CN114805610B - 一种高表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高效表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌及其构建方法。本发明的甘精胰岛素前体为引导肽、甘精胰岛素B链和甘精胰岛素A链依次串联所得的多肽，甘精胰岛素B链的C端的两个精氨酸与甘精胰岛素A链的N端直接连接，甘精胰岛素B链的N端连接有引导肽。本发明的甘精胰岛素前体设计简化了甘精胰岛素制备过程的酶切步骤，提高了酶切效率；同时，能显著提升其在重组基因工程菌中的表达量。

Description

一种高表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌及其构建方法。

背景技术

糖尿病是当今社会高发的慢性疾病。胰岛素类产品是糖尿病市场第一大用药品种，其中又以三代重组胰岛素为主。甘精胰岛素（glycine-arginine insulin，简称Glargine）属于通过基因重组技术获得的长效胰岛素类生物制品。没有明显峰值及其引发的低血糖、猝死等风险，由于其安全性、长效性的特点，甘精胰岛素持续数年成为胰岛素市场中市场份额最大的产品。国外由Aventis公司生产的重组甘精胰岛素，商品名为来得时（Lantus），国内由甘李药业有限公司生产的重组甘精胰岛素注射液，商品名为长秀霖。

甘精胰岛素的结构设计为：将人胰岛素A链的第21位Asn替换成Gly，在B链的第30位氨基酸后加入2个Arg而成。完整的重组甘精胰岛素由A链和B链共53个氨基酸组成，其中A链含有21个氨基酸，B链含有32个氨基酸。甘精胰岛素通常在重组大肠杆菌工程菌中以包涵体形式表达制备，表达产物多为融合蛋白形式的重组甘精胰岛素前体，上述前体结构通常设计为在B链和A链之间加入C肽（由数十个氨基酸组成）。C肽保证了A链和B链的正确折叠，并可通过胰蛋白酶和羧肽酶B酶切切除。也就是说，现有甘精胰岛素生产方式多为通过重组大肠杆菌工程菌生产甘精胰岛素单链前体，经过体外变复性后，通过胰蛋白酶、羧肽酶等蛋白酶在体外水解加工形成成熟双链结构，继而通过一系列纯化手段去除混杂的蛋白酶及其他衍生物杂质后，纯化得到甘精胰岛素。

目前，可以采用重组基因工程菌表达制备胰岛素。表达系统包括原核基因表达系统、酵母表达系统和动物细胞表达系统。对于原核基因表达系统，使用最多的即为大肠杆菌Escherichiacoli来作为宿主菌，这也是目前应用最广泛的蛋白表达系统。原因是大肠杆菌表达系统遗传背景和生理特性研究清楚，已开发有多种商业化工程菌可以使用；且大肠杆菌易于培养和控制、转化操作简单，并具有表达水平高、成本低、周期短等特点。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。

然而，由于甘精胰岛素结构的特殊性（双链结构、多对分子内二硫键等），目前甘精胰岛素前体在表达过程中普遍存在表达水平低、表达后包涵体变复性条件苛刻、酶切纯化步骤繁琐等技术缺陷。因此，仍迫切需要开发能够高效表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌，以提高发酵效率，简化酶切纯化步骤，有效降低生产成本。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新的甘精胰岛素前体、表达该甘精胰岛素前体的重组基因工程菌及其构建方法。

概念：

甘精胰岛素：将人胰岛素A链的第21位Asn替换成Gly，在人胰岛素B链的第30位氨基酸后加入2个Arg，其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使所述A链和B链连接起来，同时存在一对A链内二硫键A6(Cys)-A11(Cys)。

甘精胰岛素多肽：是指甘精胰岛素的单链氨基酸肽段，具体是指甘精胰岛素B链、甘精胰岛素A链直接相连或通过连接肽（如C肽）相连获得的多肽。

甘精胰岛素前体：指甘精胰岛素多肽通过酶切位点序列与引导肽等连接而成的融合蛋白，可以通过蛋白酶将引导肽等切除获得甘精胰岛素多肽。具体到本发明，甘精胰岛素前体是指如SEQ ID No:1~SEQ ID No:10所示的融合蛋白。

本发明第一方面提出一种新的甘精胰岛素前体，甘精胰岛素前体为引导肽、甘精胰岛素B链和甘精胰岛素A链依次串联所得的多肽，其中甘精胰岛素B链的C端与A链的N端直接连接，甘精胰岛素B链的N端与引导肽相连；甘精胰岛素前体的氨基酸序列选自SEQ IDNo:1~SEQ ID No:10。

甘精胰岛素B链C端为两个精氨酸，本发明将其与甘精胰岛素A链N端的甘氨酸（G）直接连接，如此连接，可直接采用kex2蛋白酶的Arg-Arg识别位点进行切割，一步切割即可将甘精胰岛素A链和甘精胰岛素B链切割分离，显著提高了酶切效率，同时避免了采用胰蛋白酶或羧肽酶B切除C肽过程中的副反应，有效控制了相关杂质。

为进一步提高本发明重组基因工程菌对目的蛋白的高效表达，针对甘精胰岛素A链和甘精胰岛素B链直连多肽的特点，本发明对前体中的引导肽进行了针对性的研究设计，筛选得到可实现本发明甘精胰岛素前体高表达的引导肽。优选的，本发明的新的甘精胰岛素前体的氨基酸序列选自SEQ ID No:1或SEQ ID No:10。

本发明第二方面提出编码上述甘精胰岛素前体的多核苷酸。多核苷酸与甘精胰岛素前体氨基酸的对应关系如表1所示。具体的，多核苷酸的序列选自SEQ ID No:11~SEQ IDNo.20所示的核苷酸序列。并优选为SEQ ID No:11或SEQ ID No:20所示的核苷酸序列。

本发明第三方面提出用于表达甘精胰岛素前体的重组表达载体，其包含所述编码甘精胰岛素前体的多核苷酸。具体的，本发明实施例的表达载体优选使用质粒载体，具体可选用质粒pET-28a（+）；并优选通过NdeI和XhoI酶切位点插入本发明的多核苷酸。

本发明第四方面提出包括上述重组表达载体的宿主菌。宿主菌选自原核细胞，进一步优选大肠杆菌，具体可选自大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）。重组基因工程菌按照如下方法制备：

（1）合成上述多核苷酸；

（2）将多核苷酸插入到表达载体上，构建得到重组表达载体；

（3）将重组表达载体导入到宿主菌中，得到表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌。

本发明第五方面提出一种表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌的构建方法，至少包括以下步骤：

S1、合成表达包含甘精胰岛素前体的多核苷酸；

S2、将多核苷酸插入到表达载体上，构建得到重组表达载体；

S3、将重组表达载体导入到宿主菌中，得到表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌。

具体的，多核苷酸序列选自SEQ ID No:11~ SEQ ID No:20；优选SEQ ID No:11~SEQ ID No:13、SEQ ID No:20；更优选SEQ ID No:11或SEQ ID No:20，更优选SEQ ID No:20。

具体的，表达载体选自质粒pET-28a（+），宿主细胞选自大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）。

本发明提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明通过引导肽的设计和将甘精胰岛素B链与A链直接连接的设计，获得了一种表达量显著提升的重组基因工程菌，极大提升了甘精胰岛素前体的表达效率。并且，基于本发明获得的甘精胰岛素前体可经过简化的酶切纯化步骤即可得到甘精胰岛素，具备显著提高的酶切纯化效率。因此，本发明的重组基因工程菌更适于甘精胰岛素商业化生产，具备更加广阔的市场前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中获得的8个转化子的诱导表达结果图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

以下实施例所用到原料均为市售。

实施例所用到材料包括：

（1）菌株和质粒

宿主菌Escherichia coli BL21（DE3）是基因工程常用工具菌种，重组质粒pLA001-pLA010均委托宝生物公司合成。

（2）培养基

LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L。

LB固体培养基，配方为：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，琼脂粉（Agar）20g/L。

实施例所用到实验方法：

大肠杆菌转化、SDS-PAGE是基因工程领域的常规操作方法，参见[美]MichaelR.Green,JosephSambrook.分子克隆指南：第四版[M].贺福初,等,译.北京:科学出版社,2017:124-125,1325-1330。

实施例1：重组工程菌的构建及诱导表达

1.1重组工程菌的构建

设计包含引导肽和单链甘精胰岛素的融合蛋白，即甘精胰岛素前体，获得编码融合蛋白的多核苷酸，并合成融合蛋白的表达框序列，将表达框分别插入pET-28a（+）质粒的NdeI和XhoI位点之间，并分别命名为重组质粒pLA001 ~ pLA009。将重组质粒分别转化大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3），转化液涂布LB固体培养基（含卡那霉素30μg/mL），利用抗性筛选得到含有目的基因重组质粒的工程菌。

质粒编号对应插入其中的融合蛋白如下表1所示；

表1

重组质粒序号	表达融合蛋白序列	编码融合蛋白的多核苷酸序列
			pLA001	SEQ ID NO:1	SEQ ID NO:11
pLA002	SEQ ID NO:2	SEQ ID NO:12
			pLA003	SEQ ID NO:3	SEQ ID NO:13
pLA004	SEQ ID NO:4	SEQ ID NO:14
			pLA005	SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:15
pLA006	SEQ ID NO:6	SEQ ID NO:16
			pLA007	SEQ ID NO:7	SEQ ID NO:17
pLA008	SEQ ID NO:8	SEQ ID NO:18
			pLA009	SEQ ID NO:9	SEQ ID NO:19

1.2重组工程菌的诱导表达

从重组工程菌的筛选平板上分别挑取转化子，无菌接种至含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温振荡培养过夜。按照初始OD₆₀₀=0.05的比例转接至20mL的LB液体培养基（含卡那霉素30μg/mL）中，37℃恒温振荡培养至OD₆₀₀=0.6~3.0，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导表达目的蛋白。诱导6小时后离心收集菌体。SDS-PAGE（16%分离胶和4%浓缩胶）电泳再经凝胶成像，表达结果如表2所示。

表2

重组工程菌所包含质粒的序号	重组工程菌的表达量
		pLA001	+
pLA002	+
		pLA003	+
pLA004	-
		pLA005	-
pLA006	-
		pLA007	-
pLA008	-
		pLA009	-

经表达确认，在构建的表达体系中，仅pLA001 ~ pLA003检测到成功表达目的片段，而pLA004 ~ pLA009几乎未检测到目的片段的表达。虽然如此，pLA001 ~ pLA003的表达量也仅为普通表达水平。

为尝试进一步提高构建的重组工程菌的表达潜力，发明人尝试对引导肽进行多种设计改进。在经过大量的研究及实验后，最终得到，将pLA001引导肽末端的氨基酸由PR优化为KR能够显著提升重组工程菌的表达量。质粒编号对应插入其中的融合蛋白如下表3所示；

表3

重组质粒序号	表达融合蛋白序列	编码融合蛋白的多核苷酸序列
			pLA010	SEQ ID NO:10	SEQ ID NO:20

同样按照上述1.1和1.2方法，构建包含pLA010的重组工程菌，其表达量与pLA001相比，如表4所示：

表4

重组工程菌所包含质粒的序号	重组工程菌的表达量
		pLA001	+
pLA010	+++

通过对pLA001和pLA010进行发酵生产，结果显示，后者的表达水平明显提升，pLA001表达水平经检测约为3g/L，pLA010表达水平可达约12g/L，表达水平显著提升。

1.3在构建包含pLA010的重组工程菌过程中，从其筛选平板上挑取的8个转化子，按照实施例1.2所示方法进行诱导表达，诱导表达结果见附图1。

由图1可知，本发明构建的包含pLA010的重组工程菌能够实现目的蛋白的高效表达，具备良好的应用前景。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 北京惠之衡生物科技有限公司

吉林惠升生物制药有限公司

<120> 一种高表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌及其构建方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Thr Lys Ala Ala Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln

1 5 10 15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

20 25 30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val

35 40 45

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg

50 55 60

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

85 90 95

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

100 105 110

Glu Asn Tyr Cys Gly

115

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu

1 5 10 15

Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe

20 25 30

Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn

35 40 45

Pro Leu Gly Thr Gly Pro Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser

50 55 60

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe

65 70 75 80

Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser

85 90 95

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

100 105

<210> 3

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Asp Asp Asp Asp Lys Arg Phe

1 5 10 15

Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu

20 25 30

Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly

35 40 45

Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu

50 55 60

Asn Tyr Cys Gly

65

<210> 4

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ser Ala Pro Val Ala Phe

1 5 10 15

Ala Ala Leu Ala Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His

20 25 30

Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr

35 40 45

Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile

50 55 60

Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

65 70 75

<210> 5

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Lys Arg Phe Val Asn Gln His

1 5 10 15

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu

20 25 30

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln

35 40 45

Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

50 55 60

<210> 6

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val Ala

1 5 10 15

Gly Thr Ala Asn Ala Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser

20 25 30

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe

35 40 45

Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser

50 55 60

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

65 70 75

<210> 7

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala

1 5 10 15

Thr Val Ala Gln Ala Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser

20 25 30

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe

35 40 45

Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser

50 55 60

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

65 70 75

<210> 8

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Lys Lys Ser Thr Leu Ala Leu Val Val Met Gly Ile Val Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ser Val Gln Ala Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser

20 25 30

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe

35 40 45

Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser

50 55 60

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

65 70 75

<210> 9

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Lys Arg Phe Val Asn Gln His

20 25 30

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu

35 40 45

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln

50 55 60

Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

65 70 75 80

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Thr Lys Ala Ala Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln

1 5 10 15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

20 25 30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val

35 40 45

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Lys Arg

50 55 60

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

85 90 95

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

100 105 110

Glu Asn Tyr Cys Gly

115

<210> 11

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggcaacca aagcagcaag cgttctgaaa ggtgatggtc cggttcaggg tattatcaac 60

tttgaacaga aagaaagcaa cggtccggtt aaagtttggg gtagcattaa aggtctgacc 120

gaaggtctgc atggttttca tgttcatgaa tttggcgata ataccgcagg tagcaccagc 180

gcaggtccgc gttttgttaa tcagcatctg tgtggtagcc atctggttga agcactgtat 240

ctggtttgtg gtgaacgtgg ttttttctat accccgaaaa cacgtcgtgg tattgttgaa 300

cagtgttgta ccagcatttg tagcctgtat cagctggaaa actattgcgg t 351

<210> 12

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgttcccga ccatcccgct gtctcgtctg ttcgacaacg ctatgctgcg tgctcaccgt 60

ctgcaccagc tggctttcga cacctaccag gaattcgaag aagcttacat cccgaaagaa 120

cagaaatact ctttcctgca gaacccgctg ggtaccggtc cgcgtttcgt taaccagcac 180

ctgtgcggtt ctcacctggt tgaagctctg tacctggttt gcggtgaacg tggtttcttc 240

tacaccccga aaacccgtcg tggtatcgtt gaacagtgct gcacctctat ctgctctctg 300

taccagctgg aaaactactg cggt 324

<210> 13

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgttcaaat tcgaattcaa attcgaagac gacgacgaca aacgtttcgt taaccagcac 60

ctgtgcggtt ctcacctggt tgaagctctg tacctggttt gcggtgaacg tggtttcttc 120

tacaccccga aaacccgtcg tggtatcgtt gaacagtgct gcacctctat ctgctctctg 180

taccagctgg aaaactactg cggt 204

<210> 14

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgtacctga aaatcctggc taccgctctg tctgctccgg ttgctttcgc tgctctggct 60

aaacgtttcg ttaaccagca cctgtgcggt tctcacctgg ttgaagctct gtacctggtt 120

tgcggtgaac gtggtttctt ctacaccccg aaaacccgtc gtggtatcgt tgaacagtgc 180

tgcacctcta tctgctctct gtaccagctg gaaaactact gcggt 225

<210> 15

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgaccatga tcaccgactc tctggctaaa cgtttcgtta accagcacct gtgcggttct 60

cacctggttg aagctctgta cctggtttgc ggtgaacgtg gtttcttcta caccccgaaa 120

acccgtcgtg gtatcgttga acagtgctgc acctctatct gctctctgta ccagctggaa 180

aactactgcg gt 192

<210> 16

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgaaacgta acatcctggc tgttatcgtt ccggctctgc tggttgctgg taccgctaac 60

gctaaacgtt tcgttaacca gcacctgtgc ggttctcacc tggttgaagc tctgtacctg 120

gtttgcggtg aacgtggttt cttctacacc ccgaaaaccc gtcgtggtat cgttgaacag 180

tgctgcacct ctatctgctc tctgtaccag ctggaaaact actgcggt 228

<210> 17

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgaaaaaaa ccgctatcgc tatcgctgtt gctctggctg gtttcgctac cgttgctcag 60

gctaaacgtt tcgttaacca gcacctgtgc ggttctcacc tggttgaagc tctgtacctg 120

gtttgcggtg aacgtggttt cttctacacc ccgaaaaccc gtcgtggtat cgttgaacag 180

tgctgcacct ctatctgctc tctgtaccag ctggaaaact actgcggt 228

<210> 18

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgaaaaaat ctaccctggc tctggttgtt atgggtatcg ttgcttctgc ttctgttcag 60

gctaaacgtt tcgttaacca gcacctgtgc ggttctcacc tggttgaagc tctgtacctg 120

gtttgcggtg aacgtggttt cttctacacc ccgaaaaccc gtcgtggtat cgttgaacag 180

tgctgcacct ctatctgctc tctgtaccag ctggaaaact actgcggt 228

<210> 19

<211> 237

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgatcaccc tgcgtaaact gccgctggct gttgctgttg ctgctggtgt tatgtctgct 60

caggctatgg ctaaacgttt cgttaaccag cacctgtgcg gttctcacct ggttgaagct 120

ctgtacctgg tttgcggtga acgtggtttc ttctacaccc cgaaaacccg tcgtggtatc 180

gttgaacagt gctgcacctc tatctgctct ctgtaccagc tggaaaacta ctgcggt 237

<210> 20

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggctacca aagctgcttc tgttctgaaa ggtgacggtc cggttcaggg tatcatcaac 60

ttcgaacaga aagaatctaa cggtccggtt aaagtttggg gttctatcaa aggtctgacc 120

gaaggtctgc acggtttcca cgttcacgaa ttcggtgaca acaccgctgg ttctacctct 180

gctggtaaac gtttcgttaa ccagcacctg tgcggttctc acctggttga agctctgtac 240

ctggtttgcg gtgaacgtgg tttcttctac accccgaaaa cccgtcgtgg tatcgttgaa 300

cagtgctgca cctctatctg ctctctgtac cagctggaaa actactgcgg t 351

Claims (6)

1.一种甘精胰岛素前体，其特征在于，所述甘精胰岛素前体为引导肽、甘精胰岛素B链和甘精胰岛素A链依次串联所得的多肽，其中甘精胰岛素B链的C端与甘精胰岛素A链的N端直接连接，甘精胰岛素B链的N端与引导肽相连；

所述甘精胰岛素前体的氨基酸序列为SEQ ID No:10。

2.编码如权利要求1所述的甘精胰岛素前体的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列为SEQ ID No:20。

3.用于表达甘精胰岛素前体的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述的多核苷酸，所述表达载体选自质粒pET-28a（+）。

4.包含如权利要求3所述重组表达载体的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌由所述重组表达载体导入到宿主菌中得到，所述宿主菌选自大肠杆菌BL21（DE3）。

5.根据权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于，如下方法制备：

（1）合成权利要求2所述的多核苷酸；

（2）将所述多核苷酸插入到表达载体上，所述表达载体选自质粒pET-28a（+），构建得到重组表达载体；

（3）将所述重组表达载体导入到宿主菌中，所述宿主菌选自大肠杆菌BL21（DE3），得到所述表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌。

6.一种表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）合成权利要求2所述的多核苷酸；

（2）将所述多核苷酸插入到表达载体上，所述表达载体选自质粒pET-28a（+），构建得到重组表达载体；

（3）将所述重组表达载体导入到宿主菌中，所述宿主菌选自大肠杆菌BL21（DE3），得到所述表达甘精胰岛素前体的重组基因工程菌。

Images