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CN114901694A - 抗trop2抗体、抗体-药物缀合物及其应用 - Google Patents

抗trop2抗体、抗体-药物缀合物及其应用 Download PDF

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CN114901694A
CN114901694A CN202080091216.7A CN202080091216A CN114901694A CN 114901694 A CN114901694 A CN 114901694A CN 202080091216 A CN202080091216 A CN 202080091216A CN 114901694 A CN114901694 A CN 114901694A
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CN
China
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antibody
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val
thr
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CN202080091216.7A
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秦刚
杨冬
时丽丽
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Genequantum Healthcare Suzhou Co Ltd
Original Assignee
Genequantum Healthcare Suzhou Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明提供新颖的抗TROP2抗体、新颖的抗体‑药物缀合物及其制备方法，以及所述抗体和所述抗体‑药物缀合物在治疗方面的应用。

Description

抗TROP2抗体、抗体-药物缀合物及其应用
本申请要求2019年12月31日提交的国际专利申请号PCT/CN2019/130780的优先权，其公开内容整体援引加入本文。
技术领域
本发明涉及生物药物领域。具体地，本发明提供了抗TROP2抗体、抗体-药物缀合物及其制备方法，以及所述抗体和所述抗体-药物缀合物在治疗方面的应用。
背景技术
人滋养层细胞表面抗原2(Trophoblast antigen 2，TROP2，又称为GA733-1、EGP-1、MIS1)为单次跨膜糖蛋白，由基因TACSTD 2(tumor-associated calcium signaltransducer 2)编码(Bignotti E et al.,BMC Clinical Pathology,2012；12:22)。它包含一段N端前导肽、一段胞外结构域、一段跨膜结构域、一段胞内结构域以及一段胞内尾(Fornaro M et al.,International Journal of Cancer,1995,62(5):610-618)。TROP2转导细胞内钙离子信号，后者转而激活多种在细胞增殖、生存、迁移和侵袭中起重要作用的信号通路。TROP2在多种晚期上皮癌中高表达，包括胰腺癌、胃癌和结直肠癌。TROP2过表达与癌症患者的较差预后以及肿瘤的侵略性和转移相关(Shvartsur A,Bonavida B.Genes andCancer,2015:84-105)。因此，TROP2为极具吸引力的晚期癌症(例如上皮癌)的治疗靶标(Cubas R,et al.,Biochimica et Biophysica Acta,2009,1796(2):309-314)。抗TROP2抗体在晚期癌症的治疗中具有巨大的潜力。
已经报道了几种针对TROP2的抗体、抗体-药物缀合物(ADC)和组合疗法。处于癌症治疗的临床试验阶段的ADC之一为Sacituzumab Govitecan(Immunomedics的IMMU-132或hRS7-SN-38，美国专利号US 9,770,517及US 10,413,539)，其中人源化抗TROP2抗体hRS7与毒素SN-38缀合。
虽然TROP2具有作为治疗靶标的潜力，但关于优选的疾病类型、优选的治疗组合、药物递送方法和副作用谱，仍有很多未知之处。需要新的可选的靶向TROP2的疗法。
发明内容
在一方面，本发明提供了一种抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中所述VL包含：
(i)CDR-L1，其具有SEQ ID No.1的氨基酸序列，
(ii)CDR-L2，其具有SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的氨基酸序列，
(iii)CDR-L3，其具有SEQ ID No.4的氨基酸序列；和
其中所述VH包含：
(i)CDR-H1，其具有SEQ ID No.5的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其具有SEQ ID No.9的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述VL具有与SEQ ID No.10、11、12或13具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述VH具有与SEQ ID No.14、15或16具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗TROP2抗体包含轻链(LC)，其中所述LC具有与SEQ IDNo.17、18、19或20具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗TROP2抗体包含重链(HC)。在一个示例性的实施方案中，所述HC具有与SEQ ID No.21、22或23具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗TROP2抗体包含VL和VH，其中所述VL和VH分别具有以下氨基酸序列：SEQ ID No.10和SEQ ID No.14；SEQ ID No.11和SEQ ID No.14；SEQ ID No.12和SEQ ID No.14；SEQ ID No.12和SEQ ID No.15；SEQ ID No.12和SEQ ID No.16；SEQ IDNo.13和SEQ ID No.14；SEQ ID No.13和SEQ ID No.15；SEQ ID No.10和SEQ ID No.15；SEQID No.10和SEQ ID No.16；SEQ ID No.11和SEQ ID No.15；SEQ ID No.11和SEQ ID No.16；或SEQ ID No.13和SEQ ID No.16。
在一些实施方案中，所述抗TROP2抗体包含LC和HC，其中所述LC和HC分别具有以下氨基酸序列：SEQ ID No.17和SEQ ID No.21；SEQ ID No.18和SEQ ID No.21；SEQ ID No.19和SEQ ID No.21；SEQ ID No.19和SEQ ID No.22；SEQ ID No.19和SEQ ID No.23；SEQ IDNo.20和SEQ ID No.21；SEQ ID No.20和SEQ ID No.22；SEQ ID No.17和SEQ ID No.22；SEQID No.17和SEQ ID No.23；SEQ ID No.18和SEQ ID No.22；SEQ ID No.18和SEQ ID No.23；或SEQ ID No.20和SEQ ID No.23。
本发明还提供了一种编码本文所述的抗TROP2抗体或抗原结合片段的核酸或包含所述核酸的载体。在一些实施方案中，可以将所述核酸克隆到一个或多个载体中。在一优选实施方案中，所述载体是表达载体。本发明还提供了用本文所述至少一种核酸或载体转化的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过连接子缀合的抗体和治疗剂，其中所述连接子选自LU102、LU104和LU104’，其具有如下结构：
Figure BDA0003720505410000031
在一些实施方案中，本发明的ADC具有式(1)或式(1’)的结构或者为其混合物：
Figure BDA0003720505410000032
Figure BDA0003720505410000041
其中A为抗体，例如，抗TROP2抗体；优选地，所述抗体选自Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063、Ab0064和Ab0002。
在另一些实施方案中，本发明的ADC具有式(2)或式(2’)的结构或者为其混合物：
Figure BDA0003720505410000042
其中A1为抗体，例如，抗TROP2抗体；优选地，所述抗体选自Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063、Ab0064和Ab0002。
本发明还提供了一种抗体-药物缀合物(ADC)，其包含本文所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与至少一种治疗剂缀合。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、编码所述抗体或其抗原结合片段的治疗性核酸或表达载体、抗体-药物缀合物和/或表达靶向TROP2的CAR的免疫细胞。
在另一方面，本发明提供了一种治疗患有疾病的受试者的方法，所述疾病以TROP2阳性病变细胞为表征，其中所述方法包括向有需要的受试者给药治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段、核酸或表达载体、抗体-药物缀合物或表达靶向TROP2的CAR的免疫细胞或者药物组合物。
附图说明
图1描述了人种系抗体的VL或VH序列。
图2描述了(a)本发明的人源化VL区的序列比对；和(b)本发明的人源化VH区的序列比对。
图3描述了ADC DG1002和DG1004的体内肿瘤抑制功效。
图4描述了ADC DG202的体内肿瘤抑制功效。
具体实施方式
一般定义和术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同含义。另外，涉及蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学和免疫学的术语和实验方法是本领域广泛使用的那些术语和普通方法。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，表述“至少一个”或“一个或多个”是指一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多。如本文所用，除非明确指出相反的含义，否则“一个”和“一种”应理解为表示“至少一个”或“至少一种”。
如本文所用，术语“抗原(Ag)”是可以在体内触发免疫应答，特别是触发抗体产生的任何物质。如本文所用，该术语是指包含抗体特异性结合的表位(即，抗原决定簇)的任何物质。抗原可以是多肽、脂质、碳水化合物、多核苷酸等。在一个具体的实施方案中，抗原是指TROP2蛋白或其片段，其包含与本发明的抗体或抗原结合片段结合的表位。TROP2蛋白或其片段可以是任何种类的，例如人、鼠和兔等。
如本文所用，术语“抗体(Ab)”是通过至少一个抗原结合位点(即互补位)特异性结合抗原表位的免疫球蛋白(Ig)分子或其片段。“常规”或“全长”抗体通常由四条多肽组成：两条重链(HC)和两条轻链(LC)。从氨基末端到羧基末端，每条轻链均包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。从氨基末端到羧基末端，每条重链均包含重链可变区(VH)和一个或多个重链恒定区(CH)，其可包括CH1、CH2、CH3和CH4。当被木瓜蛋白酶消化时，可将全长抗体切割成两个Fab片段(即，抗原结合片段)和一个Fc区(即，可结晶片段)。每个Fab片段基本上包含一条轻链和一个重链可变区和一个重链恒定区(即VH-CH1，也称为Fd)，其中VL和VH形成抗原结合位点(也称为可变区片段，Fv)，并且CL和CH1通过二硫键共价连接。可以通过多肽连接子将VL和VH共价连接以形成单链Fv片段(scFv)。Fv或scFv可以通过在VL和VH之间引入链间二硫键以生成二硫键稳定的可变片段(dsFv)或单链二硫键稳定的可变片段(scdsFv，带有连接肽和链间二硫键)。通过将轻链和Fd片段与多肽连接子连接可生成单链Fab(scFab)片段。Fc区基本上包含两条重链的其余重链恒定区(即CH2-CH3或CH2-CH3-CH4)，在铰链区通过二硫键共价连接。另一种蛋白酶胃蛋白酶切割抗体以产生F(ab’)2片段。F(ab’)2片段基本上包含两个通过二硫键在铰链区连接的Fab片段。Fab’片段是F(ab’)2片段的一半，它是通过还原F(ab’)2片段铰链区的二硫键形成的。
每个VL和VH具有三个高变的“互补决定区(CDR)”和四个相对保守的“构架区(FR)”，从氨基端(N端)到羧基端(C端)的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本领域技术人员使用本领域的方法，例如Kabat或Chothia编号，可知道并可鉴定CDR和FR(参见例如Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242；和Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。每个CDR形成一个CDR环(CDR loop)并在抗原结合的特异性和亲和力中起作用。框架区残基形成支架并维持Fv结构域的整体结构。通常在人源化抗体设计期间发现的一些关键框架区残基，被称为“游标区残基(vernier zone residue)”，对抗体的亲和力很重要，并且通常在抗体人源化过程中得以保留。六个CDR环(即来自VL和VH的三个CDR)在FR的帮助下形成三维结构，所述三维结构定义了抗体的互补位或抗原结合位点。根据在VL或VH中的位置，CDR被称为重链可变区CDR(CDR-H)，例如CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；或轻链可变区CDR(CDR-L)，例如CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3。
如本文所用，对于抗体或抗原结合片段来说，“亲和力”是抗体或抗原结合片段的互补位与表位(即同源抗原)结合的强度的量度。通常，通过平衡解离常数KD测量和报告抗体的亲和力。KD可以使用以下公式从动力学分析中计算得出：
KD＝Kd/Ka，
其中Kd和Ka分别为抗原和抗体之间的解离速率常数和结合速率常数。
KD和亲和力成反比，即KD值越小，亲和力越大。抗体或抗原结合片段的典型KD值在μM(10-6M)至nM(10-7至10-9M)的范围内。可以使用标准动力学分析方法来测量Kd和Ka，包括但不限于免疫测定、表面等离振子共振(SPR)(Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11:54；Englebienne(1998)Analyst.123:1599)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定法(参见，例如，Paul,W.E.,FundamentalImmunology,2nd ed.,Raven Press,New York,pages 332-336(1989)；还参见美国专利号US7,229,619)。实时检测和监测结合率的仪器和方法是已知的并且是可商购的(例如，瑞典乌普萨拉Biacore AB的BiaCore 2000)。
如本文所用，“特异性结合”是指抗体或抗原结合片段与其同源抗原之间的亲和力。通常，抗体以高亲和力特异性地与其同源抗原结合，或以10-7至10-9M或更小的KD值，优选10-8或更小、10-9或更小或10-10或更小的KD值特异性地与其同源抗原结合。
如本文所用，“热稳定性”是当受到热挑战时生物分子维持其结构/功能的能力的量度。热稳定性通常用于评估生物分子的生物物理性质。治疗性生物分子(例如，治疗性抗体)通常受益于良好的热稳定性，例如，延长保质期和血清半衰期，减少对冷链储存的需求，扩大实际应用的范围。通常将热稳定性表示为去折叠中点或疏水性暴露的中点Tm，即生物分子中折叠和去折叠的种群相同时的温度。可使用本领域众所周知的方法在热转变分析中测量Tm，例如，使用差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光法(DSF)。抗体的典型Tm可为约60℃以上、65℃以上、70℃以上、或75℃以上。通常，这样的Tm为约95℃或以下，例如约90℃或以下或者约88℃或以下。
如本文所用，“抗体”的定义涵盖常规抗体、重组抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全人源抗体、非人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、细胞内抗体、双价抗体(diabody)、抗独特型抗体和抗原结合片段。本文提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用，“嵌合抗体”是包含非人源可变区和人源恒定区的抗体。产生嵌合抗体的技术是本领域众所周知的(参见，例如，Jones et al.,1986,Nature,321:522；Sandhu,Crit.Rev.Biotech.,1992,12:437)。
如本文所用，“人源化抗体”是衍生自非人源抗体的抗体，其序列被修饰以增加与人免疫球蛋白分子的序列相似性。与非人源抗体相比，人源化抗体在人体内的免疫原性较低。可使用本领域熟知的技术将嵌合抗体人源化(参见，例如，Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81(21):6851-6855；Neuberger et al.(1984)Nature 312:604-608)。
如本文所用，抗体的“抗原结合片段”是指全长抗体的任何部分，其包含抗体的可变结构域的至少一部分(例如一个或多个CDR)，并且与所述全长抗体特异性结合至相同的同源抗原。如本文所述的抗原结合片段可通过全长抗体的酶处理和/或合成方法来产生，例如通过将抗体的CDR移植到另一抗体的框架中而产生的重组抗体。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、scFv、dsFv、scdsFv、双价抗体、Fab、scFab、Fab’、F(ab’)2和其他片段。抗原结合片段通常包含至少或大约50个氨基酸，并且通常包含至少或大约200个氨基酸。
如本文所用，“抗体”或“抗原结合片段”包含至少一个抗原结合位点或互补位。因此，“抗体”或“抗原结合片段”的定义涵盖源自如上所述的任何抗体或任何抗原结合片段的任何变体，例如氨基酸序列变体、糖基化变体和共价修饰的变体。
如本文所用，可通过用相应的保守残基取代一个或多个氨基酸残基来产生蛋白的“氨基酸序列变体”，而不影响蛋白的生物学活性。氨基酸的合适的保守取代是本领域技术人员已知的。本领域技术人员认识到，通常多肽非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变其生物学活性(参见，例如，Watson et al.,Molecular Biology of the Gene,4thEdition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224)。
如本文所用，“糖基化”是指蛋白的翻译后修饰，其导致向蛋白主链添加碳水化合物或聚糖部分(例如，O-连接的聚糖(例如，丝氨酸或苏氨酸-连接的糖基化)和N-连接的聚糖(例如，天冬酰胺-连接的糖基化))。本领域技术人员能够使用本领域已知的技术产生治疗性抗体的糖基化变体，以实现所需的治疗效果。如本文所用，可通过共价连接引入天然或非天然氨基酸、化合物或肽连接子而产生抗体或抗原结合片段的“共价修饰的变体”。因此，抗体或抗原结合片段包括具有与免疫球蛋白抗原结合域同源或基本同源的抗原结合域的任何蛋白。
如本文所用，“多肽”是指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用。
“宿主细胞”可为含有外源多核苷酸的任何原核或真核细胞。
如本文所用，“核酸”或“多核苷酸”是指通过磷酸二酯键连接在一起的至少两个核苷酸或核苷酸衍生物的聚合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。可以以载体的形式将外源核酸导入宿主细胞。可将治疗性核酸导入受试者体内以治疗疾病。如本文所用，治疗性核酸，例如载体，包含编码如本文所述的任何抗TROP2抗体或抗原结合片段的核酸。
如本文所用，术语“表达”是指通过转录产生RNA多核苷酸或通过翻译产生多肽。可使用本领域已知的任何方法来检测生物样品中多肽的表达水平。这类方法包括但不限于使用与待检测多肽特异性结合的抗体进行的酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、流式细胞术、免疫荧光成像和免疫组化。
如本文所用，“载体”是用于将外源核酸转移到宿主细胞中的介质，外源核酸可在宿主细胞中扩增或表达。如本文所用，“载体”的定义涵盖质粒、线性化质粒、病毒载体、粘粒、噬菌体载体、噬菌粒、人工染色体(例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体)等。如本文所用，载体可在宿主细胞内表达和/或复制，意味着载体能够在宿主细胞中表达RNA多核苷酸或多肽和/或产生载体的多个拷贝。为了“表达”或“复制”，载体可包含与启动子可操作连接的核酸序列或元件。如本文所用，对于核酸序列或元件来说，“可操作地连接”是指这些核酸序列在功能上彼此相关。例如，启动子可与编码多肽的核酸序列可操作地连接，从而调节或介导核酸的转录。本领域技术人员可为特定目的选择和使用适当的载体。
如本文所用，术语“负载物(payload)”是指包含在本发明的缀合物中的功能部分，例如通过连接子连接的方式。负载物可选自小分子化合物、核酸及类似物、示踪分子(包括荧光分子等)、短肽、多肽、拟肽和蛋白。在一实施方案中，负载物选自小分子化合物、核酸分子和示踪分子。在一优选的实施方案中，负载物选自小分子化合物。在一更优选的实施方案中，负载物选自细胞毒素及其片段。
负载物的非限制性实例可以是治疗剂。“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗作用的物质。治疗剂的实例包括但不限于通常为细胞毒素的小分子药物(例如，Mertansine(DM1)，monomethyl auristatin F(MMAF，单甲基奥利斯他汀F)，monomethyl auristatin D(MMAD，单甲基奥利斯他汀D)和monomethyl auristatin E(单甲基奥利斯他汀E，MMAE))、寡核苷酸及其类似物(例如干扰RNA)、生物活性肽(例如胰高血糖素样肽-1)、治疗性抗体、蛋白毒素(例如白喉毒素)和酶(例如脲酶)。
“细胞毒素”是指抑制或阻止细胞的表达活性、细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。细胞毒素的实例包括但不限于靶向以下靶标的药物：微管细胞骨架、DNA结构或DNA合成或修复、RNA合成、蛋白质合成、驱动蛋白介导的蛋白质转运、细胞凋亡。靶向微管细胞骨架的药物可为，例如，微管稳定剂或微管蛋白聚合抑制剂。微管稳定剂的实例包括但不限于紫杉烷。微管蛋白聚合抑制剂的实例包括但不限于美登木素类(maytansinoids)、奥利斯他汀类(auristatins)、长春碱类、秋水仙碱类和海兔毒素类。靶向DNA的药物例如可为直接破坏DNA结构的药物或拓扑异构酶抑制剂，例如DNA双链破坏剂(DNA double strand breaker)、DNA烷化剂、DNA嵌入剂(DNA intercalator)。DNA双链破坏剂例如可以为烯二炔抗生素，包括但不限于达内霉素(dynemicin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、uncialamycin等。DNA烷化剂例如可以为DNA双烷化剂(bis-alkylator，即DNA交联剂(DNA-cross linker))或DNA单烷化剂(mono-alkylator)。DNA烷化剂的实例包括但不限于吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮
Figure BDA0003720505410000091
类(PBD)二聚体、1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚体、CBI-PBD异二聚体、二氢吲哚并-苯二氮
Figure BDA0003720505410000092
(IGN)二聚体、duocarmycin类化合物等。拓扑异构酶抑制剂的实例包括但不限于喜树碱类、蒽环类抗生素(anthracycline)。靶向RNA的药物例如可以为抑制剪接的药物，其实例包括但不限于普拉地内酯(pladienolide)。靶向驱动蛋白介导的蛋白质转运的药物例如可以为有丝分裂驱动蛋白抑制剂，包括但不限于纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂。
间隔子是位于不同结构模块之间并且可以在空间上分隔结构模块的结构。间隔子的定义不限于其是否具有特定功能或是否可裂解或可降解。间隔子的实例包括但不限于氨基酸和非氨基酸结构，其中非氨基酸结构可以是但不限于氨基酸衍生物或类似物。“间隔子序列”是指作为间隔子的氨基酸序列，其实例包括但不限于如Leu、Gln等的单个氨基酸，含有多个氨基酸的序列，例如，含有两个氨基酸的序列，如GA等，或例如GGGS、GGGGSGGGGS等。间隔子的其他实例包括，例如，自降解(self-immolative)间隔子，如PAB(对氨基苄基)等等。
如本文所用，“Sortase识别序列”或“Sortase供体序列”是指由Sortase酶识别的氨基酸序列，所述Sortase酶使得其与Sortase受体序列缀合。Sortase受体序列的实例不限于N-末端寡聚甘氨酸、寡聚丙氨酸和聚合度为3-10的寡聚甘氨酸/丙氨酸。例如，寡聚甘氨酸序列可以是Gn序列，其中G是Gly，n是3-10的整数。Sortase识别序列对应于Sortase的类型。例如，来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Sortase A的Sortase识别序列可以是LPXTGJ，其中L是Leu，P是Pro，X是任何天然或非天然氨基酸，T是Thr，G是Gly，并且J不存在或为包含1-10个氨基酸的氨基酸片段。包含Sortase识别序列的部分(如本发明的抗体)可以缀合至包含Sortase受体序列的部分(例如，连接子-负载物中间体，其由连接子(如LU102、LU104或LU104’)和如本文所述的治疗剂在相应Sortase的催化下获得)。例如，在Sortase A介导的缀合反应(如来自金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌的Sortase A)中，第一部分(例如，在轻链的C末端包含LPETGG序列的抗体)所包含的LPXTGJ序列中的Thr和Gly之间的肽键被Sortase A裂解，所得中间体通过形成新的Thr-Gly肽键连接到第二部分(例如，包含Gn的连接子-负载物中间体，如本文所述的IM102或IM104)所包含的Gn的游离N端，因此两个部分通过形成LPXTGn连接。Gn和LPXTGJ如上文所定义。
如本文所用，“序列同一性”具有本领域公认的含义，两个核酸或多肽之间的序列同一性百分比可通过使用公开的算法(例如基本局部比对搜索工具(BLAST)和快速自适应收缩/阈值算法(FASTA))比对两个序列来计算。(参见，例如Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994)。尽管有许多方法可以测量两个多核苷酸或多肽之间的同一性，但术语“同一性”是技术人员众所周知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM JApplied Math48:1073(1988))。
如本文所用，“治疗”患有疾病或病症的受试者是指向受试者给药或施用组合物、手术或治疗方案以试图治愈所述疾病或病症，或阻止、减轻、改善或消除所述疾病或病症的症状。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。“预防”是指防止潜在的疾病和/或防止症状恶化或疾病进展。如本文所用，治疗还包括如本文所提供的任何抗体或其抗原结合片段或药物组合物的任何药物用途。所述疾病的非限制性实例包括但不限于TROP2阳性癌症，优选上皮癌，包括但不限于胃癌、乳腺癌、尿路上皮癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、头颈癌和卵巢癌。
如本文所用，“受试者”的定义包括人和非人受试者，例如实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠和非人灵长类动物)，优选人。
如本文所用，“治疗作用”是指由于受试者的治疗所产生的改变疾病或病症的症状的作用，通常是改善或消除疾病或病症的症状的作用。
如本文所用，“治疗有效量”是指包含一种或多种活性剂的药剂、化合物或组合物的量，其在施用于受试者后至少足以产生治疗作用。因此，它是预防、治愈、改善、阻止或部分阻止疾病或病症的症状所必需的量。
在本说明书的上下文中，VL中氨基酸的位置定义如下：(i)基于SEQ ID No.10-13中的任何一个，因为它们具有相同的长度；(ii)从N端开始；(iii)将从N端开始第一个氨基酸的位置指定为1。基于SEQ ID No.14-16中的任何一个，类似地定义VH中的氨基酸位置，因为它们具有相同的长度。
抗TROP2抗体或其抗原结合片段
在一方面，本发明提供了一种抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(VL)，其中所述VL具有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在本发明一实施方案中，所述VL包含：
(i)CDR-L1，其具有SEQ ID No.1的氨基酸序列，
(ii)CDR-L2，其具有SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的氨基酸序列，
(iii)CDR-L3，其具有SEQ ID No.4的氨基酸序列。
在本发明的另一实施方案中，所述VL具有与SEQ ID No.10、11、12或13具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL具有与SEQ ID No.10、11、12或13具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一优选实施方案中，所述VL具有SEQ ID No.10、11、12或13的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含轻链(LC)。在一个示例性的实施方案中，所述LC具有与SEQ ID No.17、18、19或20具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述LC具有与SEQ ID No.17、18、19或20具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一优选实施方案中，所述LC具有SEQ ID No.17、18、19或20的氨基酸序列。
本发明的抗TROP2抗体包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含：
(i)CDR-H1，其具有SEQ ID No.5的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其具有SEQ ID No.9的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述VH具有与SEQ ID No.14、15或16具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH具有与SEQ ID No.14、15或16具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。在一优选实施方案中，所述VH具有SEQ ID No.14、15或16的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含重链(HC)。在一个示例性的实施方案中，所述HC具有与SEQ ID No.21、22或23具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HC具有与SEQ ID No.21、22或23具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。在一优选实施方案中，所述HC具有SEQ ID No.21、22或23的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含VL和VH，其中所述VL和VH如上文所定义。
在一具体实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含LC和HC，其中所述LC和HC如上文所定义。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含VL和VH，所述VL包含具有SEQ IDNo.1的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ ID No.4的氨基酸序列的CDR-L3；所述VH包含具有SEQ ID No.5的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ IDNo.6的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID No.9的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含VL和VH，所述VL包含具有SEQ IDNo.1的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ ID No.4的氨基酸序列的CDR-L3；所述VH包含具有SEQ ID No.5的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ IDNo.7的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID No.9的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含VL和VH，所述VL包含具有SEQ IDNo.1的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ ID No.4的氨基酸序列的CDR-L3；所述VH包含具有SEQ ID No.5的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ IDNo.8的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID No.9的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含VL和VH，所述VL包含具有SEQ IDNo.1的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID No.3的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ ID No.4的氨基酸序列的CDR-L3；所述VH包含具有SEQ ID No.5的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ IDNo.6的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID No.9的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含VL和VH，所述VL包含具有SEQ IDNo.1的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID No.3的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ ID No.4的氨基酸序列的CDR-L3；所述VH包含具有SEQ ID No.5的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ IDNo.7的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID No.9的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含VL和VH，所述VL具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID No.3的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ ID No.4的氨基酸序列的CDR-L3；所述VH包含具有SEQ ID No.5的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID No.8的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID No.9的氨基酸序列的CDR-H3。
在一个更具体的实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含VL和VH，其中所述VL和VH分别具有以下氨基酸序列：SEQ ID No.10和SEQ ID No.14(对应于Ab0052)；SEQ ID No.11和SEQ ID No.14(对应于Ab0053)；SEQ ID No.12和SEQ ID No.14(对应于Ab0054)；SEQ IDNo.12和SEQ ID No.15(对应于Ab0061)；SEQ ID No.12和SEQ ID No.16(对应于Ab0062)；SEQ ID No.13和SEQ ID No.14(对应于Ab0063)；SEQ ID No.13和SEQ ID No.15(对应于Ab0064)；SEQ ID No.10和SEQ ID No.15；SEQ ID No.10和SEQ ID No.16；SEQ ID No.11和SEQ ID No.15；SEQ ID No.11和SEQ ID No.16；或SEQ ID No.13和SEQ ID No.16。
在一个更具体的实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含LC和HC，其中所述LC和HC分别具有以下氨基酸序列：SEQ ID No.17(或SEQ ID No.27)和SEQ ID No.21(对应于Ab0052)；SEQ ID No.18(或SEQ ID No.28)和SEQ ID No.21(对应于Ab0053)；SEQ ID No.19(或SEQ ID No.29)和SEQ ID No.21(对应于Ab0054)；SEQ ID No.19(或SEQ ID No.29)和SEQ ID No.22(对应于Ab0061)；SEQ ID No.19(或SEQ ID No.29)和SEQ ID No.23(对应于Ab0062)；SEQ ID No.20(或SEQ ID No.30)和SEQ ID No.21(对应于Ab0063)；SEQ ID No.20(或SEQ ID No.30)和SEQ ID No.22(对应于Ab0064)；SEQ ID No.17(或SEQ ID No.27)和SEQ ID No.22；SEQ ID No.17(或SEQ ID No.27)和SEQ ID No.23；SEQ ID No.18(或SEQ IDNo.28)和SEQ ID No.22；SEQ ID No.18(或SEQ ID No.28)和SEQ ID No.23；或SEQ IDNo.20(或SEQ ID No.30)和SEQ ID No.23。
在一具体实施方案中，本发明的抗体如表1所示。
表1
Figure BDA0003720505410000131
注：表中的数字指的是相应的SEQ ID号，例如10是指SEQ ID No.10。
在一些优选的实施方案中，本发明的抗体为全长抗体。在一些实施方案中，所述抗体为抗原结合片段，其包含全长抗体的至少一个抗原结合位点。在一些实施方案中，本发明的抗体为IgG。在一优选实施方案中，所述抗体为人源化抗体。
所述抗体特异性结合TROP2。在一些实施方案中，TROP2为具有本发明的抗体结合的表位的全长蛋白或其片段。TROP2可以是人或非人的TROP2，例如大鼠、小鼠、兔TROP2，优选人TROP2。
可以修饰本发明的抗体或抗原结合片段(例如，轻链或重链)，如添加一种或多种附加元件以掺入ADC。这类元件的非限制性实例可以是活性基团、天然或非天然氨基酸、肽或其组合。
可以将附加元件引入到本发明的抗体或抗原结合片段中以用于各种目的。在一些实施方案中，附加元件是活性基团，使得抗体或抗原结合片段可以通过活性基团与负载物缀合生成抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，附加元件是肽，如本文所述的连接酶识别序列(例如，Sortase识别序列(LPETGG))、信号肽或间隔子序列(例如，GA)或其组合。
附加元件的引入位置不受限制，例如，可以但不限于在抗体的重链或轻链的C末端或者N末端。在一具体实施方案中，可以将Sortase识别序列(LPETGG)和间隔子序列(GA)(一起作为GALPETGG，对应于SEQ ID No.25)添加到轻链的C末端。在一具体实施方案中，在SEQID No.27-30的C末端引入Sortase识别序列和间隔子序列(一起作为GALPETGG，对应于SEQID No.25)，分别得到SEQ ID No.17-20。因此，具有或不具有上述附加元件的抗体或抗原结合片段(例如，轻链或重链)涵盖在本发明的范围内，并且本领域技术人员应该理解，例如，当提及轻链的序列时，它可以指具有或不具有附加元件，如SEQ ID No.25。例如，根据轻链序列的描述，SEQ ID No.27-30分别等同于SEQ ID No.17-20。
对本发明的抗体或抗原结合片段进行如上修饰形成的抗体或抗原结合片段涵盖在本发明的范围内。
核酸、载体和宿主细胞
在另一方面，本发明提供了一种核酸，其编码本发明的抗TROP2抗体或抗原结合片段。本发明还提供了包含所述核酸的载体。在一些实施方案中，可将本发明的核酸克隆到一个或多个载体中。在一些优选的实施方案中，所述载体是表达载体，例如用于在细菌、酵母或哺乳动物细胞中表达的质粒，或用于噬菌体展示的噬菌体载体和噬菌粒载体。
本发明还提供了用至少一个如上所述的核酸或载体转化的宿主细胞。本文的宿主细胞可用于产生本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段。宿主细胞的实例包括但不限于例如细菌的原核细胞、例如酵母菌的低等真核细胞、例如哺乳动物细胞的高等真核细胞。
本发明的核酸可从各种来源获得，例如，噬菌体展示文库、酵母展示文库、杂交瘤细胞(例如，小鼠B细胞杂交瘤细胞)和合成的方法。从所述文库或杂交瘤细胞获得本发明的核酸的方法是本领域众所周知的。
在一些实施方案中，将本发明的核酸制备为重组核酸，其包含另外的核酸序列，例如调控元件和编码所需肽或蛋白的核酸序列。可使用本领域众所周知的分子克隆技术制备包含本发明的核酸的所述重组核酸，例如化学合成、定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术(参见Sambrook,J.,E.F.Fritsch,and T.Maniatis.(1989).Molecular cloning:alaboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。所述调节元件可调节抗体或抗原结合片段的表达，其包括但不限于增强子、绝缘子(insulator)、内部核糖体进入位点(IRES)。所述肽或蛋白可促进所表达的抗体或片段的检测或分离，其包括但不限于亲和标签(例如生物素标签、聚组氨酸标签(His6)或谷胱甘肽S-转移酶(GSH)标签、酶可切割的肽和报告蛋白(例如荧光蛋白))。在一些实施方案中，可将本发明的核酸和所述调节元件和/或编码所需肽或蛋白的核酸序列可操作地连接至启动子。根据所用宿主细胞的类型和纯化策略，本领域技术人员能够选择合适的表达载体、启动子、调节元件以及肽或蛋白。
本发明还提供了一种在宿主细胞中产生本发明的抗TROP2抗体或抗原结合片段的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)用至少一种本文所述的核酸或表达载体转化宿主细胞，
(ii)在合适的条件下培养转化的宿主细胞以允许所述核酸或表达载体表达，和任选地
(iii)从宿主细胞或培养基中分离和纯化本发明的抗体或抗原结合片段。
转化宿主细胞的方法是本领域众所周知的，包括但不限于磷酸钙转染、二乙氨基乙基葡聚糖转染、电穿孔、脂质体转染和噬菌体感染(参见例如Maniatis et al.(1982)(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor,N.Y.)和Primrose and Old(1980)(Principles of Gene Manipulation,Blackwell,Oxford)。
可以稳定或瞬时转化宿主细胞。在一些实施方案中，可使用同时包含编码重链和轻链的核酸的单个载体。在一特定实施方案中，使用两个载体，其中一个载体编码所述抗体的轻链，而另一个编码所述抗体的重链。在一些实施方案中，所述表达载体可进一步包含一种或多种选择性标记基因，例如新霉素或嘌呤霉素抗性基因。在一些实施方案中，可以将伴侣质粒与上述表达载体一起导入同一宿主细胞中，例如导入细菌中，以帮助抗体的增溶和/或折叠。可使用本领域众所周知的技术进行抗体的分离和纯化，例如，使用蛋白A亲和柱。
细菌(例如，大肠杆菌BL21(DE3))对于表达较小的抗原结合片段，例如Fv，scFvs，Fab和Fab'片段特别有利。在一些实施方案中，将编码两个可变结构域的核酸序列克隆到单个载体中并导入大肠杆菌BL21(DE3)。适合于抗体表达的哺乳动物宿主细胞包括但不限于骨髓瘤细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和其他适于表达抗体的哺乳动物细胞。在一个特定的实施方案中，用两个表达载体转化哺乳动物宿主细胞，每个表达载体编码抗TROP2抗体的重链和轻链，并且表达的抗体使用蛋白A(protein A)亲和柱纯化。
在一些其他实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或抗原结合片段可以使用本领域已知的技术从文库中分离，例如酵母展示文库或噬菌体展示文库(参见，例如，Winter etal.,(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455and McCafferty et al.,(1990)Nature 348:552-553)。
非人源抗体的人源化
本发明的抗体或抗原结合片段可由非人源抗体例如嵌合抗体产生，例如，可如下制备：首先，使用已知完善的结构作为模板对嵌合抗体的VL和VH区进行分子建模。可从公共数据库(例如，蛋白质数据库(PDB))获得模板信息；同时，将嵌合抗体的VL和VH序列与抗体基因数据库(例如，国际免疫遗传学数据库(international ImMunoGeneTics informationsystem，IMGT)或国家生物技术信息中心的Igblast工具(NCBI))中的人抗体种系基因进行同源性搜索；然后，选择与嵌合抗体的VL和VH序列具有最高序列同一性的人种系基因作为框架(FR)供体。最后，将嵌合抗体的CDRs移植到人种系基因的相应区域中。为了保持人源化抗体的稳定性和抗原特异性，可在人源FR区域引入回复突变，其中一些人源FR残基被嵌合抗体中的对应残基代替。
抗体-药物缀合物
本发明还提供了一种抗体-药物缀合物(ADC)，其包含本发明的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与至少一种治疗剂缀合。在一些实施方案中，治疗剂与抗体连接，任选地共价连接。可用于共价缀合的活性基团可由抗体的氨基酸残基的侧链或抗体的修饰基团提供，例如胺、羧基、苯基、硫醇或羟基。优选地，治疗剂与抗体或抗原结合片段的缀合不干扰抗体抗原结合。在一些实施方案中，治疗剂和抗体通过连接子(任选地共价)连接。连接子可为可裂解的或不可裂解的。可裂解的连接子的实例包括但不限于：酶可裂解的连接子(例如，肽连接子)、酸不稳定的连接子(例如，腙类(hydrazone)连接子)或可还原的连接子(例如，二硫键连接子)。不可裂解的连接子通过不可还原的键(通常称为硫醚键)与抗体的氨基酸残基相连，这可带来更好的血浆稳定性。优选地，连接子在血清中是稳定的，并且可以被裂解或降解以在细胞中，特别是在靶细胞的溶酶体中释放治疗剂。在一优选实施方案中，连接子是酶可裂解的，并且可在治疗剂和本发明的抗体或抗原结合片段之间提供共价键。
在一实施方案中，所述治疗剂是细胞毒素，其中所述细胞毒素选自长春碱类、秋水仙碱类、紫杉烷类、奥利斯他汀类、美登木素类、calicheamicin、doxorubicin、duocarmycin、SN-38、cryptophycin类似物、deruxtecan、duocarmazine、centanamycin、海兔毒素类(dolastatins)和吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine)(PBD)。
在一具体实施方案中，细胞毒素是奥利斯他汀类，例如MMAE、MMAF、MMAD等。在US20060229253A1中描述了奥利斯他汀类化合物的合成和结构。在一个特定的实施方案中，治疗剂是MMAF或Mertansine(DM1)。
在另一方面，本发明提供了新颖的连接子和它们在ADC生产中的应用。例如，在特定实施方案中，本发明的ADC中的连接子选自LU102、LU104和LU104’，其具有以下结构：
Figure BDA0003720505410000171
在一具体实施方案中，本发明提供了一种抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过连接子缀合的抗体和治疗剂，其中所述连接子选自LU102、LU104和LU104’。
在一实施方案中，本发明提供了一种制备ADC的方法，所述ADC包含通过连接子缀合的抗体和治疗剂，所述方法包括通过巯基部分与马来酰亚胺基部分的反应(例如，其中治疗剂为奥利斯他汀类，例如，MMAD、MMAE或MMAF，其被马来酰亚胺基取代基N-酰化，例如马来酰亚胺烷基酰基(maleimidoalkylacyl)，例如马来酰亚胺基己酰基(mc)，例如mc-MMAF，并且连接子是LU102；或其中ADC中治疗剂是DM1(mertansine)并且连接子是LU104或LU104’)将连接子与治疗剂缀合，其中所述连接子或所述治疗剂中的一个包含马来酰亚胺基部分并且另一个具有巯基部分；将所形成中间体与碱基反应以打开马来酰亚胺环；用sortase催化偶联将这个开环中间体与抗体偶联；和回收所形成的ADC。
在一具体实施方案中，所述连接子为LU104或LU104’，其包含马来酰亚胺基部分，所述治疗剂具有巯基部分，并且通过巯基部分与马来酰亚胺基部分的反应将所述连接子与所述治疗剂缀合以形成硫代琥珀酰亚胺。所述治疗剂本身可包含巯基部分(例如，DM1)或衍生为包含巯基部分。应当理解，有或没有衍生化的治疗剂涵盖在负载物的定义中。
在一具体实施方案中，通过将连接子与治疗剂(负载物)缀合形成的中间体具有式(I-1)或式(I-2)的结构：
Figure BDA0003720505410000181
在一具体实施方案中，如式(I-1)所示的中间体通过将连接子LU102与治疗剂缀合形成。在一具体实施方案中，如式(I-2)所示的中间体通过将连接子LU104’与治疗剂缀合形成。
在一具体的实施方案中，将如式(I-2)所示的中间体与碱反应以打开马来酰亚胺环，从而形成如式(I-2-1)或式(I-2-2)所示的开环中间体：
Figure BDA0003720505410000191
在一具体实施方案中，通过将如式(I-1)所示的中间体与抗体偶联形成的ADC具有式(Ⅱ-1)的结构：
Figure BDA0003720505410000192
其中z为1-20的整数；
A为抗体。
在一具体实施方案中，z为1-10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一具体实施方案中，z为2。
在一具体实施方案中，通过将如式(I-2-1)所示的开环中间体与抗体偶联形成的ADC具有式(Ⅱ-2-1)的结构：
Figure BDA0003720505410000201
其中z如上所定义；
A1为抗体。
在一具体实施方案中，通过将如式(I-2-2)所示的开环中间体与抗体偶联形成的ADC具有式(Ⅱ-2-2)的结构：
Figure BDA0003720505410000202
其中z如上所定义；
A1为抗体。
在一具体实施方案中，负载物为mc(开环)-MMAF，式(Ⅱ-1)的ADC具有式(1-1)或式(1’-1)的结构：
Figure BDA0003720505410000211
在一具体实施方案中，负载物为DM1，式(Ⅱ-2-1)的ADC具有式(2-1)的结构：
Figure BDA0003720505410000212
在一具体实施方案中，负载物为DM1，式(Ⅱ-2-2)的ADC具有式(2’-1)的结构：
Figure BDA0003720505410000221
在一些实施方案中，ADC中的治疗剂是如上所述的细胞毒素。在一具体实施方案中，所述治疗剂为奥利斯他汀类，例如，MMAD、MMAE或MMAF，其被马来酰亚胺基取代基N-酰化，例如马来酰亚胺烷基酰基，例如马来酰亚胺基己酰基(mc)，例如mc-MMAF；并且连接子为LU102。在一具体实施方案中，治疗剂为DM1(mertansine)并且连接子为LU104或LU104’。
在一些实施方案中，ADC中的抗体是抗TROP2的抗体。在一实施方案中，ADC中的抗体是本发明的抗体或抗原结合片段。在一具体实施方案中，ADC中的抗体是Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063或Ab0064，其包含轻链和重链，所述轻链和重链分别具有以下氨基酸序列：SEQ ID No.27和SEQ ID No.21(Ab0052)；SEQ ID No.28和SEQ ID No.21(Ab0053)；SEQ ID No.29和SEQ ID No.21(Ab0054)；SEQ ID No.29和SEQ ID No.22(Ab0061)；SEQ ID No.29和SEQ ID No.23(Ab0062)；SEQ ID No.30和SEQ ID No.21(Ab0063)或SEQ ID No.30和SEQ ID No.22(Ab0064)(参见表1)。在另一实施方案中，ADC中的抗体是Ab0002。Ab002是一种人源化抗TROP2抗体(序列来源于WHO drug information,INN list 113,Vol.29,No.2,2015)，其包含具有SEQ ID No.33和SEQ ID No.32的氨基酸序列的轻链和重链。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段在制备ADC之前被修饰以包括一种或多种附加元件。这类元件可促进ADC的制备，如连接酶识别序列(如Sortase识别序列，如LPETGG)，用于在连接酶催化下抗体和治疗药物之间的位点特异性缀合，或在抗体和治疗药物之间提供空间分隔，如间隔子(如含有两个氨基酸如GA的间隔子序列等等)。在一些实施方案中，连接酶是Sortase，如Sortase A、Sortase B、Sortase C、Sortase D、Sortase L.plantarum等(US20110321183A1)。
在一实施方案中，Sortase是来自金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌的Sortase A，Sortase识别序列具有LPXTGJ的氨基酸序列，其中X是天然或非天然的任何单个氨基酸；J不存在，或者是任选标记的包含1-10个氨基酸的氨基酸片段。在一实施方案中，J不存在。在又一实施方案中，J是包含1-10个氨基酸的氨基酸片段，其中每个氨基酸独立地是任何天然或非天然氨基酸。在另一实施方案中，J是Gm，其中m是1-10的整数。在另一具体实施方案中，Sortase识别序列是LPETG或LPETGG。在另一实施方案中，Sortase是来自金黄色葡萄球菌的Sortase B，并且Sortase识别序列是NPQTN。在另一实施方案中，Sortase是来自炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的Sortase B，并且Sortase识别序列是NPKTG。在另一实施方案中，Sortase是来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的Sortase亚家族5，并且Sortase识别序列是LAXTG，其中X如上定义。在另一实施方案中，Sortase是来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的Sortase A，并且Sortase识别序列是LPQTSEQ。在一具体实施方案中，在抗体轻链的C末端引入Sortase识别序列(LPETGG)和间隔子序列(GA)(一起作为GALPETGG，对应于SEQ ID No.25)，其中ADC中的抗体是Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063、Ab0064或Ab0002，其包含轻链和重链，所述轻链和重链分别具有以下氨基酸序列：SEQ ID No.17和SEQ ID No.21(Ab0052)；SEQ ID No.18和SEQ ID No.21(Ab0053)；SEQ ID No.19和SEQ ID No.21(Ab0054)；SEQ ID No.19和SEQ ID No.22(Ab0061)；SEQ IDNo.19和SEQ ID No.23(Ab0062)；SEQ ID No.20和SEQ ID No.21(Ab0063)；SEQ ID No.20和SEQ ID No.22(Ab0064)；或SEQ ID No.31和SEQ ID No.32(Ab0002)。
在一些优选的实施方案中，本发明的ADC包含：(i)本发明的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段被修饰以包括连接酶识别序列和/或间隔子序列，和(ii)治疗剂，其中所述治疗剂与连接子偶联；在所述连接酶的催化下，所述抗体或抗原结合片段通过所述连接酶识别序列与所述治疗剂位点特异性偶联。
在一具体实施方案中，本发明的ADC包含：(i)本发明的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段被修饰(如在轻链或重链的N末端或者C末端)以包括Sortase识别序列(LPETGG)和间隔子序列(GA)(一起作为GALPETGG，对应于SEQ ID No.25)，和(ii)选自MMAF和DM1的治疗剂，其中治疗剂与选自LU102、LU104和LU104’的连接子偶联；在Sortase连接酶催化下，所述抗体或抗原结合片段通过Sortase识别序列与所述治疗剂位点特异性偶联。
在一具体实施方案中，本发明ADC中的抗体被修饰(如在轻链或重链的N末端或者C末端)以包括Sortase识别序列和间隔子序列(如具有GALPETGG序列的肽，对应于SEQ IDNo.25)，本发明的ADC中的治疗剂是MMAF，其被mc衍生化以形成mc-MMAF(mc表示马来酰亚胺基己酰基)，连接子是LU102，所述ADC具有如下式(1)或式(1’)所示的结构或者为其混合物：
Figure BDA0003720505410000241
式(1)和式(1’)是异构体，其中A为抗体，例如，抗TROP2抗体；优选地，所述抗体选自Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063、Ab0064或Ab0002。式(1)和式(1’)分别落入式(1-1)和式(1’-1)的范围。
在一具体实施方案中，在式(1)和式(1’)中，所述抗体为Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063或Ab0064，其包含轻链和重链，所述轻链和重链分别具有以下氨基酸序列：SEQ ID No.17和SEQ ID No.21(Ab0052)；SEQ ID No.18和SEQ ID No.21(Ab0053)；SEQ ID No.19和SEQ ID No.21(Ab0054)；SEQ ID No.19和SEQ ID No.22(Ab0061)；SEQ IDNo.19和SEQ ID No.23(Ab0062)；SEQ ID No.20和SEQ ID No.21(Ab0063)；或SEQ ID No.20和SEQ ID No.22(Ab0064)；并且所述ADC分别为DG402、DG502、DG602、DG702、DG802、DG902或DG1002。
在一具体实施方案中，在式(1)和式(1’)中，所述抗体为Ab0002，其包含轻链和重链，所述轻链和重链具有SEQ ID No.31和SEQ ID No.32的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，本发明的ADC中的抗体被修饰以包括Sortase识别序列和间隔子序列(如具有GALPETGG序列的肽，对应于SEQ ID No.25)，本发明ADC中的治疗剂为DM1，所述连接子为LU104或LU104’，所述ADC具有如下式(2)或式(2’)所示的结构或者为其混合物：
Figure BDA0003720505410000251
式(2)和(2’)是异构体，其中A1是抗体，例如抗TROP2抗体，优选地，所述抗体选自Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063、Ab0064和Ab0002。式(2)和式(2’)分别落入式(2-1)和式(2’-1)范围。
在一具体实施方案中，在式(2)和式(2’)中，所述抗体为Ab0052、Ab0053、Ab0054或Ab0064，其包含轻链和重链，所述轻链和重链分别具有以下氨基酸序列：SEQ ID No.17和SEQ ID No.21(Ab0052)；SEQ ID No.18和SEQ ID No.21(Ab0053)；SEQ ID No.19和SEQ IDNo.21(Ab0054)；或SEQ ID No.20和SEQ ID No.22(Ab0064)；并且所述ADC分别为DG404、DG504、DG604或DG1004。
在另一实施方案中，在式(2)和式(2’)中，所述抗体为Ab0002，其包含轻链和重链，所述轻链和重链具有SEQ ID No.31和SEQ ID No.32的氨基酸序列，并且所述ADC为DG202。
在一特定实施方案中，本发明的ADC如表2所示。
表2
Figure BDA0003720505410000252
Figure BDA0003720505410000261
在一些优选的实施方案中，本发明的ADC能够靶向TROP2阳性细胞并由此追踪或杀死靶细胞。在一些更优选的实施方案中，本发明的抗体-药物缀合物选择性地杀死TROP2阳性癌细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞包括胃癌细胞、乳腺癌细胞、尿路上皮癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、头颈癌细胞和卵巢癌细胞。
可使用如上所述的所需治疗剂和连接子以及本发明的抗体或抗原结合片段来制备本发明的ADC。本领域技术人员可根据治疗目的选择合适的连接子、治疗剂和制备方法。
嵌合抗原受体(CAR)和表达CAR的免疫细胞
本发明还提供了靶向TROP2的嵌合抗原受体(CAR)和表达所述CAR的免疫细胞。
本文所述的CAR是工程化的抗原受体，其包含：
(i)胞外结构域，其包含至少一个本发明的抗原结合片段，
(ii)跨膜结构域，和
(iii)免疫效应分子的一个或多个细胞内刺激结构域。
在一些实施方案中，所述至少一个抗原结合片段包含本发明抗体的轻链可变区和重链可变区，优选地，所述轻链可变区和重链可变区与示例性抗体相同。在一些优选的实施方案中，所述至少一个抗原结合片段是包含至少一个本发明的抗原结合片段的单链可变区片段(scFv)，更优选地，所述scFv包含与本发明的示例性抗体相同的轻链可变区和重链可变区。
在一些实施方案中，所述CAR的跨膜结构域可衍生自CD28或CD8α。在一些实施方案中，所述CAR的一个或多个细胞内刺激结构域包含信号结构域，例如衍生自CD3分子(例如，CD3ξ)胞内尾的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，还任选地包括共刺激信号结构域，其可衍生自CD7、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、OX40(CD134)和ICOS等。在一些实施方案中，所述CAR可进一步包含连接胞外结构域和跨膜结构域的铰链和间隔区。在一个最优选的实施方案中，如上所述的CAR既具有针对TROP2阳性细胞的抗原结合特异性，又具有免疫效应分子的效应功能。
本发明还提供了编码任何所述CAR的核酸和表达所述CAR的免疫细胞(例如T细胞)。如上所述的免疫细胞将靶向TROP2阳性病变细胞(例如，TROP2阳性癌细胞)，并被激活以启动效应功能，例如，引起TROP2阳性癌细胞的死亡。
药物组合物和治疗
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段、编码所述抗体或其抗原结合片段的治疗性核酸或表达载体、抗体-药物缀合物和/或表达靶向TROP2的CAR的免疫细胞。
本文提供的药物组合物可以是各种剂型，例如固体、半固体、液体、粉末、溶液或冻干形式。取决于不同剂型，药物组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂(参见如Alfonso R.Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20thEdition.Baltimore,MD:Lippincott Williams&Wilkins)。
用于制备固体剂型药物组合物的赋形剂包括但不限于：稀释剂(例如乳糖、微晶纤维素和右旋糖)、粘合剂和胶粘剂(例如阿拉伯胶、明胶、淀粉糊和羧甲基纤维素)、润滑剂(例如聚乙二醇、硬脂酸钙和硬脂酸)、崩解剂(例如淀粉、纤维素和交联剂聚合物)、防腐剂、媒介物、助流剂(例如玉米淀粉)、甜味剂(例如甘露醇和糖精)、包衣(例如聚维酮、乙基纤维素和合成聚合物)和增塑剂(例如蓖麻油、二乙酰化甘油单酸酯和聚乙二醇)。用于制备半固体剂型药物组合物的赋形剂包括但不限于：结构形成赋形剂(例如鲸蜡硬脂醇和矿物油)、防腐剂(例如苄醇、对羟基苯甲酸丙酯和苯甲酸钠)、抗氧化剂(例如丁基羟基甲苯和丁基羟基茴香醚)、增溶剂(例如羊毛脂和胆固醇)、胶凝剂(例如羧基甲基纤维素、羟丙基纤维素和黄原胶)和润肤剂(例如甘油、矿物油、凡士林和异丙基棕榈酸酯)。用于制备液体剂型药物组合物的赋形剂包括但不限于：溶剂(例如，水、酒精、乙酸和糖浆)、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂和乙酸盐缓冲剂)、抗微生物防腐剂(例如，苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯、苯酚和硫柳汞)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、硫酸氢钠、硫脲和丁基羟基甲苯)、螯合剂(例如EDTA二钠、二羟乙基甘氨酸和柠檬酸)和乳化剂(例如十二烷基硫酸钠盐、溴棕三甲铵和聚乙二醇酯)。
可通过本领域已知的任何方法，例如通过全身或局部施用，将本文提供的药物组合物给药于受试者。给药途径包括但不限于肠胃外(例如，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下或腔内)、局部、硬膜外或粘膜(例如鼻内或口服)。确切的给药剂量将取决于各种因素，例如治疗目的、给药途径和受试者的状况，例如患者的健康状况、体重、性别、饮食等。因此，对于治疗师来说，有必要滴定药物组合物的剂量并根据需要改变给药途径以获得最佳治疗效果。通常，本文提供的药物组合物的给药剂量范围为足以产生所需效果的剂量范围，其中所述效果为消除表达TROP2的细胞。
在一优选实施方案中，可由本发明的抗TROP2抗体或抗原结合片段制备本发明的药物组合物，并以治疗有效量给药于人类受试者。抗体的治疗剂量例如可为优选单一治疗剂量在0.1-25mg/kg体重之间，并且对于单一治疗剂量最优选在0.1-10mg/kg体重之间。在一具体实施方案中，可按照常规实践将本发明的任何抗体或抗原结合片段配制成适于任何给药途径的形式，并通常可以是液体形式(例如，无菌的生理上可接受的抗体溶液)，以实现例如静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内给药。在一些实施方案中，可由表达本发明所述靶向TROP2的CAR的免疫细胞(例如T细胞)制备本发明的药物组合物，并以治疗有效量给药于受试者。
本发明还涉及本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸或表达载体、抗体-药物缀合物或表达靶向TROP2的CAR的免疫细胞在制备治疗疾病的药物的用途，所述疾病以TROP2阳性病变细胞为表征。
本发明还提供了一种治疗患有疾病的受试者的方法，所述疾病以TROP2阳性病变细胞为表征。所述方法包括向有需要的受试者给药治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸或表达载体、本发明的抗体-药物缀合物或表达本发明靶向TROP2的CAR的免疫细胞或者本发明的药物组合物。
本发明还涉及本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸或表达载体、本发明的抗体-药物缀合物或表达本发明靶向TROP2的CAR的免疫细胞或者本发明药物组合物的用途，其用于治疗以TROP2阳性病变细胞为表征的疾病。
在一些实施方案中，所述疾病为癌症，优选TROP2阳性癌症，例如胃癌、乳腺癌、尿路上皮癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、头颈癌、卵巢癌等。在一些优选的实施方案中，所述受试者是人。
尽管已经参考特定实施例描述了本发明，但是应当理解，这些实施例仅是本发明的应用和原理的示例。可以修改上述实施方案而不脱离本发明的精神和范围。
下面列出本发明的具体实施方案：
实施方案1：一种抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中
所述VL包含：
(i)CDR-L1，其具有SEQ ID No.1的氨基酸序列，
(ii)CDR-L2，其具有SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的氨基酸序列，和
(iii)CDR-L3，其具有SEQ ID No.4的氨基酸序列；
其中所述VH包含：
(i)CDR-H1，其具有SEQ ID No.5的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其具有SEQ ID No.9的氨基酸序列。
实施方案2：实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中
所述VL具有与SEQ ID No.10、11、12或13具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案3：实施方案1或实施方案2的抗体或其抗原结合片段，其中
所述VH具有与SEQ ID No.14、15或16具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案4：实施方案1-3任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链(LC)，所述轻链具有与SEQ ID No.17、18、19或20具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案5：实施方案1-4任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链(HC)，所述重链具有与SEQ ID No.21、22或23具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案6：实施方案1-5任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下任一组合的VL和VH：
SEQ ID No.10和SEQ ID No.14，
SEQ ID No.11和SEQ ID No.14，
SEQ ID No.12和SEQ ID No.14，
SEQ ID No.12和SEQ ID No.15，
SEQ ID No.12和SEQ ID No.16，
SEQ ID No.13和SEQ ID No.14，
SEQ ID No.13和SEQ ID No.15，
SEQ ID No.10和SEQ ID No.15，
SEQ ID No.10和SEQ ID No.16，
SEQ ID No.11和SEQ ID No.15，
SEQ ID No.11和SEQ ID No.16或
SEQ ID No.13和SEQ ID No.16。
实施方案7：实施方案1-6任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下任一组合的LC和HC：
SEQ ID No.17和SEQ ID No.21，
SEQ ID No.18和SEQ ID No.21，
SEQ ID No.19和SEQ ID No.21，
SEQ ID No.19和SEQ ID No.22，
SEQ ID No.19和SEQ ID No.23，
SEQ ID No.20和SEQ ID No.21，
SEQ ID No.20和SEQ ID No.22，
SEQ ID No.17和SEQ ID No.22，
SEQ ID No.17和SEQ ID No.23，
SEQ ID No.18和SEQ ID No.22，
SEQ ID No.18和SEQ ID No.23或
SEQ ID No.20和SEQ ID No.23。
实施方案8：实施方案1-7任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合TROP2。
实施方案9：实施方案8的抗体，其中所述TROP2为全长蛋白或其片段，其具有实施方案1-8任一项的抗体所结合的表位。
实施方案10：实施方案8或实施方案9的抗体或其抗原结合片段，其中所述TROP2为人或非人TROP2。
实施方案11：实施方案1-10任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化抗体。
实施方案12：实施方案1-11任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为IgG分子。
实施方案13：一种核酸，其编码实施方案1-12任一项的抗体或其抗原结合片段。
实施方案14：一种载体，其包含实施方案13的核酸分子。
实施方案15：一种制备实施方案1-12任一项的抗体的方法，其包括：
(i)用实施方案13的核酸或实施方案14的载体转化宿主细胞，
(ii)在适合表达所述核酸分子或载体的条件下培养转化的宿主细胞，和
(iii)分离和纯化所述抗体或其抗原结合片段。
实施方案16：一种抗体-药物缀合物(ADC)，其包含：
(i)实施方案1-12任一项的抗体或其抗原结合片段；和
(ii)至少一种治疗剂。
实施方案17：实施方案16的抗体-药物缀合物，其中所述抗体和所述治疗剂通过连接子缀合，所述连接子为可裂解的或不可裂解的。
实施方案18：实施方案17的抗体-药物缀合物，其中所述连接子为蛋白酶可裂解的连接子、pH不稳定的连接子或可还原的连接子。
实施方案19：实施方案18的抗体-药物缀合物，其中所述连接子选自LU102和LU104。
实施方案20：实施方案16-19任一项的抗体-药物缀合物，其中所述治疗剂为细胞毒素，优选mc-MMAF或DM1，例如选自DG1002和DG1004的抗体-药物缀合物。
实施方案21：一种嵌合抗原受体，其包含：
(i)胞外结构域，其包含根据权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段，
(ii)跨膜结构域，和
(iii)一个或多个细胞内刺激结构域。
实施方案22：实施方案21的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合片段为单链Fv片段(scFv)。
实施方案23：实施方案21或实施方案22的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包含衍生自CD28或CD8的跨膜结构域。
实施方案24：实施方案21-23任一项的嵌合抗原受体，其中所述细胞内刺激结构域包含衍生自CD3ξ的信号结构域。
实施方案25：实施方案21-24任一项的嵌合抗原受体，其中所述细胞内刺激结构域衍生自CD7、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、OX40(CD134)或ICOS。
实施方案26：一种核酸，其编码实施方案21-25任一项的嵌合抗原受体。
实施方案27：一种宿主细胞，其表达实施方案21-25任一项的嵌合受体。
实施方案28：实施方案27的宿主细胞，其为免疫细胞，优选为T细胞。
实施方案29：一种药物组合物，其包含：
(i)实施方案1-12任一项的抗体或其抗原结合片段、实施方案13的核酸、实施方案14的载体、实施方案16-20任一项的抗体-药物缀合物或者实施方案27或实施方案28的宿主细胞；和(ii)药学上可接受的赋形剂。
实施方案30：一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的实施方案1-12任一项的抗体或其抗原结合片段、实施方案13的核酸、实施方案14的载体、实施方案16-20任一项的抗体-药物缀合物、实施方案27或28的宿主细胞或者实施方案29的药物组合物，其中所述疾病为TROP2阳性癌症。
实施方案31：实施方案30的方法，其中所述TROP2阳性癌症为胃癌、乳腺癌、尿路上皮癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、头颈癌或卵巢癌。
实施方案32：实施方案30的方法，其包括给药选自DG1002和DG1004的抗体-药物缀合物。
实施方案33：一种抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过连接子缀合的抗体和治疗剂，其中所述连接子选自LU102和LU104。
实施方案34：实施方案33的ADC，其中所述治疗剂为奥利斯他汀类，例如，MMAD、MMAE或MMAF，其被马来酰亚胺基取代基N-酰化，例如马来酰亚胺烷基酰基，例如马来酰亚胺基己酰基(mc)，例如mc-MMAF，并且所述连接子为LU102。
实施方案35：实施方案33的ADC，其中所述治疗剂为DM1(mertansine)并且所述连接子为LU104。
实施方案36：实施方案34的ADC，其具有式(1)或式(1’)的结构或者为其混合物：
Figure BDA0003720505410000321
其中A为抗体，例如，抗TROP2抗体，例如Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063或Ab0064。
实施方案37：实施方案35的ADC，其中所述ADC具有式(2)或式(2’)的结构或者为其混合物：
Figure BDA0003720505410000322
Figure BDA0003720505410000331
其中A1为抗体，例如，抗TROP2抗体，例如Ab0052、Ab0053,、b0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063或Ab0064。
实施方案38：实施方案33-37任一项的ADC，其中所述抗体为抗TROP2抗体，例如，Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063或Ab0064。
实施方案39：一种制备实施方案33-38任一项的抗体-药物缀合物(ADC)的方法，其包括
通过巯基部分与马来酰亚胺基部分反应将连接子与治疗剂缀合，其中所述连接子或所述治疗剂中的一个包含马来酰亚胺基部分并且另一个具有巯基部分，
将所形成的中间体与碱反应以打开马来酰亚胺环，
用sortase催化偶联将这个开环中间体与抗体偶联，和
回收所形成的ADC。
实施方案40：实施方案39的方法，其中
所述治疗剂为奥利斯他汀类，例如，MMAD、MMAE或MMAF，其被马来酰亚胺基取代基N-酰化，例如其中马来酰亚胺基取代基是马来酰亚胺烷基酰基(例如马来酰亚胺基己酰基(mc))，例如mc-MMAF；
并且所述连接子为LU102。
实施方案41：实施方案39的方法，其中所述治疗剂为DM1(mertansine)并且所述连接子为LU104。
实施方案42：化合物LU102：
Figure BDA0003720505410000332
实施方案43：化合物LU104：
Figure BDA0003720505410000341
实施方案44：LU102或LU104在制备抗体-药物缀合物中作为连接子的用途。
有益效果
本发明的抗体对其靶标TROP2或其片段具有高亲和力，其KD约为8×10-10M(0.8nM)、7×10-10M(0.7nM)、6×10-10M(0.6nM)、4×10-10M(0.4nM)或更小。这使得靶标和抗体之间能够进行特异性相互作用。
此外，本发明的抗体具有良好的热稳定性。它可能显示为较高的Tm，例如84℃、85℃、86℃或更高的Tm，例如84.5℃、85℃、85.5℃。热稳定性是生物分子的重要生物物理性质。高的热稳定性使治疗性抗体在不利条件下(例如在抗体的制造、运输和存储过程中)具有更长的半衰期。在另一方面，高的热稳定性可使本发明的抗体在某些苛刻条件下保持活性，例如，在缀合分子(例如ADC)的制备过程中的化学反应，或在繁琐的分离和纯化过程中的不利条件(例如，缓冲区和温度)中保持活性。因此，高的热稳定性可极大地促进抗体在许多应用中的使用。
此外，本发明的抗体是人源化的。在非人类系统中产生的治疗性抗体可能具有免疫原性并引发不良的免疫反应，有时甚至是致命的免疫反应，例如，鼠抗体通常会诱导人类抗小鼠抗体反应(HAMA)。另外，免疫原性还可通过影响清除率而改变治疗性抗体的药代动力学，从而影响体内功效。
总之，本发明的抗体对其抗原TROP2或其片段具有高结合亲和力，良好的热稳定性和较低的免疫原性。当用作治疗剂时，此类抗体或包含该抗体的ADC应具有以下至少一种优点：(i)具有更长的体内半衰期，(ii)诱导较低的人抗小鼠抗体(HAMA)反应，以及(iii)由于更长的体内半衰期和更低的HAMA反应而具有更高的治疗功效。
实施例
实施例1：人源化抗Trop2抗体的制备
构建人源化抗体的方法是本领域众所周知的。简而言之，使用蛋白质数据库(PDB)中已知完善的小鼠抗体结构，对嵌合抗体的可变区进行三维同源性建模分析。使用相同的建模分析，可以确定构架区内对于抗原结合重要的关键残基。然后，鉴定出与嵌合抗体可变区具有最高序列相似性的人种系基因，并将其选作框架供体。接下来，使用合成的寡核苷酸和PCR将人种系基因的CDR替换为嵌合抗体的CDR。为了保持人源化抗体的稳定性和抗原特异性，将回复突变引入人源FR区域，其中一些人源FR的残基被嵌合抗体中的对应残基代替。
1.1 Ab0001可变区的同源性建模
分别以小鼠抗体2D73的轻链(PDB ID：4BZ2)和小鼠抗体14G7的重链(PDB ID：2Y6S)作为模板，使用建模软件Bioluminate，对Ab0001(已知的抗TROP2的嵌合抗体)的VL和VH区进行三维同源性建模。确定CDR的典型结构和残基。同时根据建模分析识别框架区中的游标区残基。
1.2选择框架供体
为了选择合适的人种系基因作为框架(FR)供体(FR 1-4)，在NCBI的IgBlast工具或IMGT中分别对Ab0001的VH和VL序列针对整个人抗体种系V基因和J基因进行搜索。
将与Ab0001的VH和VL具有最高序列相似性的人重链和轻链种系V基因和J基因分别选作框架(FR)供体。选择人重链种系基因IGHV1-69*08和IGHJ4*01以及轻链种系基因IGKV1-16*01和IGKJ4*01作为FR供体，分别用于Ab0001的VH和VL区的人源化。人种系抗体的VL和VH序列如图1所示。CDR以粗体显示。下划线标出了与Ab0001中对应残基不同的框架区残基。
1.3人源化抗体的VH和VL区的序列设计
合并人种系抗体的框架区序列和Ab0001的CDR序列，并引入回复突变以生成人源化的VH和VL序列(即，人源化的抗TROP2抗体的VH和VL序列)。
人源化VL区的最终示例性序列(Ab0001-huV3-VL、Ab0001-huV4-VL、Ab0001-huV5-VL和Ab0001-huV8-VL，也分别为SEQ ID No.10、11、12和13)和VH区的最终示例性序列(Ab0001-huV4-VH、Ab0001-huV5-VH和Ab0001-huV6-VH，也分别为SEQ ID No.14、15和16)在图2a和2b中显示。
对于VL区，将CDR-L1中的残基VL24-T突变为K。将框架区2中的VL36-F突变为Y。基于步骤1.1中的三维同源性建模，VL69-Q和VL71-Y为游标区残基。在Ab0001-huV3-VL(SEQID No.10)中保留VL69-Q和VL71-Y。在Ab0001-huV4-VL(SEQ ID No.11)中，将VL69-Q突变为T。在Ab0001-huV5-VL(SEQ ID No.12)中，将VL69-Q突变为T，将VL71-Y突变为F。为了消除DG基序，将CDR-L2中的VL56-D在Ab0001-huV8-VL(SEQ ID No.13)中突变为S。
对于VH区，基于步骤1.1中的三维同源性建模，在Ab0001-huV4-VH(SEQ ID No.14)、Ab0001-huV5-VH(SEQ ID No.15)和Ab0001-huV6-VH(SEQ ID No.16)中保留了重要的构架区残基，它们是VH68-A和VH70-L(游标区残基)、VH61-N(与VL残基相互作用)、VH77-N(与CDR残基)。为了消除DS基序，将CDR-H2中的VH57-S在Ab0001-huV5-VH中突变为T，在Ab0001-huV6-VH中突变为A。
1.4构建编码人源化抗TROP2抗体的表达载体
将IGKV1-16*01、IGKJ4*01的核酸序列与编码Ab0001轻链CDR的核酸序列合成组装，以生成编码人源化VL的核酸。将IGHV1-69*08、IGHJ4*01的核酸序列与编码Ab0001重链CDR的核酸序列合成组装，以生成编码人源化VH的核酸。
为了生成编码人源化抗TROP2抗体轻链的表达载体，将以上获得的人源化VL的核酸序列分别克隆到pCDNA 3.3载体(Life Technology)中，所述pCDNA 3.3载体含有N端轻链信号肽(SEQ ID No.24)、人源抗体的轻链恒定区序列和sortase酶识别序列(LPETGG)和间隔子序列(GA)(一起作为GALPETGG，对应于SEQ ID No.25)。为了生成编码人源化抗TROP2抗体重链的表达载体，将以上获得的人源化VH的核酸序列分别克隆到含有pCDNA 3.3载体(Life Technology)中，所述pCDNA3.3载体含有N端重链信号肽(SEQ ID No.26)和人源抗体的重链区恒定序列。
1.5人源化抗TROP2抗体的产生
将步骤1.4中制备的编码人源化抗TROP2抗体轻链和重链的质粒配对，并以2：1的质量比混合。将质粒和PEIMAX(Polyscience)转染试剂分别在HEK293F基本培养基中稀释，然后混合均匀。将混合物在室温静置，并添加至HEK293F种子细胞培养物中。对细胞培养物采样进行细胞密度和生存力分析，并补充10％体积的HEK293F feed培养基。然后将培养温度移至32℃继续培养。在孵育72小时后，再次对细胞培养物取样进行细胞密度和生存力分析。在孵育144小时后，对细胞培养物取样进行细胞密度和生存力分析。
1.6人源化抗TROP2抗体的纯化
按照制造商的说明，使用亲和色谱法纯化抗体。简而言之，用MabSelect SureLX树脂(GE Healthcare)对色谱柱(BestChrom，中国上海)进行装柱，并用50mM Tris，150mMNaCl，pH 7.4平衡。然后将步骤1.5获得的细胞培养物的上清液施加到柱上。用50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4清洗柱，以去除非特异性结合的蛋白质。然后用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)洗脱抗体，并用1M Tris-HCl(pH 9.0)将含有抗体的洗脱液调节至pH 6.5。最后，通过Anicon Ultra-15离心过滤器(Merk Millipore)将抗体的缓冲液交换为50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4。获得本发明的抗体(Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab062、Ab0063和Ab0064，也参见表1)。
1.7 Ab0002的制备和纯化
使用类似于实施例1.5和1.6中描述的方法制备抗TROP2抗体Ab0002。Ab0002的序列从WHO drug information,INN list 113,Vol.29,No.2,2015中获得。Ab0002包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID No.32的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID No.33的氨基酸序列。将编码Ab0002轻链和重链的核酸克隆到pCDNA3.3载体中。为了制备本发明的包含Ab0002的ADC，在轻链(SEQ ID No.33)的C末端引入如上所述的肽GALPETGG(SEQ IDNo.25)，得到具有SEQ ID No.31的氨基酸序列的修饰的轻链。
实施例2：结合动力学和亲和力分析
进行了结合动力学和亲和力分析。根据制造商的说明，在带有传感器芯片蛋白A(Sensor Chip Protein A)(GE Healthcare)的Biacore 8K(GE Healthcare)上进行表面等离子体共振(SPR)分析。所有测量均在25℃的HBS-EP+缓冲液(10mM HEPES、pH 7.4、150mMNaCl、3mM EDTA和0.05％表面活性剂P20)中进行。将约110–140RU(共振单位)的每种纯化抗体分别捕获在传感器芯片的流通池2、4、6、8、10、12、14、16(即反应表面)上。流通池1、3、5、7、9、11、13和15用HBS-EP+缓冲液处理，用作参考表面。
在HBS-EP+缓冲液中制备重组人TROP2的胞外域(即分析物)(Acrobiosystem)的连续稀释液(分别为243、81、27、9、3、1、0.333和0.111nM)。捕获抗体后，以30μL/min的流速注入TROP2连续稀释液3分钟(结合阶段)，然后缓冲液流动10分钟(解离阶段)。通过两次30秒的脉冲以50μL/min的流速注入10mM Glycine-HCl pH 1.5来再生芯片表面。使用本领域已知的方法在Biacore 8K评估软件上处理收集的数据，包括以下步骤：(1)将y轴上的响应值与x轴上的开始进样设定为0；(2)采用双重参考方法对数据进行处理，包括首先减去反应表面的数据以得到分析物进样曲线，然后从分析物进样曲线减去缓冲液进样曲线；(3)并采用整体拟合的1：1结合模型进行动力学分析。每种抗体的分析结果表示为Ka(解离速率)，Kd(结合速率)和KD(亲和常数)(表3)。如表3所示，所有人源化抗体和Ab0001以相似的亲和力结合抗原。
表3
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) K<sub>D</sub>(nM)
Ab0001 1.09E+06 4.41E-04 0.41
Ab0052 1.03E+06 3.21E-04 0.31
Ab0053 1.01E+06 3.26E-04 0.32
Ab0054 9.75E+05 4.16E-04 0.43
Ab0061 8.74E+05 5.45E-04 0.62
Ab0062 8.89E+05 7.19E-04 0.81
Ab0063 8.62E+05 3.94E-04 0.46
Ab0064 7.22E+05 5.47E-04 0.76
实施例3：人源化抗体的热稳定性
3.1通过DSF测定的Tm值
按照制造商的说明，使用LightCycler 480实时PCR仪(Roche)进行差示扫描荧光法(DSF)测定。简而言之，将19μL的每种抗体溶液(1mg/mL)与1μL的20x SYPRO Orange溶液混合，然后添加到96孔板中。使用荧光共振能量转移滤波器(560-580nm)收集荧光发射，激发波长为450-490nm。在DSF实验期间，在测量之前，以5s的平衡时间以0.2℃的增量使温度从25℃升高到95℃。使用GraphPad prism进行数据分析。疏水性暴露的中点Tm定义为对应于第二荧光转变的一阶导数最大值的温度。
如表4所示，与Ab0001相比，本发明的抗体表现出预料不到的Tm值的提高，即，从79.5℃到约85℃，表明本发明的抗体的热稳定性比Ab0001的更高。
表4
抗体 T<sub>m</sub>(℃)
Ab0001 79.5
Ab0052 85.0
Ab0053 85.0
Ab0054 85.0
Ab0061 85.5
Ab0062 84.5
Ab0063 84.5
Ab0064 85.0
3.2通过SEC-HPLC测定的抗体的热稳定性
通过尺寸排阻-高效液相色谱法(SEC-HPLC)测量热诱导的抗体的聚集和降解。
每种抗体分为两部分：一部分保存在2～8℃作为对照，另一部分在PCR仪中于60℃孵育24小时(热处理)。然后，将经过热处理的或对照的样品以12,000rpm离心5分钟，然后将上清液添加至SEC-HPLC色谱柱，以检测单体(对应于完整抗体)、高分子量(HMW，对应于由于聚集产生的抗体聚集体)和低分子量(LMW，对应于由于降解产生的抗体片段)形式的抗体的百分比。如表5所示，在正常储存条件下(2～8℃)，所有抗体的单体百分比约为98％；热处理(60℃，24h)后，Ab0001的单体百分比降至83.35％，而本发明抗体的单体百分比在90.47％(Ab0064)至97.11％(Ab0062)的范围内，表明本发明的抗体的热稳定性比Ab0001好得多。
表5
Figure BDA0003720505410000391
实施例4：抗体-药物缀合物(ADC)的制备
制备ADC的方法可以在例如US20170112944A1中找到。
4.1抗体的制备
将Sortase酶识别序列(LPETGG)和间隔子序列(GA)(一起作为GALPETGG，对应于SEQ ID No.25)添加至Ab0001的轻链的C末端以获得修饰的Ab0001。
4.2制备连接子
连接单元LU102(参见以下结构)采用常规固相多肽合成方法合成，采用Rink-amide-MBHA-树脂或二氯树脂。用Fmoc保护连接子中的氨基酸和氨基。偶联试剂选自HOBT、HOAt/DIC或HATU。合成结束后，用三氟乙酸切割树脂。产物经HPLC纯化产物，冻干备用。理论分子量：538.24，实测：539.2[M+H]+。
Figure BDA0003720505410000392
参照上述方法制备连接子LU104，其结构如下：
Figure BDA0003720505410000401
作为示例，连接子LU104可以转化为C末端氨基化连接子LU104’，例如通过(1)用Boc2O保护甘氨酸的末端NH2，(2)将(1)中所得产物在偶联试剂存在下与NH3反应，所述偶联试剂选自HOBT、HOAt/DIC和HATU，和(3)对甘氨酸的末端NH2去保护。所述C末端氨基化连接子LU104’具有如下结构：
Figure BDA0003720505410000402
连接子LU104和连接子LU104’可以各自独立地用于与负载物反应，形成连接子-负载物中间体。
4.3中间体的制备
取连接子LU102和mc-MMAF(摩尔比1.2：1)，分别溶于水和DMF后充分混合，得到混合物，使其在0-40℃下反应0.5-20h，得到中间体IM102(闭环)。参见如下式(i)。经HPLC纯化后，通过质谱分析检测中间体的分子量。理论值：1462.80，实测值：732.41[M/2+1]+，1463.81[M+H]+。
Figure BDA0003720505410000411
参照上述方法将连接子LU104’和DM1共价连接，以获得具有式(ii)结构的中间体IM104(闭环)：
Figure BDA0003720505410000412
4.4中间体的开环
将IM102(闭环)与适量Tris Base溶液或其他能促进开环反应的溶液混合，然后在0-40℃下反应0.2-20h。反应完成后，通过半制备/制备型HPLC对反应产物进行纯化，得到IM102(开环)，其结构如式(iii)和式(iii′)所示(显示为异构体)。理论分子量：1480.81，实测值：741.41[M/2+1]+，1481.81[M+H]+。
Figure BDA0003720505410000413
Figure BDA0003720505410000421
参照上述方法进行中间体IM104(闭环)的开环并纯化，得到中间体IM104(开环)，其结构如式(iv)和式(iv')所示(显示为异构体)：
Figure BDA0003720505410000422
4.5参考ADC和本发明的ADC的制备
4.5.1使用修饰的Ab0001制备参考ADC(DG002和DG004)
通过连接酶(Sortase)将IM102(开环)与Ab0001以位点特异性方式偶联，生成具有上式(1)和(1')所示结构的DG002，其中式(1)和式(1')为异构体。具体步骤如下：
1)Ab0001的处理：利用超滤、透析或脱盐柱法处理Ab0001，将其储存溶液置换为连接酶缓冲液。
2)DG002的酶催化偶联：使用野生型Sortase A或基于其改造优化的突变型连接酶催化Ab0001与IM102(开环)的偶联反应，制备DG002。在连接酶缓冲液中，将修饰的Ab0001和IM102(开环)以1：1至1：100的摩尔比充分混合，然后添加到固相偶联体系中。固相偶联体系包含固定化的连接酶，其固定在固相偶联体系的基质上。固定的连接酶催化抗体Ab0001与IM102(开环)的偶联反应。偶联反应在4-40℃下进行0.5-20h。反应完成后，将反应混合物进行超滤或渗析以除去未反应的中间体，得到DG002。将DG002在4℃或-80℃下储存于含有20mM柠檬酸、200mM NaCl，pH 5.0的缓冲液中。
3)DG002的SDS-PAGE检测与分析
通过SDS-PAGE分析DG002的纯度和偶联效率。结果如图1所示。偶联反应发生在修饰的Ab0001的轻链上。与未发生偶联反应的Ab0001轻链相比，与IM102(开环)偶联的Ab0001轻链显示出明显的分子量跃迁。在偶联的产物中未检测到未偶联的轻链，偶联效率高达95％以上。偶联产物的纯度符合预期。
4)DG002的HIC-HPLC检测与分析
利用HIC-HPLC分析DG002的DAR(药物/抗体比)分布。未偶联细胞毒素的抗体Ab0001小于5％；并且偶联产物主要含有DG002，其DAR为2。
5)DG002的SEC-HPLC检测与分析
利用SEC-HPLC分析DG002的高分子量聚集程度。结果表明，在DG002中未检测到高分子量聚集体，表明偶联反应条件温和且不会对抗体结构造成破坏。参考ADC DG002具有式(1)或(1’)结构或者为其混合物：
Figure BDA0003720505410000431
Figure BDA0003720505410000441
其中A为Ab0001。
使用类似于上述2)的方法，将中间体IM104(开环)与修饰的Ab0001以位点特异的方式偶联，得到DG004，其结构如下(显示为异构体)：
Figure BDA0003720505410000442
其中A1为Ab0001。
4.5.2本发明的ADC的制备
将本发明的抗体和抗体Ab0002(抗TROP2抗体，序列源自WHO drug information,INN list 113,Vol.29,No.2,2015)通过在抗体轻链的C末端引入间隔子序列(GA)和Sortase识别序列(一起作为GALPETGG，对应于SEQ ID No.25)进行修饰，然后与中间体IM102(开环)或IM104(开环)偶联，使用类似于4.5.1的方法，得到本发明的ADC。ADC DG002、DG402、DG502、DG602、DG702、DG802、DG902和DG 1002中的每一个都具有式(1)或式(1’)的结构或者为其混合物。ADC DG004、DG404、DG504、DG604、DG1004和DG202中的每一个都具有式(2)或式(2’)的结构或者为其混合物。所制备的ADC列于表6中。
表6
Figure BDA0003720505410000451
实施例5：ADC的热稳定性
5.1通过DSF测定的Tm值
如实施例3所述，通过DSF测量ADC的Tm值。
如表7所示，与衍生自Ab0001的ADC相比，本发明的ADC显示出Tm值的意外提高，即，从77.8℃(DG002)或78.1℃(DG004)到83.9℃(DG1004)至86.9℃(DG702)的范围，表明本发明的ADC的热稳定性高于衍生自Ab0001的ADC的热稳定性。
表7
ADC T<sub>m</sub>(℃)
DG002 77.8
DG402 86.3
DG502 86.1
DG602 86.5
DG702 86.9
DG802 86.0
DG902 86.3
DG1002 86.0
DG004 78.1
DG404 84.1
DG604 84.4
DG1004 83.9
5.2通过SEC-HPLC测定的热稳定性
如实施例3所述，通过SEC-HPLC测量热诱导的ADC的聚集和降解。如表8所示，在正常储存条件(2～8℃)下，所有ADC的单体百分比为约98％。热处理(60℃，24h)后，DG004和DG002(衍生自Ab0001的ADC)的单体百分比分别急剧降低至58.09％和60.31％，而本发明的ADC的单体百分比在92.50％(DG402)至96.07％(DG404)的范围内，表明本发明的ADC热稳定性比衍生自Ab0001的ADC更好。
表8
Figure BDA0003720505410000461
Figure BDA0003720505410000471
实施例6：ADC对肿瘤细胞生长的抑制活性
如实施例4所述制备包含抗体的ADC。使用肿瘤细胞系NCI-N87(ATCC，目录号CRL-5822)、MDA-MB-468(ATCC，目录号HTB-132)、SK-BR-3(ATCC，目录号HTB-30)、MCF-7(ATCC，目录号HTB-22)、FaDu(ATCC，目录号HTB-43)和COLO 205(ATCC，目录号CCL-222)来评估ADC的细胞生长抑制活性。TROP2在NCI-N87、FaDu、MDA-MB-468和SK-BR-3中高表达，在MCF-7和COLO205中度表达。
将处于良好状态且汇合度约为80％的肿瘤细胞消化，并接种在96孔板中，培养过夜。细胞贴壁后，添加不同浓度的ADC(分别为30、10、3.333、1.111、0.370、0.123、0.041、0.014、0.005nM)。在37℃下孵育72小时后，使用
Figure BDA0003720505410000473
发光试剂盒(Promega)测定不同ADC浓度下的细胞活力，并使用Prism 6软件进行分析，以获得每个ADC的IC50值(表9)。如表9所示，本发明的ADC有效抑制肿瘤细胞的生长。
表9
Figure BDA0003720505410000472
ND：未检测。
实施例7：ADC的体内肿瘤抑制功效
使用BALB/c裸鼠和人胃癌细胞系NCI-N87建立异种移植肿瘤模型。将NCI-N87细胞在37℃，5％CO2的条件下保持在单层细胞状态，培养液为添加了10％的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液(Gibco)。通常每周两次对细胞进行传代培养。收获在指数生长期生长的NCI-N87细胞并计数以进行接种。BALB/c裸鼠(雌性，六至八周龄，重约18～22g)购自北京生命河实验动物有限公司(Beijing Vital River LaboratoryAnimal Co.,LTD)或其他认证的供应商。
在每只小鼠的右肩胛区域皮下接种在0.2mL PBS中的10×106NCI-N87细胞。将动物随机分为八组，每组六只。当平均肿瘤体积达到约100–200mm3时，将表10所示的ADC静脉内注入小鼠体内。用媒介物(0.9％盐水)或Ab0064裸抗(10mg/kg)处理的组作为对照。
表10
Figure BDA0003720505410000481
使用卡尺每周两次在二维上测量肿瘤大小，并使用以下公式将肿瘤大小表示为以mm3为单位的体积(V)：V＝0.5a x b2，其中a为肿瘤的长径，b为肿瘤的短径。
如图3所示，DG1002和DG1004分别以4mg/kg和10mg/kg的剂量抑制肿瘤生长。因此，本发明的ADC以较低的剂量有效抑制肿瘤生长。
如图4所示，DG202以3mg/kg的剂量抑制肿瘤生长。因此，本发明的ADC以较低的剂量有效抑制肿瘤生长。
序列表
Figure BDA0003720505410000482
Figure BDA0003720505410000491
Figure BDA0003720505410000501
Figure BDA0003720505410000511
序列表
<110> 启德医药科技（苏州）有限公司
<120> 抗TROP2抗体、抗体-药物缀合物及其应用
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr
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Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Ser Phe His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Val Ser Ser
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr
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Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr
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Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Ala Phe His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab0001-HuV3-LC
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
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<212> PRT
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<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ala Leu Pro Glu Thr Gly Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ala Leu Pro Glu Thr Gly Gly
210 215 220
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr
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Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Ser Phe His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg Phe Phe Glu Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
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<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Thr Phe His Tyr Asn Gln Lys Phe
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100 105 110
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Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
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Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N端轻链信号肽
<400> 24
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
20
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sortase识别序列和间隔子序列
<400> 25
Gly Ala Leu Pro Glu Thr Gly Gly
1 5
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N端重链信号肽
<400> 26
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
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<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab0001-HuV3-LC
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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<213> Artificial Sequence
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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130 135 140
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab0001-HuV5-LC
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab0002-LC
<400> 31
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ala Leu Pro Glu Thr Gly Gly
210 215 220
<210> 32
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab0002-HC
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 33
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ab0002-LC
<400> 33
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (37)

1.一种抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，
其中所述VL包含：
(i)CDR-L1，其具有SEQ ID No.1的氨基酸序列，
(ii)CDR-L2，其具有SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的氨基酸序列，和
(iii)CDR-L3，其具有SEQ ID No.4的氨基酸序列；
其中所述VH包含：
(i)CDR-H1，其具有SEQ ID No.5的氨基酸序列，
(ii)CDR-H2，其具有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8的氨基酸序列，和
(iii)CDR-H3，其具有SEQ ID No.9的氨基酸序列。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述VL具有与SEQ ID No.10、11、12或13具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH具有与SEQ ID No.14、15或16具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链(LC)，所述轻链具有与SEQ ID No.17或27、18或28、19或29或者20或30具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1-4任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链(HC)，所述重链具有与SEQ ID No.21、22或23具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
6.权利要求1-5任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下组合的VL和VH：
SEQ ID No.10和SEQ ID No.14，
SEQ ID No.11和SEQ ID No.14，
SEQ ID No.12和SEQ ID No.14，
SEQ ID No.12和SEQ ID No.15，
SEQ ID No.12和SEQ ID No.16，
SEQ ID No.13和SEQ ID No.14，
SEQ ID No.13和SEQ ID No.15，
SEQ ID No.10和SEQ ID No.15，
SEQ ID No.10和SEQ ID No.16，
SEQ ID No.11和SEQ ID No.15，
SEQ ID No.11和SEQ ID No.16，或
SEQ ID No.13和SEQ ID No.16。
7.权利要求1-6任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下组合的LC和HC：
SEQ ID No.17或27和SEQ ID No.21，
SEQ ID No.18或28和SEQ ID No.21，
SEQ ID No.19或29和SEQ ID No.21，
SEQ ID No.19或29和SEQ ID No.22，
SEQ ID No.19或29和SEQ ID No.23，
SEQ ID No.20或30和SEQ ID No.21，
SEQ ID No.20或30和SEQ ID No.22，
SEQ ID No.17或27和SEQ ID No.22，
SEQ ID No.17或27和SEQ ID No.23，
SEQ ID No.18或28和SEQ ID No.22，
SEQ ID No.18或28和SEQ ID No.23，或
SEQ ID No.20或30和SEQ ID No.23。
8.权利要求1-7任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合至TROP2。
9.权利要求8的抗体，其中TROP2为全长蛋白或其片段，其具有权利要求1-8任一项的抗体所结合的表位。
10.权利要求8或9的抗体或其抗原结合片段，其中所述TROP2为人TROP2或非人TROP2。
11.权利要求1-10任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化抗体。
12.权利要求1-11任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为IgG分子。
13.一种核酸，其编码权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段。
14.一种载体，其包含权利要求13的核酸。
15.一种制备权利要求1-12任一项的抗体的方法，其包括：
(i)用权利要求13的核酸或权利要求14的载体转化宿主细胞，
(ii)在适合表达所述核酸分子或载体的条件下培养转化的宿主细胞，和任选地
(iii)分离和纯化所述抗体或其抗原结合片段。
16.一种抗体-药物缀合物(ADC)，其包含：
(i)权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段；和
(ii)至少一种治疗剂。
17.权利要求16的ADC，其中所述抗体和所述治疗剂通过连接子缀合，所述连接子为可裂解的或不可裂解的。
18.权利要求17的ADC，其中所述连接子为蛋白酶可裂解的连接子、pH不稳定的连接子或可还原的连接子。
19.权利要求17的ADC，其中所述连接子选自LU102、LU104和LU104’，其具有如下结构：
Figure FDA0003720505400000031
Figure FDA0003720505400000041
20.权利要求19的ADC，其中所述ADC具有式(Ⅱ-1)、式(Ⅱ-2-1)或式(Ⅱ-2-2)的结构，或者为式(Ⅱ-2-1)和式(Ⅱ-2-2)的混合物：
Figure FDA0003720505400000042
Figure FDA0003720505400000051
其中z为1-20的整数；
其中负载物为治疗剂；
其中A和A1各自独立地选自权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段；优选地，A和A1各自独立地选自Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063和Ab0064；
优选地，z为2。
21.权利要求16-20任一项的ADC，其中所述治疗剂为细胞毒素，优选mc-MMAF或DM1，
例如选自DG1002和DG1004的抗体-药物缀合物。
22.权利要求21的ADC，其中所述ADC具有式(1-1)或式(1’-1)的结构或者为其混合物：
Figure FDA0003720505400000061
其中z为1-20的整数；
其中A选自权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段；优选地，A选自Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063和Ab0064；
优选地，z为2。
23.权利要求21的ADC，其中所述ADC具有式(2-1)或式(2’-1)的结构或者为其混合物：
Figure FDA0003720505400000062
Figure FDA0003720505400000071
其中z为1-20的整数；
其中A1为选自权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段；优选地，A1选自Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063和Ab0064；
优选地，z为2。
24.一种嵌合抗原受体，其包含：
(i)胞外结构域，其包含权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段，
(ii)跨膜结构域，和
(iii)一个或多个细胞内刺激结构域。
25.一种宿主细胞，其表达权利要求24的嵌合受体，优选地，所述宿主细胞为免疫细胞，更优选为T细胞。
26.一种药物组合物，其包含：
(i)权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段、权利要求13的核酸、权利要求14的载体、权利要求16-23任一项的抗体-药物缀合物或者权利要求25的宿主细胞；和
(ii)药学上可接受的赋形剂。
27.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段、权利要求13的核酸、权利要求14的载体、权利要求16-23任一项的抗体-药物缀合物、权利要求25的宿主细胞或者权利要求26的药物组合物，其中所述疾病为TROP2阳性癌症；优选地，所述TROP2阳性癌症为胃癌、乳腺癌、尿路上皮癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、头颈癌或卵巢癌。
28.权利要求27的方法，其包括给药选自DG1002和DG1004的抗体-药物缀合物。
29.一种抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过连接子缀合的抗体和治疗剂，其中所述连接子为LU104或LU104’，其具有如下结构：
Figure FDA0003720505400000081
30.权利要求29的ADC，其中所述ADC具有式(Ⅱ-2-1)或式(Ⅱ-2-2)的结构或者为其混合物：
Figure FDA0003720505400000091
其中z为1-20的整数；
其中负载物为治疗剂；
其中A1为抗体；
优选地，z为2。
31.权利要求29或30的ADC，其中所述治疗剂为细胞毒素，优选为DM1(mertansine)。
32.权利要求29-31任一项的ADC，其中所述抗体为抗TROP2抗体；优选地，所述抗体选自Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063、Ab0064和Ab0002。
33.权利要求32的ADC，其中所述ADC具有式(2-1)或式(2’-1)的结构或者为其混合物：
Figure FDA0003720505400000101
其中z为1-20的整数；
其中A1选自Ab0052、Ab0053、Ab0054、Ab0061、Ab0062、Ab0063、Ab0064和Ab0002；
优选地，z为2。
34.一种制备权利要求29-33任一项的抗体-药物缀合物(ADC)的方法，其包括：
通过巯基部分与马来酰亚胺基部分的反应将连接子与治疗剂缀合，其中所述连接子包含马来酰亚胺基部分并且所述治疗剂具有巯基部分，
将所形成的中间体与碱反应以打开马来酰亚胺环，
用sortase催化偶联将上述开环中间体与抗体偶联，和
回收所形成的ADC。
35.权利要求34的方法，其中所述治疗剂为DM1(mertansine)。
36.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求29-33任一项的ADC，其中所述疾病为TROP2阳性癌症，优选地所述TROP2阳性癌症为胃癌、乳腺癌、尿路上皮癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、头颈癌或卵巢癌。
37.权利要求36的方法，其包括给药抗体-药物缀合物DG202。
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