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CN114657242B - Gpr33基因在马尔尼菲篮状菌易感人群评估的应用 - Google Patents

Gpr33基因在马尔尼菲篮状菌易感人群评估的应用 Download PDF

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CN114657242B CN202210256670.4A CN202210256670A CN114657242B CN 114657242 B CN114657242 B CN 114657242B CN 202210256670 A CN202210256670 A CN 202210256670A CN 114657242 B CN114657242 B CN 114657242B
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gpr33
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Abstract

本发明涉及一种生物样本中GPR33基因作为生物标志物在开发和/或制备评估马尔尼菲篮状菌易感人群的产品中的应用，涉及生物技术和医学技术领域。本发明提供了一种生物样本中GPR33基因作为生物标志物在开发和/或制备评估马尔尼菲篮状菌易感人群的产品中的应用，为HIV阴性马尔尼菲篮状菌的易感人群的评估提供生物标志物。

Description

GPR33基因在马尔尼菲篮状菌易感人群评估的应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学技术领域，特别是涉及GPR33基因在马尔尼菲篮状菌易感人群评估的应用。
背景技术
马尔尼菲篮状菌感染是一种严重威胁患者生命的地方性致病真菌病，其易感人群逐渐由HIV阳性向HIV阴性患者转移，并且在HIV阴性肺部真菌感染中发病率上升最快，然而HIV阴性马尔尼菲篮状菌感染的易感因素和发病机制上不明确，常被误诊、漏诊，死亡率和复发率均较高。了解其发病机制是快速诊断和有效治疗该疾病的关键。
马尔尼菲篮状菌病常见于一些细胞免疫存在缺陷的患者。近些年来，越来越多的潜在免疫缺陷被发现与马尔尼菲篮状菌的易感性相关，其中基因突变导致的免疫缺陷较为显著，包括STAT1，CARD9，STAT3等基因突变。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种生物样本中GPR33基因作为生物标志物在开发和/或制备评估马尔尼菲篮状菌易感人群的产品中的应用，为HIV阴性马尔尼菲篮状菌的易感人群的评估提供生物标志物。
为了达到上述目的，本发明提供一种生物样本中GPR33基因作为生物标志物在开发和/或制备评估马尔尼菲篮状菌易感人群的产品中的应用。
本发明人在研究过程中发现，马尔尼菲篮状菌病患者体内的GPR33基因上的停止增益变体c.C418T可能导致蛋白质翻译提前终止并改变蛋白质的3D结构，因此可以通过检测生物样本中GPR33基因的序列，来判断提供生物样本的人员是否为马尔尼菲篮状菌的易感人群。
在其中一个实施例中，所述生物标志物为GPR33基因c.C418T突变。
本发明还提供了一种用于评估马尔尼菲篮状菌易感人群的产品，该产品包括：用于检测生物样本中GPR33基因的试剂。
在其中一个实施例中，所述用于检测生物样本中GPR33基因的试剂包括：提取生物样本中核酸的试剂、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和PCR产物测序试剂。
在其中一个实施例中，所述产品采用以下引物对进行PCR扩增：
rs1047034-F：GTCTGGTTGATATGGGAGT(SEQ ID NO:1)；
rs1047034-R：CAAGGCAGTGATCTGTTTC(SEQ ID NO:2)；
rs1292324632-F：GCCTTCCTCTTCTCCATCGA(SEQ ID NO:3)；
rs1292324632-R：GCTGGCCTCGTCAATTTCAT(SEQ ID NO:4)；
rs17097921-F：AAGTCACCTTTCCTTTACG(SEQ ID NO:5)；
rs17097921-R：TATGGGTGCTAAGATTCAA(SEQ ID NO:6)；
rs62011763-F：TCTCCATGAGCCTCAGTGTC(SEQ ID NO:7)；
rs62011763-R：GCCGCCTCTCCTGTTTTAAC(SEQ ID NO:8)；
rs62011763-NF：GGAAAGAGGTCTGTGCCA(SEQ ID NO:9)；
rs62011763-NR：TCATCCTGTTGCCGAAGC(SEQ ID NO:10)。在其中一个实施例中，所述产品采用以下引物对进行PCR产物测序：
rs1047034-R1：GAGTTTTATGCTGCTATTCT(SEQ ID NO:11)；
rs1292324632-R：GCTGGCCTCGTCAATTTCAT(SEQ ID NO:12)；
rs17097921-R1：CTCCCAACTTCAAGACAATCA(SEQ ID NO:13)；
rs62011763-R1：AACATCTGATTGTTTTCCA(SEQ ID NO:14)。在其中一个实施例中，其特征在于，所述生物样本为外周血。
本发明还提供了一种用于评估马尔尼菲篮状菌易感人群的系统，该系统包括：
分析装置：用于检测待评估对象的生物样本中GPR33基因，输入评估模型进行分析；
输出装置：用于输出上述分析结果。
在其中一个实施例中，所述分析的方法为：当所述生物样本中存在GPR33基因c.C418T突变时，则认为待评估对象为马尔尼菲篮状菌易感人群。
本发明还提供了一种评估马尔尼菲篮状菌易感人群的方法，该方法包括以下步骤：收集外周血，提取核酸，检测GPR33基因。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的生物样本中GPR33基因作为生物标志物在开发和/或制备评估马尔尼菲篮状菌易感人群的产品中的应用，为HIV阴性马尔尼菲篮状菌的易感人群的评估提供生物标志物，为HIV阴性马尔尼菲篮状菌病的发病机制的研究提供可靠依据，未来可能用于评估该病易感人群并作为治疗靶点。
附图说明
图1为实施例1中筛选得到生物标志物GPR33基因的流程图，其中，图1的a为患者选择流程图，图1的b为招募了53名HIV阴性TM感染患者，收集了他们的血液样本并进行了全基因组测序，并将GATK的联合调用模块(最佳实践)应用于预处理读取文件，图1的c为过滤了八个约束的变体，图1的d为承载四种突变体的基因的染色体概述；
图2为实验例中rs1047034的琼脂糖凝胶电泳图，M从上到下依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp；
图3为实验例中rs1292324632+rs1310028733的琼脂糖凝胶电泳图，M从上到下依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp；
图4为实验例中rs17097921的琼脂糖凝胶电泳图，M从上到下依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp；
图5为实施例1中GPR33的氨基酸3D结构图和实验例中GPR33基因的Sanger测序峰图，其中，图5的a为GPR33(UniPort ID:Q49SQ1)的野生型，具有七个α-螺旋，特别是α3和α4形成二硫键，图5的b为GPR33(R140X)的突变体，其中突变位点后的结构由单线绘制，图5的c为突变位点140R的近距离观察，虚线为氢键，图5的d为通过sanger测序证实了GPR33上的杂合突变c.C418T，图5的e和f为sanger测序证实GPR33上的纯合突变c.C418T。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
试剂、材料、设备来源：
Qiagen FlexiGene DNA试剂盒(Qiagen)、Qiagen MiRNeasy试剂盒(Qiagen)、SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific)、BGI 2xSuper PCR Mix(with dye)5ML(5支/包，北京六合华大基因科技有限公司)、BGI D2000 Plus DNA Ladder(1250ul/包，北京六合华大基因科技有限公司)、磁珠法全血/唾液/口腔基因组提取试剂盒(100次/盒，武汉纳磁生物科技有限公司)、琼脂糖(100g/瓶，太阳马)、磁珠(10ml/瓶，硕美)。
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
实施例1
筛选得到生物标志物GPR33基因。
筛选得到生物标志物GPR33基因的流程如图1所示。
1、根据纳入排除标准入组53例HIV阴性马尔尼菲篮状菌感染患者。
在2018年1月至2021年1月之间，根据以下纳入标准，借助一项前瞻性多中心队列研究从全国7个分中心纳入58例HIV阴性马尔尼菲篮状菌感染患者。
纳入标准：(1)实验室检查明确HIV阴性；(2)有马尔尼菲篮状菌感染的临床或影像学表现；(3)在以下标本中分离出马尔尼菲蓝状菌或有相应的病理变化：痰，气道分泌物，肺泡灌洗液，肺，胸膜渗出，骨髓涂片，皮肤，淋巴结等，包括①acid-Schiff或Wright’s染色后可见圆形或椭圆形，有明显横隔；②从培养物中分离病原体；③病理检查示TM感染伴化脓性肉芽肿、中央坏死和大量单核巨噬细胞浸润；或④宏基因组学二代测序(mNGS)显示抗真菌治疗后TM和症状和体征得到改善。
根据以下排除标准：患有HIV阳性或自身免疫性疾病、癌症或免疫缺陷的患者；或在过去3个月内接受过免疫抑制药物。
最终入组53例患者(如图1中的a所示)。该研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。本研究经广州医科大学第一附属医院伦理委员会批准(参考编号2019026)，并获得参与者的书面知情同意。
该研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。本研究经广州医科大学第一附属医院伦理委员会批准(参考编号2019026)，并获得参与者的书面知情同意
2、样本收集和运输。
(1)材料：乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管。
(2)实验方法：53名HIV阴性马尔尼菲篮状菌病患者经消毒皮肤后，从肘静脉抽取静脉血5ml至抗凝真空采血管中。样本在2℃和8℃之间储存，直到准备好运送到广州金域诊断集团有限公司(中国广州)的标准化和认可实验室。所有样本都储存在-80℃以进行DNA提取。
3、DNA提取和测序。
(1)材料：Qiagen FlexiGene DNA试剂盒、Qiagen MiRNeasy试剂盒、SuperScriptVILO cDNA合成试剂盒、Agilent 2100、BGISEQ-50/MGISEQ-2000平台。
(2)实验方法。
①提取基因组DNA：使用Qiagen FlexiGene DNA试剂盒从EDTA血液中提取基因组DNA。
②逆转录聚合酶链反应(PCR)：使用Qiagen MiRNeasy试剂盒从新鲜分离的PBMC中提取RNA。
③构建cDNA文库：使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒逆转录成cDNA。使用DNA片段化、末端修复、接头连接和PCR扩增构建DNA文库。Agilent 2100用于DNA文库的质量控制。
③测序：汇集了合格的文库，并使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000平台制备和测序DNA纳米球(DNB)。
4、基因研究。
(1)方法。
通过Burrows-Wheeler-Alignment(BWA)工具对人类参考基因组组装GRCh38进行测序读取比对；使用Picard软件排除PCR重复。GATK最佳实践发现了小的变异，其中在应用VQSR的质量控制后，仍有175,537,409个高质量的变异。在本发明中，本发明人关注已识别的1,302,281个SNP和271,749个插入缺失。
使用ANNOVAR进一步注释感兴趣的突变体。其中的等位基因频率使用以下数据库进行注释：1000基因组计划(1KGP)、外显子组聚合联盟(ExAC)、基因组聚合数据库(gnomAD)、NHLBI-ESP计划与6500个外显子组(ESP6500)和中国代谢分析项目(中国地图)。
首先关注影响已知具有免疫功能基因的变异。从ImmPort数据库(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29485622/)中策划了一个包含1793个基因的免疫基因组合。进一步要求本发明中的所有患者共享该组合选择的突变体。另一方面，对所有突变体进行了硬过滤，以识别具有或不具有已知免疫功能的基因上的新突变体。在硬过滤过程中，本发明人保留了满足以下约束的突变体：①外显子或剪接突变体；②无义或错义突变体；③没有与重复或片段重复的重叠；④由所有样本共享；⑤1000GP中等位基因频率≤0.01％或未报道；⑥gnomAD中的等位基因频率≤0.01％或未报告；⑦ESP6500等位基因频率≤0.01％或未报告；⑧ChinaMAP等位基因频率≤0.01％或未报道。这里的约束①-③用于保留最有可能影响基因功能的变体。⑤至⑧的限制旨在识别与该疾病相关的罕见或新型变异，尤其是在中国人群中。
过滤后留下的变异被认为具有致病潜力，需要进一步的人工调查。根据美国医学遗传学会和分子病理学协会(ACMG/AMP)的指导方针，使用InterVar软件和ClinVar的临床报告评估了四种突变体的致病性。对可能合理的突变体进行了十种有害性预测算法(如SIFT、PolyPhen2和LRT)的组合，并通过进化速率分析(GERP)分数和组合注释依赖消耗(CADD)分数进一步研究变体对蛋白质功能的潜在影响。
(2)结果。
①经过8个条件过滤，最终得到分布于3个染色体的4个突变体(如图1中的b-d所示)。
②在免疫基因组合中识别出可能致病的突变体。
通过上述免疫基因组，从251个免疫相关基因的ClinVar或InterVar中鉴定出302个没有良性报告的变体。这些变体包括三个插入缺失、两个停止增益变体、一个开始损失变体和296个非同义变体。(MCC、TRHDE、ISCU上三个插入缺失的生物学关系)。SLC22A24上的停止增益变体和DENND3上的开始损失变体分别具有负的PhyloP分数-0.076和-2.88，这表明这两个变体位于快速进化的位置而不是保守的位置，因此不太可能是致病的。另一方面，GPR33基因上的停止增益变体c.C418T的GERP评分为3.15，表明与进化的中性速率相比，该变体的位点经历的突变少3.15个。通过检查蛋白质GPR33基因的拓扑结构，本发明人发现了一个由七个α-螺旋组成的跨膜结构域，它负责跨细胞膜的信号转导。对3D结构的进一步研究显示，二硫键之间存在二硫键，作为共价键连接多肽(如图5中的a-c所示)。然而，突变体p.R140X位于七个α-螺旋的核心，损失了α-螺旋以及和之间的二硫键。此外，ARG-140显示出与多个氢键的强烈相互作用并通过形成多个氢键，这些氢键随着停止增益突变R140X的形成而丧失。通过预测该变体的功能，GPR33基因上的停止增益变体c.C418T可能导致蛋白质翻译提前终止并改变蛋白质的3D结构。
实验例
通过Sanger测序验证GPR33基因突变。
1、材料：BGI 2xSuper PCR Mix(with dye)、BGI D2000 Plus DNA Ladder、磁珠法全血/唾液/口腔基因组提取试剂盒、琼脂糖、磁珠、29名患者的外周血单个核细胞冻存标本。
2、实验方法。
(1)核酸提取：参考核酸提取操作说明书进行操作。
(2)PCR扩增。
①引物信息：根据检测信息，查找参考序列，用Primer Premier 5软件进行引物设计，引物信息如下表所示。
表1引物信息
Figure BDA0003548847410000061
②扩增体系和条件：如下表所示。
表2 PCR扩增反应体系和条件
Figure BDA0003548847410000062
Figure BDA0003548847410000071
(3)电泳鉴定。
方法：3μL PCR产物进行1.0％的琼脂糖凝胶检测，观察条带性状。
结果：如图2-4所示。
(4)PCR产物纯化。
PCR产物纯化按照磁珠纯化标准操作流程操作，利用磁珠能够吸附或者释放带电荷物质的原理，在高盐低pH溶液吸附DNA，在低盐高pH溶液释放DNA，从而达到分离提纯DNA产物的目的。
(5)测序。
将纯化后的PCR产物进行上机检测。
(6)数据分析。
数据下机后更名分类，然后上传系统，数据从系统下载下来后使用phred\phrap软件进行SNP分析并导出分析结果。
3、实验结果。
在29名患者中，26个患者出现GPR33基因纯合突变，3个患者出现GPR33基因杂合突变，结果如图5中的d-f所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州医科大学附属第一医院
广州呼吸健康研究院
<120> GPR33基因在马尔尼菲篮状菌易感人群评估的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtctggttga tatgggagt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaggcagtg atctgtttc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccttcctct tctccatcga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctggcctcg tcaatttcat 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagtcacctt tcctttacg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatgggtgct aagattcaa 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctccatgag cctcagtgtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccgcctctc ctgttttaac 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggaaagaggt ctgtgcca 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcatcctgtt gccgaagc 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagttttatg ctgctattct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctggcctcg tcaatttcat 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctcccaactt caagacaatc a 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacatctgat tgttttcca 19

Claims (7)

1.检测生物样本中GPR33基因c.C418T突变的试剂在制备评估HIV阴性马尔尼菲篮状菌易感人群的产品中的应用，所述应用包括：当所述生物样本中存在GPR33基因c.C418T突变时，则认为待评估对象为HIV阴性马尔尼菲篮状菌易感人群。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：用于检测生物样本中GPR33基因c.C418T突变的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用于检测生物样本中GPR33基因c.C418T突变的试剂包括：提取生物样本中核酸的试剂、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和PCR产物测序试剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：采用以下引物对进行PCR扩增：
rs17097921-F：AAGTCACCTTTCCTTTACG；
rs17097921-R：TATGGGTGCTAAGATTCAA。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：采用以下引物进行PCR产物测序：
rs17097921-R1：CTCCCAACTTCAAGACAATCA。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述生物样本为外周血。
7.一种用于评估HIV阴性马尔尼菲篮状菌易感人群的系统，其特征在于，该系统包括：
分析装置：用于检测待评估对象的生物样本中GPR33基因c.C418T突变，输入评估模型进行分析；所述分析的方法为：当所述生物样本中存在GPR33基因c.C418T突变时，则认为待评估对象为HIV阴性马尔尼菲篮状菌易感人群；
输出装置：用于输出上述分析结果。
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