述的系统，其中所述细胞为原核细胞。

69.如权利要求47至68中任一项所述的系统，其中所述目标DNA序列位于为单链的所述DNA分子的区域内。

70.如权利要求69所述的系统，其中当被转录时，所述一种或多种指导RNA能够与所述目标DNA序列杂交，且所述指导RNA能够与所述RGN多肽形成复合物，以导向所述目标DNA序列的切割。

71.如权利要求47至68中任一项所述的系统，其中所述目标DNA序列位于为双链的所述DNA分子的区域内。

72.如权利要求71所述的系统，其中当被转录时，所述一种或多种指导RNA能够与所述目标DNA序列杂交，且所述指导RNA能够与所述RGN多肽形成复合物，以导向所述目标DNA序列的切割。

73.如权利要求72所述的系统，其中所述RGN多肽能够产生双链断裂。

74.如权利要求72所述的系统，其中所述RGN多肽能够产生单链断裂。

75.如权利要求71至74中任一项所述的系统，其中所述RGN多肽可操作地连接至碱基编辑多肽。

76.如权利要求75所述的系统，其中所述碱基编辑多肽为脱氨酶。

77.如权利要求71至76中任一项所述的系统，其中所述目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

78.如权利要求47至77中任一项所述的系统，其中所述RGN多肽包含一种或多种核定位信号。

79.如权利要求47至78中任一项所述的系统，其中所述RGN多肽针对在真核细胞中的表达而被密码子优化。

80.如权利要求47至79中任一项所述的系统，其中包含编码所述一种或多种指导RNA的所述核苷酸序列的多核苷酸及包含编码RGN多肽的所述核苷酸序列的所述多核苷酸位于一个载体上。

81.如权利要求47至80中任一项所述的系统，其中所述系统还包含一种或多种供体多核苷酸或包含编码所述一种或多种供体多核苷酸的一种或多种核苷酸序列的一种或多种多核苷酸。

82.一种药物组合物，包含如权利要求1至14中任一项所述的核酸分子、如权利要求15至25中任一项所述的载体、如权利要求26所述的细胞、如权利要求34至46中任一项所述的分离的RGN多肽、或如权利要求47至81中任一项所述的系统和药学上可接受的载剂。

83.一种结合DNA分子的目标DNA序列的方法，包含将如权利要求47至81中任一项所述的系统递送至所述目标DNA序列或包含所述目标DNA序列的细胞。

84.如权利要求83所述的方法，其中所述RGN多肽或所述指导RNA还包含可检测标记，从而允许对所述目标DNA序列的检测。

85.如权利要求83所述的方法，其中所述指导RNA或所述RGN多肽还包含表达调控子，从而调控所述目标DNA序列的或受所述目标DNA序列的转录控制下的基因的表达。

86.一种切割DNA分子的目标DNA序列的方法，包含将如权利要求47至81中任一项所述的系统递送至所述目标DNA序列或包含所述目标DNA序列的细胞。

87.如权利要求86所述的方法，其中经修饰的目标DNA序列包含异源DNA在所述目标DNA序列内的插入。

88.如权利要求86所述的方法，其中经修饰的目标DNA序列包含至少一个核苷酸自所述目标DNA序列的缺失。

89.如权利要求86所述的方法，其中经修饰的目标DNA序列包含所述目标DNA序列中的至少一个核苷酸的突变。

90.一种用于结合DNA分子的目标DNA序列的方法，所述方法包括：

a)通过组合以下，以在体外将RNA指导核酸酶(RGN)核糖核苷酸复合物在适合形成所述RGN核糖核苷酸复合物的条件下进行组装：

i)能够与所述目标DNA序列杂交的一种或多种指导RNA；和

ii)RGN多肽，所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

b)使所述目标DNA序列或包含所述目标DNA序列的细胞与所述在体外组装的RGN核糖核苷酸复合物接触；

其中所述一种或多种指导RNA与所述目标DNA序列杂交，从而将所述RGN多肽导向至与所述目标DNA序列结合。

91.如权利要求90所述的方法，其中所述目标DNA序列位于为单链的所述DNA分子的区域内。

92.如权利要求90所述的方法，其中所述目标DNA序列位于为双链的所述DNA分子的区域内。

93.如权利要求92所述的方法，其中所述目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

94.如权利要求90至93中任一项所述的方法，其中所述RGN多肽或所述指导RNA还包含可检测标记，从而允许对所述目标DNA序列的检测。

95.如权利要求90至93中任一项所述的方法，其中所述指导RNA或所述RGN多肽还包含表达调控子，从而允许对所述目标DNA序列的表达的调控。

96.一种用于切割和/或修饰DNA分子的目标DNA序列的方法，包含使所述DNA分子与以下接触：

a)RNA指导核酸酶(RGN)多肽，其中所述RGN包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

b)能够将(a)的所述RGN靶向至所述目标DNA序列的一种或多种指导RNA；

其中所述一种或多种指导RNA与所述目标DNA序列杂交，从而将所述RGN多肽导向至与所述目标DNA序列结合，并且发生所述目标DNA序列的切割和/或修饰。

97.如权利要求96所述的方法，其中所述目标DNA序列位于为单链的所述DNA分子的区域内。

98.如权利要求96所述的方法，其中所述目标DNA序列位于为双链的所述DNA分子的区域内。

99.如权利要求98所述的方法，其中通过所述RGN多肽的切割产生双链断裂。

100.如权利要求98所述的方法，其中通过所述RGN多肽的切割产生单链断裂。

101.如权利要求98至100中任一项所述的方法，其中所述RGN多肽可操作地连接至碱基编辑多肽。

102.如权利要求101所述的方法，其中所述碱基编辑多肽为脱氨酶。

103.如权利要求98至102中任一项所述的方法，其中所述目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

104.如权利要求96至103中任一项所述的方法，其中经修饰的目标DNA序列包含异源DNA在所述目标DNA序列内的插入。

105.如权利要求96至103中任一项所述的方法，其中经修饰的目标DNA序列包含至少一个核苷酸自所述目标DNA序列的缺失。

106.如权利要求96至103中任一项所述的方法，其中经修饰的目标DNA序列包含所述目标DNA序列中的至少一个核苷酸的突变。

107.如权利要求90至106中任一项所述的方法，其中所述RGN包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

108.如权利要求90至106中任一项所述的方法，其中所述RGN包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

109.如权利要求90至108中任一项所述的方法，其中未发现所述RGN多肽与所述一种或多种指导RNA在自然界中彼此复合。

110.如权利要求90至109中任一项所述的方法，其中所述目标DNA序列为真核目标DNA序列。

111.如权利要求90至110中任一项所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列且所述一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列。

112.如权利要求90至110中任一项所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列且所述一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

113.如权利要求90至110中任一项所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列且所述一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有100％序列同一性的CRISPR重复序列。

114.如权利要求90至110中任一项所述的方法，其中所述一种或多种指导RNA包含tracrRNA。

115.如权利要求114所述的方法，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

116.如权利要求114所述的方法，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

117.如权利要求114所述的方法，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

118.如权利要求114至117中任一项所述的方法，其中所述一种或多种指导RNA为单指导RNA(sgRNA)。

119.如权利要求114至117中任一项所述的方法，其中所述一种或多种指导RNA为双指导RNA。

120.如权利要求83至119中任一项所述的方法，其中所述目标DNA序列位于细胞内。

121.如权利要求120所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。

122.如权利要求121所述的方法，其中所述真核细胞为植物细胞。

123.如权利要求121所述的方法，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。

124.如权利要求121所述的方法，其中所述真核细胞为昆虫细胞。

125.如权利要求120所述的方法，其中所述细胞为原核细胞。

126.一种包含如权利要求96至119中任一项所述的方法修饰的目标DNA序列的细胞。

127.如权利要求126所述的细胞，其中所述细胞为真核细胞。

128.如权利要求127所述的细胞，其中所述真核细胞为植物细胞。

129.一种包含如权利要求128所述的细胞的植物。

130.一种包含如权利要求128所述的细胞的种子。

131.如权利要求127所述的细胞，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。

132.如权利要求131所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。

133.如权利要求132所述的细胞，其中所述人细胞为免疫细胞。

134.如权利要求133所述的细胞，其中所述人细胞为干细胞。

135.如权利要求134所述的细胞，其中所述干细胞为经诱导的多能干细胞。

136.如权利要求127所述的细胞，其中所述真核细胞为昆虫细胞。

137.如权利要求126所述的细胞，其中所述细胞为原核细胞。

138.一种包含实施方案127及131-135中任一项所述的细胞和药学上可接受的载剂的药物组合物。

139.一种用于检测样本中的DNA分子的目标DNA序列的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的RNA指导核酸酶(RGN)多肽或包含编码所述RGN多肽的核苷酸序列的多核苷酸，其中当与能够与所述目标DNA序列杂交的指导RNA结合时，所述RGN多肽能够以RNA指导的序列特异性方式结合及切割DNA分子的所述目标DNA序列；

b)所述指导RNA或包含编码所述指导RNA的核苷酸序列的多核苷酸；和

c)不与所述指导RNA杂交的检测单链DNA(ssDNA)。

140.如权利要求139所述的试剂盒，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

141.如权利要求139所述的试剂盒，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

142.如权利要求139至141中任一项所述的试剂盒，其中编码所述指导RNA的至少一个所述核苷酸序列及编码所述RGN多肽的所述核苷酸序列可操作地连接至与所述核苷酸序列异源的启动子。

143.如权利要求139至142中任一项所述的试剂盒，其中未发现所述RGN多肽与所述一种或多种指导RNA在自然界中彼此复合。

144.如权利要求139至142中任一项所述的试剂盒，其中所述目标DNA序列为真核目标DNA序列。

145.如权利要求139至144中任一项所述的试剂盒，其中所述检测ssDNA包含荧光团/淬灭剂对。

146.如权利要求139至144中任一项所述的试剂盒，其中所述检测ssDNA包含荧光共振能量转移(FRET)对。

147.如权利要求139至146中任一项所述的试剂盒，其中所述RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，且所述一种或多种指导RNA包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列。

148.如权利要求139至146中任一项所述的试剂盒，其中所述RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，且所述一种或多种指导RNA包含CRISPRRNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

149.如权利要求139至146中任一项所述的试剂盒，其中所述RGN多肽包含与SEQ IDNO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列，且所述一种或多种指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有100％序列同一性的CRISPR重复序列。

150.如权利要求139至146中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种指导RNA包含tracrRNA。

151.如权利要求150所述的试剂盒，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

152.如权利要求150所述的试剂盒，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

153.如权利要求150所述的试剂盒，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

154.如权利要求150至153中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种指导RNA为单指导RNA(sgRNA)。

155.如权利要求150至153中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种指导RNA为双指导RNA。

156.如权利要求139至155中任一项所述的试剂盒，其中所述目标DNA序列位于为单链的所述DNA分子的区域内。

157.如权利要求139至155中任一项所述的试剂盒，其中所述目标DNA序列位于为双链的所述DNA分子的区域内。

158.如权利要求157所述的试剂盒，其中通过所述RGN多肽的切割产生双链断裂。

159.如权利要求157所述的试剂盒，其中通过所述RGN多肽的切割产生单链断裂。

160.如权利要求157至159中任一项所述的试剂盒，其中所述目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

161.一种检测样本中的DNA分子的目标DNA序列的方法，所述方法包括：

a)使所述样本与以下接触：

i)包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的RNA指导核酸酶(RGN)多肽，其中当与能够与所述目标DNA序列杂交的指导RNA结合时，所述RGN多肽能够以RNA指导的序列特异性方式结合及切割DNA分子的所述目标DNA序列；

ii)所述指导RNA；和

iii)不与所述指导RNA杂交的检测单链DNA(ssDNA)；和

b)测量通过所述RGN切割所述检测ssDNA产生的可检测信号，从而检测所述目标DNA序列。

162.如权利要求161所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

163.如权利要求161所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

164.如权利要求161至163中任一项所述的方法，其中所述样本包含来自细胞裂解物的DNA分子。

165.如权利要求161至163中任一项所述的方法，其中所述样本包含细胞。

166.如权利要求165所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。

167.如权利要求161至163中任一项所述的方法，其中包含所述目标DNA序列的所述DNA分子通过存在于包含RNA的样本中的RNA模板分子的逆转录产生。

168.如权利要求167所述的方法，其中所述RNA模板分子为RNA病毒。

169.如权利要求168所述的方法，其中所述RNA病毒为冠状病毒。

170.如权利要求169所述的方法，其中所述冠状病毒为蝙蝠SARS样冠状病毒、SARS-CoV或SARS-CoV-2。

171.如权利要求167至170中任一项所述的方法，其中包括RNA的样本来源于包含细胞的样本。

172.如权利要求161至171中任一项所述的方法，其中所述检测ssDNA包含荧光团/淬灭剂对。

173.如权利要求161至171中任一项所述的方法，其中所述检测ssDNA包括荧光共振能量转移(FRET)对。

174.如权利要求161至173中任一项所述的方法，其中所述方法还包含在步骤a)的接触之前或与步骤a)的接触一起扩增所述样本中的核酸。

175.一种切割单链DNA(ssDNA)的方法，所述方法包括使核酸群体与以下接触，其中所述群体包含DNA分子，所述DNA分子包含目标DNA序列及多个非目标ssDNA：

a)包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的RNA指导核酸酶(RGN)多肽，其中当与能够与所述目标DNA序列杂交的指导RNA结合时，所述RGN多肽能够以RNA指导的序列特异性方式结合及切割所述目标DNA序列；和

b)所述指导RNA；

其中所述RGN多肽切割所述多个非目标ssDNA。

176.如权利要求175所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

177.如权利要求175所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2、4、1、3和5至109中任一个具有100％序列同一性的氨基酸序列。

178.如权利要求175至177中任一项所述的方法，其中所述核酸群体在细胞裂解物内。

179.如权利要求175至178中任一项所述的方法，其中包含所述目标DNA序列的所述DNA分子通过RNA模板分子的逆转录产生。

180.如权利要求161至179中任一项所述的方法，其中未发现所述RGN多肽与所述指导RNA在自然界中彼此复合。

181.如权利要求161至180中任一项所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列且所述指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPRRNA包含与SEQ ID NO:116具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列。

182.如权利要求161至180中任一项所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列且所述指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPRRNA包含与SEQ ID NO:116具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列。

183.如权利要求161至180中任一项所述的方法，其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:11具有100％序列同一性的氨基酸序列且所述指导RNA包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:116具有100％序列同一性的CRISPR重复序列。

184.如权利要求161至180中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含tracrRNA。

185.如权利要求184所述的方法，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少90％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

186.如权利要求184所述的方法，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有至少95％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

187.如权利要求184所述的方法，其中所述tracrRNA选自以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:121具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:111具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:2具有100％序列同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:123具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:113具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:4具有100％序列同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO:120具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:110具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:1具有100％序列同一性的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:122具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:112具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO:124具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:114具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:5具有100％序列同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO:125具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:115具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的氨基酸序列；

g)与SEQ ID NO:126具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:117具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:12具有100％序列同一性的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO:127具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:118具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:13具有100％序列同一性的氨基酸序列；和

i)与SEQ ID NO:128具有100％序列同一性的tracrRNA，其中所述指导RNA还包含CRISPR RNA，所述CRISPR RNA包含与SEQ ID NO:119具有100％序列同一性的CRISPR重复序列，且其中所述RGN多肽包含与SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的氨基酸序列。

188.如权利要求184至187中任一项所述的方法，其中所述指导RNA为单指导RNA(sgRNA)。

189.如权利要求184至187中任一项所述的方法，其中所述指导RNA为双指导RNA。

190.如权利要求161至189中任一项所述的方法，其中所述目标DNA序列位于为单链的所述DNA分子的区域内。

191.如权利要求161至189中任一项所述的方法，其中所述目标DNA序列位于为双链的所述DNA分子的区域内。

192.如权利要求191所述的方法，其中所述目标DNA序列通过所述RGN多肽的切割产生双链断裂。

193.如权利要求191所述的方法，其中所述目标DNA序列通过所述RGN多肽的切割产生单链断裂。

194.如权利要求191至193中任一项所述的方法，其中所述目标DNA序列位于与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的位置。

195.一种治疗疾病的方法，所述方法包括对需要治疗的个体施用有效量的实施方案82或138的药物组合物。

196.如权利要求195所述的方法，其中所述疾病与因果突变关联，且所述有效量的所述药物组合物校正所述因果突变。