CN114853715B - 一种有机亚硝酸根供体缩酮型前药及其制备方法与医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化学领域，具体涉及含有1‑硝甲基‑2‑苯基乙烯骨架的有机亚硝酸根

供体缩酮型前药，其制备方法，以及化合物I的药用组合物在预防或治疗脑缺血、心肌缺血和肺动脉高压中的医药用途。与先前设计合成的有机亚硝酸根供体化合物VI相比，本发明的有机亚硝酸根供体缩酮型前药I具有更好的血浆稳定性，并且缩酮型前药I策略可进一步提高

发挥的缺血保护作用和提高氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)原代神经元细胞的生存率。同时药代动力学研究表明，缩酮前药型

供体具有更好的药代动力学行为。此外，前药策略可显著降低MCAO大鼠脑梗死体积及脑含水量，加速大鼠缺血脑组织内皮细胞增殖，促进新生血管生成。

Description

一种有机亚硝酸根供体缩酮型前药及其制备方法与医药用途

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种含1-硝甲基-2-苯基乙烯骨架的有机亚硝酸根

供体缩酮型前药(化合物I)的制备方法，含有缩酮型前药(化合物I)的药用组合物及其医药用途，特别是在制备预防或治疗脑缺血、心肌缺血及肺动脉高压药物中的应用。

背景技术

近些年来研究表明，亚硝酸钠(NaNO₂)对一些心脑血管疾病，特别是缺血性疾病，具有很好的治疗保护作用。临床研究表明，静脉滴注低剂量的亚硝酸钠对急性缺血性脑卒中病人确实有效且耐受性良好，副作用仅为一过性的血压下降和高铁血红蛋白水平微量上升(5％)，停药后即可消失。

心肌缺血是心梗的主要诱发因素之一，亚硝酸钠抗心肌缺血效果显著。心肌缺血小鼠口服亚硝酸钠可减少心肌梗塞体积约48％。对心肌缺血小鼠心室注射亚硝酸钠，可降低梗塞体积的67％。小鼠心肌缺血前24h或再灌注前立即腹腔注射亚硝酸钠，可分别减小心肌梗塞体积52.7％和66％。对心肌缺血病人静脉滴注低剂量的亚硝酸钠，可以减轻患者心肌缺血/再灌注损伤，但对正常组织没有影响。

除心、脑缺血性疾病外，亚硝酸钠还可用于治疗肝、肾及肢体的缺血/再灌注损伤。亚硝酸钠抑制肝脏缺血小鼠的细胞坏死和凋亡，显示了很强的肝保护作用。在小鼠肾缺血模型，亚硝酸钠通过舒张血管，也发挥了良好的保护作用。在小鼠后肢静脉缺血模型，亚硝酸钠可时间依赖性地刺激内皮细胞生长，提高缺血区血管密度，增加血流量。

亚硝酸钠的作用机制研究发现，NO清除剂carboxy-PTIO(简写为PTIO)可抑制亚硝酸钠的抗缺血/再灌注保护活性，提示亚硝酸钠的治疗效果具有NO依赖性。临床试验时也发现，静脉滴注亚硝酸钠后血浆中S-亚硝基硫醇量显著增加，提示亚硝酸钠被还原成NO后，再与硫醇作用生成亚硝基硫醇。

亚硝酸钠还原成NO的机理研究表明，在缺血导致的低氧、低pH环境，

可被脱氧血红蛋白(deoxy-Hb)、黄嘌呤氧化还原酶(XOR)以及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)等还原为NO，产生血管舒张、血流增加，清除自由基、抗氧化，促进缺血部位的血管新生等多种治疗作用；在正常的含氧组织中，/>

被氧化为无害的/>

排出体外。因此，NO₂ ^–被视为缺血、缺氧组织中NO的前药。

虽然亚硝酸钠治疗多种动物缺血性疾病已显示出很好的效果，但它进入人体循环后可被快速代谢，半衰期仅为25-30分钟。此外，大剂量亚硝酸钠给药，并未产生缺血保护作用。究其原因，可能是高浓度的亚硝酸钠在短时间内产生大量的NO，与超氧阴离子自由基

反应，生成氧化能力更强的过氧亚硝酸盐(ONOO^-)，导致蛋白硝化和DNA损伤等毒副作用。再者，若频繁给予亚硝酸钠，有可能造成过多Na⁺摄入，对心血管产生不良影响。

发明内容

研究和发现有机小分子

供体化合物，使其持续释放少量/>

不仅具有重要的理论意义，而且具有潜在的临床应用价值。

基于以上的发现，设计合成了一系列有机亚硝酸根供体化合物，在预防或治疗脑缺血、心肌缺血和肺动脉高压中具有良好的治疗作用。尽管如此，目前合成的有机亚硝酸根供体化合物依然存在着一些问题。由于先前的有机亚硝酸根供体如化合物VI具有α,β–不饱和酮(Michael受体)结构，此结构可与内源性(如血浆中)存在的多种亲核物质相结合，因此化合物VI的稳定性和药代动力学行为(PK)不理想。尽管化合物VI表现出了较好的体外脑缺血保护活性，但芳环上的取代基不能改善其稳定性。因此，我们仍需要进一步改造现有的有机亚硝酸根供体，使其在保证活性的前提下进一步提高稳定性和药代动力学行为。

缺血部位的组织/细胞微环境相比于正常微环境具有微酸性(pH 5.5-5.8)的特点。人们常在药物设计时通过对活性基团进行掩蔽，引入对酸性敏感的基团(如缩酮/醛、亚胺、腙和酰腙等)制备成前药，使其具有一定稳定性的同时可选择性地在酸性环境中释放出原药。受此启发，我们设想把现有的有机亚硝酸根供体VI结构中的酮羰基利用二醇片段以缩酮形式保护起来形成前药，希望能提高其稳定性，尤其是亲核物质的作用下的稳定性；此外，缩酮结构在酸性条件下(缺血/缺氧组织中)脱除保护基释放出原来羰基，即恢复原药化合物VI的结构，并进一步释放出

从而达到选择性在缺血/缺氧部位选择性释放的目的(图1)。

基于上述背景，本发明提供了含有1-硝甲基-2-苯基乙烯骨架的有机

供体缩酮型前药(化合物I)，并提供了化合物I的制备方法，含此化合物的药用组合物、其药学上可接受的盐，及其医药用途。

技术方案：本发明公开的化合物是含有1-硝甲基-2苯基乙烯骨架的有机

供体型化合物缩酮型前药(化合物I)，及其药学上可接受的盐：

化合物I：(E)-2-硝甲基-3-苯基-1-(3-(三氟甲基)苯基)丙-2-烯-1-缩酮；

本发明还提供了所述化合物I的制备方法。

设计的有机亚硝酸根供体缩酮型前药(化合物I)可用如下步骤制备得到：

目标化合物I的合成步骤首先是由起始原料二苄胺(化合物II)和3-三氟甲基苯丙酮(化合物III)在过硫酸铵的存在下反应得关键中间体IV，再在自由基引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)的作用下，经N-溴代丁二酰亚胺(NBS)溴代得中间体V，接着与亚硝酸银(AgNO₂)反应制得化合物VI，最后化合物VI与乙二醇在对甲苯磺酸(p-TsOH)、原甲酸三乙酯的催化下，无水苯作溶剂回流带水即得目标化合物I。

本发明还提供所述化合物、药物组合物在制备预防或治疗心脑血管疾病及抗肺动脉高压药物中的应用，所述心脑血管疾病为脑缺血、脑卒中、心肌缺血、心肌梗死、心绞痛、心律失常或冠心病。

本发明药物组合物的剂型可以由本领域技术人员，按照药学领域的常规方法制备。例如，使活性成分与一种或多种载体(也称为辅料)混合，然后将其制成所需的剂型，包括片剂、胶囊、颗粒剂、气雾剂；还可以按照注射剂常规生产方法制成静脉注射或静脉注射冻干剂。

有益效果：与先前设计合成的有机亚硝酸根供体化合物VI相比，本发明的有机亚硝酸根供体缩酮型前药(化合物I)具有如下优异的性能：(1)化合物I具有更好的血浆稳定性。(2)化合物I在体外含巯基的亲核试剂存在下具有更高的稳定性，并可剂量依赖性地缓慢释放

(3)化合物I在体内可缓慢释放/>

产生有效浓度的NO，发挥显著的抗脑缺血活性，并且缩酮型前药策略可进一步提高/>

发挥的缺血保护作用。(4)缩酮型前药化合物I可进一步提高氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)原代神经元细胞的生存率。(5)药代动力学研究表明，缩酮前药型/>

供体I具有更好的PK行为。(6)化合物I可显著降低MCAO大鼠脑梗死体积及脑含水量。(7)化合物I可明显改善大鼠神经行为功能。(8)化合物I可加速大鼠缺血脑组织内皮细胞增殖，促进新生血管生成，显著改善化合物VI的脑缺血活性。

附图说明

图1是缩酮型前药(化合物I)的设计思想；

图2是有缩酮型前药(化合物I)的血浆稳定性；

图3是缩酮型前药(化合物I)在亲核物质的存在下的稳定性；

图4是缩酮型前药(化合物I)在OGD/R模型中对原代神经元保护作用；

图5是缩酮型前药(化合物I)在OGD/R原代神经元中亚硝酸根离子释放；

表1是缩酮型前药(化合物I)体外抗血小板聚集活性评价；

表2是缩酮型前药(化合物I)在大鼠体内的药代动力学参数；

图6是缩酮型前药(化合物I)在大鼠血浆内的浓度曲线；

表3是缩酮型前药(化合物I)在血浆、脑组织分布试验结果；

图7是缩酮型前药(化合物I)的体内抗脑缺血活性评价。

具体实施方式

以下是通过实施例形式展示具体的实施方式，对本发明内容进一步的详细说明。

实施例1：(E)-2-硝甲基-3-苯基-1-(3-(三氟甲基)苯基)丙-2-烯-1-缩酮(化合物I)的制备

(a)依次将(NH₄)₂S₂O₈、特戊醇和二苄胺置于舒伦克瓶中，分别加入3-三氟甲基苯丙酮，N₂置换，120℃反应24-30h；反应液逐渐由白色渐变为黄色。反应结束后，加水淬灭，然后用乙酸乙酯(100mL)萃取，有机层用水、饱和食盐水各洗涤3次，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝100/1,v/v)分离纯化得化合物IV。产物IV为无色油状物，收率75％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.00(s,1H),7.92(d,J＝7.7Hz,1H),7.81(d,J＝7.6Hz,1H),7.60(t,J＝7.7Hz,1H),7.43(d,J＝4.2Hz,4H),7.40-7.34(m,1H),7.16(s,1H),2.29(s,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ197.75,143.13,139.32,136.55,135.41,132.52,131.11,130.68,129.74,128.92,128.80,128.55,128.05,128.00,126.22,126.17,126.12,126.07,125.57,14.21.

(b)将化合物IV分别(222.1mg,1.0mmol,1.0eq)溶于50mL四氯化碳中，加入NBS(213.6mg,1.2mmol,1.2eq)、偶氮二异丁腈(AIBN)(1.6mg,0.01mmol,0.01eq)，氮气保护下加热至回流，反应24h，加水淬灭反应。旋蒸除去四氯化碳，然后用乙酸乙酯萃取，有机层用水、饱和食盐水各洗涤3次，无水硫酸钠干燥，浓缩纯化得无色油状物V，收率81％。¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ8.05-7.91(m,3H),7.74(t,J＝7.8Hz,1H),7.61(d,J＝6.9Hz,2H),7.49(q,J＝8.0,7.1Hz,3H),7.27(s,1H),4.60(s,2H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ195.00,144.13,138.56,136.56,136.21,133.83,132.70,129.96,129.53,129.05,128.82,128.29,126.18,26.27.

(c)将烯丙基溴代物V(0.85mmol,1.0eq)溶于25mL无水乙醚中，加入亚硝酸银(390mg,2.6mmol,3.0eq)，避光反应过夜。反应液过滤，滤液浓缩，柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝20/1,v/v)得无色油状物VI，产率56％。¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ8.10(d,J＝8.2Hz,2H),7.96(d,J＝7.6Hz,1H),7.78(t,J＝7.7Hz,1H),7.67(s,1H),7.49(d,J＝5.2Hz,3H),7.44-7.36(m,2H),5.68(s,2H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ197.31,151.36,140.42,135.66,135.49,133.72,133.16,132.56,131.88,131.80,131.69,131.64,131.59,128.96,74.26.ESI-MS(m/z):336.1[M+H]⁺.

(d)将化合物VI(1.0eq)溶于2mL苯(超干溶剂)中，依次加入乙二醇(2.0eq)、无水对甲苯磺酸(0.1eq)及原甲酸三乙酯(8.0eq)，80℃下回流带水(Dean-Stark分水器)24h。随后加入碳酸氢钠水溶液淬灭，过滤除去不溶物，用乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并有机层，饱和食盐水洗涤3次(10mL×3)，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析(PE/EA＝20/1,v/v)得目标化合物I,收率10％，无色油状物。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.86(s,1H),7.78(d,J＝7.7Hz,1H),7.64(d,J＝7.7Hz,1H),7.53(t,J＝7.7Hz,1H),7.34(d,J＝3.3Hz,5H),7.09(s,1H),5.04(s,2H),4.14(m,2H),3.97(m,2H)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃):δ141.99,137.10,136.60,136.31,129.79,129.16,129.11,128.63,128.52,128.20,127.79,126.91,125.07,123.07,65.43,65.02,64.78.ESI-MS(m/z):380.1[M+H]⁺.

实施例2：缩酮型前药(化合物I)血浆稳定性试验

1.试验方法

将一定浓度(200μM)的化合物I和化合物VI分别溶于牛血浆(5％DMSO助溶)，于37.4℃下孵育，每隔一段时间分别取样，利用HPLC记录两个化合物的峰面积，从而进行比较，化合物VI为阳性对照。

2.试验结果

结果如图2所示。结果发现，化合物VI在血浆中迅速降解，2h内即降解完毕；缩酮前药I显著改善了原药的血浆稳定性。化合物I稳定性较好，24h内仅降解了7.8％；。这些结果提示，缩酮型前药血浆稳定性更佳，明显强于化合物VI。

实施例3：缩酮型前药(化合物I)在亲核物质的存在下的稳定性。

1.试验方法

将等浓度的N-乙酰半胱氨酸(200μM)分别与化合物VI和化合物I在37.4℃下共同孵育，采用前述同样的方法在各个时间点测定各化合物浓度。

2.试验结果

如图3所示，随着时间的延长，化合物VI可逐渐发生降解，而化合物I具有较好的稳定性，其在亲核物质的存在下几乎不发生降解。以上这些结果证明，对化合物I的α,β-不饱和酮结构中的羰基进行保护，可有效降低其被亲核物质进攻的能力，提高稳定性。

实施例4：OGD/R模型原代神经元保护作用测试

1.试验方法

将研究化合物I在体外对原代神经元细胞的OGD/R损伤保护作用。在此之前，我们发现造模前24h为最佳给药时间点。于是我们选择不同浓度的化合物VI和化合物I，分别测试相应浓度化合物在OGD/R模型中的活性。

2.试验结果

如图4所示，与OGD/R模型组对比，化合物VI与化合物I(0.1、1和10μM)均可剂量依赖性地提高经OGD/R处理后的神经元存活率，其中缩酮型前药(化合物I)在高浓度下的效果最强，存活率为75.6％，优于同条件下的原药化合物VI(70.9％)。此外，这些结果还提示了缩酮型前药策略可提高

发挥的缺血保护作用。

实施例5：OGD/R原代神经元中亚硝酸根离子释放测试

1.试验方法

首先分离大鼠原代皮质神经元，建立OGD/R模型，模拟体外缺血/再灌注损伤，利用Griess试剂法测试化合物在OGD/R模型原代神经元细胞中的

释放水平。化合物(10μM)和原代神经元细胞预孵化24h后，再经过OGD 2h/R 24h，检测细胞裂解液中/>

的水平。

2.试验结果

如图5所示，化合物VI和I均可以在OGD/R模型原代神经元中释放出较高浓度的

值得注意的是，目标化合物I的释放量高于VI，即缩酮型前药策略可提高原药在缺氧损伤细胞中的/>

释放量，这可能与化合物I改善了整体分子的稳定性及透膜特性有关。以上结果与OGD/R原代神经元细胞保护作用结果一致，提示化合物的活性与/>

的释放有关。

实施例6：体外抗血小板聚集活性评价

1.试验方法

富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)制备：新西兰白兔(雌雄各半，南京青龙山动物繁殖场)禁食12-18h，用10％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，分离颈总动脉后插入聚乙烯管取血，注入含1/10容量的3.8％枸橼酸钠溶液的硅化离心管中，将血液与抗凝剂轻轻混匀，以1000rpm离心15min，吸出上层米黄色悬液约即为富血小板血浆(PRP)。余下的血浆再以3000转/min，离心15min，吸取上清液，制得贫血小板血浆(PPP)，以PPP调PRP使血小板数在1×10⁸/mL。

采用比浊法在37℃条件下测定血小板聚集率。取260μL PRP于比浊管中，随后分别加入10μL不同浓度的待测化合物，37℃条件下孵育5min，再依次加入诱导剂30μL，诱导剂ADP(Sigma,St.Louis,MO,USA)终浓度为10μM，诱导剂AA(Sigma,St.Louis,MO,USA)终浓度为1mM。采用血小板聚集仪测定对照管和测试管5min内的最大聚集率，计算出药物对血小板聚集的抑制率。计算公式为：血小板聚集抑制率(IRPA)＝(对照组血小板聚集率－实验组血小板聚集率)/对照组血小板聚集率×100％。

2.试验结果

表1

如表1所示，在AA(1mM)和ADP(10μM)诱导下，化合物I和VI均可表现出较强的血小板聚集抑制活性。其中，缩酮型前药(化合物I)活性更为显著，对ADP诱导的血小板聚集半抑制浓度(IC₅₀)是0.13±0.006mM。

实施例7：体内药代动力学和组织分布研究

1.试验方法

为了进一步评价缩酮型前药(化合物I)在体内的代谢性质，我们测定了化合物I和化合物VI的大鼠体内药代动力学(PK)性质及脑组织分布情况。分别对大鼠尾静脉单次注射I(10mg/kg)或VI(10mg/kg)，PK试验组于0、5、15、30min及1、2、4、6、8、24h进行采血取样，脑组织分布试验组分别在15min、1h及6h处死并取脑组织，通过LC-MS/MS检测及定量分析。

2.试验结果

表2

如表2和图6所示，直接静脉注射化合物VI(10mg/kg)后，其在大鼠血浆中消除极快，2h时间点已基本检测不到，其消除半衰期约为0.15±0.07h；而静脉注射前药I(10mg/kg)可持续检测到8h时间点左右，其消除半衰期大大延长(t_1/2＝1.38±0.26h)。此外，在给药化合物I后，大鼠血浆中也可检测到原药VI的存在，其半衰期也得到了延长，这表明I可以在体内缓慢转化为VI。以上结果初步提示，相比于化合物VI，缩酮前药型

供体I具有更好的PK行为。

表3

此外，表3中血浆、脑组织分布试验结果表明，缩酮型前药(化合物I)在脑中具有较高的相对浓度，各时间点脑/血浓度比分别为2.47、3.47和1.90，表明化合物I具有较好的脑选择性，提示缩酮改造策略在缺血性脑卒中药物开发应用中可能具有一定的潜力。

实施例8：选择性释放的缩酮型前药(化合物I)的体内抗脑缺血活性评价

1.试验方法

进一步，对体外表现出了高活性的化合物I进行体内抗急性脑缺血活性评价。为了评价化合物I的体内抗脑缺血活性，我们选用尼龙线栓法制造的短暂大鼠脑中动脉栓塞(tMCAO)模型模拟急性脑缺血状态，缺血2h后取出线栓进行再灌注造模。参照文献报道NaNO₂的给药剂量，分别设高、中、低三个剂量(225、900和3600μg/kg)，以VI作为对照，假手术组和模型组给予等体积的溶剂。缺血后4h、24h及48h(即每天给药一次)静脉注射给药，并在缺血后72h进行神经功能评分(Longa’s法)、脑梗死体积及脑水肿测试。

2.试验结果

化合物给药完毕24h后，我们依据Longa’s法首先对各组动物进行了神经行为功能缺损评分。如图7A所示，tMCAO模型组大鼠神经功能受到明显损伤。与模型组相比，除NaNO₂组以外，各给药组均可改善大鼠神经行为功能。化合物VI与其缩酮型前药(化合物I)活性较强，其中化合物I给药组呈现剂量依赖性，高浓度组疗效表现最佳。

随后，我们利用TTC染色法评价各组大鼠脑梗死体积。如图7B所示，模型组可观察到明显的脑梗死，各给药组均可一定程度上地减少tMCAO大鼠脑梗死体积。化合物I各剂量组的活性表现优于VI，且呈现剂量依赖性。其中化合物I高剂量组(I-H，3.6mg/kg)的平均脑梗死体积抑制率为79.5％。

最后，我们考察了化合物抗脑水肿的活性。各组脑水肿测试结果如图7C所示。我们发现，缩酮前药型

供体化合物I的各剂量组脑水肿抑制率(低、中、高剂量组分别为86.8％、92.5％、97.8％)显著大于原药VI(60.4％)。

综合以上测试结果，我们可总结得知，缩酮前药型

供体化合物I不仅具有较好的抗脑梗死、抗脑水肿活性，且对动物神经行为学评分也具有显著的改善作用，高剂量组表现最佳。其活性优于原药VI，说明前药策略可以改善化合物的脑缺血活性，提示目标化合物I的稳定性得到提高的同时可能选择性地在缺血部位高效释放出/>

Claims (8)

1.一种化合物，其特征在于，为式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐：

2.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，化合物I的合成路线包括：

3.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括：

化合物II和化合物III在过硫酸铵的存在下反应得中间体IV；

中间体IV在自由基引发剂偶氮二异丁腈AIBN的作用下，经N-溴代丁二酰亚胺NBS溴代得中间体V；

中间体V与亚硝酸银AgNO₂反应得化合物VI；

化合物VI与乙二醇在对甲苯磺酸、原甲酸三乙酯的催化下，无水苯作溶剂回流带水即得目标化合物I。

4.一种药物组合物，其特征在于，包括含有治疗有效量的权利要求1所述化合物，以及药学上可接受的载体。

5.权利要求1所述化合物在制备预防和/或治疗缺血性心脑血管疾病中的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于，所述缺血性心脑血管疾病为脑缺血、脑卒中、心肌缺血、心肌梗死、心绞痛、心律失常或冠心病。

7.权利要求1所述的化合物在制备预防和/或治疗肺动脉高压药物中的应用。

8.权利要求4所述的药物组合物在制备预防和/或治疗脑缺血、心肌缺血及肺动脉高压药物中的应用。

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