CN103476786B - 一种生产血液来源蛋白质注射制剂的方法，以及使用上述方法获得的蛋白质物料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产血液来源的蛋白物料的注射级药用剂型产品的方法，包括以下步骤：将聚合物/盐双水相系统中的原物料在苯酚中分级，通过辛酸沉淀纯化系统上层水相，然后通过热凝法纯化系统下层水相，通过层析增加双相中物料纯度，通过对两种制备产物进行纳米过滤来去除病毒颗粒、成型、稳定化和包装获得的物料。

Description

一种生产血液来源蛋白质注射制剂的方法，以及使用上述方 法获得的蛋白质物料

技术领域

本发明涉及对治疗用蛋白纯化领域，特别是生产血液来源的病毒载量降低的注射级蛋白产品剂型的方法，例如免疫球蛋白和/或白蛋白。

背景技术

血浆来源制品，例如人白蛋白、人免疫球蛋白和异源抗蛇毒血清是治疗许多疾病、事故和受伤的重要药物。由于目前对这些制品的需求量增加，因此改进生产方法效率以提供足够的药品来满足需求是很重要的，这可避免这类药物在短期内的全球供应短缺情况。

为获得血液来源的蛋白制品，特别是血浆，目前已有一些方法。其中我们可看到一些方法：

1.血浆分级

Cohn血浆分级法(冷醇分级)是血浆来源的生物制品行业使用的最常见方法(参见see Cohn EJ,Strong LE,Hughes WL,Mulford DJ,Ashworth JN,Mel in M.,Taylor HL1946."Preparation and properties of serum and plasma proteins.IV.A system forthe separat ion into fract ions of the protein and lipoprotein components ofbiological t issue and fluids",Journal of the American Chemical Society,68:459-475)。为改进原始方法的生产成本和效能相关方面，一些研究人员已提出在工艺中采用反应性较低或抑制性步骤的改进方案(参见Hink J.,Hidalgo J.,Seeberg V.,JohnsonFF 1957."Preparation and properties of a heat-treated human plasma proteinfraction."VoxSanguinis 2:174-186；Kistler,P,Nitschmann,H.1962."Large ScaleProduction of Human plasma Fractions”,VoxSanguinis 7:414-424,Schneider,W.,Wolter,D.,McCarty,L.1976."Alternativesfor PlasmaFractionation."VoxSanguinis,(31)2:141-151)。而且，其它的改进方案提示基于使用沉淀剂、一种或多种层析步骤或其组合将其并入纯化方法。最常使用的沉淀剂为硫酸铵、聚乙二醇和辛酸。

2.使用双水相系统(ATPS)的血浆分级

已有报道使用双水相系统(ATPS)用于具有高商业价值化合物的初级回收和分级。ATPS由聚合物-聚合物、聚合物-盐和盐-醇混合物组成，并已用于生物制品(例如蛋白、基因材料)细胞或其细胞器、有机物，例如香料和染料、重金属和某些药物的初级回收和部分纯化(参见Benavides,J.,Rito-Palomares,M.2008."Review:Practical experiences fromthe development of two-phase Aqueous Processes for the recovery of high valuebiological products".J ChemTechnolBiotechnol 3:133-142；Huddleston,J.,A.Veide,K.Kohler,J.Flanagan,S-0.Enfors and A.Lyddiat.1991."The molecular basis ofpartitioning in Aqueous two-phase systems".Tibtech9:381-388))。

U.S.Patent 4,684,723公开了一种使用ATPS从血浆或培养基中存在的其它蛋白和核苷酸分离α-蛋白酶抑制剂的方法。同样，在专利申请WO2010/062244A1中，其提出了ATPS提取二阶段中治疗用蛋白(特别是单克隆抗体)的回收和部分纯化方法。在第一个阶段中，抗体会分布在上相中，而在第二个阶段中，其在该相中沉淀。然后将其回收，重新溶解以通过层析来进一步纯化。在另一发明(美国专利申请号2010/0179252)中提出采用多相系统，包括两种类型的聚合物，一种是酸性的，一种是醚类的，以及至少一种用于分离生物分子、细胞或颗粒的盐。此外，专利申请WO 2010/080062提车了一种用ATPS聚合物-盐分离生物分子的方法，其中目标分子，例如一种单克隆抗体，分别在不富含聚合物的相中。此外，还有针对ATPS抗体分离条件、提取和纯化方面的研究。(参见Andrews,BA,Nielsen,S.,Asenjo,JA 2007,"Partinioning and purification of monoclonal antibodies inAqueous two-phase systems",Bioseparation 6(5):303-313；Azevedo,A.,Rosa,P.,Ferreira,F.Aires-Barros,M.2007,"Optimisation of Aqueous two-phase extractionof human antibodies",J.Biotechnology 132(2):209-217,and Rosa,P.,Azevedo,A.,Sommerfeld,S.,Mutter,M,Aires-Barros,M.,W.2009,"Application ofAqueous two-phase systems to antibody purification:A multi-phase approach",J.Biotechnology 139(4):306-313)。

而且，已有关于在这类系统中分离白蛋白的研究发表，研究参数包括pH、温度、聚合物和盐的类型。(参见Gündüz,U.2000."Partitioning of bovine serum albumin in anAqueous two-phase system:optimization of partition coefficient",Journal ofChromatography B:Biomedical Sciences and Applications,743(1-2):259-262.；Farruggia,B.,Nerli,B.,Stang,G.2003."Study of the serum albumin-polyethyleneglycol interaction to predict the protein partitioning in Aqueoustwo-phase systems."Journal of Chromatography B,798(1):25-33,Lu,Y.,Yang,Y.,Zhao,X.,Xia,C.2010"Bovine serum albumin partitioning in polyethylene glycol(PEG)/potassium citrate Aqueous two-phase systems."Food and BioproductsProcessing.88(1):40-46；Garza,M.,Rito,M.,Serna,S.,Benavides,J.2010."Potentialof Aqueous Two-Phase Systems constructed on Flexible devices:Human serumalbumin as proof of concept".Process Biochemistry 45(7):1082-1087)

3.通过辛酸沉淀来纯化免疫球蛋白

Steinbuch,M.,Audran,R.在1969年首次通过辛酸沉淀法来纯化免疫球蛋白("Theisolation of IgG from mammalian be With The aid of caprylic acid".ArchBiochem.Biophysics 134,279-284)。之后，基于这一方法，发明了数种方法。例如，美国专利4,164,495(Hansen,1979)使用1-8％v/v PEG和0.1-5％v/v辛酸来沉淀蛋白。专利5,075,425(Kotitschke et al.1991)使用2.5％辛酸沉淀污染蛋白，然后通过DEAE-Sephadex吸附。类似地，专利申请号WO2006064373(Bloy et al.,2006)提出使用2.5％辛酸来沉淀蛋白污染物。同样，专利US6955917(Alred et al.,2003)提出使用40％辛酸盐(15-50mM,优选20mM)溶液用于去除污染蛋白和对产物进行病毒灭活，然后通过离子交换层析。该工艺与专利申请号WO200508293(et al,2005)中提出的类似，使用辛酸盐或庚酸盐溶液用于同一目的。

最后，有一些专利提出使用辛酸用于其它目的。美国专利5,164,487(Kothe etal,1992)中提出使用浓度为0.4-1.5％的辛酸用于去除血管活性物质和蛋白水解酶，然后再进行离子交换层析；美国专利20070244305(Parkinnen,2007)提出使用PEG沉淀污染蛋白，然后使用辛酸灭活病毒。

这些专利中提出的大多数方法产量约为60％，起始于冷醇分级的最初阶段。

4.白蛋白纯化

对于白蛋白，差别化的热变性或选择性热凝是用于从血浆或包含蛋白的混合物中纯化的方法。美国专利4,156,681提出将血浆在乙醇和辛酸钠中加热至68℃，然后加入PEG可回收沉淀的白蛋白。类似地，在美国专利3,992,367中，血浆加热至60℃，然后用乙醇沉淀白蛋白。在另一发明(U.S.4,222,934)中，血浆加热至60℃，然后加热PEG去除变性的沉淀蛋白，用等电沉淀来回收白蛋白。而且，在美国专利4,177,188中，在热处理前回收免疫球蛋白。

因此，目前有工艺从血浆、血清、部分Cohn法组分或其它包含白蛋白和/或免疫球蛋白的起始物料回收，然后采用选择性热凝或辛酸沉淀来分别纯化白蛋白和免疫球蛋白。但是，到目前为止，尚无对从双水相系统(ATPS)中获得的组分应用此类纯化技术的报道。

本发明解决了现有技术的局限，其展示了一条可获得血液来源的病毒载量降低的人用注射级蛋白制品剂型的生产线，这是使用ATPS获得免疫球蛋白和白蛋白相关的最重要的一个方面(在现有技术中未曾描述过)。

发明内容

本发明为一种生产血液来源的病毒载量降低的注射级蛋白产品剂型，该方法包括以下步骤(图1和4)：

a.通过加入一种聚合物和至少一种盐使双水相系统的起始物料分级；

b.向双相系统中加入苯酚作为灭活病毒的第一步；

c.将双水相系统的上下双相分级为双水相；

d.通过脂肪酸沉淀系统上层水相来纯化产品；

e.通过热凝方法来纯化系统下层水相中的产品；

f.在系统上下双相的纯化步骤中用两个步骤来去除形成的变性蛋白沉淀物；

g.通过层析增加从上下双相中获得的产品纯度；

h.将前一步骤中获得的产物进行纳米纯化以去除病毒颗粒；以及

i.对获得的产物进行制剂、稳定化和灭菌。

本发明方法所用起始物料可选自血浆、血清、通过Cohn法获得的组分或任何其它含有血浆来源蛋白产品(特别是白蛋白和/或免疫球蛋白)的物料。

最初，进行系统中的起始物料分离，包括双水相。加入一种聚合物和一种盐，其中所选聚合物为分子量为1000-6000Da的聚乙二醇，并优选3350Da的聚乙二醇，其浓度范围为6-15％w/v，优选6-9％w/v。

在分级中所有盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵和柠檬酸钠，优选使用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，浓度为10-20％w/v，优选为15-20％w/v。

此外，采用一种不参与双相形成的盐，但其可影响系统中溶液分级，优选使用氯化钠，浓度为5-20％w/v，优选为12-15％w/v。

在pH 5.5-7.5进行分级步骤，优选pH约为6，并在室温下进行(20-25℃)。

作为第一步的病毒灭活步骤，本发明采用苯酚浓度为0.05-0.3％v/v，在优选的实施例中使用苯酚浓度为0.25％v/v。

病毒灭活后，我们进行双水相系统的上下水相分离，使用的工艺可选自静置和分离、静置和过滤、静置和弃上清或简单离心的组合。

下一步是将从ATPS获得的上相中的产物纯化。该相富含免疫球蛋白，且其纯化需要进行辛酸沉淀，辛酸浓度为1-6％v/v，优选浓度为1.5-2％v/v。

同时进行热凝来纯化系统下相中富含白蛋白的产物。该工艺在60-70℃下进行，优选65℃。该操作在0.012M辛酸钠和9％乙醇v/v中。

为增加系统中上相中产物的纯度，采用的层析步骤包含离子交换层析、亲和层析或疏水交换层析。系统下相中获得产物的最终纯化阶段采用离子交换层析。

通过纳米过滤从本发明工艺获得的产物中去除病毒颗粒，采用20nm排除滤膜。该产物采用向免疫球蛋白和白蛋白溶液分别加入例如蔗糖辛酸钠等物质进行稳定化。免疫球蛋白制剂可保持为溶液或冻干粉。对于白蛋白，最后一步为60℃巴氏消毒10小时。最后，通过0.22mm排除滤膜来对获得的产物进行灭菌。

本发明的其它内容为上述方法获得的产物。通过本发明优选实施例获得的白蛋白和免疫球蛋白为注射级溶液产品，病毒载量降低，符合相应规格(WHO,2010.抗蛇毒免疫球蛋白的生产、控制和管理指南、WHO,2004ECOG人血浆制品病毒安全性的病毒灭活和去除指南)。

附图说明

图1.获得无病毒的超免疫马血浆来源的蛋白制品的发明方法流程图。其显示了在该工艺每阶段中获得的产物的产率和纯度值。标有星号的操作示病毒灭活或去除步骤。关键词：Igs＝免疫球蛋白；AV＝抗蛇毒素

图2.用于从超免疫马血浆中生产抗蛇毒素的样本凝胶过滤方法。使用Superdex200 10/300GL柱，用150mM NaCl缓冲液,20mMTris-HCl,pH 7.5进行洗脱。A.超免疫马血浆；B.ATPS重悬上相；C.经辛酸沉淀后获得的过滤产物。

图3.用于获得马白蛋白的样本凝胶过滤方法。使用Superdex 200 10/300GL柱，用150mM NaCl缓冲液,20mMTris-HCl,pH 7.5进行洗脱。A.超免疫马血浆；B.ATPS下相；C.经热凝获得的过滤产物的阳离子交换层析。

图4.获得无病毒的人类血浆来源的静脉注射用蛋白制品的发明方法流程图。其显示了在该工艺每阶段中获得的产物的产率和纯度值。标有星号的操作示病毒灭活或去除步骤。关键词：Igs＝免疫球蛋白

图5.用于从人类血浆中获得γ免疫球蛋白的样本凝胶过滤方法。使用Superdex200 10/300GL柱，用150mM NaCl缓冲液,20mMTris-HCl,pH 7.5进行洗脱。A.人类血浆；B.ATPS重悬上相；C.经辛酸沉淀后获得的过滤产物的阴离子交换层析。

图6.用于获得人白蛋白的样本凝胶过滤方法。使用Superdex 200 10/300GL柱，用150mM NaCl缓冲液,20mMTris-HCl,pH7.5进行洗脱。A.人类血浆；B.ATPS下相；C.下相阳离子交换层析。

具体实施方式

本发明包括一种纯化血浆(血液)来源的蛋白制品的方法，尤其适用于从含有多种蛋白质的混合物中同时分级回收注射级品质的免疫球蛋白和白蛋白。本方法经济实用，使用价格实惠的试剂，并且与科恩氏法(Cohn method)不同的是，不需要特殊的设备来满足严格的温度要求。使用本方法所获得的产品，(主要是免疫球蛋白和白蛋白)呈现出高水平的品质(>90％)和性能。除免疫球蛋白和白蛋白以外，本方法也适用于分级回收血液中的其他蛋白质，如凝血因子等。还可应用于从酶解后的血浆中或纯化得到的免疫球蛋白中纯化免疫球蛋白片段(F(ab’)2或Fab)。此外，在得到各产品的过程中有2次灭活和1次去除病毒的步骤，可以减少病毒载量以保证安全，符合相关条例的规定。本方法还适用于超免疫血浆中的抗体纯化，例如抗蛇毒素血清和抗毒素的生产。

起始物料可以是血浆或者血清，经过或不经蛋白水解酶水解，血浆或血清的某些组分，其他含有人源或动物来源的免疫球蛋白和/或白蛋白的混合物。

起始物料的分级是通过ATPS系统实现的。在此种分级中，目的产物对组成该系统的双水相之一具有亲和力，这一点不同于目的产物所在混合物的其他组分。不同水相的形成，是通过混合两种或两种以上特定浓度的亲水性物质得到的。这些物质由于各自水合作用相关的热力学力的不同，在特定浓度下在水中不混溶。该系统中的水即原本存在于起始物料中的水。该系统包含一种水溶性聚合物，一种水溶性盐，以及另一种涉及溶质分级过程但不参与两种水相形成的水溶性盐。该聚合物为聚乙二醇(PEG)，分子量范围在1000至6000Da之间，主要分级至上层水相；盐为磷酸钾，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，主要分级至下层水相；不涉及水相形成的盐为氯化钠。磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的比例决定系统的酸碱度(pH)；随着磷酸二氢钾的增加，系统pH降低。预期的蛋白质分级所需的pH在5.5至7.5之间，温度在20至25℃之间(室温)。此外，加入苯酚以在分级过程中灭活起始物料中存在的病毒颗粒。苯酚的抗病毒能力在于其能够对病毒的蛋白和脂质结构进行物理破坏。

将系统各组分按照以下浓度分别加入到起始物料中，同时持续搅拌：苯酚0.05-0.3％v/v，聚乙二醇6-15％w/v，磷酸钾10-20％w/v，氯化钠5-20％w/v；更优选的是，苯酚0.25％v/v，聚乙二醇6-9％w/v，磷酸钾15-20％w/v，氯化钠15％w/v。各组分加入的顺序可以改变，但建议等待前一组分完全溶解后再加入下一组分。当所有组分加入后，混合物应再持续搅拌一小时。然后静置，以利于各相的形成。注意各组分浓度用w/v(质量体积比)表示，因为起始物料提供了组成ATPS系统所需的水，因此有利于各组分以固体形式而非溶液形式添加。这是一项改进，因为当放大本方法的生产规模时，无需准备多种成分的溶液和各种不同的容器。

当各相形成后，不同的环境特性和蛋白质本身的特性，如蛋白质分子量，蛋白浓度，酸碱度，离子强度和系统各组分的浓度，决定了各蛋白质的分级。在此条件下，白蛋白和其他杂蛋白分配至富盐的下层水相，免疫球蛋白和其他杂蛋白分配至上层水相。与保持悬浮的白蛋白不同，免疫球蛋白在上层水相中发生沉淀，从而使其在此相中的浓缩可以一步完成。这是另一项改进，因为本方法把初步纯化和蛋白浓缩这两组操作联合了起来。

各相的分级可以通过过滤、离心或者倾析实现。从这一步骤往后，每一相进入相互平行的纯化路线。以下将分别描述每条纯化路线(图1和4)：

从上层ATPS相中纯化免疫球蛋白

当各相分级之后，将上层相中回收的沉淀重悬于一定体积的水中。此一体积的水应能使全部沉淀溶解，优选的体积为少于或等于初始体积，以使产物具有恰当的浓度。搅拌悬液直至团块完全溶解。然后加入一种脂肪酸，以沉淀并变性杂蛋白，而使免疫球蛋白留在悬液中。该脂肪酸作用的浓度范围是1-6％v/v，优选的浓度介于1.5-2％v/v之间。该脂肪酸可以由6-8个碳原子组成，优选的是8个碳原子(辛酸)。沉淀过程可以选择在pH 5-8之间进行，不影响所获结果。在沉淀过程中必须进行剧烈的搅拌，并持续30-60分钟。然后，所产生的沉淀通过微滤或离心去除。此外，这一步骤对有包膜病毒能够起到灭活的作用。非电离形式的辛酸分子为亲脂性，能够破坏和穿透病毒的脂双层以及膜上的蛋白质。

然后，将含有免疫球蛋白的滤液或上清通过一种色谱柱，可选自阴离子交换、亲和层析或疏水交换层析，以提高纯度。

从下层ATPS相中纯化白蛋白

通过透析或渗滤去除富含白蛋白的下层相(图1和4)中来自ATPS系统的盐。这一过程是利用具有分子大小孔径的滤膜来实现的，其孔径小于或等于30kDa分子大小。然后，通过一种选择性的热凝固过程对溶液进行处理，加热至60-70℃之间，优选的是65℃，持续0.5至2小时。这一步骤将其余的蛋白质沉淀下来而将白蛋白留在溶液中，因为其余的血浆蛋白在这一温度均发生变性。利用辛酸钠和N-乙酰氨酸钠等试剂来保持白蛋白在这一温度的稳定性，优选的是0.02-0.1M的辛酸钠，更优选的浓度是0.012M。加热时加入5-15％v/v的乙醇，更优选的浓度是9％v/v，以促进其余蛋白的沉淀。加热后冷却至室温，并将pH值调整到5。产生的沉淀通过微滤或离心分级去除，并回收悬液中的白蛋白。产物纯化过程的最后一步是将溶液通过一种层析柱，经过一个特殊步骤，通过阳离子交换树脂(磺酸或者羟甲基)。

两种药物制剂的纳滤、制剂制备、稳定化和包装

白蛋白和免疫球蛋白的溶液均通过类似的方法进行纳米过滤、制剂、稳定化和包装(图1和4)。纳米过滤是一个基于尺寸大小排阻的去除病毒步骤，使用20μm大小孔径的滤器。在免疫球蛋白溶液中存在抗病毒抗体，因此病毒颗粒以抗体病毒复合物的形式被过滤去除，而在白蛋白制剂中则直接以病毒颗粒的形式被去除。各溶液经纳滤后，按照处方对相应的药物进行制剂。免疫球蛋白的制剂包含：经30kDa排阻滤膜超滤的蛋白溶液浓度1.0至10.0g/dL；pH值在5-7之间，优选的是5；5％的蔗糖作为稳定剂以及0.9％的氯化钠。产品经0.22μm排阻膜过滤消毒，然后进行包装。产品可冻干，也可保持液态。

经过纳滤后，白蛋白的制剂包含：经10kDa排阻滤膜超滤的蛋白溶液浓度20g/dL；pH值在6.5-7.5之间，优选的是7；添加辛酸钠作为稳定剂以及0.9％的氯化钠。药物经消毒、包装后在60℃进行巴氏消毒10小时。巴氏消毒法利用较高的温度能够灭活有包膜和无包膜病毒。根据Kempf,C.,Stucki,M.,Boschetti,N.2007.“Pathogen inactivation andremoval procedures used in the production of intravenous immunoglobulins”,Biologicals 35:35-42，巴氏消毒法作用于包膜病毒的脂双层，使脂质由固态变成液态，从而稳定病毒颗粒。

对以下各实施例的描述将有助于更好地理解本发明的方法。所提供的各实施例仅用来说明阐述本发明，而绝不应被认为是对本发明应用范围的限制。

实施例

实例1.从超免疫马血浆中生产抗蛇毒血清和白蛋白。

为从同一批富含抗蛇毒抗体的超免疫马血清中获取免疫球蛋白和白蛋白，将1L上述血浆通过“水二相聚合物盐系统”进行分级。该血浆来自用三色矛头蝮、中美巨蝮和中美响尾蛇毒素免疫的马匹体内。起始物料含有63％免疫球蛋白和27％白蛋白(图1和2)。为形成二相系统，加入150g氯化钠(15％w/v)，106g磷酸氢二钾，74g磷酸二氢钾(18％w/v)，90g聚乙二醇(9％w/v)，以及作为抗病毒剂的苯酚2.5mL(0.25％v/v)。磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的比例是0.7，这样系统pH值即为6.1。每个组分加入后应持续搅拌至完全溶解，然后再加入下一组分。加入全部组分后，继续剧烈搅拌系统1小时，然后静置1小时以形成各相；上层相含有免疫球蛋白沉淀，下层相含悬浮状态的白蛋白。接着，使混合物在重力作用下进行微滤。这一步也可通过离心或倾析实现。过滤后，将沉淀(免疫球蛋白)和滤液(白蛋白)分别进行处理。如图1所示，各相分级后，血浆中68％的抗蛇毒免疫球蛋白从上层相中得到回收(图2B)，血浆中100％的白蛋白从下层相中得到回收(图3B)。产品纯度经凝胶过滤方法估算，分别为92％和62％。两相之间总的蛋白产率是88％，剩余12％为纤维蛋白，来自上层相(图1)。

为制备抗毒素，将沉淀重悬于1400mL去离子水中，持续搅拌1小时。免疫球蛋白和其他残留蛋白溶解后，加入辛酸。通常，在抗毒素的生产中辛酸的使用量为5-7％v/v。但在本实例中，因为含免疫球蛋白的部分来自ATPS系统，含有较少的杂蛋白，因而所需辛酸的量更少(1.75％v/v)。剧烈搅拌30分钟以促进沉淀。此步骤有双重作用；一是沉淀杂蛋白，二是灭活包膜病毒。然后在重力作用下微滤，回收溶液中的免疫球蛋白。到这一步，血浆中60％的抗蛇毒免疫球蛋白得到回收，纯度为99％(图1和2)。由于产品纯度很高，所以不需要额外的层析处理，将产品直接进行制剂。

将滤液用15kDa排阻滤膜对去离子水进行透析。也可通过超滤进行渗滤处理，代替透析。用20μm排阻滤膜对抗毒素进行纳米过滤处理，作为第三个抗病毒步骤。然后，用30kDa排阻滤膜超滤产物，将产物浓缩到中和活性所需的浓度规格(例如，三色矛头蝮为3mg毒素/mL抗毒素，中美巨蝮为3mg毒素/mL抗毒素，中美响尾蛇为2mg毒素/mL抗毒素，中美珊瑚蛇为0.5mg毒素/mL抗毒素)。产物进行制剂时，pH值为7，加入0.9％氯化钠w/v和0.25％苯酚w/v，0.22μm滤膜过滤消毒(图1)。按照10mL每份，将产品分装到无菌瓶内。

利用15kDa排阻膜将富含白蛋白的ATPS系统下层相对水透析，以除去来自系统的盐。也可通过超滤进行渗滤处理，代替透析。为除去杂蛋白，将白蛋白悬液进行热凝固处理，加入2.4g(0.012M)辛酸钠作为稳定剂，还需加入126mL95％乙醇v/v(9％v/v)。然后将混合物65℃水浴加热1小时。冷却至室温后，用0.5M HCl调整pH至5。在重力作用下微滤去除蛋白沉淀。如图1和3C所示，这一步产率为94％，纯度为91％。

为进一步提纯所获得的富白蛋白滤液，加入0.1％氯化钠，用0.5M氢氧化钠调整pH至8。然后将溶液通过带磺酸树脂的阳离子交换膜。回收游离部分，用0.5M HCl调整pH至7。作为第二个抗病毒步骤，将溶液通过20μm滤膜进行纳米过滤。用10kDa滤膜超滤，将产物浓缩至20g/dL，加入辛酸钠作为稳定剂，调整pH至7。产物用0.22μm滤膜过滤消毒，分装至无菌瓶内。然后60℃巴氏消毒法处理10小时以确保灭活病毒(图1)。

实例2从人血浆中生产无病毒注射级品质的免疫球蛋白和白蛋白

将1L人血浆通过ATPS系统分级以获取免疫球蛋白和白蛋白。应当注意的是，人血浆所含白蛋白的比例(52％)要高于免疫球蛋白(16％)。为形成二相系统，需加入150g氯化钠(15％w/v)，106g磷酸氢二钾，74g磷酸二氢钾(18％w/v)，60g聚乙二醇(6％w/v)和2.5mL抗病毒剂苯酚(0.25％v/v)。在本实例中，所用PEG的浓度要低于实例一中所使用的浓度，因为起始物料也即人血浆中免疫球蛋白比例较低，分级时所需的上层相也相对较少。分级步骤的其余操作均与实例一相同。如图4和5B所示，上层相中回收的免疫球蛋白产率为85％，纯度为42％，而下层相中白蛋白的产率为91％，纯度为80％(图4和6B)。系统总的蛋白产率为91％，其余部分为纤维蛋白。

两相分级之后，富含免疫球蛋白沉淀的上层相重悬于1400mL去离子水中，持续搅拌1小时。免疫球蛋白和其他蛋白溶解后，加入2％v/v的辛酸。回收的滤液中免疫球蛋白产率为70％，纯度为82％(图4)。

与实例一不同，辛酸沉淀后回收的滤液，需进行阴离子交换层析以进一步提纯免疫球蛋白溶液(图4)。为此需加入0.1％氯化钠，用0.5M HCl调整pH至5，然后将混合物通过带季铵树脂的阴离子交换膜。回收游离部分，用0.5M氢氧化钠调整pH至7。在这一部分中，起始物料中70％的免疫球蛋白得到回收，经凝胶过滤方法测得纯度为92％(图4和5C)。应当注意的是，辛酸沉淀和层析均能有效去除IgA和IgM。对获得的产物进行制剂、稳定和消毒的方法与实例一中处理抗毒素溶液的方法相同。

富含白蛋白的ATPS下层相中，白蛋白纯度为80％，回收产率为91％(图6B)，因此，透析后没有对溶液进行选择性热凝固处理。白蛋白的提纯是通过阳离子交换层析实现的，方法与实例一中处理马白蛋白的方法相同。此外，其余操作步骤同样与实例一相同。最终的产物纯度为90％，回收产率为91％(图4和6C)。

实例3抗蛇毒免疫免疫球蛋白纯度和产率的测定

对起始物料和纯化过程中每一步采集样品的纯度分析是通过在FPLC中凝胶过滤层析实现的(图2和3)。使用Superdex 200 10/300GL层析柱，用NaCl150mM，Tris-HCl 20mM，pH 7.5的缓冲液进行洗脱。保留时间为25±0.3分钟(对应免疫球蛋白分子量)的峰曲线下面积，与层析谱全部峰的曲线下总面积之比即为总免疫球蛋白的纯度。

为测定蛋白产率，对起始物料和纯化过程中每一步采集样品的总蛋白浓度通过一种改进的双缩脲法进行定量(参见Parvin,R.,Pande,S.V.,Venkitasubramanian,A.1965.“On the colorimetric Biuret Method of Protein Determination”.AnalyticalBiochemistry 12:219-229)。利用蛋白质测定获取的数据，FPLC法测定的纯度和每个样品的体积，免疫球蛋白的总量可以通过计算得出并以克为单位表示。最后，样品中总免疫球蛋白的量(g)，与起始物料中总免疫球蛋白的量(g)的比值即为蛋白产率。

此外，对起始物料和纯化过程中每一步采集的样品或在对三色矛头蝮毒素特异性抗体的定量中，需进行一项ELISA测定。为此，在96孔板每孔中加入100μL三色矛头蝮毒素的磷酸盐溶液(3μg/well)，室温孵育过夜。然后，按照100μL/孔加入不同稀释度的待测样品，每个稀释度三个重复孔，室温孵育1小时。洗板，然后每孔加入100μL过氧化物酶偶联的马抗IgG抗体溶液，孵育1小时。再次洗板后，加入底物(过氧化氢和邻苯二胺)显色。在酶标分析仪上测定492nm波长处的吸光度。通过根据已知浓度的抗毒素IgG制作的标准校正曲线，计算得出马抗毒素IgG的浓度并以g/L为单位表示。上述标准品是通过亲和层析法获得的，将初步纯化的超免疫马样品通过偶联三色矛头蝮毒素的琼脂糖层析柱纯化。

根据ELISA测得的浓度，以及每个抗毒素免疫球蛋白样品的体积，计算得出抗毒素免疫球蛋白的总量并以克为单位表示。最后，计算样品中抗毒素免疫球蛋白的量(g)与起始物料中抗毒素免疫球蛋白的量(g)的比值即得出蛋白产率。

实例4人免疫球蛋白纯度和产率的测定

对起始物料和纯化过程中每一步采集样品的产率测定方法与实例3相同。

利用一种放射免疫扩散(RID)试剂盒(Cromatest,Linear Chemicals SL,Barcelona,Spain)，来对IgG、IgA和IgM进行定量。将待测样品置于琼脂糖凝胶的孔内，使其扩散48小时。根据每个样品的浓度和体积，计算每种类型抗体的量并以克为单位表示。从以上数据中，根据RID测定的免疫球蛋白的量与样品中总蛋白量的比值，计算得出每个样品中IgG的纯度。此外，计算样品中IgG的量(g)与起始物料中IgG量(g)的比值即得出IgG的产率。

实例5白蛋白纯度和产率的测定

马白蛋白和人白蛋白的测定方法类似。通过在FPLC中凝胶过滤层析法测定白蛋白的纯度(图3和6)，详见前述。保留时间为28±0.3分钟(对应白蛋白分子量)的峰曲线下面积，与层析谱全部峰的曲线下总面积之比即为白蛋白的纯度。

蛋白产率的测定，详见前述，为样品中白蛋白的量(g)与起始物料中白蛋白的量(g)的比值。

Claims (31)

1.一种生产原料为病毒载量降低的血浆来源蛋白产品的注射级剂型的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.通过加入一种聚合物和至少一种盐分使双水相系统的起始物料分级；其中起始物料组分中所用的聚合物为分子量在1000-6000Da范围内的聚乙二醇；其中盐分可选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸铵和柠檬酸钠；

b.向双相系统中加入苯酚作为灭活病毒的第一步；

c.将系统的上下双相分级为双水相；

d.通过脂肪酸沉淀系统上层水相来纯化产品；

e.通过热凝方法来纯化系统下层水相中的产品；

f.在系统上下双相的纯化步骤中用两个步骤来去除形成的变性蛋白沉淀物；

ii.通过层析增加从上下双相中获得的产品纯度；

iii.将前一步骤中获得的产物进行纳米纯化以去除病毒颗粒；以及

i.对获得的产物进行制剂、稳定化和灭菌。

2.根据权利要求1中的方法，其中起始物料可选自由血浆、血清、通过Cohn法获得的组分或任何其它含有血浆来源蛋白产品的物料。

3.根据权利要求1中的方法，其中聚合物为分子量为3350Da的聚乙二醇。

4.根据权利要求1或3中的方法，其中聚乙二醇的浓度为6-15％w/v。

5.根据权利要求4中的方法，其中聚乙二醇的浓度为6-9％w/v。

6.根据权利要求1中的方法，其中盐分为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。

7.根据权利要求6中的方法，其中磷酸二氢钾和磷酸氢二钾浓度为10-20％w/v。

8.根据权利要求7中的方法，其中磷酸二氢钾和磷酸氢二钾浓度为15-20％w/v。

9.根据权利要求6-8任一项中的方法，其中磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的应用比例取决于所需的pH值。

10.根据权利要求1中的方法，其中一种盐分会对溶剂组分产生影响，但不 会对双相形成产生影响。

11.根据权利要求10中的方法，其中盐分为氯化钠。

12.根据权利要求11中的方法，其中氯化钠的浓度为5-20％w/v。

13.根据权利要求12中的方法，其中氯化钠的浓度为12-15％w/v。

14.根据权利要求1中的方法，其中分级步骤在pH值为5.5-7.5时进行。

15.根据权利要求14中的方法，其中分级步骤在pH值为6时进行。

16.根据权利要求1中的方法，其中首次病毒分级步骤使用的苯酚浓度为0.05-0.3v/v。

17.根据权利要求16中的方法，其中苯酚浓度为0.25％v/v。

18.根据权利要求1中的方法，其中双水相系统的上下双相分级是通过从安装和分级、安装和过滤、安装和弃上清或离心工艺中选择一个组合。

19.根据权利要求1中的方法，其中双水相系统的上层水相中包含产物的纯化是通过辛酸沉淀完成。

20.根据权利要求19中的方法，其中辛酸的浓度为1-6％v/v。

21.根据权利要求20中的方法，其中辛酸的浓度为1.5-2％v/v。

22.根据权利要求1中的方法，其中热凝在60°-70℃之间进行。

23.根据权利要求22中的方法，其中热凝在65℃下进行。

24.根据权利要求1中的方法，其中下层水相的选择性热凝在存在辛酸钠和乙醇时进行。

25.根据权利要求24中的方法，其中使用的辛酸钠混合物为0.012M，乙醇浓度为9％v/v。

26.根据权利要求1中的方法，其中双水相系统中上层水相中获得的产物纯化的最后一步中的层析步骤可选择离子交换层析、亲和层析、疏水交换层析。

27.根据权利要求1中的方法，其中双水相系统中上层水相中获得的产物纯化的最后一步中的层析步骤为离子交换层析。

28.根据权利要求1中的方法，其中纳米纯化采用20μm的排除滤膜进行。

29.根据权利要求1中的方法，其中产物的过滤采用22μm的排除滤膜进行。

30.根据权利要求1中的方法，所述“i.对获得的产物进行制剂、稳定化和灭菌。”中所述产物包括免疫球蛋白，其中免疫球蛋白可冷冻干燥或在制剂期间保持液体状态。

31.根据权利要求1中的方法，所述“i.对获得的产物进行制剂、稳定化和灭菌，”步骤后还包括：所述产物包括免疫球蛋白，其中免疫球蛋白经60℃下巴氏消毒10小时，作为包装后的病毒灭活步骤。