CN114965617A

CN114965617A - 一种识别电子受体导致的电化学活性微生物检测毒害污染物假阳性的方法

Info

Publication number: CN114965617A
Application number: CN202210629882.2A
Authority: CN
Inventors: 刘红; 曹波; 易越
Original assignee: Beihang University
Current assignee: Beihang University
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-06-06
Also published as: CN114965617B

Abstract

本发明涉及一种识别电子受体导致的电化学活性微生物检测毒害污染物假阳性的方法。本方法通过设计两步检测法，利用生物电化学系统输出电信号抑制率和双向电子传递能力的电化学活性微生物产生反向电流，即可实现识别电子受体导致的水质生物毒性检测报警的假阳性问题。本发明建立的两步检测流程既具有生物电化学系统在水质检测中快速高效、操作方便和灵敏度高等优势，同时排除了检测中可能遇到的电子受体造成的假阳性报警问题。此外两步检测流程中的电化学系统运行相对独立，确保检测结果准确性的同时，节省检测成本，提高检测效率。

Description

一种识别电子受体导致的电化学活性微生物检测毒害污染物假阳性的方法

技术领域

本发明涉及水质检测领域，具体涉及通过电化学活性微生物进行水质生物毒性假阳性检测。

背景技术

水质检测对整个水环境保护、水污染控制以及维护水环境健康方面起着至关重要的作用。对饮用水来说，水中的有害细菌、重金属农药等会引起各种病症；对工业用水来说，水中的矿物杂质、酸碱离子等会影响产品质量或损害容器及管道，因此水质检测是关乎民生大事，不可小觑。传统的水质检测方法如化学热解法、原子荧光检测法、液相色谱法等虽然具有检测精度高、稳定性好、可重复性强等优势，但同时也存在操作步骤复杂、反应条件危险、检测时间长、技术要求高且容易造成二次污染等问题。而基于生物传感器的水质生物毒性检测技术因其分析速度快，检测范围广且可同时分析多种污染物的综合毒性而越来越受到重视，其已经成为确保供水和生态环境安全的基本措施之一。

水质生物毒性检测是基于生物毒理学发展起来的检测方法，水生生物长期生活在水环境中，其健康状态可反映水环境的污染程度。在一定条件下，水生生物生理行为的改变可以作为评估水环境安全与否的重要指标。如鱼类、蚤类、藻类和微生物等，通常被选做受试生物，通过其在水样中运动、呼吸活动和生理代谢的变化来评估水质毒性。微生物因其种类多、易培养、个体小和繁殖快等优势，是目前国际上研究最多的水质生物毒性检测受体。其中发光细菌毒性实验研究最为广泛，发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，可在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生荧光作为报警信号。有毒物质通过抑制酶的活性或抑制胞内与发光反应相关的代谢过程降低荧光强度，从而通过观测发光细菌的荧光强度表征水体毒性。发光细菌法具有快速、灵敏性高、简洁方便、价廉等优点，但其实际应用时发光强度极易受到污染物颜色和浊度干扰，产生假阳性报警问题。

最近几年，随着电化学活性微生物受到越来越多研究者的关注，其应用范围涉及污水处理检测、微生物产电及MFC传感器等多个领域。电化学活性微生物是一种具有胞外电子传递能力，可实现化学能和电能双向转换的特殊环境微生物，基于电化学活性微生物的水质检测技术不仅可以避免发光细菌造成的假阳性，并且兼顾发光细菌水质毒性生物检测技术的优点。早期大量研究发现部分电化学活性微生物可以的利用不溶性固体例如电极作为电子受体，将呼吸链代谢产生的电子跨膜传递至胞外，这称为产电过程。在一定条件下，电化学活性微生物输出的电信号与微生物的代谢活性直接相关。而电化学活性微生物检测水质生物毒性的原理基于有毒有害物质会减弱损害微生物的正常代谢，导致电信号下降从而反应出有毒有害物质的浓度，其已被证明能够检测水样中重金属、有机农药和抗生素等多种污染物，表现出广阔的应用前景。

随着电化学活性微生物在检测水质生物毒性中的实际应用及研究的深入，水体中存在的电子受体，如硝酸盐、亚硝酸盐和富马酸等会干扰电化学活性微生物的电信号，造成其电信号下降从而出现误报警。关于如何识别由电子受体导致的利用电化学活性微生物检测水质生物毒性可能产生的假阳性报警问题，其方法和技术有待进一步研究。

发明内容

本发明涉及一种识别电子受体导致的电化学活性微生物检测毒害污染物假阳性的办法，该办法的原理为：水体中毒害污染物降低电化学活性微生物的输出电流是基于毒理学效应，而水体中不具有毒理学效应的电子受体降低输出电流是由于与电极竞争电子，因此根据毒害污染物、电子受体降低电化学活性微生物输出电流的机制不同，能够识别电子受体导致的假阳性问题；该方法的特征为：构建二级报警流程，根据水体对电化学活性微生物输出电流的影响判断是否启动一级报警，根据水体对电化学活性微生物代谢活性的影响判断是否启动二级报警，综合一级、二级报警结果分析水质生物毒性，利用二级报警结果识别一级报警的假阳性，若一级报警为假阳性，根据水样对具有反向胞外电子传递能力的生物电化学系统反向电流的影响，判断水体中存在电子受体导致了一级报警的假阳性。

本发明所提供方法的具体步骤如下：

(1)以对数生长期的电化学活性微生物作为种源构建纯培养的三电极生物电化学系统A；

(2)将蒸馏水注射加入到系统A中，记录系统A输出的稳定电流参数i₁；

(3)将除菌后的待测水体注射加入到系统A中，记录系统输出的稳定电流参数i₂；

(4)设一级报警系数为P₁，参考公式(1)计算电流抑制率：

当P₁≥30％则启动一级报警，当30％>P₁≥0则不启动一级报警；

(5)将正常电解液替换引起一级报警的电化学系统A中的电解液，将蒸馏水注射加入带系统A中，记录系统A输出的稳定电流参数i₃；

(6)设一级报警系数为P₂，参考公式(2)计算电流抑制率：

当P₂≥30％则启动二级报警，当30％>P₂≥0则不启动二级报警；

(7)综合一级、二级报警结果分析水质生物毒性，若一级报警系数30％>P₁≥0，水体正常，无生物毒性；若一级报警系数P₁≥30％,二级报警系数30％>P₁≥0,则一级报警为假阳性；一级报警系数P₁≥30％,二级报警系数P₂≥30％,则水体存在毒害污染物。

(8)以具有双向电子传递能力的对数生长期电化学活性微生物为种源构建纯培养的三电极生物电化学系统B；

(9)记录系统B稳定运行时的基线电流i₄；

(10)将引起一级报警的假阳性水体除菌后注射加入电化学系统B中，记录系统B输入的稳定电流参数i₅；

(11)设信噪比系数为S，参考公式(3)计算信噪比值：

若S≥3，则水体中含有电子受体。

本发明的优点如下：与现有技术相比，本发明所述方法即具有生物电化学系统在水质检测中的优点，即快速高效、操作方便、灵敏度高等优势，同时排除了生物电化学系统在检测中可能遇到的电子受体造成的假阳性报警问题；此外两步检测流程中的电化学系统运行相对独立，确保检测结果准确性的同时，节省检测成本，提高检测效率。

附图说明

图1为本发明识别电子受体导致的电化学活性微生物检测毒害污染物假阳性的办法的流程图；

图2为本发明实例中S.loihica PV-4生物电化学系统加入含电子受体水样输入电流变化图；

具体实施方式

实施例1

构建含有工作电极、对电极和参比电极组成的单室三电极生物电化学系统。工作电极选用边长为2cm的正方形碳布(HCP330，上海河森电气有限公司，中国)。对电极和参比电极分别采用边长1cm的正方形铂片电极(Pt210，天津艾达恒晟科技有限公司，中国)和标准Ag/AgCl电极(R0303，天津艾达恒晟科技有限公司，中国；0.205V vs.标准氢电极)，碳布使用前经丙酮溶液过夜浸泡，再用超纯水将碳布充分漂洗以除去丙酮溶液，最后烘干并高温氨化处理。电解池有效体积为50mL，用四氟盖子密封，盖子设置5个孔，其中三个孔分别插入工作电极、对电极和参比电极，另外两个孔为进水口和出水口。所有配件除参比电极外均经过高温高压灭菌，参比电极则用75％酒精中浸泡过夜，最后在洁净工作台(SW-CJ-1F，苏净安泰)内完成电化学系统组装。

将冻存在-80℃的菌种Shewanella loihica PV-4完全融化后接种至LB液体培养基内摇床过夜培养。次日，取5ml新鲜菌液添加至300ml LB液体培养基内再次活化，待菌液)OD600≈1时终止培养。利用一次性无菌注射器将15mL重悬后菌液和25mLDM培养基加入生物电化学系统，其中DM培养基中微生物生长碳源为10mM乳酸钠、微生物生长氮源为0.5g/L酵母提取物。将电化学系统置于22℃恒温培养箱(HPS-500，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)内，记录并监测生物电化学系统的输入电流。

系统启动完成，调整电势为-0.5V，当电流信号基本稳定后，监测系统输入的基线电流值为0uA。将电解池入水口和出水口打开，分别将含富马酸、二甲基亚砜(DMSO)、硝酸根和氧化三甲胺(TMAO)的水样加入生物电化学系统中。从图2可以看出，当系统输入的基线电流稳定后，再向其加入含电子受体的水样，均会产生反向电流，其中含富马酸的水样引起电化学系统产生反向电流峰值的均值为98.7uA(97uA 104uA 95uA)，DMSO的水样引起电化学系统产生反向电流峰值的均值为110.3uA(96uA 99uA 136uA)，硝酸根的水样引起电化学系统产生反向电流峰值的均值为55.7uA(55uA 60uA 52uA)，TMAO的水样引起电化学系统产生反向电流峰值的均值为117.3uA(125uA 131uA 96uA)，由上述电子受体水样产生反向电流从而得到信噪比系数S均远大于3，并且随着电子受体的消耗，电化学系统的输入电流恢复为基线电流0uA。

实验结果表明，以S.loihica PV-4为种源构建的生物电化学系统可以识别水样中多种电子受体并将其还原产生反向电流，可用于判断水体中存在电子受体导致了一级报警的假阳性问题。

Claims

1.一种识别电子受体导致的电化学活性微生物检测毒害污染物假阳性的方法，该方法的原理为：水体中毒害污染物降低电化学活性微生物的输出电流是基于毒理学效应，而水体中不具有毒理学效应的电子受体降低输出电流是由于与电极竞争电子，因此根据毒害污染物、电子受体降低电化学活性微生物输出电流的机制不同，能够识别电子受体导致的假阳性问题；该方法的特征为：构建二级报警流程，根据水体对电化学活性微生物输出电流的影响判断是否启动一级报警，根据水体对电化学活性微生物代谢活性的影响判断是否启动二级报警，综合一级、二级报警结果分析水质生物毒性，利用二级报警结果识别一级报警的假阳性，若一级报警为假阳性，根据水样对具有反向胞外电子传递能力的生物电化学系统反向电流的影响，判断水体中存在电子受体导致了一级报警的假阳性。

2.如权利要求1所述的电子受体包括硝酸盐、亚硝酸盐、富马酸、氧化三甲胺和二甲基亚砜的一种或多种。

3.如权利要求1所述的一级报警检测流程为：

1)检测蒸馏水对电化学活性微生物影响，记录输出电流i₁；

2)检测水体对电化学活性微生物影响，记录输出电流i₂；

3)设一级报警系数为P₁，参考公式(1)计算电流抑制率；

4)当P₁≥30％则启动一级报警，当30％>P₁≥0则不启动一级报警。

4.如权利要求1所述的二级报警检测流程为：

1)判断一级报警是否启动，若启动则进行二级报警检测流程；

2)检测蒸馏水对电化学活性微生物影响，记录输出电流i₃；

3)设二级报警系数为P₂，参考公式(2)计算电流抑制率；

4)当P₂≥30％则启动二级报警，当30％>P₁≥0则不启动二级报警。

5.如权利要求1所述的综合一级、二级报警结果分析水质生物毒性，利用二级报警结果识别一级报警的假阳性，特征为：

1)一级报警系数30％>P₁≥0，水体正常，无生物毒性；

2)一级报警系数P₁≥30％,二级报警系数30％>P₂≥0,则一级报警为假阳性；

3)一级报警系数P₁≥30％,二级报警系数P₂≥30％,则水体存在毒害污染物。

6.如权利要求1所述的根据水样对具有反向胞外电子传递能力的生物电化学系统反向电流的影响，判断水体中存在电子受体导致了一级报警的假阳性，特征为：

1)构建具有反向胞外电子传递的生物电化学系统；

2)记录系统稳定运行时的基线电流i₄；

3)检测一级报警的假阳性水体对生物电化学系统影响，记录输入电流i₅；

4)设信噪比系数为S，参考公式(3)计算信噪比值；

5)若S≥3，则水体中含有电子受体。