CN114853853B - 一种口腔癌标志物的完全抗原及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种口腔癌标志物的完全抗原及其应用，该口腔癌标志物的完全抗原包括α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R或Biotin‑α肽；由于肽段较短，适合通过化学合成的方法获得，获取简单方便，成本较低；α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin‑α肽可与T细胞表位融合，可以在小鼠体内诱导产生较强的免疫反应，可作免疫原免疫小鼠，以制备用于α‑肽检测的单克隆抗体；该完全抗原免疫性强，基本不含不需要的B细胞表位，有利于α‑肽特异性的多克隆抗体或单克隆抗体研发。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体的说是一种口腔癌标志物的完全抗原及其应用。
背景技术
口腔癌指发生在口腔的恶性肿瘤，有舌癌、牙龈癌、腭癌、口咽癌、唇癌等，最常见的是舌癌。尽管口腔癌在我国的癌症谱中并不是发病率和死亡率非常高的癌症，但近年来有上升趋势。全球疾病负担(GBD)研究结果显示，最近几十年，我国口腔癌无论是发病率还是死亡率，都呈现出较明显的上升趋势，从1990年-2017年，我国口腔癌新发病与死亡人数分别上升280％和197％，且男性上升幅度超过女性。流行病学研究表明，口腔癌的发生和环境致癌物，特别是香烟、酒精和槟榔果等有关。
在过去的二十多年中，口腔癌患者的5年生存率，是主要癌症当中较低的，且没有明显改善；其标准治疗手段主要有手术、放疗或者多种措施并举。对于早期(I期、II期)的患者，这些标准治疗方案治疗效果比较明显；但仍有大约20％-30％的患者复发，在原病灶处或淋巴结中再现癌细胞。对于晚期患者(III期、IV期)，标准治疗手段不是很成功，约有50-60％的复发率，20％-35％的病例还发生了远器官迁移。即使有较好的治疗手段，口腔癌患者会承受很大的痛苦，术后不论对面容还是日常起居都会产生很大的影响，降低生命质量。
良好的肿瘤标志物，对于肿瘤的早期发现、精准治疗、疗效观察、病情检测以及预后的评价具重要的意义。近年，一种高灵敏度(100％)和高特异性(97％)的口腔癌标志物通过蛋白组学被鉴定，是一种较有前景的检测指标。该标志物经鉴定为纤维蛋白原α链C端的一个大小为25aa的短肽段，其序列为：DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV。鉴于其多肽性质，适合用免疫手段进行检测。
但由于肽段太短，直接免疫该肽无法获得特异性抗体。为解决这一问题，很多免疫原性低下的抗原或半抗原通常需要偶联到载体蛋白上(主要有钥孔血蓝蛋白KLH和牛血清白蛋白BSA)。采用此方式制备的抗原存在两个主要的缺陷：一是机体会产生大量针对载体蛋白的抗体，针对抗原和半抗原的抗体量减少；而且对载体蛋白的抗体亲和力相对更高，导致针对偶联的抗原的亲和力较低。二是偶联到载体蛋白的过程复杂，通常一个载体蛋白上偶联了数个抗原或半抗原，抗体和偶联产物能二价结合，表现出极高的亲和力，但实际上原始的半抗原与抗体的结合力较弱，不利于获得高亲和力抗体，进而影响试剂盒的开发。
发明内容
本发明的目的在于提出了一种口腔癌标志物的完全抗原及其应用，该口腔癌标志物的完全抗原可与T细胞表位融合，以促进免疫反应的发生，产生的抗血清具有较高的亲和力和特异性，可作免疫原免疫小鼠，以制备用于α-肽检测的单克隆抗体，且该完全抗原免疫性强，基本不含不需要的B细胞表位，有利于α-肽特异性的多克隆抗体或单克隆抗体研发。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种口腔癌标志物的完全抗原，包括α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R或Biotin-α肽；
所述α肽的氨基酸序列为：
DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV；
所述融合肽1的氨基酸序列为：
SKDQIKKLTSLKNKLERRQNDEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV；所述融合肽1R的氨基酸序列为：
DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPVSKDQIKKLTSLKNKLERRQN；所述融合肽2的氨基酸序列为：
LEYYLREKAKMAGTLIIPESDEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV；所述融合肽2R的氨基酸序列为：
DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPVLEYYLREKAKMAGTLIIPES；所述Biotin-α肽的氨基酸序列为：
biotin-DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV。
优选地，所述α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin-α肽分别通过化学合成方法获得。
一种口腔癌标志物的完全抗原的应用，将α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin-α肽与T细胞表位融合，用于免疫动物来获得α肽抗体或进一步制备单克隆抗体。
优选地，所述T细胞表位是一种疟原虫来源的小分子短肽，该小分子短肽的氨基酸序列为：SKDQIKKLTSLKNKLERRQN。
一种口腔癌标志物的完全抗原的应用，将所述α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin-α肽用于α肽的抗原或抗体的检测。
采用上述技术方案后，本发明与背景技术相比，具有如下优点：本发明的α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin-α肽由于肽段较短，适合通过化学合成的方法获得，获取简单方便，成本较低；α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin-α肽可与T细胞表位融合，可以在小鼠体内诱导产生较强的免疫反应，可作免疫原免疫小鼠，以制备用于α-肽检测的单克隆抗体。该完全抗原免疫性强，基本不含不需要的B细胞表位，有利于α-肽特异性的多克隆抗体或单克隆抗体研发。
附图说明
图1为本发明的α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2和融合肽2R的免疫血清滴度图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
参见图1，一种口腔癌标志物的完全抗原，包括α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R或Biotin-α肽；
所述α肽的氨基酸序列为：
DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV；
所述融合肽1的氨基酸序列为：
SKDQIKKLTSLKNKLERRQNDEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV；所述融合肽1R的氨基酸序列为：DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPVSKDQIKKLTSLKNKLERRQN；所述融合肽2的氨基酸序列为：
LEYYLREKAKMAGTLIIPESDEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV；所述融合肽2R的氨基酸序列为：DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPVLEYYLREKAKMAGTLIIPES；所述Biotin-α肽的氨基酸序列为：biotin-DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV。
优选地，所述α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin-α肽分别通过化学合成方法获得。
一种口腔癌标志物的完全抗原的应用，将α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin-α肽与T细胞表位融合，用于免疫动物来获得α肽抗体或进一步制备单克隆抗体。
优选地，所述T细胞表位是一种疟原虫来源的小分子短肽，该小分子短肽的氨基酸序列为：SKDQIKKLTSLKNKLERRQN。
一种口腔癌标志物的完全抗原的应用，将所述α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin-α肽用于α肽的抗原或抗体的检测。
1、小鼠免疫试验
在6-8周龄的Balb/C小鼠首次免疫时，取α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2和融合肽2R作为免疫原稀释至1mg/mL(用0.01mol/LPBS缓冲液稀释)，分别与弗氏完全佐剂等体积混合，并充分乳化。乳化好的抗原，分别采用颈背部皮下多点接种的方式接种小鼠3只，接种抗原剂量为50μg/只，每只0.1ml；14天后进行第2次免疫，用弗氏不完全佐剂与免疫原等体积乳化，免疫剂量和首次免疫剂量相同，加强免疫次数为4次。
2、免疫效价的鉴定
五免一周后尾尖采血200μL，离心，收集血清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA法)测血清效价。
1)抗血清效价的测定，其步骤如下：
(1)包被：将链霉亲和素用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释成10μg/mL，按100μL/孔加入到酶标板中，置于37℃温箱中孵育2小时。倾去孔内液体，用PBST缓冲液(pH7.2)洗板3次，甩干洗涤液。
(2)封闭：每孔加150μL的封闭液(5％BSA)，37℃封闭1h，甩干孔内液体，用PBST缓冲液(pH 7.2)洗板3次，拍干洗涤液。
(3)抗原吸附：每孔加100μL用封闭液(5％BSA)稀释的0.2μg/mL的Biotin-α肽；用PBST缓冲液(pH 7.2)洗板3次，拍干洗涤液。
(4)加抗血清：各列孔加入100μL用封闭液(5％BSA)稀释后的抗血清，抗体从1:1000开始，以2为梯度用0.01M PBS脱脂奶粉溶液开始稀释，共稀释8个梯度。加样量为每孔100μL，37℃孵育60min，PBST缓冲液(pH 7.2)洗涤3次，拍干。同时设置未经免疫的小鼠血清作为阴性对照。
(5)加酶标二抗：每孔加入100μLHRP-羊抗鼠IgG(PBS稀释5000倍)，37℃孵育30min，PBST缓冲液(pH 7.2)洗涤3次，拍干。
(6)显色：将辣根过氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液和质量分数为30％的过氧化氢按照1:1的体积比混合，每孔100μL，37℃孵育15min。然后每孔加入50μL的终止液(2mol/L H2SO4)。
(6)读数测定：在波长450nm条件下用酶标仪读取吸光值(OD)。以阴性对照的OD的2.5倍对对应的稀释度为抗血清效价，测试结果如图1和表1所示。
表1抗血清效价的测试结果
由图1和表1的结果表明，本发明的α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin-α肽可以在小鼠体内诱导产生较强的免疫反应，可作免疫原免疫小鼠，以制备用于α-肽检测的单克隆抗体。该完全抗原免疫性强，基本不含不需要的B细胞表位，有利于α-肽特异性的多克隆抗体或单克隆抗体研发。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (3)
1.一种口腔癌标志物的完全抗原，其特征在于，包括α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R或Biotin-α肽；
所述α肽的氨基酸序列为：
DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV；
所述融合肽1的氨基酸序列为：
SKDQIKKLTSLKNKLERRQNDEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV；
所述融合肽1R的氨基酸序列为：
DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPVSKDQIKKLTSLKNKLERRQN；
所述融合肽2的氨基酸序列为：
LEYYLREKAKMAGTLIIPESDEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV；
所述融合肽2R的氨基酸序列为：
DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPVLEYYLREKAKMAGTLIIPES；
所述Biotin-α肽的氨基酸序列为：
biotin- DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV。
2.如权利要求1所述的一种口腔癌标志物的完全抗原，其特征在于：所述α肽、融合肽1、融合肽1R、融合肽2、融合肽2R和Biotin-α肽分别通过化学合成方法获得。
3.一种如权利要求1-2任一所述的口腔癌标志物的完全抗原的应用，其特征在于：用于免疫动物来获得α肽抗体或进一步制备用于α-肽检测的单克隆抗体。
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