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CN114869923A - 民族药双参水溶性提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

民族药双参水溶性提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114869923A CN202210668831.0A CN202210668831A CN114869923A CN 114869923 A CN114869923 A CN 114869923A CN 202210668831 A CN202210668831 A CN 202210668831A CN 114869923 A CN114869923 A CN 114869923A
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Abstract

本发明提供了一种民族药双参水溶性提取物及其制备方法和应用，属于药物化学技术领域。本发明首先将民族药双参进行醇提，得到醇提液和醇提药渣，然后再分别经进一步处理得到水溶性粗提物，具体的，所述醇提液浓缩后经正丁醇萃取，所述醇提药渣经水提以及除蛋白处理；水溶性粗提物合并后以低级醇‑水为洗脱剂进行大孔吸附树脂柱层析分离，得到不同洗脱组分，根据洗脱剂组成选择水溶性部位，除水洗脱后所得组分以外，其它洗脱组分经醇沉后与水洗脱后所得组分合并，即得到民族药双参水溶性提取物。采用本发明方法制备的民族药双参水溶性提取物可以应用于防治糖尿病及肾病，且安全性高，具有良好的开发和应用前景。

Description

民族药双参水溶性提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种民族药双参水溶性提取物及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是因胰岛素分泌或利用不足而引起糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的综合症。DM不仅影响人们的健康，而且给社会带来沉重的负担。糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是DM患者常见的并发症之一，是导致终末期肾病和DM患者死亡的主要原因，约30～40％的DM 患者会发展为DN，且发生率随着病程延长而增加。DN早期临床表现为肾小球滤过率增高，尿中微量白蛋白增多，血浆尿素氮和肌酐升高，最后发展为慢性肾功能不全。DN早期的主要病理特征是肾小球肥大，肾小球和肾小管基底膜增厚及系膜区细胞外基质的进行性积聚；后期为肾小球、肾小管间质的纤维化，并最终导致蛋白尿和肾功能衰竭。
目前对DM的治疗主要以降糖为主，对DN的治疗以采用联合用药为主，综合降血糖、降血压以及降血脂等方面的药物进行治疗，主要是延缓DN的发展，不能起到根治的效果。当前，临床上用激素及细胞毒类药物治疗DN，尽管取得了一定疗效，但存在易复发、易产生激素依赖等不良反应。血管紧张素转换酶抑制剂(如卡托普利、依那普利等)对DN有治疗作用。然而，血管紧张素转换酶抑制剂副作用大，会引起低血压、高血钾、肾功能不全、咳嗽等症状。到目前为止，尚没有理想的治疗方法。因此，针对DM和DN，寻找一种高效、低毒的防治药物是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种民族药双参水溶性提取物及其制备方法和应用。采用本发明方法制备的民族药双参水溶性提取物可以应用于防治糖尿病及肾病，且安全性高，具有良好的开发和应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种民族药双参水溶性提取物的制备方法，包括以下步骤：
将民族药双参进行醇提，得到醇提液和醇提药渣；
所述醇提液经第一浓缩得到醇提组分A，将所述醇提组分A与水以及正丁醇混合进行萃取，得到水溶性组分A1；
将所述醇提药渣进行热水提取，所得水提液经第二浓缩得到水提浓缩液 B，将所述水提浓缩液B进行除蛋白处理，所得除蛋白溶液经第三浓缩得到水提组分B1；
以低级醇-水为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述水溶性组分A1与水提组分B1合并后的混合组分进行大孔吸附树脂柱层析分离，依次得到流份 AB1、流份AB2和流份AB3，所述梯度洗脱包括依次进行的3个梯度，按低级醇和水的体积比计，所述洗脱剂的组成依次为0：1、1～7：9～3和9.5： 0.5，分别对应流份AB1、流份AB2和流份AB3；
将所述流份AB1经第四浓缩得到水洗脱组分AB1'；将所述流份AB2依次经第五浓缩和醇沉，得到水溶醇沉组分AB2'；将所述水洗脱组分AB1'与水溶醇沉组分AB2'合并，得到民族药双参水溶性提取物。
优选地，所述民族药双参为双参或大花双参。
优选地，所述醇提为冷浸提取，所述醇提采用的醇提试剂为乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的体积分数为60～95％。
优选地，所述除蛋白处理采用的方法为Sevag法。
优选地，所述大孔吸附树脂柱层析分离采用的大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂或101大孔吸附树脂。
优选地，所述水洗脱组分AB1'与水溶醇沉组分AB2'合并后还包括：将所得混合组分进行分级醇沉，得到上清液和醇沉淀，所述上清液经第六浓缩后得到第一民族药双参水溶性提取物，所述醇沉淀为第二民族药双参水溶性提取物。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的民族药双参水溶性提取物，包括水溶性多糖类成分和水溶性小分子成分，所述水溶性多糖类成分的相对分子量范围为504～2.0×106，所述水溶性小分子的相对分子量范围为214～792。
优选地，所述水溶性多糖类成分包括高分子量多糖和低分子量多糖，所述高分子量多糖的相对分子量范围为5.0×104～2.0×106，所述低分子量多糖的相对分子量范围为504～4.0×104；所述水溶性小分子为水溶性环烯醚萜苷类化合物和/或其衍生物。
本发明提供了上述技术方案所述民族药双参水溶性提取物在制备防治糖尿病或肾病的药物或保健品中的应用。
优选地，所述糖尿病为II型糖尿病；所述肾病为糖尿病肾病、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、肾病综合征和肾小球肾炎中的至少一种。
本发明提供了一种民族药双参水溶性提取物的制备方法，首先将民族药双参进行醇提，得到醇提液和醇提药渣，然后再分别经进一步处理得到水溶性粗提物，具体的，所述醇提液浓缩后经正丁醇萃取，所述醇提药渣经水提以及除蛋白处理；水溶性粗提物合并后以低级醇-水为洗脱剂进行大孔吸附树脂柱层析分离，去除色素和其它低极性小分子成分，得到不同洗脱组分，根据洗脱剂组成选择水溶性部位，除水洗脱后所得组分以外，其它洗脱组分经醇沉后与水洗脱后所得组分合并，即得到民族药双参水溶性提取物(民族药双参水溶性总提取物)。
进一步地，本发明将所述民族药双参水溶性提取物进一步进行分级醇沉，得到上清液和醇沉淀，可以将民族药双参水溶性提取物中活性物质进一步分离，分别得到第一民族药双参水溶性提取物(TGPB)和第二民族药双参水溶性提取物(TGPC)。
本发明实施例中以人肾小球系膜细胞和STZ诱导建立的糖尿病小鼠模型进行活性筛选，结果表明，本发明提供的双参水溶性提取物对高糖培养人肾小球系膜细胞具有明显保护作用，对STZ诱导糖尿病小鼠的血糖、糖化血清蛋白和血脂紊乱起纠正作用，同时对其肾脏具有明显保护作用，表明该双参水溶性提取物能够防治糖尿病及肾病，可以用于制备防治糖尿病及肾病的药物或保健品；且毒性试验证实，该双参水溶性提取物安全性高，可以保证糖尿病及肾病患者长期用药的安全性，具有良好的开发和应用前景。
附图说明
图1为实施例4中各双参活性组分对STZ糖尿病小鼠中糖化血清蛋白 (GSP)的影响图；
图2为实施例4中各双参活性组分对STZ糖尿病小鼠中血肌酐(Scr) 的影响图；
图3为实施例4中各双参活性组分对STZ糖尿病小鼠肾脏组织中超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX) 的影响图；
图4为实施例4中小鼠肾脏切片光学显微照片；
图5为实施例5中不同时间点和不同浓度的高糖对HRMC细胞的增殖情况(x±s)与空白对照组的对比图；
图6为实施例5中双参水溶性提取物在50～800μg/mL浓度范围内对人肾小球系膜细胞毒性测试结果图；
图7为实施例5中不同浓度双参活性组分对高糖培养人肾小球系膜细胞增殖的影响与正常糖组(NG)的对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种民族药双参水溶性提取物的制备方法，包括以下步骤：
将民族药双参进行醇提，得到醇提液和醇提药渣；
所述醇提液经第一浓缩得到醇提组分A，将所述醇提组分A与水以及正丁醇混合进行萃取，得到水溶性组分A1；
将所述醇提药渣进行热水提取，所得水提液经第二浓缩得到水提浓缩液 B，将所述水提浓缩液B进行除蛋白处理，所得除蛋白溶液经第三浓缩得到水提组分B1；
以低级醇-水为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述水溶性组分A1与水提组分B1合并后的混合组分进行大孔吸附树脂柱层析分离，依次得到流份 AB1、流份AB2和流份AB3，所述梯度洗脱包括依次进行的3个梯度，按低级醇和水的体积比计，洗脱剂的组成依次为0：1、1～7：9～3和9.5：0.5，分别对应流份AB1、流份AB2和流份AB3；
将所述流份AB1经第四浓缩得到水洗脱组分AB1'；将所述流份AB2依次经第五浓缩和醇沉，得到水溶醇沉组分AB2'；将所述水洗脱组分AB1'与水溶醇沉组分AB2'合并，得到民族药双参水溶性提取物。
中药和民族民间药物等属于天然药物，从中药和民族民间药物中发现具有多靶点防治DM和DN的活性成分是防治DM和DN药物研发的一条重要有效途径。中药和民族民间药物中水溶成分具有低毒或无毒、无副作用等特点，在医疗保健领域具有巨大的需求空间。川续断科(Dipsacaceae)双参属 (Triplostegia)药用植物共2种，具体为双参和大花双参，其中，大花双参 (Triplostegiagrandiflora Gagnep)又称青羊参或大花囊苞花，为彝族药，彝名为则非、则色，常用于治肾虚腰痛、遗精、阳萎、月经不调和经闭等；双参(Triplostegiaglandulifera Wall)又称萝卜参、对对参、童子参、肚拉、土洋参或一支蒿等，因有补肾、健脾益气以及活血调经的功能，常用于久病体虚、补血补气。本发明从民族药双参(双参或大花双参)中提取分离得到民族药双参水溶性提取物，对于DM特别是DN具有显著疗效，同时对人肾小球系膜细胞和STZ诱导建立的糖尿病小鼠模型具有无毒性的特点，表明所述民族药双参水溶性提取物可应用于防治DM及DN，具有良好的开发和应用前景。下面对所述民族药双参水溶性提取物的制备方法进行详细说明。
本发明将民族药双参进行醇提，得到醇提液和醇提药渣。在本发明中，所述民族药双参具体为双参或大花双参。在本发明中，所述民族药双参在使用前优选依次进行清洗和干燥；本发明优选取民族药双参的地下部分(即根茎)使用；所述干燥的方式优选包括自然晾干或烘干，所述烘干的温度优选为40～50℃。本发明优选将干燥后的民族药双参切割为1cm长的小块状使用。
在本发明中，所述醇提优选为冷浸提取，具体是将所述民族药双参与醇提试剂混合，在室温条件下进行提取；所述醇提的次数优选为2～4次，更优选为3次；所述醇提试剂优选为乙醇水溶液，每次醇提时所用乙醇水溶液的体积分数独立优选为60～95％，更优选为80～95％；每次醇提时醇提试剂与待醇提物料的用量比独立优选为(3～6)L：2kg，更优选为2L：1kg；每次醇提的时间独立优选为24～36h，更优选为24h。本发明具体是在每次醇提后滤出药渣进行下一次醇提，最后一次醇提后滤出的药渣作为醇提药渣，将每次醇提结束滤出药渣后所得溶液合并，作为醇提液。本发明优选采用冷浸提取的方式进行醇提，作用是提取极性较低的小分子成分。
在本发明中，得到醇提液后，所述醇提液经第一浓缩得到醇提组分A，将所述醇提组分A与水以及正丁醇混合进行萃取，得到水溶性组分A1。在本发明中，所述第一浓缩优选为减压浓缩，所述第一浓缩的温度优选为 50～60℃，更优选为55℃；所述第一浓缩优选是将醇提液浓缩至无醇味，得到醇提组分A；所述第一浓缩过程中回收醇提试剂中的醇。本发明优选将所述醇提组分A与水混合，得到醇提组分A水溶液；将所述醇提组分A水溶液与正丁醇混合进行萃取。在本发明中，所述醇提组分A水溶液中水与民族药双参的用量比优选为(0.5～1)L：2kg，更优选为1L：2kg。在本发明中，所述萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次；每次萃取时正丁醇与待萃取物料的体积比独立优选为(1～2)：1，更优选为(1～1.5)：1。本发明通过采用正丁醇萃取去除溶于正丁醇的色素以及低极性成分。
在本发明中，得到醇提药渣后，将所述醇提药渣进行热水提取，所得水提液经第二浓缩得到水提浓缩液B，将所述水提浓缩液B进行除蛋白处理，所得除蛋白溶液经第三浓缩得到水提组分B1。在本发明中，所述热水提取的次数优选为2～4次，更优选为3次；每次热水提取的方式独立优选为回流提取或蒸煮提取，所述回流提取的温度优选为90～95℃；每次热水提取所用水的质量优选为待水提物料质量的2～5倍，更优选为3倍；每次热水提取的时间独立优选为2～3h，更优选为2.5h。本发明具体是在每次热水提取后滤出药渣进行下一次热水提取，将每次热水提取结束滤出药渣后所得溶液合并，作为水提液。本发明优选采用回流提取或蒸煮提取的方式进行热水提取，能够完全提取醇提药渣中的水溶性成分。在本发明中，所述第二浓缩优选为减压浓缩，所述第二浓缩的温度优选为60～70℃，更优选为65℃；所述第二浓缩优选是将所述水提液浓缩至原体积的10～20％(即所述水提浓缩液B的体积为水提液体积的10～20％)。在本发明中，所述除蛋白处理采用的方法优选为Sevag法，所述除蛋白处理的次数优选为2～4次，更优选为3次；所述 Sevag法采用的Sevag试剂优选为氯仿和正丁醇，每次除蛋白处理时所述氯仿和正丁醇的体积比独立优选为(2～5)：1，更优选为4：1；每次除蛋白处理时所述Sevag试剂与待除蛋白处理物料的体积比独立优选为(1～2)：1，更优选为1：1。在本发明中，所述第三浓缩优选为减压浓缩，所述第三浓缩的温度优选为60～70℃，更优选为60～65℃；所述第三浓缩优选是将除蛋白溶液浓缩至无正丁醇。
得到所述水溶性组分A1与水提组分B1后，本发明以低级醇-水为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述水溶性组分A1与水提组分B1合并后的混合组分进行大孔吸附树脂柱层析分离，依次得到流份AB1、流份AB2和流份 AB3，所述梯度洗脱包括依次进行的3个梯度，按低级醇和水的体积比计，所述洗脱剂的组成依次为0：1、1～7：9～3和9.5：0.5，分别对应流份AB1、流份AB2和流份AB3。在本发明中，所述大孔吸附树脂柱层析分离采用的大孔吸附树脂优选为AB-8大孔吸附树脂或101大孔吸附树脂，更优选为 AB-8大孔吸附树脂。在本发明中，进行大孔吸附树脂柱层析分离时优选采用湿法上样方式，具体是将水溶性组分A1与水提组分B1合并后的混合组分浓缩除去大量水后直接上样。在本发明中，所述低级醇优选为甲醇或乙醇，更优选为甲醇。在本发明中，按低级醇和水的体积比计，所述洗脱剂的组成优选依次为0：1、6：4和9.5：0.5。本发明采用梯度洗脱方式便于将民族药双参中不同极性部位进行分离。
得到流份AB1后，本发明将所述流份AB1经第四浓缩得到水洗脱组分 AB1'。本发明对所述第四浓缩没有特殊限定，能够去除流份AB1中大量的水即可。
得到流份AB2后，本发明将所述流份AB2依次经第五浓缩和醇沉，得到水溶醇沉组分AB2'。本发明对所述第五浓缩没有特殊限定，能够去除流份AB2中的甲醇以及水即可，所述第五浓缩优选是将流份AB2浓缩至原体积的5～10％(即流份AB2经第五浓缩得到流份AB2浓缩液，所述流份AB2 浓缩液的体积为流份AB2体积的5～10％)。在本发明中，所述醇沉采用的醇沉试剂优选为醇水溶液，所述醇水溶液中的醇优选为甲醇或乙醇，更优选为乙醇；在本发明的实施例中，具体采用工业酒精。在本发明中，所述醇沉的次数优选为2～4次，更优选为3次；每次醇沉所述醇水溶液的体积分数独立优选为90～95％，更优选为93～95％；每次醇沉时所用醇沉试剂与待醇沉物料的体积比优选为(1.5～3)：1，更优选为(1.5～2)：1；每次醇沉的温度独立优选为4～8℃，更优选为4℃，本发明的实施例中，具体是在冰箱中进行醇沉；每次醇沉的时间独立优选为12～24h，更优选为12～18h。在本发明的实施例中，每次醇沉后，具体是将所得上清液减压浓缩至水溶性成分刚好全溶于水，使最后一次醇沉时体系中乙醇的终浓度达90％(体积分数)以上，将每次醇沉所得沉淀合并，得到水溶醇沉淀组分AB2'。
得到水洗脱组分AB1'与水溶醇沉组分AB2'后，本发明将所述水洗脱组分AB1'与水溶醇沉组分AB2'合并，得到民族药双参水溶性提取物(记为民族药双参水溶性总提取物)。
在本发明中，所述水洗脱组分AB1'与水溶醇沉组分AB2'合并后优选还包括：将所得混合组分进行分级醇沉，得到上清液和醇沉淀，所述上清液经第六浓缩后得到第一民族药双参水溶性提取物(记为TGPB)，所述醇沉淀为第二民族药双参水溶性提取物(记为TGPC)。在本发明中，所述分级醇沉采用的醇沉试剂优选为醇水溶液，所述醇水溶液中的醇优选为乙醇；所述分级醇沉的次数优选为2～4次，更优选为3次；每次醇沉时体系中醇的体积分数优选为30～60％，更优选为30％；每次醇沉的温度独立优选为4～8℃，更优选为5～6℃；每次醇沉的时间独立优选为12～24h，更优选为15～18h。在本发明中，所述第六浓缩优选为减压浓缩，所述第六浓缩的温度优选为 60～70℃，更优选为65℃；所述第六浓缩具体是为了去除所述上清液中溶剂。所述第六浓缩后，本发明优选将所得浓缩物进行干燥，得到第一民族药双参水溶性提取物；所述干燥优选为冷冻干燥。本发明优选将所述醇沉淀进行干燥，得到第二民族药双参水溶性提取物；所述干燥优选为冷冻干燥。
本发明提供的方法中优选还包括脱色处理，具体可以按照以下两种方式中任一种进行脱色处理：
方式一：将水溶醇沉组分AB2'进行脱色处理，所得脱色溶液与流份AB1 混合经第七浓缩得到混合浓缩液；之后按照前述方法将所述混合浓缩液进行分级醇沉，得到上清液和醇沉淀，然后按照上述方案对所述上清液和醇沉淀进行相应处理，得到第一民族药双参水溶性提取物和第二民族药双参水溶性提取物。在本发明中，可以采用脱色试剂进行脱色处理，也可以采用大孔吸附树脂进行脱色处理，下面分别进行说明。
在本发明中，当采用脱色试剂进行脱色处理时，具体是将所述水溶醇沉组分AB2'、水与脱色试剂混合，进行脱色处理，得到脱色溶液；所述水溶醇沉组分AB2'与水的质量比优选为1：(0.5～1)，更优选为1：0.5；所述脱色试剂优选包括活性炭或双氧水，所述活性炭的质量优选为水溶醇沉组分 AB2'质量的2～5％，更优选为4％；所述双氧水的质量浓度优选为30％，所述双氧水的体积优选为水溶醇沉组分AB2'与水混合所得溶液总体积的5～8％，更优选为7％。在本发明中，所述脱色处理的温度优选为50～60℃，更优选为55℃；当采用活性炭时，所述脱色处理的时间优选为30～60min，更优选为40min；当采用双氧水时，所述脱色处理的时间优选为1～3h，更优选为 2h。
在本发明中，当采用大孔吸附树脂进行脱色处理时，具体是将水溶醇沉组分AB2'上样于大孔吸附树脂，以醇-水为洗脱剂进行洗脱，得到脱色溶液。在本发明中，所述大孔吸附树脂优选为AB-8大孔吸附树脂或101大孔吸附树脂；所述洗脱剂中的醇优选为甲醇；所述洗脱方式优选为梯度洗脱，所述洗脱剂中醇的体积分数优选为0～60％，更优选为0～40％，即优选收集水与醇体积比为1：0～4：6时所得脱色溶液，更优选收集水与醇体积比为1：0～6： 4时所得脱色溶液。
在本发明中，所述第七浓缩优选为减压浓缩；所述第七浓缩优选是将脱色溶液与流份AB1混合后所得体系浓缩至水溶性成分刚好全溶于水。
方式二：将所述水洗脱组分AB1'与水溶醇沉组分AB2'合并后所得混合组分进行分级醇沉后，将所得上清液和醇沉淀分别进行脱色处理，进而分别得到第一民族药双参水溶性提取物和第二民族药双参水溶性提取物；所述分级醇沉以及脱色处理的方法优选参照上述技术方案进行，不再赘述。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的民族药双参水溶性提取物，包括水溶性多糖类成分和水溶性小分子成分，所述水溶性多糖类成分的相对分子量范围为504～2.0×106，所述水溶性小分子的相对分子量范围为214～792。在本发明中，所述水溶性多糖类成分优选包括高分子量多糖和低分子量多糖，所述高分子量多糖的相对分子量范围优选为 5.0×104～2.0×106，所述低分子量多糖的相对分子量范围优选为504～4.0×104；所述水溶性小分子优选为水溶性环烯醚萜苷类化合物和/或其衍生物，所述水溶性环烯醚萜苷类化合物优选包括马钱子酸、马钱子酸衍生物、马钱子苷和马钱子苷衍生物中的至少一种。
在本发明中，所述第一民族药双参水溶性提取物中的功能性物质包括低分子量多糖、水溶性环烯醚萜类化合物及其衍生物；所述第二民族药双参水溶性提取物中的功能性物质包括高分子量多糖。
本发明提供了上述技术方案所述民族药双参水溶性提取物在制备防治糖尿病或肾病的药物或保健品中的应用。在本发明中，所述糖尿病优选为II 型糖尿病，肾病为糖尿病肾病、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、肾病综合征和肾小球肾炎中的至少一种，优选为糖尿病肾病。
在本发明中，所述药物优选包括活性成分以及药学上可接受的辅料。在本发明中，所述药物中活性成分为所述民族药双参水溶性提取物，所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的载体和/或赋形剂；所述药物中所述活性成分的含量优选为0.1～99.9wt％，更优选为1～90wt％；本发明对所述药学上可接受的载体没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体即可；本发明对所述药学上可接受的赋形剂没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的药学上可接受的赋形剂即可，具体可以包括甘露醇、硬脂酸镁、淀粉或环糊精。在本发明中，所述药物的剂型优选包括注射剂或口服制剂。在本发明中，当所述药物用于防治糖尿病时，所述药物的有效剂量优选为 50～200mg，所述药物的服用方法优选为口服；当所述药物用于防治糖尿病肾病时，所述药物的有效剂量优选为100mg，所述药物的服用方法优选为口服。
本发明对所述民族药双参水溶性提取物在制备防治糖尿病或肾病的保健品中的应用没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
本发明中民族药双参水溶性提取物对模型动物和人肾小球系膜细胞无毒，能降低糖尿病小鼠的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，其中第一民族药双参水溶性提取物(TGPB)的效果尤为显著，说明本发明提供的民族药双参水溶性提取物具有一定的调节血脂代谢紊乱能力。同时，本发明中民族药双参水溶性提取物能够降低糖尿病小鼠的尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr) 含量，其中TGPB的效果尤为显著，说明本发明提供的民族药双参水溶性提取物能够改善糖尿病小鼠的肾功能。因此本发明提供的民族药双参水溶性提取物适宜于糖尿病及肾病人群。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明以下实验所用氯仿、正丁醇、乙醇、甲醇为工业级试剂，并且重蒸后使用。
实施例1
以双参为原料制备双参水溶性提取物，步骤如下：
(1)将双参根茎部分洗净，晾干，然后切成体积为1cm3的小块状作为双参样品备用；称取双参样品2kg，加入4L体积分数为95％的乙醇水溶液，室温(25℃)条件下进行冷浸提取，重复3次，每次提取时间为24h，每次提取后滤出药渣进行下一次提取，最后一次提取后滤出的药渣作为醇提药渣，将每次提取结束滤出药渣后所得溶液合并，作为醇提液；
将所述醇提液在50℃条件下减压浓缩至无醇味，得到醇提组分A，同时回收乙醇；将所述醇提组分A与1L蒸馏水混合，得到醇提组分A水溶液；将所述醇提组分A水溶液与等体积正丁醇混合进行萃取，重复3次，得到萃取母液(即水溶性组分A1)和正丁醇萃取液，将所述正丁醇萃取液在70℃条件下减压浓缩以去除正丁醇，得到醇提组分A2；
向所述醇提药渣中加入3倍醇提药渣重量的蒸馏水，加热进行蒸煮提取，重复3次，每次提取时间为2.5h，每次提取后滤出药渣进行下一次提取，将每次提取结束滤出药渣后所得溶液合并，作为水提液；将所述水提液在65℃条件下减压浓缩至2L，得到水提浓缩液B；采用Sevag法将所述水提浓缩液 B进行除蛋白处理，重复3次，所述Sevag法采用的Sevag试剂为氯仿和正丁醇，所述氯仿和正丁醇的体积比为4：1，所述Sevag试剂与水提浓缩液B 的体积比为1：1，将除蛋白后所得水溶液在60℃条件下进行减压浓缩，得到水提组分B1；
将所述水溶性组分A1和水提组分B1合并后经AB-8大孔吸附树脂柱层析分离，样品湿法上样，以甲醇-水为洗脱剂，按甲醇与水体积比依次为0:1、 6:4和9.5:0.5进行梯度洗脱，每个梯度洗脱剂用量为2～3个柱体积，通过薄层色谱检测，依次得到流份AB1、流份AB2和流份AB3；
将所述流份AB2减压浓缩至1L，然后与工业乙醇(乙醇体积分数最高为95％)混合，在4℃冰箱内进行醇沉，重复3次，每次醇沉所用工业乙醇的体积为流份AB2体积的2倍，每次醇沉时间为12h，每次醇沉后，所得上清液减压浓缩除至水溶性成分刚好全溶于水，使最后一次醇沉时体系中乙醇的终浓度达90％(体积分数)以上，将每次醇沉所得沉淀合并，得到水溶醇沉淀组分AB2'，最后一次醇沉得到的上清液为醇溶上清液AB3'；
将所述流份AB1减压浓缩去除溶剂，得到水洗脱组分AB1'，将所述水洗脱组分AB1'与水溶醇沉淀组分AB2'合并，得到双参水溶性提取物(记为双参水溶性总提取物)。
实施例2
按照实施例1的方法制备得到流份AB1与水溶醇沉组分AB2'；
采用AB-8大孔吸附树脂柱层析法将所述水溶醇沉组分AB2'进行脱色处理，具体是以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集水与甲醇体积比为1：0～6： 4时所得脱色溶液；将所述脱色溶液与流份AB1混合后减压浓缩至水溶性成分刚好全溶于水，然后用乙醇水溶液在5℃进行分级醇沉，重复3次，每次醇沉过程中体系中乙醇的终浓度为30％(体积分数)，每次醇沉时间为18h，得到上清液和醇沉淀；所述上清液在65℃经减压浓缩后进行冷冻干燥，得到第一双参水溶性提取物(TGPB)；所述醇沉淀进行冷冻干燥，得到第二双参水溶性提取物(TGPC)。
对比例1
按照实施例1的方法制备得到流份AB3、醇溶上清液AB3'和醇提组分 A2，将所述流份AB3、醇溶上清液AB3'和醇提组分A2合并，在50℃条件下减压浓缩去除溶剂，得到民族药双参总醇提取物，记为TGPA。
实施例3
以大花双参为原料，按照实施例1的方法制备得到流份AB1与水溶醇沉组分AB2'；之后按照实施例2的方法制备得到第一大花双参水溶性提取物和第二大花双参水溶性提取物。
实施例4
动物实验：双参水溶性提取物对STZ诱导糖尿病小鼠肾脏的保护作用
1、体内活性研究：
将雄性昆明种小鼠适应性喂养1W，一般状态良好后，隔夜禁食12h，单次腹腔注射STZ，剂量为120mg·kg-1，建立糖尿病小鼠模型(尾静脉取血检测空腹血糖(FBG)，若FBG值≥11.1mmol·L-1造模成功)；取造模成功小鼠，随机分为11组，每组20只，分组情况为：模型组(Model)、Tempol 组；TGPA低剂量组(TGPA-L)、中剂量组(TGPA-M)、高剂量组(TGPA-H)；双参水溶性提取物TGPB低剂量组(TGPB-L)、中剂量组(TGPB-M)、高剂量组(TGPB-H)；双参水溶性提取物TGPC低剂量组(TGPC-L)、中剂量组(TGPC-M)、高剂量组(TGPC-H)。每日上午进行灌胃给药，Tempol 组给药剂量为90mg·kg-1，各给药组高中低剂量分别为30mg·kg-1、60mg·kg-1、 120mg·kg-1。持续给药4～6W，正常组和模型组给予等体积的蒸馏水。分别在给药4W和6W后，取半数小鼠眼球取血测定空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)，分离出血清测定糖化血清蛋白(Glycosylated serum protein， GSP)、总胆固醇(Total Cholesterol，TC)、血肌酐(Serum creatinine，Scr)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、血尿素氮(Blood ureanitrogen，BUN)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)以及高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol，HDL-C)；取血后颈椎脱臼处死动物后摘取肝脏、胸腺、脾脏和肾脏，滤纸吸干水分后称重，计算脏器指数。其中一侧肾脏放入4％组织固定液，用于制作病理切片，进行组织形态学检查。随后分别取0.1g组织制作10％肝脏匀浆和10％肾脏匀浆，离心取上清液测定超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量。
2、体内实验结果：
(1)双参3个活性组分(TGPA、TGPB以及TGPC)均改善STZ糖尿病小鼠的“三多一少”，降低了空腹血糖水平，特别是TGPB明显降低了STZ 糖尿病小鼠的空腹血糖水平，其中TGPB-H组的P<0.01，具有显著性差异，活性较好。具体结果见表1。
表1 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠FBG的影响
Figure BDA0003692437920000141
Group 4W(n＝20) 6W(n＝10)
Normal 6.80±1.30 5.85±2.05
Model 18.50±1.40<sup>**,△</sup> 23.15±2.65<sup>**,△△</sup>
Tempol 14.65±2.85<sup>**,#</sup> 11.91±1.45<sup>**,##</sup>
TGPA-H 15.05±2.35<sup>**,##</sup> 13.00±1.30<sup>**,##,△</sup>
TGPA-M 16.80±1.70<sup>**,#,△</sup> 14.25±1.95<sup>**,#,△</sup>
TGPA-L 17.27±1.86<sup>**,#,△△</sup> 16.63±2.82<sup>**,#,△</sup>
TGPB-H 14.91±2.13<sup>**,##</sup> 13.63±1.17<sup>**,##</sup>
TGPB-M 15.55±2.76<sup>**,##,△△</sup> 11.90±1.29<sup>**,##</sup>
TGPB-L 16.79±1.29<sup>**,#,△△</sup> 13.40±2.20<sup>**,#</sup>
TGPC-H 15.78±2.10<sup>**,#</sup> 13.73±1.49<sup>**,#</sup>
TGPC-M 14.09±1.84<sup>**,#</sup> 15.36±2.16<sup>**,#</sup>
TGPC-L 16.63±1.66<sup>**,#,△</sup> 14.74±1.17<sup>**,#</sup>
备注：与正常组(Normal)相比，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与模型组(Model)相比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05；与阳性对照组 (Tempol)相比，“△△”表示P<0.01，“△”表示P<0.05。数值为均数和标准差表示。
(2)与Normal组相比，Model组的小鼠各脏器指数均明显降低。Tempol 组和各给药组的小鼠脏器指数均接近Normal组甚至高于Normal组水平；其中，高剂量给药组的肾脏指数均高于Normal组水平，说明双参活性组分对糖尿病小鼠的肾脏有显著影响。具体结果见表2和表3。
表2 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠肝脏指数和肾脏指数的影响(
Figure BDA0003692437920000142
n＝10)
Figure BDA0003692437920000143
Figure BDA0003692437920000151
备注：与正常组(Normal)相比，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与模型组(Model)相比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05；与阳性对照组 (Tempol)相比，“△△”表示P<0.01，“△”表示P<0.05。数值为均数和标准差表示。
表3 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响(
Figure BDA0003692437920000152
n＝10)
Figure BDA0003692437920000153
Figure BDA0003692437920000161
备注：与正常组(Normal)相比，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与模型组(Model)相比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05；与阳性对照组 (Tempol)相比，“△△”表示P<0.01，“△”表示P<0.05。数值为均数和标准差表示。
(3)与模型组比较，TGPB明显降低模型小鼠的糖化血清蛋白(GSP)。具体结果见表4和图1。
表4 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠GSP(mmol·L-1)的影响(
Figure BDA0003692437920000162
n＝10)
Group 4W 6W
Normal 2.09±0.11 2.07±0.10
Model 3.02±0.09<sup>**,△</sup> 3.45±0.16<sup>**,△</sup>
Tempol 2.89±0.16<sup>**,#</sup> 2.88±0.10<sup>**,#</sup>
TGPA-H 2.56±0.08<sup>**,##,△</sup> 2.34±0.08<sup>*,##,△△</sup>
TGPA-M 2.99±0.03<sup>**,#,△</sup> 2.71±0.01<sup>**,##,△</sup>
TGPA-L 3.10±0.08<sup>**</sup>,△ 2.95±0.15<sup>**,##</sup>
TGPB-H 2.38±0.131<sup>*,##,△△</sup> 2.29±0.121<sup>*,##,△△</sup>
TGPB-M 2.51±0.11<sup>*,#,△</sup> 2.42±0.09<sup>*,#,△</sup>
TGPB-L 2.90±0.05<sup>**,#</sup> 2.71±0.14<sup>**,##</sup>
TGPC-H 2.87±0.13<sup>**,#</sup> 2.60±0.02<sup>**,##</sup>
TGPC-M 2.93±0.08<sup>**</sup> 2.62±0.02<sup>**,##</sup>
TGPC-L 3.09±0.17<sup>**</sup> 2.66±0.07<sup>**,#</sup>
备注：与正常组(Normal)相比，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与模型组(Model)相比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05；与阳性对照组 (Tempol)相比，“△△”表示P<0.01，“△”表示P<0.05。数值为均数和标准差表示。
(4)双参水溶性提取物能降低糖尿病小鼠的尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)含量，其中TGPB-H组的效果显著，说明双参水溶性提取物能改善糖尿病小鼠的肾功能。具体结果见表5和图2。
表5 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠BUN和Scr的影响(
Figure BDA0003692437920000171
n＝10)
Figure BDA0003692437920000172
备注：与正常组(Normal)相比，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与模型组(Model)相比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05；与阳性对照组(Tempol) 相比，“△△”表示P<0.01，“△”表示P<0.05。数值为均数和标准差表示。
(5)双参能降低糖尿病小鼠的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，其中 TGPB-H的效果尤为显著。说明双参活性组分有一定的调节血脂代谢紊乱能力。具体结果见表6和表7。
表6 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠TG和TC的影响(
Figure BDA0003692437920000173
n＝10)
Figure BDA0003692437920000174
Figure BDA0003692437920000181
表7 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠HDL-C和LDL-C的影响(
Figure BDA0003692437920000182
n＝10)
Figure BDA0003692437920000183
备注：与正常组(Normal)相比，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与模型组(Model)相比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05；与阳性对照组 (Tempol)相比，“△△”表示P<0.01，“△”表示P<0.05。数值为均数和标准差表示。
(6)双参各组分能升高糖尿病小鼠肝脏的T-SOD、GSH-PX活性，而降低其MDA含量，其中TGPB-H组的抗氧化能力仅次于阳性对照Tempol 组。具体结果见表8和表9。
表8 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠肝脏T-SOD和MDA的影响(
Figure BDA0003692437920000191
n＝10)
Figure BDA0003692437920000192
表9 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠肝脏GSH-PX(mmol·L-1)的影响(
Figure BDA0003692437920000193
Figure BDA0003692437920000194
n＝10)
Figure BDA0003692437920000195
Figure BDA0003692437920000201
备注：与正常组(Normal)相比，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与模型组(Model)相比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05；与阳性对照组 (Tempol)相比，“△△”表示P<0.01，“△”表示P<0.05。数值为均数和标准差表示
(7)双参活性组分能升高糖尿病小鼠肾脏的T-SOD、GSH-PX活性，而降低其MDA含量，且存在浓度依赖关系，其中TGPB-H组效果最为明显，抗氧化能力仅次于阳性对照Tempol组。具体结果见表10、表11以及图3。
表10 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠肾脏T-SOD和MDA的影响(
Figure BDA0003692437920000202
n＝10)
Figure BDA0003692437920000203
Figure BDA0003692437920000211
表11 双参活性组分对STZ糖尿病小鼠肾脏GSH-PX(mmol·L-1)的影响(
Figure BDA0003692437920000212
Figure BDA0003692437920000213
n＝10)
Group 4W 6W
Normal 73.34±2.68 73.22±3.50
Model 52.77±1.17<sup>**,△△</sup> 51.01±2.05<sup>**,△△</sup>
Tempol 67.82±2.93<sup>*,##</sup> 68.51±2.08<sup>*,##</sup>
TGPA-H 59.55±2.10<sup>**,#,△</sup> 60.54±3.11<sup>**,##,△</sup>
TGPA-M 57.67±1.12<sup>**,#,△</sup> 56.64±2.01<sup>**,#,△</sup>
TGPA-L 51.60±2.30<sup>**,△△</sup> 52.60±1.07<sup>**,△△</sup>
TGPB-H 61.49±2.03<sup>*,##,△</sup> 62.31±1.50<sup>*,##,△</sup>
TGPB-M 59.67±1.17<sup>**,#,△</sup> 60.60±2.15<sup>**,#,△</sup>
TGPB-L 53.65±2.01<sup>**,△△</sup> 53.36±1.10<sup>**,△△</sup>
TGPC-H 54.14±1.52<sup>**,△△</sup> 55.25±2.40<sup>**,#,△</sup>
TGPC-M 53.57±2.70<sup>**,△△</sup> 52.53±1.06<sup>**,△△</sup>
TGPC-L 51.66±3.50<sup>**,△△</sup> 51.61±2.04<sup>**,#,△△</sup>
备注：与正常组(Normal)相比，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与模型组(Model)相比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05；与阳性对照组 (Tempol)相比，“△△”表示P<0.01，“△”表示P<0.05。数值为均数和标准差表示。
(8)体内实验结果
(a)TGPB可以改善STZ糖尿病小鼠肾脏指数；综合肝脏、脾脏以及胸腺指数结果，发现TGPC有一定提高免疫能力的作用。
(b)双参3种活性组分在一定程度上均能够改善STZ糖尿病小鼠的“三多一少”，降低了FBG水平；可提高肝脏和肾脏抗氧化能力，表现为提高 T-SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量；双参活性组分可在一定程度上对血糖和血脂紊乱起到纠正作用，表现为血清中GSP、TC、TG、LDL-C水平有下降的趋势，影响了HDL-C含量。
(c)TGPB可在一定程度上改善肾功能，表现为降低Scr、BUN含量。
(9)病理切片结果
图4为小鼠肾脏切片光学显微照片(放大400倍)，由图4可知，“正常组 (Control)”肾脏结构无新增变化，肾小球囊无粘连系膜细胞及基质无增生，肾小球体积无明显变化，肾小管上皮细胞未见水肿，肾间质无纤维化及单核细胞浸润。
“模型组(Model)”肾小球体积明显增大，肾小球系膜细胞及基质局部病灶，节段性增生，肾小管上皮细胞水肿，肾间质无显著变化。
与模型组对照，治疗组(TGPA、TGPB、TGPC)-高(H)、中(M)、低 (L)剂量组中，高剂量(-H)的肾小球体积减小，肾小球系膜细胞及基质局部病灶增生减少，肾小管上皮细胞水肿减轻。与阳性对照组(Tempol)组现象一致。说明双参3种活性组分对模型小鼠的肾脏有保护作用，特别是 TGPB组分高剂量组效果优异。
3、结论：
(1)双参3个活性组分均改善STZ糖尿病小鼠的“三多一少”，降低了空腹血糖水平和糖化血清蛋白(GSP)，特别是双参水溶性组分TGPB明显降低了STZ糖尿病小鼠的空腹血糖水平和糖化血清蛋白(GSP)。
(2)双参活性组分对STZ糖尿病小鼠有一定的肾脏保护作用，其机制可能与双参活性组分可提高STZ糖尿病小鼠肾脏和肝脏抗氧化能力、调整糖脂代谢紊乱以及改善肾功能有关。
实施例5
细胞实验：双参水溶性提取物对高糖培养人肾小球系膜细胞的保护作用
1、高糖建模：采用MTT法检测高糖刺激HMC细胞增殖情况，结果显示：细胞培养12～72h，含25mmol/L、27.5mmol/L、30mmol/L和32.5mmol/L 葡萄糖的培养基对HMC细胞刺激增殖在12～48h呈明显增殖状态，并于48h 细胞增长至极点；其中含有30mmol/L葡萄糖培养基增殖最明显，当细胞培养至64～72h，细胞呈现生长缓慢状态。所以采用30mmol/L高糖培养基对 HMC细胞培养48h作为高糖刺激HMC细胞的最佳模型。具体结果见图5，, 其中，*P﹤0.05，**P﹤0.01。
2、组分对细胞毒性实验：双参水溶性提取物在50～800μg/mL浓度范围内对人肾小球系膜细胞无毒性，故采用此浓度范围的双参活性组分进一步验证糖刺激的人肾小球系膜细胞(HMC)增值抑制作用。具体结果见图6。
3、细胞实验：采用MTT法，对双参活性组分抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞(Human renalmesangial Cell，HRMC)增殖的作用进行检测，将 HRMC细胞均匀种在96孔板中，使其细胞密度为2.0×104个/孔；待细胞贴壁后，换无血清培养基继续培养24h，根据分组加入100μL正常糖培养基、 100μL高糖完全培养基和不同浓度给药组，每组5个复孔，继续培养48h。加入MTT溶液20μL，CO2培养箱孵育4h后，倾出上清液，加入150μLDMSO，震板2min后，于490nm处测定OD值。设置正常对照组(NG，含5.5mmol·L-1葡萄糖)、高糖组(HG，含30mmol·L-1葡萄糖)、Tempol组(100μmol·L-1) 以及双参活性组分TGPA、TGPB和TGPC三个组分药物组(50μg·L-1、 200μg·L-1、800μg·L-1)组；各药物干预时间为48h，反复离心得到沉淀下来的细胞，随后进行超声使其破裂。用MTT法检测各实验组对高糖培养HMC 细胞增殖与细胞活力影响；随后进行ROS含量检测并采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assaym，ELISA)测定各组HRMC细胞上清液内T-SOD、MDA含量。
(1)双参活性组分对高糖诱导的HRMC细胞增殖的抑制作用
双参水溶性提取物无细胞毒性，且TGPB和TGPC均对高糖诱导的 HRMC增殖有一定的抑制作用。具体结果见图7(TGPA对应TGA，TGPB 对应TGB，TGPC对应TGC)，其中“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与高糖组(HG)比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05。
(2)双参活性组分对高糖诱导HRMC细胞内MDA、T-SOD含量影响与NG(P<0.05)组相比，HG(P<0.05)的细胞内MDA明显增多，TGPB (P<0.05)的效果较其它给药组的效果好，并出现了一定的药物浓度依赖。
与NG(P<0.05)组相比，高糖诱导HRMC细胞内的T-SOD含量明显降低，TGPA和TGPB的各剂量组均T-SOD含量较HG组有所回升，TGPC 组只有最高剂量组TGC-800(800μg·L-1，P<0.05)略有回升，其它两个剂量组几乎与HG组含量一致。具体结果见表12。
表12 双参活性组分对高糖诱导HRMC细胞内MDA、T-SOD含量影响(
Figure BDA0003692437920000241
Figure BDA0003692437920000242
n＝6)
Group MDA(nmol·mL<sup>-1</sup>) T-SOD(U·L<sup>-1</sup>)
NG 6.12±0.26 94.22±1.24
HG 8.35±0.62<sup>**</sup> 62.00±2.73<sup>**</sup>
TGPA-50 8.85±0.30<sup>**</sup> 76.44±1.00<sup>**,#</sup>
TGPA-200 8.75±0.40<sup>*</sup> 79.64±1.57<sup>**,#</sup>
TGPA-800 8.09±0.66<sup>**</sup> 79.52±0.84<sup>**,#</sup>
TGPB-50 7.72±0.56<sup>**,##</sup> 80.74±1.41<sup>**,#</sup>
TGPB-200 7.40±0.42<sup>**,#</sup> 80.33±2.38<sup>*,##</sup>
TGPB-800 7.22±0.66<sup>**,##</sup> 82.56±1.73<sup>*,##</sup>
TGPC-50 8.78±0.76<sup>*,#</sup> 62.78±1.48<sup>**,#</sup>
TGPC-200 8.39±0.39<sup>*,#</sup> 62.78±1.73<sup>*,#</sup>
TGPC-800 8.12±0.16<sup>*,#</sup> 66.44±1.89<sup>*</sup>
备注：与正常糖组(NG)相比，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与高糖组(HG)相比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05。
(3)双参活性组分作用后的高糖诱导HRMC细胞内ROS含量检测
双参三个活性组分对高糖诱导HRMC细胞内ROS降低程度大小比较： TGPB-800>TGPB-200>TGPA-200>TGPA-800>TGPA-50>TGPB-50>TGPC-80 0>TGPC-200>TGPC-50，因此，TGPB对细胞内ROS含量影响受给药剂量影响大，TGPA效果也较为明显，且不同给药剂量降低程度相当。具体结果见表13。
表13 双参活性组分对高糖诱导HRMC细胞内ROS含量影响(
Figure BDA0003692437920000251
n＝6)
Group ROS
NG 529.00±4.24
HG 1373.00±25.46<sup>**</sup>
TGPA-50 820.00±11.31<sup>*,##</sup>
TGPA-200 807.50±2.12<sup>*,##</sup>
TGPA-800 817.00±7.07<sup>*,##</sup>
TGPB-50 878.50±3.54<sup>**,##</sup>
TGPB-200 791.00±11.31<sup>*,##</sup>
TGPB-800 770.00±5.66<sup>*,#</sup>
TGPC-50 1185.50±47.38
TGPC-200 1164.00±38.18<sup>**,#</sup>
TGPC-800 1148.50±4.95<sup>*</sup>
备注：与正常糖组(NG)相比，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05；与高糖组(HG)相比，“##”表示P<0.01，“#”表示P<0.05。
(4)结果发现：双参水溶性提取物升高了高糖培养HRMC细胞内T-SOD，且降低了MDA和ROS的含量；尤其是TGPA和TGPB对高糖培养人肾小球系膜细胞具有保护作用，其机制可能与其能提高HRMC细胞抗氧化能力有关。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种民族药双参水溶性提取物的制备方法，包括以下步骤：
将民族药双参进行醇提，得到醇提液和醇提药渣；
所述醇提液经第一浓缩得到醇提组分A，将所述醇提组分A与水以及正丁醇混合进行萃取，得到水溶性组分A1；
将所述醇提药渣进行热水提取，所得水提液经第二浓缩得到水提浓缩液B，将所述水提浓缩液B进行除蛋白处理，所得除蛋白溶液经第三浓缩得到水提组分B1；
以低级醇-水为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述水溶性组分A1与水提组分B1合并后的混合组分进行大孔吸附树脂柱层析分离，依次得到流份AB1、流份AB2和流份AB3，所述梯度洗脱包括依次进行的3个梯度，按低级醇和水的体积比计，所述洗脱剂的组成依次为0：1、1～7：9～3和9.5：0.5，分别对应流份AB1、流份AB2和流份AB3；
将所述流份AB1经第四浓缩得到水洗脱组分AB1'；将所述流份AB2依次经第五浓缩和醇沉，得到水溶醇沉组分AB2'；将所述水洗脱组分AB1'与水溶醇沉组分AB2'合并，得到民族药双参水溶性提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述民族药双参为双参或大花双参。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醇提为冷浸提取，所述醇提采用的醇提试剂为乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的体积分数为60～95％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述除蛋白处理采用的方法为Sevag法。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂柱层析分离采用的大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂或101大孔吸附树脂。
6.根据权利要求1～5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述水洗脱组分AB1'与水溶醇沉组分AB2'合并后还包括：将所得混合组分进行分级醇沉，得到上清液和醇沉淀，所述上清液经第六浓缩后得到第一民族药双参水溶性提取物，所述醇沉淀为第二民族药双参水溶性提取物。
7.权利要求1～6任一项所述制备方法制备得到的民族药双参水溶性提取物，包括水溶性多糖类成分和水溶性小分子成分，所述水溶性多糖类成分的相对分子量范围为504～2.0×106，所述水溶性小分子的相对分子量范围为214～792。
8.根据权利要求7所述的民族药双参水溶性提取物，其特征在于，所述水溶性多糖类成分包括高分子量多糖和低分子量多糖，所述高分子量多糖的相对分子量范围为5.0×104～2.0×106，所述低分子量多糖的相对分子量范围为504～4.0×104；所述水溶性小分子为水溶性环烯醚萜苷类化合物和/或其衍生物。
9.权利要求7或8所述民族药双参水溶性提取物在制备防治糖尿病或肾病的药物或保健品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述糖尿病为II型糖尿病；所述肾病为糖尿病肾病、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、肾病综合征和肾小球肾炎中的至少一种。
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