CN111991401A - 一种化合物在治疗SARS-CoV-2感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种化合物69‑0和/或其互变异构体和/或其药学上可接受的盐等化合物在预防、缓解和/或治疗COVID19/SARS‑CoV‑2上的应用，包含上述化合物的产品能有效抑制SARS‑CoV‑2或其同源变异病毒的复制或繁殖及其所产生的细胞病变效应，其疗效好，安全性好，毒副作用低。本发明还提供一种联合治疗药物组合。所述联合治疗药物组合能有效抑制SARS‑CoV‑2在细胞内的增殖，其疗效好，安全性低，毒副作用低，能降低病毒的耐药性，具有显著的协同增效作用。

Description

一种化合物在治疗SARS-CoV-2感染中的应用

技术领域

本发明涉及药学技术和病毒感染疾病技术领域，具体涉及化合物69-0和/或其互变异构体等的应用。

背景技术

严重急性呼吸系统综合征2型冠状病毒(SARS-CoV-2)，又称2019新型冠状病毒，由2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情暴发被发现。SARS-CoV-2是一种有着高扩散能力的病毒。该病主要经呼吸道飞沫传播和接触传播，人群普遍易感，具有高度传染性。

SARS-CoV-2是一种有包膜的单链RNA β属冠状病毒。新冠病毒的感染起始于病毒粒子表面棘突糖蛋白(Spike，S蛋白)与细胞表面血管紧张素转换酶(ACE2)受体的结合。冠状病毒进入宿主细胞后解体，将核衣壳和病毒RNA释放到细胞质中，病毒RNA5′末端开放阅读框(ORF1a/b)编码多聚蛋白质(pp1a和pp1ab)。pp1a和pp1ab可被木瓜蛋白酶样蛋白酶(papain-like protease，PLpro)和3CL蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease，3CLpro，也被叫做Mpro)切割，产生非结构蛋白(non-structural proteins，NSPs)，如RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)和解螺旋酶(helicase)等。病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases，RdRp)，也被称为第12号非结构蛋白(non-structural protein 12，nsp12)，能够与其他多个非结构蛋白质组装形成一台高效的RNA合成“机器”，完成遗传物质RNA基因组的转录和复制。RNA聚合酶作为这台转录复制机器的核心部件，是最重要的抗病毒药物靶标之一，破坏其功能预期将能够阻止病毒的复制，最终达到治疗的目的。针对新型冠状病毒的药物靶点，特别是RNA聚合酶的药物研发和药效机制的验证至关重要，迫在眉睫。

瑞德西韦(Remdesivir)对许多RNA病毒表现出强大的抗病毒活性。可以抑制几种不同类型的RNA病毒的复制，但经临床试验，发现瑞德西韦在人体上并无显著降低死亡效果，且其临床用药剂量与安全剂量接近，副作用明显。因此另寻一种针对SARS-CoV-2的药物，迫在眉睫。

目前严重急性呼吸系统综合征2型冠状病毒感染尚未有疗效明确的治疗药物，临床治疗多采取隔离、抗病毒、对症支持等疗法为主，然而这些治疗仍不能满足临床需求。一方面，常用的抗病毒药物易引起神经毒性，腹泻，心律失常，肝功能异常等副作用，对于患有基础代谢障碍，免疫功能低下，或者癌症等多种基础疾病的老年人尤为需要谨慎使用。另一方面，采取对症治疗，对于逆转重症患者病情效果不明显，或者效果不佳，易引发合并感染，造成多发性、弥漫性病变。因此开展针对SARS-CoV-2的靶向药物研究将具有重大意义。

发明内容

发明概述

由于瑞德西韦对SARS-CoV-2病毒的疗效低，且其毒副作用高，研究人员也失去了对瑞德西韦的相关衍生物和前体化合物的研究兴趣。化合物69-0作为瑞德西韦的前体化合物，其抑制病毒机理与瑞德西韦相似，且化合物69-0对多种病毒的抑制活性要低于瑞德西韦，所以研究人员也不认为化合物69-0能对SARS-CoV-2病毒产生抑制作用。但经申请人研究发现，化合物69-0出乎意料地能对SARS-CoV-2病毒产生很强的抑制作用，且其毒性低，安全性好，毒副作用低，能作为临床上预防、缓解和/或治疗COVID-19/SARS-CoV-2的药物。

因此，申请人提出以下发明内容。

第一方面，本发明提供一种化合物69-0和/或其互变异构体和/或其药学上可接受的盐和/或其酯和/或其溶剂化物和/或其水合物和/或其多晶型物和/或其假多晶型物和/或其无定形形式和/或其前药在制备预防、缓解和/或治疗SARS-CoV-2或其同源变异病毒所引起的疾病或感染的产品中的应用。所述产品能有效抑制SARS-CoV-2或其同源变异病毒的复制或繁殖及其所产生的细胞病变效应，其疗效好，安全性好，毒副作用低。

第二方面，本发明还提供一种联合治疗药物组合。所述联合治疗药物组合能有效抑制SARS-CoV-2在细胞内的增殖，其疗效好，安全性低，毒副作用低，能降低病毒的耐药性，具有显著的协同增效作用。

发明详述

据文献报道，在多种不同种属病毒的活性数据显示瑞德西韦的抗病毒活性优于化合物69-0抗病毒活性。例如，瑞德西韦在Hela细胞中抑制EBOV病毒、在HMVEC细胞中抑制EBOV、在Hep-2细胞中抑制RSV、在Huh-7细胞中抑制HCV、在HAE细胞中抑制SARS-CoV增殖的IC50分别为0.1μM、0.053μM、0.015μM、0.057μM、0.069μM，在相同实验中化合物69-0抑制病毒的活性分别为＞20μM、0.78μM、0.53μM、4.1μM、0.18μM。与瑞德西韦相比，化合物69-0抑制病毒的活性降低3～＞200倍。化合物69-0中核糖单磷酸化被认为是化合物69-0活化的限速步骤，瑞德西韦则在核糖核苷中直接引入单磷酸，并通过磷酰胺键与极性基团连接形成磷酰胺前药，通过掩蔽极性基团来降低分子极性增加透膜性，当前药吸收进入体内后再经特定酶水解释放原型药物。绕过了单磷酸化的限速步骤，因而表现出更好的抑制活性。因此，根据在其他病毒中的经验数据推测瑞德西韦抗SARS-CoV-2的活性优于化合物69-0，化合物69-0在SARS-CoV-2感染中的治疗作用被忽略。

本发明首次公开了化合物69-0对SARS-CoV-2的抑制作用，出乎意料的是化合物69-0在Vero-E6细胞中活性反而优于瑞德西韦，与其他病毒中二者的比值表现出不一样的趋势，揭示了化合物69-0在治疗SARS-CoV-2感染中的潜在应用价值。

因此，本发明提出以下发明内容。

第一方面，本发明提供一种化合物69-0和/或其互变异构体和/或其药学上可接受的盐和/或其酯和/或其溶剂化物和/或其水合物和/或其多晶型物和/或其假多晶型物和/或其无定形形式和/或其前药的应用。

一种化合物69-0和/或其互变异构体和/或其药学上可接受的盐和/或其酯和/或其溶剂化物和/或其水合物和/或其多晶型物和/或其假多晶型物和/或其无定形形式和/或其前药在如下(1)-(5)中任一种应用：

(1)制备用于预防、缓解和/或治疗SARS-CoV-2或其同源变异病毒所引起的疾病的药物；

(2)制备用于预防、缓解和/或治疗SARS-CoV-2或其同源变异病毒感染的药物；

(3)制备SARS-CoV-2抑制剂；

(4)制备用于抑制SARS-CoV-2在细胞中复制或繁殖的药物；

(5)制备抑制SARS-CoV-2产生细胞病变效应的药物；

所述化合物69-0和/或其互变异构体和/或其药学上可接受的盐和/或其酯和/或其溶剂化物和/或其水合物和/或其多晶型物和/或其假多晶型物和/或其无定形形式和/或其前药以治疗有效量给予。

所述化合物可以经注射给予、口服给予、吸入给予。

所述疾病症状包括发热、咳嗽、咽痛、肺炎、急性呼吸道感染、严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓毒症或脓毒性休克等感染。

所述疾病包括呼吸系统疾病或COVID-19。

所述SARS-CoV-2或其同源变异病毒所引起的疾病包括：SARS-CoV-2或其同源变异病毒无症状感染、SARS-CoV-2或其同源变异病毒轻度感染、SARS-CoV-2或其同源变异病毒中度感染或SARS-CoV-2或其同源变异病毒重度感染。

所述COVID-19的症状包括：无症状、无明显症状、轻度至中度的呼吸道症状、严重呼吸综合征、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、肾功能衰竭、难以纠正的代谢性酸中毒或出血凝血障碍。在一些实施例中，所述严重呼吸综合征包括发热、干咳、乏力、气喘和/或呼吸乏力等症状。

所述SARS-CoV-2抑制剂包括SARS-CoV-2 RNA聚合酶抑制剂。

所述细胞包括哺乳动物细胞、鱼类动物细胞、鸟类动物细胞或两栖动物细胞。在一些实施例中，所述哺乳动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。在一些实施例中，所述哺乳动物包括猫、狗、猪、松鼠等动物。在一些实施例中，所述鸟类动物包括鹦鹉或八哥等动物。在一些实施例中，所述灵长类动物包括人类、猴子或猩猩等。

所述药物可以为组合物，所述组合物包含所述化合物69-0和/或其互变异构体和/或其药学上可接受的盐和/或其酯和/或其溶剂化物和/或其水合物和/或其多晶型物和/或其假多晶型物和/或其无定形形式和/或其前药和药学上可接受的载体或辅料。

所述药物包括固体制剂、注射剂、外用制剂、喷剂、液体制剂或复方制剂等制剂。

所述药物包括胶囊、片剂、丸剂、霜剂、乳剂、软膏剂、混悬剂、冻干剂、胶囊、缓释剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂、吸入式制剂或喷剂等剂型。

第二方面，本发明提供一种COVID-19肺炎或其同源变异病毒肺炎的联合治疗组合。

一种COVID-19肺炎或其同源变异病毒肺炎的联合治疗组合，包括权利要求1-7任一项所述药物和至少一种其他预防、缓解和/或治疗COVID-19肺炎或其同源变异病毒肺炎的产品。

在一些实施例中，所述产品包括含中药成分和/或西药成分的组合物。

在一些实施例中，所述产品的活性成分包括：阿匹莫德(apilimod)、R 82913(CAS号：126347-69-1)、DS-6930(CAS号：1242328-82-0)、ONO 5334(CAS号：868273-90-9)、瑞德西韦、磷酸奥司他韦(Oseltamivir phosphate)、汉防己甲素(HanfangchinA)、氯法齐明(clofazamine)、阿司咪唑(astemizole)、重组人源血管紧缩素转换酶2(rhACE2)或法匹拉韦(Favipiravir)和/或它们的药学上可接受的盐等可以预防、缓解和/或治疗SARS-CoV-2或其同源变异病毒所引起的疾病的化合物。

相比现有技术，本发明具有以下技术效果：

(1)能有效抑制冠状病毒SARS-CoV-2在细胞内的复制和/或繁殖，其活性远高于瑞德西韦；

(2)能有效抑制SARS-CoV-2或其同源变异病毒的复制或繁殖及其所产生的细胞病变效应；

(3)其毒性极低，安全性高；

(4)能降低病毒耐药性，降低药物毒副作用等；

(5)结构简单，有利于合成、生产和分销。

术语定义：

Vero-E6表示非洲绿猴肾细胞；caco-2表示人结肠腺癌细胞；calu-3表示人肺腺癌细胞；μM表示微摩尔每升；IC50表示半抑制浓度；MOI表示感染复数；CCK8表示；RT-PCR表示逆转录-聚合酶链反应；Hela表示海拉细胞；EBOV表示埃博拉病毒；HMVEC表示人肺微血管内皮细胞；Hep-2表示人喉表皮样癌细胞；RSV表示呼吸道合胞病毒；Huh-7表示人肝癌细胞；HCV表示丙型肝炎病毒；HAE表示遗传性血管性水肿；DMEM培养基表示达尔伯克改良伊格尔培养基；min表示分钟；h表示小时；℃表示摄氏度；nm表示纳米；μl表示微升。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明中，术语“治疗有效量”或“预防有效量”是指在合理的医学判断范围内，足以治疗或预防患者疾病但足够低地避免严重副作用(在合理的利益/风险比)的量。化合物的治疗有效量将根据所选择的具体化合物(例如考虑化合物的效力、有效性和半衰期)、所选择的给药途径、所治疗的疾病、所治疗的疾病的严重性、所治疗的患者的年龄、大小、体重和身体疾病、所治疗的患者的医疗史、治疗持续时间、并行疗法的性质、所需的治疗效果等因素发生变化，但仍可以由本领域技术人员常规确定。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

另外需要指出，所述化合物69-0和/或其互变异构体和/或其药学上可接受的盐和/或其酯和/或其溶剂化物和/或其水合物和/或其多晶型物和/或其假多晶型物和/或其无定形形式和/或其前药针对不同患者的特定使用剂量和使用方法决定于诸多因素，包括患者的年龄，体重，性别，自然健康状况，营养状况，药物的活性强度，服用时间，代谢速率，病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。这里优选使用剂量介于0.001-1000mg/kg体重/天。

附图说明

图1示Vero-E6细胞在不同浓度化合物69-0下的存活率；

图2示Vero-E6细胞在不同浓度瑞德西韦下的存活率；

图3示caco-2细胞在不同浓度化合物69-0下的存活率；

图4示caco-2细胞在不同浓度瑞德西韦下的存活率；

图5示calu-3细胞在不同浓度化合物69-0下的存活率；

图6示calu-3细胞在不同浓度瑞德西韦下的存活率；

图7示不同浓度化合物69-0对Vero-E6细胞中SARS-CoV-2病毒的抑制效果；

图8示不同浓度瑞德西韦对Vero-E6细胞中SARS-CoV-2病毒的抑制效果；

图9示不同浓度化合物69-0对caco-2细胞中SARS-CoV-2病毒的抑制效果；

图10示不同浓度化合物69-0对calu-3细胞中SARS-CoV-2病毒的抑制效果。

图11示SD大鼠给予瑞德西韦后瑞德西韦的血药浓度

图12示SD大鼠给予瑞德西韦或69-0后的69-0血浆浓度时间曲线图

图13示SD大鼠给予瑞德西韦或69-0后的69-0血浆浓度时间曲线图

图14示病毒感染后各处理组小鼠生存曲线

图15示病毒感染后各处理组小鼠不同时间点肺组织病毒载量

图16示病毒感染后各处理组小鼠不同时间点肝组织病毒载量

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例以对本发明作进一步的详细说明。

本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。

实施例1：化合物69-0在Vero-E6细胞上的毒性评价

在96孔板中接种Vero-E6细胞，待细胞贴壁后，换成含2％血清的DMEM培养基，分别加入终浓度为50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM或0.01μM的化合物69-0或瑞德西韦，并做好空白药物对照，培养48h后，加入1/10体积的CCK8试剂，于37℃继续培养2h后，取样于450nm检测吸光度值，并计算细胞存活率，结果如图1和图2所示。

结果分析：化合物69-0在终浓度为50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM、0.01μM时对于Vero-E6细胞均无细胞毒性，化合物瑞德西韦在终浓度为50μM时，对ERO-E6细胞有一定的毒性，表明化合物69-0对Vero-E6细胞毒性极低，安全性高。

实施例2：化合物69-0在caco-2细胞上的毒性评价

在96孔板中接种caco-2细胞，待细胞贴壁后，换成含2％血清的DMEM培养基，分别加入终浓度为50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM或0.01μM的化合物69-0或瑞德西韦，并做好空白药物对照，培养48h后，加入1/10体积的CCK8试剂，于37℃继续培养2h后，取样于450nm检测吸光度值，并计算细胞存活率，结果如图3和图4所示。

结果分析：化合物69-0在终浓度为50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM、0.01μM时对于caco-2细胞均无细胞毒性，化合物瑞德西韦在终浓度为50μM时，对caco-2细胞有一定的毒性，表明化合物69-0对caco-2细胞毒性极低，安全性高。

实施例3：化合物69-0在calu-3细胞上的毒性评价

在96孔板中接种calu-3细胞，待细胞贴壁后，换成含2％血清的DMEM培养基，分别加入终浓度为50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM或0.01μM的化合物69-0或瑞德西韦，并做好空白药物对照，培养48h后，加入1/10体积的CCK8试剂，于37℃继续培养2h后，取样于450nm检测吸光度值，并计算细胞存活率，结果如图5和图6所示。

结果分析：化合物69-0在终浓度在终浓度为50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM、0.01μM时对于caco-2细胞均无细胞毒性，化合物瑞德西韦在终浓度为50μM时，对calu-3细胞有一定的毒性，表明化合物69-0对calu-3细胞毒性极低，安全性高。

实施例4：化合物69-0对SARS-CoV-2病毒在Vero-E6细胞上的抑制效果

用SARS-CoV-2病毒以0.05MOI感染24孔板的Vero-E6细胞，感染1h后，弃去细胞上清液，换成2％血清的DMEM培养基，分别加入终浓度为50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM或0.01μM的化合物69-0或瑞德西韦，并做好空白药物对照。感染48h后，收取150ul细胞上清液，56℃灭活处理30min后，利用OMEGA的病毒RNA提取试剂盒(R6874-02)提取上清液中病毒RNA，利用新冠病毒N基因探针和RT-PCR检测病毒RNA，试剂盒购置于中山大学达安基因公司(DA0931)。计算出不同浓度药物对病毒的抑制效果，并算出药物的IC50，其结果如图7和图8所示。

结果分析：化合物69-0在Vero-E6细胞中可抑制SARS-CoV-2病毒的复制，其在Vero-E6细胞中的对SARS-CoV-2病毒的IC50为0.7022μM。在Vero-E6细胞中，化合物69-0的活性优于瑞德西韦，表明化合物69-0在Vero-E6细胞中可以能有效地抑制SARS-CoV-2病毒的复制和/或繁殖。

实施例5：化合物69-0对SARS-CoV-2病毒在caco-2细胞上的抑制效果

用SARS-CoV-2病毒以0.1MOI感染24孔板的caco-2细胞，感染1h后，弃去细胞上清液，换成2％血清的DMEM培养基，分别加入终浓度为50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM或0.01μM的化合物69-0，并做好空白药物对照。感染48h后，收取150μl细胞上清液，56℃灭活处理30min后，利用OMEGA的病毒RNA提取试剂盒(R6874-02)提取上清液中病毒RNA，利用新冠病毒N基因探针和RT-PCR检测病毒RNA，试剂盒购置于中山大学达安基因公司(DA0931)。计算出不同浓度药物对病毒的抑制效果，并算出药物的IC50，其结果如图9所示。

结果分析：化合物69-0在caco-2细胞中可抑制SARS-CoV-2病毒的复制，其在caco-2细胞中的对SARS-CoV-2病毒的IC50为3.603μM，表明化合物69-0在caco-2细胞中可以能有效地抑制SARS-CoV-2病毒的复制和/或繁殖。

实施例6：化合物69-0对SARS-CoV-2病毒在calu-3细胞上的抑制效果

用SARS-CoV-2病毒以0.1MOI感染24孔板的calu-3细胞，感染1h后，弃去细胞上清液，换成2％血清的DMEM培养基，加入终浓度为50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM或0.01μM的化合物69-0，并做好空白药物对照。感染24h后，收取150ul细胞上清液，56℃灭活处理30min后，利用OMEGA的病毒RNA提取试剂盒(R6874-02)提取上清液中病毒RNA，利用新冠病毒N基因探针和RT-PCR检测病毒RNA，试剂盒购置于中山大学达安基因公司(DA0931)。计算出不同浓度药物对病毒的抑制效果，并算出药物的IC50，其结果如图10所示。

结果分析：化合物69-0在calu-3细胞中可抑制SARS-CoV-2病毒的复制，其在calu-3细胞中的对SARS-CoV-2病毒的IC50为3.209μM，表明化合物69-0在calu-3细胞中可以能有效地抑制SARS-CoV-2病毒的复制和/或繁殖。

实施例7：化合物69-0在SD大叔体内的代谢及生物利用度研究实验

16只体重在220～250g雄性SD大鼠(每组4只)随机分为四组，即Remdersivir静注组(1组)、Remdersivir口服组(2组)、69-0静注组(3组)、69-0口服组(4组)。1组和3组动物采用尾静脉注射给药分别给予Remdersivir和69-0，给药体积0.1mL/100g，给药浓度为30mg/mL；2组和4组动物经口单次灌胃分别给予Remdersivir和69-0，给药体积为0.5mL/100g，给药浓度为6mg/mL。所有动物在给药前12小时空腹及给药后4小时喂食，各试验组采用等浓度不等体积给药。采用颈部静脉或眼眶静脉丛(异氟烷气体麻醉动物后)采血方式，用一次性注射器刺入静脉采血或毛细管采血，以适当速度采血。分别在给药后0.083h(口服组不采)、0.16h(口服组不采)、0.25h、0.5h、1h(静脉组不采)、2h、4h、8h、24h、48h的采集血液约0.3mL至肝素管中，在4℃下4000r/min离心10min，取上层血浆转移置冰箱冷冻(约-20℃)暂时保存至测定。向所获得的血浆样品(50μL)中加入甲醇/水混合溶剂(1∶1，10μL)及内标溶液，混匀后，涡流混合1分钟，再在14000G，4摄氏度条件下离心3分钟后，取100μL样品15.1采用Waters UPLC/XEVO TQ-S三重四极杆液质联用仪配有的UNIFI软件对待测样品进行定量处理。采用DAS3.0药代动力学软件对药时数据进行处理，计算AUC及Cmax、Tmax和t1/2等参数，使用Excel或WPS软件对试验数据计算平均值和标准差，并绘制血药浓度-时间曲线。其结果如图11-13所示。

结论：SD大鼠经口灌胃分别给予Remdersivir或69-0后，69-0在体内迅速被吸收，平均Tmax为0.94±0.77h，表明69-0吸收较快。SD大鼠经静脉注射和经口灌胃给予Remdersivir或69-0后，69-0的平均t1/2分别为4.77±2.33h、20.55±16.43h，表明69-0在大鼠体内消除比Remdersivir(平均t1/2为1.95±1.16、3.51±0.16h)更慢，69-0有良好的成药性。

实施例8：化合物69-0抗小鼠冠状病毒体内药效研究

75只BABL/c小鼠按体重区间随机分为8组，即MHV病毒对照(A组)、69-0静注治疗组(B1组)、69-0口服治疗组(B2组)、69-0腹腔治疗组(B3组)、69-0静注对照组(C1组)、69-0口服对照组(C2组)、69-0腹腔对照组(C3组)、正常对照组(D组)。治疗组及69-0对照组动物分别采用尾静脉注射给药或口服灌胃给药或腹腔注射给药分别按50mg/kg剂量给予69-0，给药体积0.2mL/20g，给药浓度为5mg/mL，首次给药剂量加倍。连续给药14天，每天观察动物死亡情况，记录动物体重，在试验结束绘制生存曲线及体重变化曲线。分别在给药后24h、72h采集A、B1、B2和B3组各4只/组，取肺和肝约1g至无菌离心管中，放-20℃保存，抽提核酸测浓度，确定一步法荧光PCR对病毒感染后组织病毒载量进行定量分析。其结果如图14-16所示。

结论：小鼠感染后5d，病毒模型对照组(A)开始出现死亡，截止14d，死亡率87.5％(7/8)，而治疗组(B1，B2，B3)死亡率在0～20％，表明药物在动物生存方面起到了明显的积极效果。小鼠感染后24h肺的载毒量，治疗组(B1，B2，B3)病毒载量均低于病毒模型对照组(A)，72h各组肺病毒载量差异减少。表明药物前期抑制病毒复制效果较明显。

由上述实施例1-6所得实验结果可知：

(1)化合物69-0在Vero-E6、caco-2、calu-3细胞中均无毒性，证明其安全性高，毒副作用小。

(2)化合物69-0在Vero-E6、caco-2、calu-3细胞中均可抑制SARS-CoV-2的复制，其IC50在0.7-3.6μM之间。特别在Vero-E6细胞中，化合物69-0的活性为瑞德西韦活性的两倍，这表明化合物69-0可以能有效地抑制SARS-CoV-2病毒在细胞内的复制和/或繁殖。

本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (8)

1.一种化合物69-0在如下(1)-(5)中任一种应用：

(1)制备用于预防、缓解或治疗SARS-CoV-2或其同源变异病毒所引起的疾病的药物；

(2)制备用于预防、缓解或治疗SARS-CoV-2或其同源变异病毒感染的药物；

(3)制备作为作为SARS-CoV-2抑制剂的药物的药物；

(4)制备用于抑制SARS-CoV-2在细胞中复制或繁殖的药物；

(5)制备抑制SARS-CoV-2产生细胞病变效应的药物；

2.根据权利要求1所述的用途，所述感染包括肺炎、急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓毒症或脓毒性休克。

3.根据权利要求1所述的用途，所述疾病包括呼吸系统疾病或COVID-19。

4.根据权利要求1所述的用途，所述细胞包括哺乳动物细胞、鱼类动物细胞、鸟类动物细胞或两栖动物细胞；所述哺乳动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物或灵长类动物；所述灵长类动物包括人类。

5.根据权利要求1所述的用途，所述药物为组合物，所述组合物包含所述化合物69-0和药学上可接受的载体或辅料。

6.根据权利要求1所述的用途，所述药物包括固体制剂、注射剂、半固体制剂、液体制剂。

7.根据权利要求1所述的用途，所述药物包括胶囊、片剂、丸剂、霜剂、乳剂、软膏剂、混悬剂、冻干剂、胶囊、缓释剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂。

8.根据权利要求1所述的用途，所述药物还包括至少一种其他预防、缓解或治疗COVID-19肺炎或其同源变异病毒肺炎的药物。

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