CN115078739A - 一种检测载脂蛋白a1的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测试剂技术领域，特别是涉及一种检测载脂蛋白A1的试剂盒及其应用。Gemini表面活性剂对载脂蛋白A1抗体的活性位点具有较强的选择性，可以使载脂蛋白A1抗体的活性位点最大程度地暴露出来，从而提高了检测载脂蛋白A1试剂中抗体的活性及专一性，利用Gemini表面活性剂制备的试剂盒可以解决市面上检测结果出现假阳性或者测值偏高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂技术领域，特别是涉及一种检测载脂蛋白A1的试剂盒及其应用。
背景技术
载脂蛋白A1是高密度脂蛋白的主要结构蛋白，可以将细胞中的胆固醇运送至肝脏处理，减慢和阻止了动脉粥样硬化的发生和发展。可有效降低糖尿病、动脉粥样硬化、高脂蛋白血症、急慢性乙肝、酒精肝、脂肪肝、肝硬化、肝癌等疾病风险。
目前检测载脂蛋白A1的方法主要有散射免疫法、透射免疫比浊法等。其中透射免疫比浊法因其较高的灵敏度、良好的特异性、较宽的线性范围受到了广泛的关注。但目前市场上大部分载脂蛋白A1试剂容易受到干扰出现假阳性，影响检测结果，延误治疗。假阳性的出现主要是因为人血清中含有APOA1-APOC3-APOA4-APOA5，这四种抗原基因簇位于11号染色体q23-q24 区域，由同一始祖基因进化而来，具有高度同源性，进而会产生交叉反应，导致假阳性或者测值偏高情况。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种检测载脂蛋白A1的试剂盒及其应用。本发明利用Gemini表面活性剂可以提高载脂蛋白A1抗体活性和专一性的作用，解决了市面上检测结果出现假阳性或者测值偏高的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了Gemini表面活性剂在提高载脂蛋白A1抗体活性和/或专一性中的应用。
本发明还提供了一种检测载脂蛋白A1的试剂盒，包括独立包装的R1试剂和R2试剂，所述R2试剂为母液和载脂蛋白A1抗体的混合试剂；所述母液的组成和R1试剂相同；
所述R1试剂包括缓冲液、增敏剂、电解质、防腐剂和活性剂；
所述活性剂为Gemini表面活性剂或Gemini表面活性剂和其他表面活性剂的混合物；
当活性剂为Gemini表面活性剂时，所述Gemini表面活性剂在R1试剂中的质量含量为0.05%~0.10%；
当活性剂为Gemini表面活性剂和其他表面活性剂的混合物时，所述Gemini表面活性剂在R1试剂中的质量含量为0.02%~0.04%，所述其他表面活性剂在R1试剂中的质量含量为1%~2%。
优选的，所述R1试剂中还包括稳定剂；所述稳定剂包括EDTA-2Na和/或甘油。
优选的，所述EDTA-2Na在R1试剂中的质量含量为0.02%~0.04%；所述甘油在R1试剂中的质量含量为7%~8%。
优选的，所述缓冲液包括：HEPES缓冲液、MES缓冲液或TRIS缓冲液；所述缓冲液的pH值为6.5~9。
优选的，所述增敏剂包括聚乙二醇6000、聚乙二醇20000和聚乙二醇35000中的一种或多种；所述增敏剂在R1试剂中的质量含量为2%~5%。
优选的，所述电解质包括氯化钠和/或氯化钾；所述电解质在R1试剂中的质量含量为0.6%~0.8%。
优选的，所述防腐剂包括叠氮钠和/或proclin300；所述防腐剂在母液中的质量含量为0.1%~0.2%。
优选的，所述载脂蛋白A1抗体在R2试剂中的体积百分含量为25%~40%。
本发明还提供了上述试剂盒在检测载脂蛋白A1中的应用。
有益效果：
本发明提供了Gemini表面活性剂在提高载脂蛋白A1抗体活性和/或专一性中的应用。Gemini表面活性剂对载脂蛋白A1抗体的活性位点具有较强的选择性，可以使载脂蛋白A1抗体的活性位点最大程度地暴露出来，从而提高了检测载脂蛋白A1试剂中抗体的活性及专一性，利用Gemini表面活性剂制备的试剂盒可以解决市面上检测结果出现假阳性或者测值偏高的问题。
具体实施方式
本发明提供了Gemini表面活性剂在提高载脂蛋白A1抗体活性和/或专一性中的应用。Gemini表面活性剂对载脂蛋白A1抗体的活性位点具有较强的选择性，可以使载脂蛋白A1抗体的活性位点最大程度地暴露出来，从而提高了检测载脂蛋白A1试剂中抗体的活性及专一性。
本发明还提供了一种检测载脂蛋白A1的试剂盒，包括独立包装的R1试剂和R2试剂，所述R2试剂母液和载脂蛋白A1抗体的混合试剂；所述母液的组成和R1试剂相同；
所述R1试剂包括缓冲液、增敏剂、电解质、防腐剂和活性剂。
如无特殊说明，本发明对所述试剂盒中的各组分来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明所述R1试剂包括缓冲液。在本发明中，所述缓冲液优选包括：HEPES缓冲液、MES缓冲液或TRIS缓冲液，更优选为TRIS缓冲液；所述缓冲液的浓度优选为50~150mmol/kg，进一步优选为70~130mmol/kg，更优选为100mmol/kg；所述缓冲液的pH值优选为6.5~9，进一步优选为7.5~8.5，更优选为8.0。
本发明所述R1试剂包括增敏剂。在本发明中，所述增敏剂在R1试剂中的质量百分含量优选为2%~5%，进一步优选为3%~5%，更优选为5%。在本发明中，所述增敏剂优选包括聚乙二醇6000、聚乙二醇20000和聚乙二醇35000中的一种或多种，更优选为聚乙二醇6000。本发明所述增敏剂有助于试剂提升反应灵敏度及线性。
本发明所述R1试剂包括电解质。在本发明中，所述电解质在R1试剂中的质量百分含量优选为0.6%~0.8%，更优选为0.8%。在本发明中，所述电解质优选包括氯化钠和/或氯化钾，更优选为氯化钠。本发明所述电解质有助于试剂提供抗原抗体反应的生理条件。
本发明所述R1试剂包括防腐剂。在本发明中，所述防腐剂在R1试剂中的质量含量优选为0.1%~0.2%，更优选为0.1%。在本发明中，所述防腐剂优选包括叠氮钠和/或proclin300，更优选为叠氮钠。本发明所述防腐剂有助于试剂长期保存，避免微生物繁殖从而影响试剂的性能。
本发明所述R1试剂包括活性剂。本发明所述活性剂为Gemini表面活性剂或Gemini表面活性剂和其他表面活性剂的混合物；
当活性剂为Gemini表面活性剂时，所述Gemini表面活性剂在R1试剂中的质量含量为0.05%~0.10%，优选为0.05%；
当活性剂为Gemini表面活性剂和其他表面活性剂的混合物时，所述Gemini表面活性剂在R1试剂中的质量含量为0.02%~0.04%，优选为0.02%；所述其他表面活性剂在R1试剂中的质量含量为1%~2%，优选为1%。
在本发明中，所述其他表面活性剂优选包括吐温20和/或曲拉通x-100，更优选为吐温20。
Gemini表面活性剂可以提高检测载脂蛋白A1试剂中抗体的活性及专一性，从而解决了市面上检测结果出现假阳性或者测值偏高的问题；考虑到Gemini表面活性剂的成本较高，本发明通过适量Gemini表面活性剂和其他价格较低的表面活性剂复配使用，可以在保证检测准确性的条件下，降低成本。
本发明所述R1试剂中优选还包括稳定剂。在本发明中，所述稳定剂优选包括EDTA-2Na和/或甘油；更优选为EDTA-2Na和甘油的混合物。在本发明中，所述EDTA-2Na在R1试剂中的质量含量优选为0.02%~0.04%，更优选为0.02%；所述甘油在R1试剂中的质量含量为7%~8%，更优选为8%。
本发明通过在R1试剂中添加适宜的试剂作为稳定剂，可以增加粘度、减少分子间的碰撞，有效防止蛋白质聚集而发生沉淀，无需进行离心即可达到消除沉淀的效果，解决了目前检测试剂容易出现不同程度的沉淀析出，从而影响使用效果的问题。
本发明所述R2试剂为母液和载脂蛋白A1抗体的混合试剂；所述母液的组成和R1试剂相同，在此不再赘述。在本发明中，所述载脂蛋白A1抗体在R2试剂中的体积百分含量优选为25%~40%，进一步优选为30%~38%，更优选为35%。
在本发明中，所述试剂盒中独立包装的R1试剂和R2试剂的质量比优选为5：1。
本发明通过使用R1溶液直接作为R2溶液的稀释母液，可以极大的简化生产操作步骤，对生产的量化具有重要意义。
本发明优选还提供了上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
将R1试剂的各个组分混合，调节pH，并用0.4μm滤膜过滤处理，得到所述R1试剂；
将部分R1试剂和载脂蛋白A1抗体混合，得到所述R2试剂；
将所述R1试剂和所述R2试剂按比例分装，得到所述试剂盒。
在本发明中，所述分步混合顺序没有特殊要求，仅需使所用到的物料完全溶解即可。在本发明中，所述R1试剂的各个组分混合的方法优选包括：将水与缓冲液的制备原料混合，得到所述缓冲液；
将所述缓冲液与增敏剂混合，得到第一混合液；
将所述第一混合液和电解质混合，得到第二混合液；
将所述第二混合液和防腐剂混合，得到第三混合液；
将所述第三混合液和活性剂混合，得到第四混合液；
将所述第四混合液和稳定剂混合，得到初级R1试剂。
在本发明中，所述水优选包括纯化水。
在本发明中，所述部分R1试剂与制备得到的R1试剂的质量比优选为0.13:1.13。
本发明提供的试剂盒与现有技术相比，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点，有较好的临床前景。本试剂盒制备简单，易于工业化生产，可高效检测血液中APOA1的含量。
本发明还提供了上述试剂盒在检测载脂蛋白A1中的应用。
本发明所述试剂盒检测载脂蛋白A1可以是以非诊断为目的，为了获得一个载脂蛋白A1的中间值。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种检测载脂蛋白A1的试剂盒及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种检测载脂蛋白A1的试剂盒，所述试剂盒由以下方法制备得到：
试剂R1的制备：
取800g的纯化水，然后依次加入90.4g甘油、0.226g EDTA-2Na、13.6888g TRIS、56.5g PEG6000、0.226g Gemini表面活性剂、9.04g NaCl、1.13g 叠氮钠、1.13g吐温20，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值为8.0，用纯化水定重至1.13kg，并用0.40μm滤膜过滤处理；
试剂R2的制备：
取130g的R1试剂，加入70g APOA1抗体，搅拌至均匀；
组成试剂盒：将上述制备的R1试剂和R2试剂按质量比R1：R2=5:1分装入瓶，组成试剂盒，试剂盒规格：R1为50g/每瓶*4，R2为20g/每瓶*2。
实施例2
一种与实施例1相似的试剂盒，区别在于，试剂R1中未添加90.4g甘油和0.226gEDTA-2Na。
实施例3
一种与实施例1相似的试剂盒，区别在于，Gemini表面活性剂的用量替换为0.452g。
实施例4
一种与实施例1相似的试剂盒，区别在于，试剂R1中未添加1.13g吐温20，且Gemini表面活性剂的用量替换为0.565g。
实施例5
一种与实施例1相似的试剂盒，区别在于，试剂R1中未添加90.4g甘油。
实施例6
一种与实施例1相似的试剂盒，区别在于，试剂R1中未添加0.226g EDTA-2Na。
实施例7
一种与实施例1相似的试剂盒，区别在于，吐温20替换为曲拉通x-100。
对比例1
一种与实施例1相似的试剂盒，区别在于，试剂R1中未添加Gemini表面活性剂。
对比例2
一种与实施例2相似的试剂盒，区别在于，试剂R1中未添加Gemini表面活性剂。
对比例3
一种与实施例1相似的试剂盒，区别在于，Gemini表面活性剂的用量替换为0.1g。
对比例4
一种与实施例1相似的试剂盒，区别在于，Gemini表面活性剂的用量替换为20g。
应用例1
验证Gemini表面活性剂降低试剂出现假阳性的作用
收取医院金标准测定的临床样本，利用AU480全自动生化分析仪结合实施例1~7和对比例1~4制备的试剂盒，测定临床样本中载脂蛋白A1的浓度，检测参数见表1，检测结果见表2。
表1 检测参数
注：表中s为样本加样量。
表2 不同试剂盒的检测结果（mg/dL）
注：表中样本浓度值为金标准测定的临床样本中载脂蛋白A1的浓度值。
由表2可知：添加Gemini表面活性剂的实施例与金标准的样本比对结果基本一致，且在测试高值样本时，比不添加的实施例的检测结果要低，说明适宜浓度的Gemini表面活性剂能降低其他同源载脂蛋白杂抗的干扰，提高准确度。且由实施例1、对比例3、和对比例4的数据说明，Gemini表面活性剂在试剂R1中浓度不宜过高或过低，过低的浓度使得抗体和抗原的结合力降低，从而使样本测值偏低；过高的浓度会影响人类血清中与APOA1抗原具有同源性基因簇APOA2-APOC3-APOA4-APOA5等的抗原抗体结合位点活性，从而与APOA1抗体错误结合，进而导致样本测值偏高。
应用例2
将实施例1~7和对比例1~4制备的试剂盒在2~8℃下放置，2、5、8和12月后观察试剂R2是否有沉淀现象，结果见表3。
表3 不同试剂盒在不同放置时间下的结果
实验数据表明：复合稳定剂的加入对消除试剂沉淀有积极的效果。
由表3可知，添加适宜的稳定剂相对于未添加稳定剂的试剂R2，可以避免沉淀的析出，试剂的稳定性更好。
应用例3
实施例1制备的试剂盒性能评价
外观评估
在自然光线下目视检查，R1为无色澄清溶液，R2为无色澄清或微黄色溶液。
空白吸光度评估
以蒸馏水为样本进行检测，测试后所得试剂空白吸光度为0.31。
线性范围评估（检测方法同应用例1）
用0.9%NaCl将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释成至少5个浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。对每一浓度的样本重复测试3次，取测试的平均值。结果见表4。
表4 线性范围评估结果
由表4可知，本发明提供的试剂盒的最高检测范围可达290mg/dL，R2≥0.99。
重复性评估（检测方法同应用例1）
使用3个不同浓度的质控品，每个浓度测15次，评估试剂盒的重复性。秸秆见表5。
表5 重复性评估结果
由表5可知，试剂盒的批内重复性分别为1.27%、0.61%、1.55%.
准确度评估（检测方法同应用例1）
用市售朗道脂类质控的质控品作为样本进行检测，每个样本测试3次，测试结果如下表6。
表6 准确的评估结果
由表6可知，试剂盒对不同质控品的检测偏差分别为-0.56%、0.55%和-0.32%，均在允许的范围内。
综上所述，本发明的试剂盒性能优异，配制简单，利于企业量化生产，具备切实的可推广普及性。本发明以R1直接作为R2的稀释母液，且使用复合稳定剂避免了离心过滤，极大地简化了配制生产步骤。在R1和R2均添加Gemini表面活性剂，可在用量极少的情况下，最大程度地暴露出载脂蛋白A1抗体的活性位点，降低其他载脂蛋白同源杂抗的干扰，有效降低试剂的假阳性，提高了试剂检测的准确度。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.Gemini表面活性剂在提高载脂蛋白A1抗体活性和/或专一性中的应用。
2.一种检测载脂蛋白A1的试剂盒，包括独立包装的R1试剂和R2试剂，其特征在于，所述R2试剂为母液和载脂蛋白A1抗体的混合试剂；所述母液的组成和R1试剂相同；
所述R1试剂包括缓冲液、增敏剂、电解质、防腐剂和活性剂；
所述活性剂为Gemini表面活性剂或Gemini表面活性剂和其他表面活性剂的混合物；
当活性剂为Gemini表面活性剂时，所述Gemini表面活性剂在R1试剂中的质量含量为0.05%~0.10%；
当活性剂为Gemini表面活性剂和其他表面活性剂的混合物时，所述Gemini表面活性剂在R1试剂中的质量含量为0.02%~0.04%，所述其他表面活性剂在R1试剂中的质量含量为1%~2%。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中还包括稳定剂；所述稳定剂包括EDTA-2Na和/或甘油。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述EDTA-2Na在R1试剂中的质量含量为0.02%~0.04%；所述甘油在R1试剂中的质量含量为7%~8%。
5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括：HEPES缓冲液、MES缓冲液或TRIS缓冲液；所述缓冲液的pH值为6.5~9。
6.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述增敏剂包括聚乙二醇6000、聚乙二醇20000和聚乙二醇35000中的一种或多种；所述增敏剂在R1试剂中的质量含量为2%~5%。
7.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述电解质包括氯化钠和/或氯化钾；所述电解质在R1试剂中的质量含量为0.6%~0.8%。
8.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂包括叠氮钠和/或proclin300；所述防腐剂在母液中的质量含量为0.1%~0.2%。
9.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述载脂蛋白A1抗体在R2试剂中的体积百分含量为25%~40%。
10.权利要求2~9任一项所述试剂盒在检测载脂蛋白A1中的应用。
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