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CN114746108A - 治疗性蛋白质组合物和方法 - Google Patents

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CN114746108A
CN114746108A CN202080066040.XA CN202080066040A CN114746108A CN 114746108 A CN114746108 A CN 114746108A CN 202080066040 A CN202080066040 A CN 202080066040A CN 114746108 A CN114746108 A CN 114746108A
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therapeutic protein
precipitating agent
composition
precipitate
protein
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尤金·祖尔罗
丹尼斯·科廷
彼得·拉德克
库尔特·L·布里尔哈特
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Plasma Tech Co Ltd
Original Assignee
Plasma Tech Co Ltd
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Abstract

本发明构思的组合物提供了一种治疗性蛋白质，其中变性形式的治疗性蛋白质杂质小于2％。与常规分离方法产生的相应治疗性蛋白质制剂相比，此类组合物提供了增强的比活性和改进的储存和/或血清稳定性的治疗性蛋白质。

Description

治疗性蛋白质组合物和方法
本申请请求2019年9月20日提交的、序列号为62/903,659的美国临时专利申请的权益。这些和所有其他引用的外部材料全部通过引用并入本文。如果通过引用并入的参考中对术语的定义或使用与本申请提供的术语的定义不一致或相反，则本申请对该术语的定义被视为具有约束力。
技术领域
本发明的技术领域涉及治疗性蛋白质，具体地，从血液或血液制品中分离的治疗性蛋白质。
背景技术
背景说明包括可能有助于理解本发明的信息。其不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明有关，也不是承认任何具体地或隐含地引用的出版物是现有技术。
目前从人类血液制品中分离出了多种用于治疗的蛋白质。这类蛋白质的示例包括白蛋白、免疫球蛋白、α-1抗胰蛋白酶和多种凝血因子。这些治疗性蛋白质经常大量高浓度使用。白蛋白以高浓度(重量百分比高达25％)用于恢复外科手术、创伤和烧伤患者的血容量。免疫球蛋白制剂(通常含有重量百分比约10％的IgG)被用作免疫调节剂，用于治疗各种疾病和病症，除了为免疫应答减弱提供支持外，还可以通过调节补体活性、抑制独特型抗体、饱和巨噬细胞Fc受体和抑制多种炎症介质发挥作用。每周注入α-1抗胰蛋白酶(约60mg/kg体重)用于治疗与α-1抗胰蛋白酶缺乏相关的遗传病或减缓其发展。凝血因子(如因子VIII、因子IX、血管性血友病因子和凝血连锁反应的其他成分)可用于治疗血友病，并以浓缩形式提供，以便通过简单注射进行治疗。
基于所需的数量，此类治疗性蛋白质可以通过规模化生产从血液制品(如血浆)中分离，通常包括沉淀、过滤、再溶解和色谱介质处理等一系列步骤。所需的高纯度通常需要使用多个分离步骤。通常情况下，使用科恩分布分离法分离血清，这涉及逐步添加酒精产生一系列沉淀的步骤。然而，这种规模化生产会导致治疗性蛋白质的变性形式在纯化的组分中累积。这种变性可导致给药后的不良反应、活性降低、储存半衰期缩短(尤其是在液体制剂中)和/或给药后血清半衰期缩短。
因此，仍然需要具有最小杂质和几乎不含变性蛋白质的治疗性蛋白质制剂。
发明内容
本发明主题提供了包含治疗性蛋白质的组合物，所述组合物已通过使其含有较低含量的变性的治疗性蛋白质和/或其他杂质的方式处理。此类组合物与通过常规方法生产的治疗性蛋白质的相应制剂相比提供更高的比活性和/或稳定性。
本发明构思的组合物包括从血液制品(例如贫冷沉淀(cryo-poor)血浆)中分离的治疗性蛋白质，其中治疗性蛋白质以天然形式和变性形式存在，其中所述变性形式占治疗性蛋白质总量或天然形式的治疗性蛋白质的约0.01％至约1％、2％、3％、4％或5％。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质在分离期间暴露于沉淀剂中。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为α-1抗胰蛋白酶，并且当用活性部位滴定猪胰蛋白酶(使用N-苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐(L-BAPNA)作为底物)进行测试时，所述组合物的抑制性大于90％。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质是免疫球蛋白，并且在给药后的体内半衰期比使用科恩分布分离法制备的免疫球蛋白组分至少多5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，治疗性蛋白质至少在4％、5％、8％、10％、15％、20％或25％的浓度下为无色白蛋白。
本发明构思的另一个实施方案是制备如上所述的治疗性蛋白质组合物的方法，通过在约1℃至约6℃的温度下，在沉淀剂存在下解冻冷冻血浆，以生成改性冷沉淀物和改性贫冷沉淀血浆，将改性冷沉淀物从改性低温血浆中分离，将改性贫冷沉淀血浆施加到色谱介质中，而不进行中间沉淀或显著稀释步骤，以产生未结合组分和结合组分，并从未结合组分或结合组分中回收包含约0.01％至约5％变性的治疗性蛋白质的治疗性蛋白质。合适的沉淀剂包括有机酸、有机酸盐(如柠檬酸钠)、无机盐和亲水性聚合物。
本发明构思的另一个实施方案是制备如上所述的治疗性蛋白质组合物的方法，通过向血液制品中添加非挥发性沉淀剂，以提供不会导致形成沉淀的沉淀剂浓度，以形成中间溶液。从中间溶液中除去水，同时保留沉淀剂，直至沉淀剂达到目标沉淀浓度，以生成沉淀和上清液，将沉淀与上清液分离，以及从上清液或沉淀物中回收包含约0.01％至约1％的变性治疗性蛋白质的治疗性蛋白质。合适的沉淀剂包括有机酸、有机酸盐(如柠檬酸钠)、无机盐和亲水性聚合物。水可以通过蒸发(例如减压)或超滤去除。在一些实施方案中，从上清液中回收所述治疗性蛋白质。在一些实施方案中，从沉淀物中回收所述治疗性蛋白质。
通过以下对优选实施方案以及附图的详细说明，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将更加明显，其中附图中相同的数字表示相同的组成部分。
具体实施方式
以下描述包括可能有助于理解本发明的信息。这不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明有关，也不是承认任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。
在一些实施方案中，用于描述和要求保护本发明某些实施方案的表示成分数量和如浓度、反应条件等特征的数字应被理解为在某些情况下由术语“大约”修饰。因此，在一些实施方案中，书面描述和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方案所寻求的期望特性而变化。在一些实施方案中，数字参数应该根据报告的有效数字的数值并通过应用普通舍入方法来解释。尽管本发明的一些实施方案阐述的数值范围和参数的大范围是近似值，但具体实施例中阐述的数值尽可能精确地进行了报告。在本发明的一些实施方案中所呈现的数值可能包含了它们各自测试测量中发现的标准差所导致的必然产生的一定误差。
除非上下文另有明确规定，否则在本文的说明书和随后的所有权利要求中，“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”的含义包括复数含义。此外，如在本文说明书中所使用的，“在……里(in)”的含义包括“在……里(in)”和“在……上(on)”，除非上下文另有明确规定。
本文中对数值范围的列举仅旨在作为单独引用落入所述范围内的每个单独数值的简写方式。除非本文另有说明，否则每个单独的值都被纳入说明书中，与其在本文中被单独列举一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可按任何适当顺序执行。使用关于本文中的某些实施方案提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“例如”)仅旨在更好地说明本发明，而不构成对本发明范围的限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对本发明的实施至关重要的任何未要求保护的元素。
本文公开的本发明的替代元素或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员都可以单独或与组的其他成员或本文中发现的其他元素一起被提及并要求被保护。出于方便和/或可专利性的原因，可以将一个组中的一个或多个成员并入在一个组中或从中删除。当出现任何并入或删除时，本说明书被视为包含修改后的组，从而满足所附权利要求中使用的所有Markush组的书面描述。
本发明构思的实施方案提供了具有低含量变性的治疗性蛋白质和其他杂质的治疗性蛋白质组合物。所得组合物以更接近其体内状态的状态(例如，在接受纯化技术之前)提供治疗性蛋白质。与现有技术方法制备的相应制剂相比，此类治疗性蛋白质制剂在给药后表现出更高的特异性、更长的稳定性和/或更长的体内半衰期。
通过本申请的制备方法，本申请实现了、至少部分实现了谨慎的避免蛋白质的变性。例如，此类方法避免使用变性有机溶剂(例如醇、酮等)，利用将沉淀剂的局部浓度降至最低的步骤，小心混合以避免产生泡沫或气泡，和/或避免或尽量减少变性沉淀剂(如有机溶剂)的使用。类似地，此类工序可以避免极端pH值(例如，将pH值保持在约6.5至约8.5之间，或将pH值保持在约6.8至约7.5之间)和/或极端温度(例如，在整个制备过程中将温度保持在约4℃至8℃，或将温度保持在约18℃至约25℃)。下面提供了此类方法的非排他性示例。
绝大多数血液制品的原料是从商业采集中心获得的冷冻血浆。在低温(通常为1至6℃)下缓慢解冻该物质，生成含有沉淀的蛋白质(即冷冻沉淀或“冷沉淀”)和富含蛋白质的上清液(贫冷沉淀血浆)的中间血液制品。冷沉淀包括源自血浆中含有的一些纤维蛋白原，以及凝血因子和纤维蛋白。贫冷沉淀血浆富含冷溶性蛋白质，经常被用作药物蛋白质的来源。
在没有进行稀释或处理步骤的情况下，贫冷沉淀血浆的蛋白质含量和/或变性的蛋白质含量可能使其不适合直接应用于常规色谱分离。令人惊讶的是，发明人发现，在解冻过程中加入低浓度的沉淀剂(即，当应用于血清和/或血浆时，不会导致肉眼可见的沉淀的浓度)可以改变所得制剂中冷溶性组分和冷不溶性组分之间的蛋白质分布。研究发现，得到的改性贫冷沉淀血浆的蛋白质含量允许其直接应用于色谱介质(例如尺寸排阻介质、离子交换介质、疏水相互作用介质、亲和介质、混合模式色谱介质等)，而无需进行稀释和/或沉淀步骤。这有利地简化了工序，而每个工序步骤都会导致非预期的变性的可能。可以在保持与初始解冻步骤中使用的温度接近或相同的低温(例如，从4℃到8℃)下进行此类色谱步骤，以减少蛋白质变性的机会。类似地，在这些步骤中，pH值可以保持恒定或控制在限制范围内(例如pH 6至pH 8、pH 6.5至7.8、pH 6.8至7.2)，以最大限度地减少变性。
在本发明构思的优选实施方案中，色谱介质是亲和介质。这有利于简化和减少血浆处理所需的时间和材料。此外，减少加工的步骤可以降低敏感蛋白种类的变性程度，从而提高储存稳定性、改善给药后的体内半衰期和/或提高比活性。
本发明构思还提供了组合物和方法，其中将非挥发性沉淀剂(例如硫酸盐、磷酸盐、有机酸盐和/或可溶性聚合物)引入含有一种或多种目标蛋白质和一种或多种污染蛋白质的血液制品。在一些实施方案中，所述沉淀剂的提供量或浓度不会导致形成可见沉淀。然后从所得反应混合物中除去水，以同时增加蛋白质和沉淀剂的浓度。当蛋白质浓度和沉淀剂浓度达到所需的目标值时，形成蛋白质沉淀，并随后与上清液组分分离。为了减少变性，可以在恒温或限制温度范围内(例如15℃至25℃、18℃至22℃)与沉淀剂混合并分离沉淀和上清液组分。类似地，在这些步骤中，pH值可以保持恒定或控制在限制范围内(例如pH 6至pH 8、pH 6.5至7.8、pH6.8至7.2)，以尽量减少变性。
根据目标蛋白质和沉淀的性质，目标蛋白质可以存在于沉淀或上清液组分中。由于在此过程中，蛋白质浓度随着沉淀浓度的增加而增加，因此沉淀组分和上清液组分之间的蛋白质分布不同于常规沉淀过程中产生的蛋白质分布，在常规沉淀过程中，蛋白质浓度随着沉淀剂浓度的增加而降低或最多保持不变。在一些实施方案中，可以对从此类沉淀过程获得的上清液进行额外溶剂(即水)的去除，以进一步增加蛋白质和沉淀剂浓度，并生成第二沉淀和第二上清液组分。
增加蛋白质浓度，同时以这种方式增加沉淀剂浓度，可以提高沉淀效率，从而提高目标蛋白质的产量。此外，以不产生可见沉淀物的初始浓度引入沉淀剂可以防止形成不需要的蛋白质沉淀，其不会由于沉淀剂的局部高浓度(如在常规工艺中添加沉淀剂时发现的)形成不需要的蛋白质沉淀，从而降低了蛋白质变性的可能性，提高了从这些过程中回收的目标蛋白质的比活性。
如上所述，在本发明构思的实施方案中，沉淀剂被选择为非挥发性的(即，在当前环境条件下具有比蛋白质水溶液中的水更高的蒸汽压)。根据沉淀剂的性质，沉淀剂的用量可能会有所不同。合适的沉淀剂最好是非变性的，并且可以包括有机酸和有机酸盐(例如柠檬酸钠)、无机盐(例如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠)和亲水性聚合物(例如PEG、葡聚糖等)。例如，如果使用柠檬酸钠等有机盐，其浓度可以约为0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％或小于约20％(w/v)。类似地，如果使用诸如硫酸铵之类的无机盐，则其可以在约0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％或小于约20％(w/v)的浓度范围内提供。如果使用亲水性聚合物，例如PEG，则其可在约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.7％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、7％或小于约10％(w/v)的浓度范围内提供。
可以通过任何合适的方法从含有沉淀剂的蛋白质水溶液中去除水。使用的方法取决于沉淀剂的性质。例如，如果沉淀剂是亲水性聚合物，可以使用截留分子量小于亲水性聚合物分子量的膜过滤(例如超滤、渗滤)以将水溶液中的水除去。在另一个实施方案中，可以通过蒸发(在环境压力下或减压下)从水溶液中除去水。
在本发明构思的优选实施方案中，通过处理血液制品获得治疗性蛋白质。合适的血液制品包括血清血浆、贫冷沉淀血浆、如上所述的改性贫冷沉淀血浆、再溶解冷沉淀和如上所述的改性再溶解冷沉淀。在一些实施方案中，血液制品在被用于本发明构思的方法之前可以经过各种工序处理(例如稀释、pH调节、添加蛋白酶抑制剂、添加抗凝血剂、沉淀等)。
在本发明构思的一些实施方案中，可以进一步处理由本发明构思的方法产生的上清液或沉淀物，以回收一个或多个目标蛋白质和/或去除不需要的杂质。在此类实施方案中，通过该方法产生的沉淀物可在额外处理之前再溶解。合适的额外处理方式包括从上清液中进一步脱水、通过添加沉淀剂的沉淀量进行常规沉淀和/或色谱分离(例如，使用离子交换、疏水作用、亲和性、混合模式和/或尺寸排除色谱分析介质)。
用于此类附加处理的色谱介质可以具有任何合适的组成和配置。合适的介质可以用于尺寸排除、离子交换、疏水相互作用、亲和和/或混合模式分离。合适的介质可以作为多孔颗粒或珠、非多孔颗粒或珠、过滤器、纤维和/或多孔膜被提供。色谱介质的结构部分可以基于任何合适的材料。实施例包括但不限于多糖(例如交联葡聚糖)、合成聚合物和/或无机材料(例如羟基磷灰石)。色谱介质可以以任何合适的几何形状被提供。合适的几何形状包括开放式或密封式色谱柱、径向色谱柱、保护柱、膜壳等。
在本发明构思的方法的实施例中，获得血液制品(例如血浆)并通过快速搅拌与等量体积的8％(w/v)柠檬酸钠混合，以形成非沉淀性柠檬酸钠浓度为4％(w/v)的蛋白质水溶液。将蛋白质水溶液转移到密封容器中，空气压力降低至低于环境温度下的水的蒸汽压，从而使水从溶液中快速蒸发。在一些实施方案中，在该过程中，将少量空气持续排入密封容器中，以防止密封室内的水蒸气平衡。去除水，直到水溶液的体积减小到使柠檬酸钠浓度在10％到12％之间，同时增加蛋白质浓度以形成可见沉淀。随后可以从上清液组分分离沉淀物，例如通过过滤或离心等方法。这种分离可以在环境压力下或减压下进行。
在本发明构思的方法的另一个实施例中，获得了血液制品(例如血浆)，并使用快速搅拌将其与等体积的平均分子量为5kD的2％(w/v)聚乙二醇(PEG)混合，以形成非沉淀PEG浓度为1％(w/v)的蛋白质水溶液。使用截留分子量为3kD的非污染膜对蛋白质水溶液进行超滤，从而快速去除溶液中的水和其他低分子量物质，同时保留沉淀剂。继续超滤，直到水溶液的体积减少到蛋白质水溶液原始体积的约25％，使PEG浓度达到了约4％w/v，同时增加了蛋白质浓度，并形成可见沉淀。随后可以通过过滤或离心等方法将沉淀物从上清液组分分离。
通过本发明构思的方法可以得到多种高产率、比活性、纯度、体外稳定性和/或体内稳定性的药用蛋白质。这些蛋白质包括纤维蛋白原、因子VII、因子VIII、因子IX、因子XIII、血管性血友病因子、纤维粘连蛋白、免疫球蛋白、α-1抗胰蛋白酶、蛋白C、蛋白S、C1酯酶抑制剂、抗凝血酶3、凝血酶和/或白蛋白。
如上所述，在本发明构思的组合物中发现的治疗性蛋白质具有低含量的变性的治疗性蛋白质。在将本发明构思的方法应用于合适的原料后处于变性状态的治疗性蛋白质组分的含量可以在混合物的总治疗性蛋白质含量或天然的治疗性蛋白质含量的约0.01％至约1％、2％、3％、4％、5％、8％或10％的范围内。与使用常规方法(例如科恩分级分离法)制备的相应治疗性蛋白质制剂相比，由此制备的治疗性蛋白质在给药后可以具有高储存稳定性和/或高体内稳定性和/或可具有高比活性。例如，与通过常规科恩分级分离方法(即乙醇沉淀)制备的相应免疫球蛋白制剂相比，本发明构思的免疫球蛋白制剂保质期和/或给药后体内半衰期可显著增加(例如，至少多10％)。类似地，当使用活性部位滴定猪胰蛋白酶(使用N-苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐(L-BAPNA)作为底物)进行测试时，本发明构思的α-1抗胰蛋白酶制剂的抑制性可大于90％。
类似地，杂质(例如胆红素、脂肪酸等)可以被充分去除，同时使90％到99.99％的治疗性蛋白质保持活性、保持天然构象，产生无色或在高蛋白质浓度(例如10mg·mL-1或更高)下基本无色的蛋白质溶液。这对于白蛋白尤其有用，因为当用于治疗时，杂质的减少会导致该蛋白质吸附不良分子(例如，循环淀粉样斑块材料和/或小分子有机分子(例如治疗性药物、滥用药物、药物代谢物等))的能力增加。
本领域技术人员应当清楚，在不偏离本发明构思的情况下，除了本发明已经描述的之外，还可以进行更多的修改。因此，除了符合所附权利要求书的精神之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求书时，所有术语都应以与上下文一致的尽可能广义的方式进行解释。尤其是，术语“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应被解释为以非排他性的方式指代元素、组分或步骤，表明所引用的元素、组分或步骤可能存在、或使用未明确引用的其他元素、组分或步骤组合，或可以与未明确引用的其他元素、组分或步骤组合。其中，说明书权利要求涉及选自A、B、C……和N的至少一种，文本应该被解释为只需要其中的一种元素，而不是A+N或B+N。

Claims (17)

1.一种含治疗性蛋白质的组合物，其中所述治疗性蛋白质以第一量的天然形式和第二量的变性形式存在，其中所述第二量为所述第一量的0.01％至5％，并且其中所述治疗性蛋白质分离自血液制品。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述治疗性蛋白质在分离期间暴露于沉淀剂。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述血液制品是改性贫冷沉淀血浆。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述治疗性蛋白质是α-1抗胰蛋白酶，且其中使用N-苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐(L-BAPNA)作为底物用活性部位滴定猪胰蛋白酶进行测试时，所述组合物抑制性大于90％。
5.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述治疗性蛋白质是免疫球蛋白，且其中所述组合物的体内半衰期比使用科恩分布分离法制备的免疫球蛋白组分的体内半衰期至少延长10％。
6.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述治疗性蛋白质是浓度至少为10％的白蛋白，且所述组合物是无色的。
7.一种制备权利要求1-6中任一项所述的组合物的方法，包括：
获取冷冻血浆；
在沉淀剂存在下，在约1℃至约6℃的温度下解冻冷冻血浆，以产生改性冷沉淀物和改性贫冷沉淀血浆；
从所述改性贫冷沉淀血浆中分离所述改性冷沉淀物；
在不进行中间沉淀或显著稀释步骤的情况下，将改性贫冷沉淀血浆施加到色谱介质，以产生未结合组分和结合组分；以及
从所述未结合组分或所述结合组分回收包含0.01％至5％变性治疗性蛋白质的治疗性蛋白质。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述沉淀剂选自有机酸、有机酸盐、无机盐和亲水性聚合物。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述沉淀剂是柠檬酸钠。
10.一种制备权利要求1-6中任一项所述的组合物的方法，包括：
获取血液制品；
向血液制品中添加非挥发性沉淀剂，以提供不会导致沉淀形成的沉淀剂浓度，以形成第一中间溶液；
从所述第一中间溶液中除去水，同时保留所述沉淀剂，直至达到所述沉淀剂的目标沉淀浓度，以生成沉淀和上清液；
从所述上清液中分离所述沉淀物；以及
从所述上清液或所述沉淀物中回收包含0.01％至5％的变性治疗性蛋白质的治疗性蛋白质。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述沉淀剂选自有机酸、有机酸盐、无机盐和亲水性聚合物。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述沉淀剂是柠檬酸钠。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中通过蒸发除去水。
14.如权利要求13所述的方法，其中蒸发在减压下进行。
15.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述沉淀剂是亲水性聚合物，并且通过超滤除去水。
16.如权利要求10-15中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质回收自所述上清液。
17.如权利要求10-15中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质回收自所述沉淀物。
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