CN114940997A

CN114940997A - GmBBE-like43基因在调控植物适应低磷和酸铝胁迫及促生长中的应用

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Publication number: CN114940997A
Application number: CN202210609252.9A
Authority: CN
Inventors: 梁翠月; 陈倩倩; 田江; 李季肤; 刘国选; 陆星; 陈康
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2022-05-31
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2042-05-31
Also published as: CN114940997B

Abstract

本发明公开了GmBBE‑like43基因在调控植物适应低磷和酸铝胁迫及促生长中的应用。本发明研究显示，细胞壁蛋白GmBBE‑like43在大豆根系受铝胁迫和低磷胁迫诱导上调表达；在不同浓度的磷处理和铝处理条件下，超量GmBBE‑like43表达明显促进了转基因大豆离体毛根和拟南芥的生长；GmBBE‑like43基因具有正调控大豆或拟南芥根系适应低磷胁迫和铝毒害进而促进根系生长的功能；同时，GmBBE‑like43基因具有调控拟南芥根系生长的功能。因此，GmBBE‑like43对植物适应低磷和酸铝胁迫具有重要作用，可以用于通过转基因技术调控植物对酸性土壤低磷和酸铝胁迫的适应能力。

Description

GmBBE-like43基因在调控植物适应低磷和酸铝胁迫及促生长中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及GmBBE-like43在调控植物适应低磷和酸铝胁迫及促生长中的应用。

背景技术

酸性土壤在世界上广泛分布，全世界酸性土壤总面积占世界耕地面积的30-40％，而且有50％以上的潜在耕地为酸性土壤，主要分布在热带、亚热带及温带地区。酸性土壤对农作物生长抑制的作用不仅表现在H⁺浓度过高危害作物本身，而且常常表现为有效磷的缺乏和铝毒害对植物生长和产量的协同抑制。因此，通过遗传改良的手段，提高作物自身对酸性土壤中低磷胁迫和铝毒害的耐受性被认为是发展可持续性农业的重要途径。

在长期进化过程中，植物形成了一系列形态、生理和分子的协同适应性机制，克服酸性土壤中存在的有效磷缺乏和铝毒害等障碍因子。据报道，植物适应铝毒害的机制，主要包括内部忍耐和外排机制(例如，有机酸的分泌)；适应低磷胁迫的机制，主要主要包括改变根的形态构型，增加根系有机酸的分泌以及提高紫色酸性磷酸酶的酶活，诱导高亲和力磷转运子的表达以及与根际微生物如菌根真菌形成共生等(Raghothama,1999；Vance etal.,2003；Liang et al.,2014)。由于有效磷的缺乏和铝毒害同时并存在于酸性土壤中，暗示了植物可能存在共同的适应机制，克服有效磷的缺乏和铝毒害。早期有研究发现，在拟南芥中有28个BBE-Likes蛋白，其中牛心果碱过氧化物酶AtBBE-Like15参与了植物细胞壁木质素的合成(Daniel et al.,2015)。而后的研究报道，在拟南芥中有4个过氧化物酶蛋白AtBBE-Like1/2/20/21可以氧化寡聚半乳糖醛酸OGs而产生H₂O₂，且依次被命名为OGOX4/3/1/2(Benedetti et al.,2015)。

大豆是重要的经济作物，在我国农业生产中具有非常重要的地位，它是一种传统的粮、油、饲兼用的豆科作物。目前在大豆的小檗碱家族相关蛋白(binding berberinefamily protein-related，BBE)的报道中，并未研究其蛋白的具体功能。尽管现有研究中在大豆BBE-Likes蛋白家族中，发现有2个铝胁迫响应的BBE-Likes蛋白，1个低磷胁迫响应的BBE-Like蛋白(Wu et al.,2018；Zhao et al.,2020)，但至今为止该BBE-Likes蛋白家族基因在大豆中的具体功能和作用并没有研究分析报道过；与南方酸性土壤的大豆基因型相关的关键基因也尚未报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供大豆GmBBE-like43基因在调控植物适应低磷和酸铝胁迫及促生长中的应用。

本发明的第一个目的是提供所述GmBBE-like43基因及其蛋白的应用。

本发明第二个目的是提供一种促进植物生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性的产品。

本发明第三个目的是提供一种促进植物生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明在高低磷处理大豆根系的蛋白组学分析结果中发现一个在蛋白水平受低磷胁迫显著上调的细胞壁蛋白GmBBE-like43，挑选了GmBBE-like43基因作为我们研究的候选基因，然后通过qRT-PCR验证发现GmBBE-like43在基因转录水平也是受低磷胁迫显著上调表达的，并且也是受铝胁迫显著上调的。随后，对GmBBE-like43基因在大豆协同响应酸性土壤低磷胁迫和铝毒害的过程中的具体功能进行分析研究。

本发明通过实时荧光定量PCR和同源克隆的方法，克隆了一个受外源磷和铝协同调控的基因GmBBE-like43。再通过大豆离体毛根转化和拟南芥转基因技术获得超量和抑制GmBBE-like43表达的大豆离体毛根、拟南芥转基因植株材料，结果显示，GmBBE-like43基因具有调控大豆根系适应低磷胁迫和铝毒害进而促进根系生长的功能；GmBBE-like43基因具有调控拟南芥根系生长，及调控拟南芥根系适应低磷胁迫和铝毒害进而促进根系生长的功能。

因此，本发明提供SEQ ID NO:1所示GmBBE-like43基因或SEQ ID NO:2所示GmBBE-like43蛋白或其表达促进剂在正调控植物根系耐低磷和/或铝毒胁迫能力和/或根系生长、在促进植物根系生长、在提高植物根系耐低磷和/或铝毒胁迫能力、在培育耐低磷和/或抗铝毒的植株、在制备植物促生剂或在提高植物对酸性土壤的适应性和/或制备酸性土壤促生剂的应用。

本发明提供一种促进植物生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性的产品，含GmBBE-like43蛋白表达促进剂。

本发明提供一种促进植物生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性的方法，通过基因编辑技术，正调控植物中GmBBE-like43基因表达水平或蛋白活性来促进植物根系生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性。

优选地，通过超量表达植物中GmBBE-like43基因，来促进植物根系生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性。

优选地，构建超量表达GmBBE-like43基因的表达载体，转化植株，得到促进植物根系生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性的转基因植株。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了大豆GmBBE-like43基因在调控植物适应低磷和酸铝胁迫及促生长中的应用。本发明研究显示，GmBBE-like43基因受铝胁迫诱导表达上调，受低磷胁迫表达上调，且随着磷处理时间的延长，其表达量明显增加。在不同磷浓度处理条件下，超量GmBBE-like43表达明显增加转基因植物的生物量；同时，在铝处理条件下，超量GmBBE-like43表达明显增加转基因植物的生长速率，表明GmBBE-like43正调控植物根系适应低磷和酸铝胁迫的能力。因此，GmBBE-like43对植物适应低磷和酸铝胁迫具有重要作用，可以用于通过转基因技术调控植物对酸性土壤低磷和酸铝胁迫的适应能力。

附图说明

图1为大豆GmBBE-like43表模式分析(A：低磷处理时间对GmBBE-like43在大豆根系表达模式的影响；B：铝处理时间对GmBBE-like43在大豆根尖表达模式的影响；数据为3次重复的平均值与标准误，星号表示对照(+P/-Al)与处理(-P/+Al)之间差异显著(Student’st-test)，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001)；

图2为GmBBE-like43的组织定位和亚细胞定位分析(A：GmBBE-like43在拟南芥中的组织化学定位分析，第一排地上部图片的标尺为2mm，最后两排根系图片的标尺为0.5mm；B：GmBBE-like43融合GFP蛋白在烟草叶片的亚细胞定位分析结果；C：GmBBE-like43融合GFP蛋白在菜豆毛根中的亚细胞定位分析结果；图B和C中第一排为转化空载体的烟草或者菜豆亚细胞定位图(35S::GFP)；第二排为GmBBE-like43融合GFP蛋白在烟草叶片或者菜豆毛根的亚细胞定位图(35S::GmBBE-like43-GFP)；图B的图片分别为在激光共聚焦显微镜下绿色荧光通道(GFP)、光镜通道(明场)和重叠后的图片(融合)观察，图C的图片分别为在激光共聚焦显微镜下绿色荧光通道(GFP)、红色荧光通道(PI染色)和重叠后的图片(融合)观察，标尺为20μm)；

图3为铝处理条件下超量或抑制GmBBE-like43表达对转基因大豆离体毛根生长的影响(A，B：GmBBE-like43在空载对照(OX-CK/RNAi-CK)与转基因毛根(OX/RNAi)中的表达模式分析；C：空载对照(OX-CK/RNAi-CK)和转基因毛根(OX/RNAi)在铝处理条件下的表型，标尺＝2cm；D，F：空载对照(OX-CK/RNAi-CK)和转基因毛根(OX/RNAi)的生长量；E，G：空载对照(OX-CK/RNAi-CK)和转基因毛根(OX/RNAi)的相对生长速率；星号表示空载对照(OX-CK/RNAi-CK)和转基因毛根(OX/RNAi)之间差异显著(Student’s t-test)；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001)；

图4为高低磷条件下超量或抑制GmBBE-like43表达对转基因大豆离体毛根生长的影响(A，B：GmBBE-like43在空载对照(OX-CK/RNAi-CK)与转基因毛根(OX/RNAi)中的表达模式分析；C：空载对照(OX-CK/RNAi-CK)和转基因毛根(OX/RNAi)在高低磷处理条件下的表型，标尺＝2cm；D，F：空载对照(OX-CK/RNAi-CK)和转基因毛根(OX/RNAi)的干重；E，G：空载对照(OX-CK/RNAi-CK)和转基因毛根(OX/RNAi)的总根长；星号表示空载对照(OX-CK/RNAi-CK)和转基因毛根(OX/RNAi)之间差异显著(Student’s t-test)，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001)；

图5为超量表达GmBBE-like43对转基因拟南芥生长的影响(A：GmBBE-like43在野生型(WT)与转基因拟南芥植株(OX1，OX2)中的表达模式分析；B：野生型(WT)与转基因拟南芥株系(OX1，OX2)在铝处理条件下的表型，图中标尺为0.5cm；C：野生型(WT)与转基因拟南芥株系(OX1，OX2)在铝处理条件下的根系生长量；D：野生型(WT)与转基因拟南芥株系(OX1，OX2)在铝处理条件下的根系相对生长速率；E：野生型(WT)与转基因拟南芥株系(OX1，OX2)在高低磷处理下的表型，图中标尺为1cm；F：野生型(WT)与转基因拟南芥株系(OX1，OX2)在高低磷处理下的根系鲜重；G：野生型(WT)与转基因拟南芥株系(OX1，OX2)在高低磷处理下的主根长；星号表示野生型(WT)与转基因拟南芥株系(OX1，OX2)之间差异显著(Student’st-test)，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1GmBBE-like43基因的表达模式分析

本发明在高低磷处理大豆根系的蛋白组学分析结果发现一个在蛋白水平受低磷胁迫显著上调的细胞壁蛋白GmBBE-like43，所以挑选了GmBBE-like43基因作为我们研究的候选基因，然后通过qRT-PCR验证发现GmBBE-like43在基因转录水平也是受低磷胁迫显著上调表达的，并且也是受铝胁迫显著上调的。随后，对GmBBE-like43基因在大豆协同响应酸性土壤低磷胁迫和铝毒害的过程中的具体功能进行分析研究。

1、低磷胁迫对GmBBE-like43在大豆根系表达模式的影响

采用卷纸育苗法，挑选种皮无破损、大小均一的种子，用100ml次氯酸钠加4.2ml的盐酸反应产生的氯气消毒12h，再于超净工作台吹1h备用。剪裁20×20cm的方形滤纸，配制pH为5.8的1/4大豆全营养液以及无菌水，灭菌待用。

进行卷纸培时，将保鲜膜铺在试验台面，用配制好的1/4大豆全营养液浸透滤纸，在距离滤纸一边约1cm处摆放7颗消毒后的豆子，豆子种脐朝下，从第一颗豆子卷至末端。卷好后的滤纸将没有豆子的一端朝下，放入装有1/4大豆全营养液的500mL烧杯中，用保鲜膜将卷有豆子的上端滤纸包起。将烧杯放入培养箱中24～26℃，先暗培养1d，再光照/黑暗(12h/12h)培养3～4d，至胚根5～6cm。

挑选生长一致的幼苗，转移到+P(250μM KH₂PO₄)与-P(5μM KH₂PO₄)营养液中，每个处理4个重复，每个重复8株苗。每两天将营养液pH调至5.8左右，每周换一次营养液，分别在3d、6d、9d和12d分别收获根系样品，液氮冷冻后，置于-80℃冰箱中保存，备用。

2、铝处理对GmBBE-like43在大豆根尖表达模式的影响

采用卷纸育苗法，培养3～4d至胚根5～6cm，挑选生长一致的幼苗，分别转移到-Al(pH 4.2，0.5mM CaCl₂)和+Al(pH 4.2，50μM AlCl₃，0.5mM CaCl₂)溶液中进行处理，处理12、24、48、72和96h后分别收获大豆根尖(0～2cm)样品，液氮快速冷冻后，保存于-80℃冰箱待用。

3、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

使用TRIzol试剂盒(Invitrogen，美国)分别提取上述处理后的植物样品的总RNA。采用MMLV-逆转录试剂盒(Promega，美国)将经DNase I处理后的RNA逆转录合成为cDNA。再采用SYBR(Promega，美国)试剂盒进行qRT-PCR分析。完成逆转录后将样品稀释15倍后通过Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR system进行实时荧光定量PCR分析。

标准曲线制备：先从每个样品的cDNA原液中吸取1～2μL样品至一个新的PCR离心管中，然后将混合液再稀释10倍为第一个标样S1，再将第一个标样稀释10倍作为第二个标样S2，以此类推稀释为5个浓度梯度标样，即S1、S2、S3、S4、S5。

定量PCR引物采用GmBBE-like43基因定量引物和内参基因为大豆的看家基因引物如下所示：

GmBBE-like43–RT1-F(SEQ ID NO.3)：5’-CGTGAACCATTCTGAGCCTTC-3’；

GmBBE-like43–RT1-R(SEQ ID NO.4)：5’-AATGGAACCTCTGCCACGTAAG-3’；

EF1-α-F(SEQ ID NO.5)：5’-TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3’；

EF1-α-R(SEQ ID NO.6)：5’-CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3’。

配制反应混合液：每20微升反应体系中，加入10微升SYBR Premix Ex Taq(2×)，0.5微升正向/反向引物，7微升ddH₂O和2微升模板。先计算所需反应的用量，将除了cDNA以外的试剂混匀，每管分装18微升，再加入2微升的cDNA模板使终体积为20微升。

定量PCR反应程序为：95℃预变性30s，PCR反应(95℃变性30秒，60℃复性15秒，72℃延伸30秒)40个循环。检测结果用Rotor-Gene的Real-Time Analysis Software计算每个样品的表达量。

结果如图1所示，在铝处理96h内，GmBBE-like43表达均是受铝胁迫诱导上调表达的，且其表达量随铝胁迫时间的延长呈现先增加后降低的趋势，其中GmBBE-like43在12h的表达量最高，其次是在24h，分别是对照处理的3.8倍和25.5倍(图1A)。另外，在高低磷处理条件下，与高磷处理相比，低磷处理3d对GmBBE-like43的表达水平无明显影响。但低磷处理6d后，该基因的表达水平受低磷胁迫明显上调，且随着磷处理时间的延长，其表达量明显增加。即与正常磷条件相比，低磷处理第6、9和12d其表达量分别为对照处理的2、3.1和5.6倍(图1B)。

实施例2GmBBE-like43组织化学定位和亚细胞定位分析

1、GmBBE-like43组织化学定位分析

(1)根据GmBBE-like43基因序列，设计特异引物pGmBBE-like43::GUS-F(SEQ IDNO.7)：5’-CGGAATTCCACGATGGAGTGCAAAAGCAT-3’，pGmB BE-like43::GUS-R(SEQ ID NO.8)：5’-AAGGATCCTTTGGCTTATCCCAATGATGAG-3’。以大豆基因型YC03-3的根系DNA为模板，进行PCR扩增，扩增GmBBE-like43起始密码子上2000bp的序列。反应条件为98℃预变性5min，98℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性1～3min(根据片段大小决定)，这一过程循环30次，72℃延伸10min。

(2)载体构建：将PCR扩增的产物通过凝胶电泳，利用试剂盒进行回收纯化，获得纯化PCR产物后，使用同源重组试剂盒

II将PCR产物与限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切法切割的pTF102载体进行重组连接反应。反应体系为20μL，包含PCR产物6μL，线性化载体质粒8μL，用重组连接酶Exnase II 2μL，反应缓冲液4μL。将试剂混合物于37℃反应30min，将重组质粒转化大肠杆菌并进行测序，获得大豆pGmBBE-like43::GUS融合基因的植物表达载体。最后将目的载体进行GV3101农杆菌转化，检测阳性克隆并于-80℃保存菌液。

(3)转基因拟南芥的获得：采用花序侵染法。主要步骤为：将上述构建好的pGmBBE-like43::GUS载体质粒转入农杆菌GV3101，挑取阳性克隆于5mL YEP培养液(含壮观和利福平)，28℃培养过夜；之后再转入100mL YEP培养液扩大培养至OD₆₀₀为1.6～2.0；然后6000rpm，离心10min，弃上清收集菌体，用等体积的5％的蔗糖水或者1/2MS培养液重悬菌体，加0.005～0.02％SilwetL-77配成转化液；转化时将拟南芥(转化前一天浇水保持植株湿润)花絮全部浸入转化液1min，取出后用稍用滤纸擦去多余的转化液，然后盖上保鲜膜保持植株湿润，先用黑色袋子罩住暗培养18h后转到正常培养条件下培养至收种(培养期间每隔1周转化一次，一共转化3次即可)。

转化后的拟南芥收获T₀代种子后，取约100μL的种子进行繁种鉴定。具体步骤为：整个操作均在超净工作台中完成，先用70％乙醇漂洗1min，离心吸除乙醇，再用已灭菌的二级水清洗1次；再用10％的次氯酸钠预洗1次，离心吸除次氯酸钠，再用1mL的10％的次氯酸钠震动漂洗5min，离心吸除次氯酸钠，用无菌水漂洗5～6次；最后用无菌水重悬种子，并将种子均匀撒播在含除草剂的MS培养基上，4℃低温处理1d后打破休眠，移入光周期16h/8h(光照/黑暗)，温度为22℃/20℃(白天/夜晚)的植物光照培养箱；约2周后，将正常存活的T1代幼苗移入基质中继续生长，待植株长大后摘取少许叶片进行DNA的提取，并进行PCR鉴定阳性植株。

(4)转基因拟南芥的GUS染色：将纯合的转基因拟南芥进行高低磷处理6d后，首先取出处理的拟南芥，用二级水冲洗3遍后放在90％丙酮固定30min，然后用配好的洗液清洗3遍，再分别放置在GUS染色液中(0.1M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH 7.2，1mM X-Gluc)，抽取真空20min，然后转至37℃恒温培养箱中，避光染色6～8h。待根系着色后，将毛根移入75％(v/v)的乙醇中保存，在体视显微镜(Leica，德国)下观察根系GUS染色情况并拍照。

结果如图2A所示，无论在低磷还是铝处理条件下，GmBBE-like43启动子融合GUS报告基因在拟南芥中表达水平均明显高于对照处理，且主要在拟南芥老叶、侧根和主根尖中上调表达。

2、GmBBE-like43亚细胞定位分析

(1)设计特异引物GmBBE-like43-GFP-F(SEQ ID NO.9)：5’-CTCTAGCGCTACCGGTATGGGAGTCCTTTCTTCTCA-3’，GmBBE-like43-GFP-R(SEQ ID NO.10)：5’-CATGGTGGCGACCGGTCGACCCTTCCTATATGACAGCG-3’。以大豆基因型YC03-3的根系cDNA为模板，对大豆GmBBE-like43基因ORF全长进行扩增。反应条件为98℃预变性5min，98℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性1～3min，这一过程循环30次，72℃延伸10min。

(2)PCR扩增的产物通过凝胶电泳，利用试剂盒进行回收纯化，获得纯化PCR产物后，使用同源重组试剂盒

II将PCR产物与经Age I酶切后的线性化载体pEGAD进行重组连接反应。反应体系为20μL，包含PCR产物6μL，pEGAD线性化载体质粒8μL，用重组连接酶Exnase II 2μL，反应缓冲液4μL。将试剂混合物于37℃反应30min，将重组质粒转化大肠杆菌并进行测序，无误后提取质粒。将35S::GmBBE-like43-GFP质粒转化农杆菌GV3101和发根农杆菌K599，检测无误后保存备用。

(3)GmBBE-like43亚细胞定位分析

烟草表皮细胞瞬时表达亚细胞定位分析是通过农杆菌转化法，将35S::GmBBE-like43-GFP或pEGAD空载(35S:GFP)导入农杆菌菌株GV3101。转化成功后含载体的GV3101接种于YEP培养基，28℃振荡培养16h后离心(5000rpm，10min)，用浸润液(含10mM MgCl₂、10mMMES和10mM乙酰丁香酮，pH＝5.6)重悬至OD₆₀₀的分光光度值为0.4～0.5，将菌体悬浮液于43℃避光静置3h后，通过注射器渗入菌液的方法共转化5～6周龄烟草的叶片下表皮。转化的烟草正常培养3d后，用激光共聚扫描显微镜(Zeiss LSM780，德国)观察荧光信号在烟草表皮细胞中的分布情况。而对于转基因菜豆毛根亚细胞定位，则将35S::GmBBE-like43-GFP或pEGAD空载(35S::GFP)导入发根农杆菌菌株K599用于转化菜豆毛根。具体方法参照本实验室建立的菜豆毛根转化体系。构建好的转基因材料在激光共聚扫描显微镜(Zeiss LSM780，德国)下观察GFP信号在细胞中的定位情况。

结果如图2所示，将35S::GmBBE-like43-GFP载体转入烟草叶片表皮细胞进行瞬时表达后，空载对照(35S::GFP)在细胞核、细胞质和质膜中均存在GFP的绿色荧光信号，而35S::GmBBE-like43-GFP在细胞边缘有很强的GFP荧光，与细胞轮廓重合，说明GmBBE-like43可能定位于细胞细胞壁上(图2B)。

为进一步验证GmBBE-like43的亚细胞定位，将35S::GmBBE-like43-GFP载体导入发根农杆菌K599，再采用发根农杆菌介导的大豆子叶节离体毛根转化法获得了35S::GmBBE-like43-GFP融合蛋白稳定表达的转基因毛根。结果与烟草表皮细胞相似，GFP荧光信号检测发现，空载的转基因对照菜豆毛根的GFP荧光遍布整个细胞。而35S::GmBBE-like43-GFP转基因菜豆毛根的GFP荧光仅在细胞边缘，而且与PI染料所激发的红色荧光融合(图2C)。因此，GmBBE-like43可能定位与于细胞壁上。

实施例3不同条件下采用磷处理后GmBBE-like43表达对大豆离体毛根生长的影响

1、GmBBE-like43功能分析载体构建

(1)超量表达载体的构建(OX-GmBBE-like43-pTF101s)

以大豆基因型YC03-3根系cDNA为模板，设计GmBBE-like43特异引物，并用上游特异引物5’-GTACCCGGGGATCCTCTAGAATGGGAGTCCTTTCTTCTCA-3’(SEQ ID NO:11)和下游特异引物5’-GCCTGCAGGTCGACTCTAGACTAACCCTTCCTATATGACAGCG-3’(SEQ ID NO:12)扩增出GmBBE-like43编码区片段。PCR反应体系为：总共50μL体系，包含43μL Master mix(2×)、基因正向/反向引物各0.5μL、2μL cDNA模板、1μL dNTPs(10μM)和1μL高保真酶，其余用水补足。PCR程序为：98℃预变性5min，98℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性1～3min，这一过程循环30次，72℃延伸10min。PCR片段回收测序无误后，将扩增得到的GmBBE-like43的CDS片段经同源重组试剂盒

II kits连接到经XbaⅠ酶切后的线性化载体pTF101s上，得到的重组载体转化大肠杆菌并测序验证，测序结果正确后，抽取重组质粒35S::GmBBE-like43转入发根农杆菌K599和农杆菌GV3101备用。

(2)干涉表达载体的构建(RNAi-GmBBE-like43-pFGC5941)

以YC03-3的根部cDNA为模板，设计两段特异引物RNAi-GmBBE-like43-pFGC5941-F/R(SEQ ID NO:13～16)，具体序列如下所示：

引物RNAi-GmBBE-like43-pFGC5941-Asc I-F(SEQ ID NO:13)：

5’-ACAATTACCATGGGGCGCGCCGGTGTGTCTTACGTGGCAGA-3’；

引物RNAi-GmBBE-like43-pFGC5941-Asc I-R(SEQ ID NO:14)：

5’-AAATCATCGATTGGGCGCGCCCAAAGCTAGCTCCACCACCA-3’；

引物RNAi-GmBBE-like43-pFGC5941-BamH I-F(SEQ ID NO:15)：

5’-ATTTGCAGGTATTTGGATCCCAAAGCTAGCTCCACCACCA-3’；

引物RNAi-GmBBE-like43-pFGC5941-BamH I-R(SEQ ID NO:16)：

5’-TCTAGACTCACCTAGGATCCGGTGTGTCTTACGTGGCAGA-3’。

扩增GmBBE-like43的300bp左右的开放阅读框序列，再通过限制性内切酶Asc I酶切目的载体，获得线性化双元载体pFGC5941；将线性化载体末端15bp～20bp序列作为同源序列，并将其分别添加到基因特异性正/反向扩增引物序列的5’端，以此引物对扩增得到带有同源序列的插入片段，测定回收产物浓度。按照一步克隆的连接方法(诺唯赞公司)，重组反应：将线性化载体和插入片段按比例1:2混合，在Exnase II催化下，37℃反应1h完成重组反应，然后再将重组产物通过限制性内切酶BamH I酶切双元载体pFGC5941后，再将扩增的第二个片段序列按照一步克隆的连接方法(诺唯赞公司)进行重组，重组反应完后，吸取3μL左后的重组产物(根据产物浓度而定)加入到50μL大肠杆菌Trans T1感受态中进行转化，挑选单克隆供后期阳性筛选，检测后进行测序验证。将阳性单克隆扩大培养，保存菌液并进行质粒提取，获得大豆GmBBE-like43干涉表达载体。将目的载体进行K599农杆菌转化，检测阳性克隆并于-80℃保存菌液。

2、转基因材料的获得

采用发根农杆菌介导的大豆子叶节离体毛根转化法。主要步骤包括：

(1)种子灭菌与萌发：挑选种皮无破损、大小一致的大豆种子于氯气中进行表面消毒12～14h，之后将种子置于超净工作台风吹30min以除去多余氯气；然后播种于萌发培养基上，在28℃光照条件下培养4天。

(2)菌液的准备：将含有OX-GmBBE-like43-pTF101s或RNAi-GmBBE-like43-pFGC5941质粒的发根农杆菌K599在平板上进行划线培养，挑取单克隆，置于28℃，200rpm/min培养12h至OD₆₀₀为1.0左右。

(3)子叶节侵染及共培养：先用解剖刀在离子叶节约0.5cm的下胚轴区域切下萌发的种子，然后用手术刀沿着背脊处垂直剖开种子，切去种子幼芽。此外，用解剖刀蘸取菌液，并垂直于子叶节及下胚轴处切出多个伤口。将切好的外置体，水平向上移至含有湿润滤纸的培养皿中；之后，用保鲜膜封住培养皿，转移到培养箱中(24℃)，光照培养5d。将共培养后的外植体转移至含有除草剂和羧苄青霉素的培养基上生长14d。

3、转基因大豆毛根阳性鉴定

提取对照组毛根及待检测转基因毛根RNA，反转cDNA后，用实施例1中GmBBE-like43荧光定量PCR引物检测超量表达GmBBE-like43转基因株系的表达量，以看家基因EF1-α(Glyma17g23900)为内参基因设计引物GmBBE-like43-RT2-F(SEQ ID NO:17)和GmBBE-like43-RT2-R(SEQ ID NO:18)进行扩增，检测干涉GmBBE-like43表达转基因株系的表达量，具体序列如下所示：

引物GmBBE-like43-RT2-F(SEQ ID NO:17)：

5’-GGACGTTGTGAACGGTACACG-3’；

引物GmBBE-like43-RT2-R(SEQ ID NO:18)：

5’-AGGATGCAATGTCTATGTTGTCC-3’。

4、转基因大豆毛根的功能验证

(1)转基因大豆毛根的铝处理

挑选长势新鲜、状态良好以及生长一致的转基因毛根进行拍照，分别转移至加入或不加入100μM AlCl₃(过滤后加入灭菌冷却后的培养液中)的1/4MS液体培养基(pH 4.5，不加KH₂PO₄,)中。在28℃摇床中，100rpm/min处理48小时后进行收获，拍摄根系照片，并使用软件Image J测量根长。

结果如图3所示，定量PCR分析表明，与空载体对照(OX-CK/RNAi-CK)相比，在不加或加铝处理条件下，GmBBE-like43在的超量表达GmBBE-like43(OX)大豆离体毛根中的表达量分别增加了约10倍和4倍(图3A)，而在干涉GmBBE-like43表达(RNAi)的大豆离体毛根中的表达量分别降低了约78％和89％(图3B)。MS培养实验结果表明，在正常处理条件下，超量或抑制GmBBE-like43表达对大豆毛根生长无明显影响。而在铝处理条件下，超量表达GmBBE-like43(OX)显著促进了转基因大豆离体毛根的生长，其根系生长量和相对生长速率与空载体对照(OX-CK)相比分别增加了约67％和77％(图3C-E)。相反，在铝处理条件下，干涉GmBBE-like43(RNAi)表达显著抑制了转基因大豆离体毛根的生长，具体表现为，与空载体对照(RNAi-CK)相比，其根系生长量和相对生长速率分别减少了约31％和22％(图3F和G)。

(2)转基因大豆毛根的高低磷处理

挑选长势新鲜、状态良好、根系形态相似、重量大约为0.1g的转基因毛根，分别转移至含有高磷(+P:1250μM KH₂PO₄)或低磷(-P:10μM KH₂PO₄)的MS固体培养基中，生长14d。收取并测定毛根干重和总根长。

结果如图4所示，定量PCR分析表明，与空载体对照(OX-CK/RNAi-CK)相比，高低磷处理条件下，GmBBE-like43在超量表达GmBBE-like43(OX)大豆离体毛根中的表达量分别增加了约1.7倍和1.8倍(图4A)，而在干涉GmBBE-like43表达(RNAi)的大豆离体毛根中的表达量分别降低了约80％和77％(图4B)。MS培养实验结果表明，无论在高磷还是低磷处理条件下，超量表达GmBBE-like43(OX)均显著促进了转基因大豆离体毛根的生长，其根系干重分别是对照(OX-CK)的1.6倍和3.4倍，同时，高低磷处理条件下超量表达GmBBE-like43(OX)大豆离体毛根的总根长分别是对照处理(OX-CK)的1.6倍和2.3倍(图4C-E)。相反，与对照相比，高低磷处理条件下干涉GmBBE-like43表达大豆离体毛根中的干重分别减少了约43％和38％，同时，其总根长和与对照相比分别减少了约59％和35％(图4F和G)。

实施例4超量表达GmBBE-like43对拟南芥生长的影响

1、转基因拟南芥的获得

将实施例3中构建好的超量表达载体(OX-GmBBE-like43-pTF101s)质粒转入农杆菌GV3101，再采用实施例2中的花序浸染法以及除草剂筛选获取T3代转基因拟南芥种子，最后利用定量PCR确认得到GmBBE-like43高表达量的不同转基因拟南芥株系用于后续基因功能研究。拟南芥GmBBE-like43定量引物为：GmBBE-like43-RT3-F(SEQ ID NO:19)和GmBBE-like43-RT3-R(SEQ ID NO:20)。以拟南芥看家基因EF1-α为内参基因，拟南芥的看家基因采用EF1-α定量引物(SEQ ID NO:21～22)，具体引物序列如下所示：

GmBBE-like43–RT3-F(SEQ ID NO:19)：

5’-CTCCTTTCCCTCATCGAGCTG-3’；

GmBBE-like43–RT3-R(SEQ ID NO:20)：

5’-TCCATAAACTCTCCCTTCAGCG-3’；

EF1-α-F(SEQ ID NO:21)：

5’-GTCGATTCTGGAAAGTCGACC-3’

EF1-α-R(SEQ ID NO:22)：

5’-AATGTCAATGGTGATACCACGC-3’。

2、转基因株系的功能验证

(1)转基因拟南芥的铝处理

通过拟南芥异源基因表达转化体系，获得两个超量表达GmBBE-like43的拟南芥转基因株系(OX1和OX2)。选取适量野生型和2个超量表达GmBBE-like43阳性拟南芥株系OX1和OX2的饱满种子。消毒处理后，先播于正常MS培养基，约3～4d后拟南芥根系长到约1cm，挑选整齐一致的幼苗进行拍照，然后移至不含或含铝(5μM AlCl₃)的1/5Hoagland营养液(pH4.5，不加KH₂PO₄，0.5mM CaCl₂)中进行培养。培养条件：室温23℃，光照强度120μmol·m^-2·S^-1，每天光照时间为16小时。移苗48小时后进行收获，拍摄幼苗照片，并使用图像J测量根系长度。

从图5A可知，转基因拟南芥中GmBBE-like43的表达量与WT相比明显提高。同时，无论是在加铝还是不加铝的处理条件下，超量表达GmBBE-like43均明显促进了转基因拟南芥根系的生长(图5B)。在正常处理条件下，与WT相比，超量表达GmBBE-like43的转基因拟南芥株系OX1和OX2的根系生长量均增加了35％左右，而在铝处理条件下，转基因株系OX1和OX2的根系生长量与WT相比分别增加了72％和133％(图5C)。同时，与WT相比，超量表达GmBBE-like43的转基因株系OX1和OX2的根系相对生长速率分别增加了约27％和72％(图5D)。

(2)转基因拟南芥的高低磷处理

选取适量野生型和2个超量表达GmBBE-like43阳性株系OX1和OX2的饱满种子。消毒处理后，先播于正常MS培养基，约3～4d后拟南芥根系长到约1cm，挑选整齐一致的幼苗，移到相应处理的1/2MS培养基的方皿中，设置两个磷水平处理：正常供磷处理(1250μMKH₂PO₄)和低磷处理(6.25μM KH₂PO₄)，每个方形皿为一个重复，每个处理5个重复。处理后第9天收样，测定植株鲜重和主根长。

结果如图5所示，无论是在高磷还是低磷处理条件下，超量表达GmBBE-like43明显促进了转基因拟南芥的根系生长(图5E)。在正常磷处理条件下，以WT相比，超量表达GmBBE-like43的转基因株系OX1和OX2的根系鲜重均增加了23％左右，而在低磷处理条件下，转基因株系OX1和OX2的根系鲜重与WT相比分别增加了20％和47％(图5F)。同时，在正常磷处理条件下，以WT相比，超量表达GmBBE-like43的转基因株系OX1和OX2的主根长均增加了9％左右，而在低磷处理条件下，转基因株系OX1和OX2的主根长与WT相比分别增加了17％和23％(图5G)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> GmBBE-like43基因在调控植物适应低磷和酸铝胁迫及促生长中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1608

<212> DNA

<213> GmBBE-like43基因(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 1

atgggagtcc tttcttctca tagaatacaa ctattattat ttcccattgt tgtgttgctt 60

tggtcagctt cagctgcaaa ttcagctaac aacacttttc ttcattgcct cgtgaaccat 120

tctgagcctt ctcaccccat aacttcagca attttcacac caaacaacac ctcattctct 180

tcagtattgg aagcctacat tagaaacctt cgtttcaaca cctccacaac ccgtaagcca 240

ttcctcataa taactgcact tcatgtatcc cacatacaag catccattat ttgtgctcaa 300

aaacacaact tgcaaatgaa aatccgaagt ggtggccatg actatgaggg tgtgtcttac 360

gtggcagagg ttccattctt catccttgac atgttcaatc taagaaccat tgaggttgac 420

ataggcactg aaaccgcttg ggtccaagct ggtgcaacac ttggtgaagt ttattataga 480

attgctgaga agagtaaaac ccatgctttc ccagcagggg tttgtcacac agttggggtg 540

ggaggacaca taagtggtgg tggctatggc aacatgatga gaaaatatgg tctctcagtg 600

gataatgtta ttgatgcaca aatggttgat gttcaaggta gattgcttga tagaaaatcc 660

atgggtgaag atctcttttg ggccatcaca ggtggtggtg gagctagctt tggtgttgtt 720

cttgcctaca aaataaagct agttcgagtt ccagaaattg tcactgtttt ccaagttggg 780

agaaccttag agcaaaatgc cactgatata gtttacaatt ggcagcatgt tgcaccaact 840

atcgacaacg atcttttcct tagggttatc ttggacgttg tgaacggtac acgaaatgga 900

acaaagactg taagagctag gttcatagct ctattccttg gtgactccaa aagccttgtt 960

tctctcttga atgacaagtt tcctcaattg ggtttgaagc aatctgattg catcgaaacg 1020

agctggcttc gatctgtgct gttttgggac aacatagaca ttgcatcctc acttgacatt 1080

ttgcttgaga gacaaccacg atcactcaac tacttgaaaa ggaaatctga ctatgtgaag 1140

aaaccgattt ccatagaggg ttttgaaggg atttggaaga agatgattga gttggaggat 1200

acactatttc aattcaatcc ttatggcgga agaatggctg agattccttc aacagcatct 1260

cctttccctc atcgagctgg gaacctatgg aagatccaat accaagcgaa ttggaataag 1320

ccagggaaag aggtagcaga tcactacata aacttgacaa gaaaacttca caagttcatg 1380

actccttttg tctccaagaa ccctagagag gctttctaca attataagga ccttgacttg 1440

gggattaacc acaatggtaa aaacagctac gctgaaggga gagtttatgg agtggagtat 1500

ttcaaggata acttcgacag gttggttcaa ataaagacca aggttgatcc ccataatttc 1560

tttaggaacg aacaaagcat ccctacgctg tcatatagga agggttag 1608

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> GmBBE-like43蛋白(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 2

Met Gly Val Leu Ser Ser His Arg Ile Gln Leu Leu Leu Phe Pro Ile

1 5 10 15

Val Val Leu Leu Trp Ser Ala Ser Ala Ala Asn Ser Ala Asn Asn Thr

20 25 30

Phe Leu His Cys Leu Val Asn His Ser Glu Pro Ser His Pro Ile Thr

35 40 45

Ser Ala Ile Phe Thr Pro Asn Asn Thr Ser Phe Ser Ser Val Leu Glu

50 55 60

Ala Tyr Ile Arg Asn Leu Arg Phe Asn Thr Ser Thr Thr Arg Lys Pro

65 70 75 80

Phe Leu Ile Ile Thr Ala Leu His Val Ser His Ile Gln Ala Ser Ile

85 90 95

Ile Cys Ala Gln Lys His Asn Leu Gln Met Lys Ile Arg Ser Gly Gly

100 105 110

His Asp Tyr Glu Gly Val Ser Tyr Val Ala Glu Val Pro Phe Phe Ile

115 120 125

Leu Asp Met Phe Asn Leu Arg Thr Ile Glu Val Asp Ile Gly Thr Glu

130 135 140

Thr Ala Trp Val Gln Ala Gly Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr Tyr Arg

145 150 155 160

Ile Ala Glu Lys Ser Lys Thr His Ala Phe Pro Ala Gly Val Cys His

165 170 175

Thr Val Gly Val Gly Gly His Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Asn Met

180 185 190

Met Arg Lys Tyr Gly Leu Ser Val Asp Asn Val Ile Asp Ala Gln Met

195 200 205

Val Asp Val Gln Gly Arg Leu Leu Asp Arg Lys Ser Met Gly Glu Asp

210 215 220

Leu Phe Trp Ala Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ala Ser Phe Gly Val Val

225 230 235 240

Leu Ala Tyr Lys Ile Lys Leu Val Arg Val Pro Glu Ile Val Thr Val

245 250 255

Phe Gln Val Gly Arg Thr Leu Glu Gln Asn Ala Thr Asp Ile Val Tyr

260 265 270

Asn Trp Gln His Val Ala Pro Thr Ile Asp Asn Asp Leu Phe Leu Arg

275 280 285

Val Ile Leu Asp Val Val Asn Gly Thr Arg Asn Gly Thr Lys Thr Val

290 295 300

Arg Ala Arg Phe Ile Ala Leu Phe Leu Gly Asp Ser Lys Ser Leu Val

305 310 315 320

Ser Leu Leu Asn Asp Lys Phe Pro Gln Leu Gly Leu Lys Gln Ser Asp

325 330 335

Cys Ile Glu Thr Ser Trp Leu Arg Ser Val Leu Phe Trp Asp Asn Ile

340 345 350

Asp Ile Ala Ser Ser Leu Asp Ile Leu Leu Glu Arg Gln Pro Arg Ser

355 360 365

Leu Asn Tyr Leu Lys Arg Lys Ser Asp Tyr Val Lys Lys Pro Ile Ser

370 375 380

Ile Glu Gly Phe Glu Gly Ile Trp Lys Lys Met Ile Glu Leu Glu Asp

385 390 395 400

Thr Leu Phe Gln Phe Asn Pro Tyr Gly Gly Arg Met Ala Glu Ile Pro

405 410 415

Ser Thr Ala Ser Pro Phe Pro His Arg Ala Gly Asn Leu Trp Lys Ile

420 425 430

Gln Tyr Gln Ala Asn Trp Asn Lys Pro Gly Lys Glu Val Ala Asp His

435 440 445

Tyr Ile Asn Leu Thr Arg Lys Leu His Lys Phe Met Thr Pro Phe Val

450 455 460

Ser Lys Asn Pro Arg Glu Ala Phe Tyr Asn Tyr Lys Asp Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gly Ile Asn His Asn Gly Lys Asn Ser Tyr Ala Glu Gly Arg Val Tyr

485 490 495

Gly Val Glu Tyr Phe Lys Asp Asn Phe Asp Arg Leu Val Gln Ile Lys

500 505 510

Thr Lys Val Asp Pro His Asn Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro

515 520 525

Thr Leu Ser Tyr Arg Lys Gly

530 535

Claims

1.SEQ ID NO:1所示GmBBE-like43基因或SEQ ID NO:2所示GmBBE-like43蛋白在正调控植物根系耐低磷和/或铝毒胁迫能力和/或根系生长中的应用。

2.SEQ ID NO:1所示GmBBE-like43基因或SEQ ID NO:2所示GmBBE-like43蛋白或其表达促进剂在促进植物根系生长中的应用。

3.SEQ ID NO:1所示GmBBE-like43基因或SEQ ID NO:2所示GmBBE-like43蛋白或其表达促进剂在提高植物根系耐低磷和/或铝毒胁迫能力中的应用。

4.SEQ ID NO:1所示GmBBE-like43基因或SEQ ID NO:2所示GmBBE-like43蛋白或其表达促进剂在培育耐低磷和/或抗铝毒的植株中的应用。

5.SEQ ID NO:1所示GmBBE-like43基因或SEQ ID NO:2所示GmBBE-like43蛋白或其表达促进剂在制备植物促生剂中的应用。

6.SEQ ID NO:1所示GmBBE-like43基因或SEQ ID NO:2所示GmBBE-like43蛋白或其表达促进剂在提高植物对酸性土壤的适应性和/或制备酸性土壤促生剂的应用。

7.一种促进植物生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性的产品，其特征在于，含GmBBE-like43蛋白表达促进剂。

8.一种促进植物生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性的方法，其特征在于，通过基因编辑技术，正调控植物中GmBBE-like43基因表达水平或蛋白活性来促进植物根系生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，通过超量表达植物中GmBBE-like43基因，来促进植物根系生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，构建超量表达GmBBE-like43基因的表达载体，转化植株，得到促进植物根系生长和/或提高植物对低磷和/或铝毒胁迫耐受性的转基因植株。