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CN114641561A - 含有包含扩增和富集的超活化细胞因子杀伤t细胞群体的细胞产物的组合物及其制备方法 - Google Patents

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CN114641561A CN201980088899.8A CN201980088899A CN114641561A CN 114641561 A CN114641561 A CN 114641561A CN 201980088899 A CN201980088899 A CN 201980088899A CN 114641561 A CN114641561 A CN 114641561A
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Abstract

本公开描述了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和含扩增和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞群体的细胞产物；以及制造所述细胞产物的方法。

Description

含有包含扩增和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞群体的细 胞产物的组合物及其制备方法
相关申请
本申请要求2018年11月13日提交的美国临时申请号62/760,077的权益和优先权，所述临时申请的内容明确地以引用的方式整体并入本文。
背景技术
淋巴细胞是一种参与免疫系统调节的白细胞。淋巴细胞在淋巴系统中更为常见，包括B细胞、T细胞、杀伤T细胞和自然杀伤(NK)细胞。有两大类淋巴细胞，即T细胞和B细胞。T细胞负责细胞介导的免疫，而B细胞负责体液免疫(与抗体有关)T细胞之所以如此命名，是因为这些淋巴细胞在胸腺中成熟，而B细胞在骨髓中成熟。B细胞产生与病原体结合以使其被破坏的抗体。CD4+(辅助)T细胞协调免疫反应。CD8+(细胞毒性)T细胞和自然杀伤(NK)细胞能够杀伤例如被病毒感染或展示出抗原序列的人体细胞。
对入侵病原体的免疫反应需要先天免疫的成功活化，从而通知后续适应性免疫反应的发展。
自然杀伤T细胞(NKT)是特化T细胞的异质亚类(Brennan等人，Nat RevImmunol.2013年2月；13(2):101-17)。这些细胞表现出对抗原暴露快速反应的先天细胞样特征，并与适应性细胞的抗原识别精度和多种效应子反应相结合(Salio等人，Annu RevImmunol.2014；32():323-66)。与传统T细胞一样，NKT细胞经历胸腺发育和选择并具有T细胞受体(TCR)来识别抗原(Berzins等人，Immunol Cell Biol.2004年6月；82(3):269-75)。
TCR基因的多样性是通过胸腺T细胞发育期间V和J基因区段的重排而产生的。(Makino,Y.等人(1993)J.Exptl Med.177:1399-1408)。TCR V和J基因区段与Ig基因一样，具有重组信号，其中由12/23bp间隔区隔开的七聚体和九聚体序列两侧为种系V和J基因区段。同前。
自然杀伤T细胞(NKT)代表T淋巴细胞的小群体，该小群体由αβT细胞受体(TCR)和NK细胞的一些谱系标志物的表达所定义。然而，与传统T细胞不同，NKT细胞表达的TCR识别由保守的非多态性MHC 1类分子CD1d呈递的脂质抗原(Godfrey等人，Nat Immunol.2015年11月；16(11):1114-23)。除TCR外，NKT细胞还具有与先天细胞诸如NK和先天淋巴样细胞相似的细胞因子(诸如IL-12、IL-18、IL-25和IL-23)的受体(Cohen等人，Nat Immunol.2013年1月；14(1):90-9)。即使在不存在TCR信号的情况下，这些炎性细胞因子的稳态表达也可以激活这些细胞因子受体。因此，NKT细胞可以合并来自TCR介导的刺激和炎性细胞因子两者的信号，以表现出一系列细胞因子的及时释放(Kohlgruber等人，Immunogenetics.2016年8月；68(8):649-63)。这些细胞因子又可以调节肿瘤微环境(TME)中存在的不同免疫细胞，从而影响宿主对癌症的免疫反应。
如表1所示，有许多亚型的NKT细胞，所述亚型可以通过其T细胞受体(TCR)的用法、细胞因子的产生、特定表面分子的表达和反应性来确定。
表1
Figure BDA0003160278680000021
Figure BDA0003160278680000031
I型NKT细胞
广义地讲，CD1d限制的NKT细胞可根据其TCR多样性和抗原特异性分为两个主要的亚类。NKT细胞最广泛表征的亚型是I型或恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)(Matsuda等人，Curr Opin Immunol,20:358-68,2008)。I型(恒定)NKT细胞(iNKT细胞)因其有限的TCR库而如此命名，表达的半恒定TCR(iTCR)α链(小鼠中的Vα14-Jα18，人类中的Vα24-Jα18)与异质Vβ链库(小鼠中的Vβ2,7或8.2及人类中的Vβ11)配对(Brennan等人，Nat Rev Immunol.2013年2月；13(2):101-17；Salio等人，Annu Rev Immunol.2014；32():323-66)。I型NKT细胞的原型抗原是半乳糖神经酰胺(α-GalCer或KRN 7000)，其是从海上海绵中作为抗肿瘤筛选的一部分分离出来的(Kawano等人，Science.1997年11月28日；278(5343):1626-9)α-GalCer是I型NKT细胞的有效活化剂，诱导它们释放大量干扰素-γ(IFN-γ)，干扰素-γ有助于活化CD8+ T细胞和抗原呈递细胞(APC)(Kronenberg,Nat Rev Immunol.2002年8月；2(8):557-68)。用于研究I型NKT细胞的主要技术包括使用载有CD1d的α-GalCer四聚体对I型NKT细胞进行染色和鉴定，施用α-GalCer以活化和研究I型NKT细胞的功能，以及最后使用CD1d缺陷型小鼠(缺乏I型和II型NKT两者)或Jα18缺陷型小鼠(仅缺乏I型NKT)(Berzins等人，Immunol Cell Biol.2004年6月；82(3):269-75)。已经报道，Jα18缺陷型小鼠除了在Traj18基因区段中具有缺失(对于I型NKT细胞发育是必需的)外，还表现出因转基因对Traj18上游几个Jα区段重排的影响而引起总体TCR较低，从而使得从Jα18缺陷型小鼠获得的数据的解释变复杂(Bedel等人，Nat Immunol.2012年7月19日；13(8):705-6)。为了克服这个缺点，已经产生了缺乏I型NKT细胞而保持总体TCR库的Jα18缺陷型小鼠的新品系，以促进关于I型NKT细胞的进一步研究(Chandra等人，Nat Immunol.2015年8月；16(8):799-80)。可以基于CD4和CD8的表面表达将I型NKT细胞进一步细分为CD4+和CD4-CD8-(双阴性或DN)亚类，以及在人类中发现的一小部分CD8+细胞(Bendelac等人，Science.1994年3月25日；263(5154):1774-8；Lee等人，J Exp Med.2002年3月4日；195(5):637-41)。I型NKT细胞存在于小鼠和人类中的不同组织中，但是在小鼠中的频率更高(Arrenberg等人，J Cell Physiol.2009年2月；218(2):246-50)。
I型NKT细胞对自身脂质和外源脂质均具有双重反应性。即使处于稳定状态，I型NKT细胞也具有活化/记忆表型(Bendelac等人，Annu Rev Immunol.2007；25():297-336；Godfrey等人，Nat Immunol.2010年3月；11(3):197-206)。
已经描述了类似于常规T细胞的Th1、Th2、Th17和TFH亚类的NKT细胞的不同功能的亚类。这些亚类表达其常规T细胞对应物的相应细胞因子、转录因子和表面标志物(Lee等人，Immunity.2015年9月15日；43(3):566-78)。I型NKT细胞具有独特的发育程序，该程序受多种转录因子调节(Das等人，Immunol Rev.2010年11月；238(1):195-215.)。在转录上，I型NKT细胞发育和活化的记忆表型的关键调节因子之一是转录因子早幼粒细胞白血病锌指(PLZF)。实际上，PLZF缺陷型小鼠显示出I型NKT细胞和细胞因子产生的显著效率(Kovalovsky D等人，Nat Immunol(2008)9:1055–64.10.1038/ni.164；Savage AK等人，Immunity(2008)29:391–403.)。已知会影响I型NKT细胞分化的其它转录因子是c-Myc(Dose等人，Proc Natl Acad Sci U SA.2009年5月26日；106(21):8641-6)、RORγt(Michel等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2008年12月16日；105(50):19845-50)、c-Myb(Hu等人，NatImmunol.2010年5月；11(5):435-41)、Elf-1(Choi等人，Blood.2011年2月10日；117(6):1880-7)和Runx1(Egawa等人，Immunity.2005年6月；22(6):705-16)。此外，控制常规T细胞分化的转录因子，诸如Th1谱系特异性转录因子T-bet和Th2特异性转录因子GATA-3，也可以影响I型NKT细胞发育(Kim等人，J Immunol.2006年11月15日；177(10):6650-9；Townsend等人，Immunity.2004年4月；20(4):477-94)。除了转录因子之外，SLAM相关蛋白(SAP)信号传导途径也可以选择性地控制I型NKT细胞的扩增和分化(Nichols等人，Nat Med.2005年3月；11(3):340-5)。已证实I型NKT细胞对自身和外源的α和β连接的鞘糖脂(GSL)、神经酰胺和磷脂有反应(Macho-Fernandez等人，Front Immunol.2015；6:362)。已经报道，I型NKT细胞主要有助于增强针对肿瘤的有效免疫反应(McEwen-Smith等人，Cancer Immunol Res.2015年5月；3(5):425-35；Robertson等人，Front Immunol.2014；5():543；Ambrosino等人，JImmunol.2007年10月15日；179(8):5126-36)。
II型NKT细胞
II型NKT细胞，也称为多样化或变异型NKT细胞，是CD1d限制性T细胞，其表达更多样化的α-βTCR而不识别α-GalCer(Cardell等人，J Exp Med.1995年10月1日；182(4):993-1004)。与I型NKT细胞相比，II型NKT细胞是人类中频率更高的主要亚类。由于不存在鉴定所有II型NKT细胞的特异性标志物和激动性抗原，这些细胞的表征一直具有挑战性。用于表征II型NKT细胞的不同方法包括比较Jα18-/-(仅缺乏I型NKT)和CD1d-/-(缺乏I型和II型两种NKT)小鼠之间的免疫反应，使用24只αβTCR转基因小鼠(其从II型NKT细胞杂交瘤VIII24过表达Vα3.2/Vβ9TCR)，使用Jα18缺陷型IL-4报告基因小鼠模型，用载有抗原的CD1d四聚体染色并评估与II型NKT杂交瘤的结合[在Macho-Fernandez,Front Immunol.2015；6:362)中有综述]。
在小鼠中对于自体糖脂反应性II型NKT细胞鉴定的第一个主要抗原是髓磷脂来源的糖脂硫脑苷脂(Arrenberg等人，J Cell Physiol.2009年2月；218(2):246-50；Jahng等人，J Exp Med.2001年12月17日；194(12):1789-99)。随后，已经报道了硫脑苷脂和溶血硫脑苷脂反应性的CD1d限制性人类II型NKT细胞((Shamshiev等人，J.Exp.Med.2002；195:1013–1021；Blomqvist等人，Eur J Immunol.2009年7月；39(7):1726–1735.))。硫脑苷脂特异性II型NKT细胞主要表现出寡克隆TCR库(Vα3/Vα1-Jα7/Jα9和Vβ8.1/Vβ3.1-Jβ2.7)(Arrenberg等人，J Cell Physiol.2009年2月；218(2):246-50)。已证实其它自体糖脂诸如βGlcCer和βGalCer会活化鼠类II型NKT细胞(Rhost等人，Scand J Immunol.2012年9月；76(3):246-55；Nair等人，Blood.2015年2月19日；125(8):1256-71)。据报道，鼠类和人类II型NKT细胞识别在Gaucher病(GD)中积聚的两种主要鞘脂、β-葡糖基神经酰胺(βGlcCer)及其脱酰基产物即葡糖基神经鞘氨醇(Nair等人，Blood.2015年2月19日；125(8):1256-71)。在早期研究中，证实溶血磷脂酰胆碱(LPC)，即在骨髓瘤患者中显著上调的溶血磷脂是人类II型NKT细胞的抗原(Chang等人，Blood.2008年8月15日；112(4):1308-16)。
II型NKT细胞可因其在人类对比小鼠中的优势，TCR结合和独特的抗原特异性区别于I型NKT细胞(J Immunol.2017年2月1日；198(3):1015-1021)。
II型NKT TCR硫脑苷脂/CD1d复合物和I型NKT TCR-α-GalCer/CD1d复合物的晶体结构提供了对NKT TCR识别抗原的机制的见解(Girardi等人，Immunol Rev.2012年11月；250(1):167-79)。发现I型NKT TCR结合主要涉及α链的刚性、平行构型的α-GalCer/CD1d复合物。确定在对α-GalCer/CD1d复合物的检测中涉及I型NKT细胞的半iTCR的CDR2β、CDR3α和CDR1α环内的关键残基(Pellicci等人，Immunity.2009年7月17日；31(1):47-59)。另一方面，II型NKT TCR主要经由其CDR3β环而不是CDR3α环以反平行方式接触其配体，该反平行方式与一些常规MHC限制性T细胞中观察到的结合非常相似(Griardi等人，Nat Immunol.2012年9月；13(9):851-6)。硫脑苷脂反应性TCR分子的三元结构揭示CDR3α环主要接触CD1d，而CDR3β决定了硫脑苷脂抗原的特异性(Patel等人，Nat Immunol.2012年9月；13(9):857-63)。II型NKT TCR与类似于TCR-肽-MHC复合物的其抗原的结合的灵活性与更大的TCR多样性和对广泛配体应答的能力相调谐。
然而，尽管两个亚类之间存在惊人差异，但是也已经报道了两个亚类之间的相似性。例如，I型和II型NKT细胞都是自反应性的，并且其发育依赖于转录调节因子PLZF和SAP(Rhost等人，Scand JImmunol.2012年9月；76(3):246-55)。虽然，许多II型NKT细胞似乎像I型NKT细胞一样具有活化/记忆表型，在其它研究中，II型NKT细胞的亚类也展示出原初T细胞表型(CD45RA+、CD45RO-、CD62高和CD69-/低)(Arrenberg等人，Proc Natl Acad Sci U SA.2010年6月15日；107(24):10984-9)。II型NKT细胞主要在识别脂质/CD1d复合物后通过TCR信号传导活化的(Roy等人，J Immunol.2008年3月1日；180(5):2942-50)，不依赖于TLR信号传导或IL-12的存在(Zeissig等人，Ann N Y Acad Sci.2012年2月；1250:14-24)。
T细胞发育
当T细胞在胸腺中发育时，TCR信号会在细胞通过各个成熟阶段时提供关键的检查点。(参见Huang,E.Y.等人，J.Immunol.(2003)171:2296-2304)。例如，TCR前信号对于最不成熟的胸腺细胞亚类(称为双阴性(DN))发育为表达CD4和CD8的双阳性(DP)胸腺细胞是必需的。同前。CD3、前Tα和功能性重排的TCRβ链的组装和表面表达介导了该检查点，称为β选择。同前。成功的TCR前信号传导后，DN胸腺细胞经历许多轮分裂和多次表型变化。同前。除了编码TCR前组分的基因外，也间接影响TCR前信号传导或是DN向DP转变期间所看到的许多细胞变化所需要的许多其它基因调节成熟。同前。
I型NKT细胞发育
在小鼠和人类中，I型NKT细胞在发育期间在双阳性(CD4+CD8+，DP)胸腺细胞阶段从常规T细胞中分离出来，与TCRαβ表达一致(Godfrey DI,Berzins SP Nat RevImmunol.2007年7月；7(7):505-18)。I型NKT细胞使用的经典TCRα的生成被广泛地认为是随机事件，因为尽管定义恒定Vα14-Jα18重排的氨基酸从未改变，但测序分析揭示用于编码这些氨基酸的核苷酸酸是多样性的(Lantz O,Bendelac A JExp Med.1994年9月1日；180(3):1097-106)。由于TCRα基因座中重组事件的结构限制，许多Vα和Jα基因区段可随其在基因座中的相对位置而变得易于重组。因此，Vα。14基因区段仅在出生前24–48小时窗口内开始与Jα18重排(Hager E.等人J Immunol.2007年8月15日；179(4):2228-34)。这解释了在胸腺中相对较晚出现NKT细胞，并且与在常见T细胞祖细胞库内随机产生规范性Vα14-Jα18重排一致。此外，最早鉴定出的NKT细胞前体的频率估计为每106个胸腺细胞中有1个细胞(Benlagha K.等人J Exp Med.2005年8月15日；202(4):485-92)。总之，这些数据支持Vα14-Jα18重排以非常低的频率随机发生的看法。
与常规T细胞一样，I型NKT细胞发育需要自我识别。限制元件CD1d由胸腺中的DP胸腺细胞和上皮细胞两者表达。然而，早期研究揭示与驱动常规T细胞的选择的上皮细胞不同，I型NKT细胞是在DP阶段由表达CD1d的DP细胞自身选择的。假设此类选择模式将I型NKT细胞的独特发育程序赋予给所选择的胸腺细胞。最近，证明DP-DP突触上的同型相互作用产生“第二信号”，其是由信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM)家族的至少两个成员(Slamf1[SLAM]和Slamf6[Ly108])[8λλ–10λλ]的亲同种受体的协同接合介导的。此类接合导致先前被认为对I型NKT细胞谱系的扩增和分化至关重要的衔接子SLAM相关蛋白(SAP)和Src激酶Fyn的下游募集(Godfrey DI，2007)。
一旦正向选择了I型NKT细胞，它们就会在胸腺中扩增并经过精心策划的成熟过程，最终导致获得其活化的NK样表型。该过程依赖于细胞因子受体、信号转导分子(例如Fyn、SAP)、转录因子(例如NFκB、T-bet、Ets1、Runx1、RORγ、Itk、Rlk、AP-1)(参见GodfreyDI,2007的综述)以及共刺激分子(诸如CD28和ICOS)的恰当表达(Hayakawa等人，JImmunol.2001年5月15日；166(10):6012-8；Akbari等人，J Immunol.2008年4月15日；180(8):5448–5456)。大多数I型NKT细胞在未成熟阶段离开胸腺(定义为不存在NK受体诸如NK1.1的表达)，并在外周完成其终末成熟(Benlagha K.等人，Science.2002年4月19日；296(5567):553-5；McNab FW等人，J Immunol.2005年9月15日；175(6):3762-8)。然而，外周器官中这些NK1.1-I型NKT细胞中有相当大的一部分未获得NK标志物的表达，实际上代表功能上与其NK1.1+胸腺对应物不同的成熟细胞(McNab等人，J Immunol.2007；179:6630–6637)。
I型NKT细胞从胸腺排出外周需要通过胸腺基质细胞表达的LTβ受体进行的淋巴毒素(LT)αβ信号传导(Franki AS等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2006年6月13日；103(24):9160-5)。此类信号传导转而调节胸腺髓质趋化因子的分泌(Zhu M.等人，JImmunol.2007年12月15日；179(12):8069-75)。建立I型NKT细胞在外周组织中的组织驻留需要I型NKT细胞表达鞘氨醇1-磷酸1受体(S1P1R)(Allende ML等人，FASEB J.2008年1月；22(1):307-15)和用于肝脏定位的CxCR6的更特异性表达(Geissmann F.等人，PLoSBiol.2005年4月；3(4):e113)。
然而，许多I型NKT细胞留在胸腺中，在那里成熟为NK1.1+表型，并成为长期驻留者(Berzins SP等人，J Immunol.2006年4月1日；176(7):4059-65)。在不同发育阶段负责I型NKT细胞从胸腺的输出/保留的机制是未知的。
I型NKT细胞活性
已经证实I型NKT细胞在免疫反应期间具有许多不同的活性。它们不仅具有迅速而稳健地产生细胞因子和趋化因子的能力，而且正如它们的名字所暗示的那样，它们还具有杀伤其它细胞的能力。另外，已经证实它们会影响许多其它免疫细胞的行为。在本节中，描述了已经归因于I型NKT细胞的众多功能特性。
细胞因子和趋化因子的产生
I型NKT细胞最初被鉴定为具有NK标志物的罕见T细胞群体，该细胞群体具有在小鼠中注射抗CD3抗体后迅速而稳健地产生IL-4的独特能力。后来的研究揭示，虽然这种稳健的IL-4产生是I型NKT细胞的特征，但它不是I型NKT细胞可以产生的唯一细胞因子。已证实I型NKT细胞会产生IFN-γ和IL-4，以及IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-21、TNF-α、TGF-β和GM-CSF(Bendelac A.等人，Annu Rev Immunol.2007；25():297-336；Gumperz JE等人，J Exp Med.2002年3月4日；195(5):625-36)。还已知I型NKT细胞会产生趋化因子阵列(Chang YJ等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2007年6月19日；104(25):10299-304)。
施用α-GalCer抗原后，I型NKT细胞在体内快速双重产生IL-4和IFNγ已成为I型NKT细胞的标志特征。实际上，在体内暴露于抗原的2小时内，来自原初小鼠的离体I型NKT细胞的细胞内分析揭示肝脏中的大多数I型NKT细胞产生IL-4和IFNγ两者(Matsuda JL等人，J Exp Med.2000年9月4日；192(5):741-54)。尚不清楚活化时来自未敏化小鼠的I型NKT细胞如何如此迅速地产生细胞因子。然而，观察到静息I型NKT细胞具有高水平的IL-4和IFNγmRNA提供了一种潜在的机制(Matsuda JL等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2003年7月8日；100(14):8395-400；Stetson DB等人，J Exp Med.2003年10月6日；198(7):1069-76)。
I型NKT细胞还在转录水平上调节其细胞因子的产生。已知调节常规T细胞中的细胞因子基因转录的几种转录因子(T-bet、GATA-3、NFκB]、c-Rel、NFAT、AP-1、STAT、Itk)也牵涉于I型NKT细胞中。例如，I型NKT细胞似乎同时表达T-bet和GATA-3转录因子，从而导致IFNγ和IL-4mRNA两者的转录。这与常规T细胞不同，其中已经证实T-bet会阻抑GATA-3的表达，反之亦然。
I型NKT细胞的细胞溶解活性
I型NKT细胞表达高水平的颗粒酶B、穿孔素和FasL，与这些细胞的细胞溶解功能一致。体外测定证明，I型NKT细胞具有以CD1d依赖性方式杀伤抗原致敏的APC的能力。另外，几种小鼠模型已经揭示，I型NKT细胞在肿瘤监测和肿瘤排斥中起重要作用。在一些肿瘤模型中，I型NKT细胞产生的IFNγ有助于NK细胞的活化，进而引发稳健的抗肿瘤反应(Crowe NY等人，J Exp Med.2002年7月1日；196(1):119-27)。类似地，已经证实I型NKT细胞会识别并应答细菌抗原并参与细菌清除(Mattner等人，Nature.2005年3月24日；434(7032):525-9；Ranson等人，J Immunol.2005年7月15日；175(2):1137-44)。
其它免疫细胞的调节
早期研究证明，I型NKT细胞来源的细胞因子可以活化其它几种细胞类型，包括NK细胞、常规CD4+和CD8+ T细胞、巨噬细胞和B细胞，并募集骨髓树突细胞(Kronenberg M,Gapin L Nat Rev Immunol.2002年8月；2(8):557-68)。I型NKT细胞还可以通过其分泌IFNγ来调节嗜中性粒细胞的募集(Nakamatsu M.等人，Microbes Infect.2007年3月；9(3):364-74)。此外，已经描述了CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)和I型NKT细胞之间的交互作用(cross-talk)，其中活化的I型NKT细胞通过IL-2依赖性机制定量和定性地调节Treg功能，而Treg可通过细胞接触依赖性机制阻遏I型NKT细胞功能(LaCava A.等人，TrendsImmunol.2006年7月；27(7):322-7)。还已观察到I型NKT细胞与不表达表征I型NKT细胞的恒定TCR-α链的其它CD1d限制性NKT细胞(II型NKT细胞)之间类似的交叉调节(Ambrosino E.等人，J Immunol.2007年10月15日；179(8):5126-36)。据报道，在过敏性气道高反应性模型中，I型NKT细胞也与γδT细胞协同作用(Jin N.等人，J Immunol.2007年9月1日；179(5):2961-8)。最后，一段时间以来人们已经认识到，通过注射α-GalCer进行的全身性I型NKT细胞活化可以非特异性地诱导B细胞活化。数据显示，从易患狼疮的NZB/W F1小鼠纯化的I型NKT细胞可以自发地增加B-1和边缘区B细胞的抗体分泌，但不能增加滤泡区B细胞的抗体分泌(Takahashi T,Strober S Eur J Immunol.2008年1月；38(1):156-65)。I型NKT细胞与B细胞亚类之间必须有直接相互作用，而且抗CD1d和抗CD40L。mAb可以阻断效应(TakahashiT,2008)。用蛋白质和α-GalCer免疫的C57BL/6小鼠发展出的抗体滴度比单独蛋白质诱导的抗体滴度高1–2log，并且增加了生成的记忆B细胞的频率(Galli G等人，Proc Natl AcadSci U S A.2007；104:3984–3989)。该机制是通过CD40-CD40L相互作用和细胞因子分泌的联合作用来介导的。B型细胞的CD1d表达也是I型NKT细胞增强反应所必需的，表明I型NKT细胞与B细胞之间具有同源相互作用(Lang GA等人，Blood.2008年2月15日；111(4):2158-62)。
I型NKT细胞识别的抗原
首先描述的I型NKT细胞配体是α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)，其是从一组海洋提取物中因其抗肿瘤活性而鉴定出来的(Kawano T.等人，Science.1997年11月28日；278(5343):1626-9)。从那时起，已经发现了更多的I型NKT细胞抗原，包括内源性抗原和外源性抗原。与作为主要由MHC分子呈递的肽的常规T细胞抗原不同，I型NKT细胞抗原具有与它们不同的脂质组分。迄今为止定义的大多数I型NKT细胞抗原具有共同的结构：埋入CD1d中的脂质尾和从CD1d突出并与NKT TCR接触的糖类头部基团。对此的主要例外是缺乏糖类头部基团的I型NKT抗原磷脂酰乙醇胺。
NKT细胞对抗原的识别
I型NKT细胞的独特抗原特异性由半恒定TCR的表达决定。已知具有与已知肽/MHC反应性TCR相似的总体结构的这种TCR如何可以替代地识别CD1d背景中的糖脂抗原是不断推测的主题。晶体学的成功和突变分析披露了这种TCR如何识别CD1d/糖脂复合物。与CD1d/α-GalCer复合的人类I型NKT TCR的晶体结构揭示了与已知的TCR/MHC/肽相互作用不同的独特对接策略(Borg等人，Nature.2007；448:44–49)。与常规的TCR-MHC相互作用(其中TCR以对角线方向接合MHC的远端部分)相比，I型NKT TCR对接在CD1d-α-Galcer复合物的最末端并平行于CD1d-α-Galcer复合物。在该结构中，I型NKT TCR和CD1d-α-GalCer复合物之间的结合表面主要由六个互补决定区(CDR)环中的三个组成：CDR1α、CDR3α和CDR2β，恒定的TCRα链在与糖脂和CD1d的相互作用中占主导地位，而TCRα链的作用限于CDR2β环与CD1d的α1螺旋相互作用。通常对于常规TCR而言与CDR3α一起介导抗原特异性的CDR3β，即I型NKTTCR的唯一高变区，与抗原没有任何接触。因此，I型NKT TCR对α-Galcer-CD1d的识别完全由I型NKT TCR上种系编码的表面介导。
通过对小鼠和人类I型NKT TCR进行广泛的突变分析，证实并扩展了这些结果(Browne等人，Nat Immunol.2007；8:1105–1113)。结果证实由TCR的CDR1α、CDR3α和CDR2β环内的残基形成的高能“热点”，这些残基对于识别α-GalCer-CD1d复合物至关重要并且为I型NKT TCR细胞的极端偏倚的TCR库提供了基础。在小鼠系统中，类似地需要这种“热点”来识别结构上不同的糖脂抗原，诸如α-GalCer和iGb3。由于对多种糖脂抗原的识别使用了相同种系编码的残基，因此这些观察结果表明I型NKT TCR充当模式识别受体(Browne等人，NatImmunol.2007；8:1105–1113)。这样，尽管TCRβ链具有多样性，但不同的NKT细胞克隆仍具有重叠的抗原特异性。
I型NKT细胞的活化
外源抗原对I型NKT细胞的同源识别和活化
已经鉴定出作为活化I型NKT细胞的同源抗原呈现的微生物糖脂。已经证实I型NKT细胞以CD1d依赖性方式直接识别由诸如鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、埃利希氏体属(Ehrlichia)和博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的细菌表达的α-连接的鞘糖脂和二酰基甘油抗原(Mattner J.等人，Nature.2005年3月24日；434(7032):525-9；Kinjo Y.等人，Nature.2005年3月24日；434(7032):520-5)。对这些糖脂抗原的生物学反应包括I型NKT细胞产生IFNγ和IL-4。
I型NKT细胞的间接识别和活化
即使在人类疾病中突出的主要革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌病原体中尚未发现被I型NKT细胞TCR识别的同源糖脂抗原，对于此类细菌也已报道了I型NKT细胞活化的替代模式。例如，已证实LPS阳性细菌(如沙门氏菌(Salmonella)或大肠埃希氏菌(Escherichia))间接活化I型NKT细胞。这些间接识别方式分为两大类：至少部分依赖于CD1d/TCR相互作用连同抗原呈递细胞的活化的那些方式，以及似乎不依赖CD1d的那些方式。
首先，证实在不存在特定同源外源糖脂的情况下，与树突细胞一起培养的革兰氏阴性细菌(诸如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))或革兰氏阳性细菌(诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))可以刺激I型NKT细胞(Mattner J.等人，Nature.2005年3月24日；434(7032):525-9；Brigl M等人，Nat Immunol.2003年12月；4(12):1230-7)。此类刺激在体外和体内被抗CD1d或抗IL-12mAb阻断。这些结果表明，一大批微生物可能能够通过APC刺激间接诱导I型NKT活化。这种机制取决于APC的TLR接合，因为鼠伤寒沙门氏菌暴露的野生型来源的骨髓来源的树突细胞(DC)，而不是TLR信号传导分子缺陷型DC能够刺激体外的I型NKT细胞(Mattner J.等人，Nature.2005年3月24日；434(7032):525-9)。也可能取决于I型NKT TCR对自身糖脂的识别，因为CD1缺陷型DC在受到类似刺激时无法刺激I型NKT细胞。此外，如使用多聚体I型NKT TCR作为染色试剂所证明的那样，经证实TLR配体对APC的活化会调节脂质生物合成途径并诱导CD1d结合的配体的特异性上调(Salio M.等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2007；104:20490–20495)。与这些结果不同，据报道大肠杆菌(Escherichia coli)LPS以依赖于APC但不依赖CD1d的方式诱导I型NKT细胞的刺激(Nagarajan NA.等人，J Immunol.2007；178:2706–2716)。在这些实验中，I型NKT细胞产生IFNγ不需要CD1d介导的内源性抗原呈递，并且暴露于IL-12和IL-18的组合足以使其活化。
最后，据报道除了LPS检测传感器TLR4外，DC中核酸传感器TLR7和TLR9的活化还导致对I型NKT细胞的刺激，正如通过他们的IFNγ产生所测量的那样(Paget C.等人，Immunity.2007；27:597–609)。
疾病中的I型NKT细胞
尽管I型NKT细胞代表人类中频率相对较低的外周血T细胞，但它们有限的TCR多样性意味着它们在活化后以高频率应答。因此，I型NKT细胞在形成适应性免疫反应中处于独特位置，并且已经证明在多种疾病(诸如癌症、自身免疫性疾病、炎性病症、组织移植相关病症和感染)中起调节作用(Terabe和Berzofsky，第8章，Adv Cancer Res,101:277-348,2008；Wu和van Kaer,Curr Mol Med,9:4-14,2009；Tessmer等人，Expert Opin TherTargets,13:153-162,2009)。例如，NKT细胞缺陷小鼠对化学诱导的肿瘤的发展敏感，而野生型小鼠受到保护(Guerra等人，Immunity 28:571-80,2008)这些实验发现与临床数据相关，临床数据显示晚期癌症患者外周血中的I型NKT细胞数量减少(Gilfillan等人，J ExpMed,205:2965-73,2008)。
I型NKT细胞占人类外周血的<0.1％和骨髓T细胞的<1％，但尽管相对不足，它们也通过产生IL-2、Th1型(IFN-γ、TNF-α)、Th2型(IL-4、IL-13)、IL-10和IL-17细胞因子发挥有效的免疫调节作用。(Lee等人，J Exp Med,2002；195:637-641；Bendelac等人，Annu RevImmunol,2007；178:58-66；Burrows等人，Nat Immunol,2009；10(7):669-71)。I型NKT细胞的特征在于高度受限(恒定)的T细胞受体(TCR)-Vα链(在人类中为Vα24)它们的TCR是独特的，因为它可以识别在泛在HLA样分子CD1d的背景下呈现的细胞膜的改变糖脂。(Zajonc和Kronenberg,Immunol Rev,2009；230(1):188-200)。CD1d在许多上皮和造血组织上以及在许多肿瘤靶标上高水平表达，并且已知仅特异性结合I型NKT TCR。(Borg等人，Nature,2007,448:44-49)。
像NK细胞一样，I型NKT细胞经由通过穿孔素/颗粒酶B、Fas/FasL和TRAIL途径介导的直接细胞毒作用，在肿瘤免疫监测中起主要作用。(Brutkiewicz和Sriram，Crit RevOncol Hematol,2002；41:287-298；Smyth等人，J.Exp.Med.2002；191:661-8；Wilson和Delovitch,Nat Rev Immunol,2003；3:211-222；Molling等人，Clinical Immunology,2008；129:182-194；Smyth等人，J Exp Med,2005；201(12):1973-1985；Godfrey等人，NatRev Immunol,2004,4:231-237)。在小鼠中，I型NKT细胞防御GVHD，同时增强包括NK细胞在内的许多细胞群体的细胞毒性。与NK细胞不同，尚未知I型NKT细胞会被诸如I类MHC的配体抑制，从而使它们在经由I类上调肿瘤从NK细胞毒性中逃脱的环境中成为有用的辅助剂。(Brutkiewicz和Sriram,Crit Rev Oncol Hematol,2002；41:287-298；Smyth等人，J ExpMed 2002；191:661-8；Wilson和Delovitch,Nat Rev Immunol,2003；3:211-222；Molling等人，Clinical Immunology,2008；129:182-194；Smyth等人，J Exp Med,2005；201(12):1973-1985；Godfrey等人，Nat Rev Immunol,2004,4:231-237)。
在使用仅缺乏I型NKT细胞的Jα18基因靶向敲除小鼠的研究中，提供了支持I型NKT细胞在抗肿瘤免疫中的作用的进一步证据(Smyth等人，J Exp Med,191:661-668,2000)。例如，I型NKT缺陷型小鼠表现出对甲基胆蒽。诱导的肉瘤和黑素瘤肿瘤的易感性显著提高，这种效应在肿瘤生长的早期阶段通过施用肝脏来源的I型NKT细胞所逆转(Crowe等人，J ExpMed,196:119-127,2002)。
I型NKT细胞对抗肿瘤免疫的至少一种贡献是经由DC活化I型NKT细胞而间接发生的。活化的I型NKT细胞可以引发一系列细胞因子级联反应-包括产生干扰素-γ(IFN-γ)-有助于加强抗肿瘤免疫反应的初免阶段(Terabe和Berzofsky，第8章，Adv Cancer Res,101:277-348,2008)。已经证实由I型NKT细胞以及NK细胞和CD8+效应子产生IFN-γ在肿瘤排斥中很重要(Smyth等人，Blood,99:1259-1266,2002)。充分表征了潜在的机制(Uemura等人，J Imm,183:201-208,2009)。
此外，已证实I型NKT细胞特异性靶向杀伤CD1d阳性肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，这是源自表现出免疫抑制功能的循环单核细胞的高度可塑性炎性细胞亚类(Sica和Bronte,JClin Invest,117:1155-1166,2007)。已知TAM是白细胞介素-6(IL-6)的主要生产者，白细胞介素-6促进许多实体瘤(包括神经母细胞瘤以及乳腺癌和前列腺癌)的增殖(Song等人，JClin Invest,119:1524-1536,2009；Hong等人，Cancer,110:1911-1928,2007)。I型NKT细胞对TAM的直接CD1d依赖性细胞毒活性表明，存在重要的替代性间接途径，I型NKT细胞可通过该途径介导抗肿瘤免疫，尤其是针对不表达CD1d的实体瘤。
在人类中，I型NKT细胞归巢至神经母细胞瘤细胞(Metelitsa等人，J Exp Med2004；199(9):1213-1221)和B细胞靶标(Wilson和Delovitch,Nat Rev Immunol 2003；3:211-222；Molling等人，Clinical Immunology,2008；129:182-194)，其两者均表达高水平的CD1d。I型NKT细胞细胞因子可增加NK细胞毒性。IFN-γ增强NK细胞增殖和直接细胞毒性，而IL-10则有效增加TIA-1，TIA-1是NK细胞毒性颗粒内具有直接的DNA裂解作用的一种分子(Tian等人，Cell,1991；67(3):629-39)，并且可以调节NK细胞靶标中的mRNA剪接，有利于靶标上膜结合的Fas的表达。(Izquierdo等人，Mol Cell,2005；19(4):475-84)。IL-10通过诱导I类MHC(NK细胞的主要抑制性配体)的肿瘤下调，进一步增强肿瘤靶标对NK裂解的敏感性。(Kundu和Fulton,Cell Immunol,1997；180:55-61)。
支持I型NKT细胞在炎性疾病和/或自身免疫性疾病的治疗中起重要作用的证据来自于使用鼠类自身免疫性疾病模型的研究。例如，在I型糖尿病(M.Falcone等人，JImmunol,172:5908-5916,2004；Mizuno等人，J Autoimmun,23:293-300,2004)、类风湿性关节炎(Kaieda等人，Arthritis and Rheumatism,56:1836-1845,2007；Miellot-Gafsou等人，Immunology,130:296-306,2010)、自身免疫性结肠炎(克罗恩病和溃疡性结肠炎模型为DSS诱导的结肠炎和自身免疫性T细胞介导的结肠炎；Geremia等人，Autoimmun Rev.13(1):3-10,2014doi:10.1016/j.autrev.2013.06.004.Epub 2013年6月15日.Katsurada等人，PLoS One,7(9):e44113,2012；Fuss和Strober，Mucosal Immunol.,1增刊1:S31-3,2008)和实验性自身免疫性脑炎(EAE)(van de Keere和Tonegawa,J Exp Med,188:1875-1882,1998；Singh等人，J Exp Med,194:1801-1811,2001；Miyamoto等人，Nature,413:531-534,2001)的小鼠模型中，I型NKT细胞在建立免疫耐受和预防自身免疫病理学中起关键作用。
I型NKT细胞也被活化并参与对移植组织的反应。不完全赞同任何一种理论，证据支持I型NKT细胞在与移植相关的病症中起重要作用。例如，已证实I型NKT细胞在排斥前会浸润心脏和皮肤同种异体移植物，并在移植后的外周淋巴组织中以扩增的数目被发现(Maier等人，Nat Med,7:557-62,2001；Oh等人，J Immunol,174:2030-6,2005；Jiang等人，JImmunol,175:2051-5,2005)。I型NKT细胞不仅被活化，而且影响随后的免疫反应(Jukes等人，Transplantation,84:679-81,2007)。例如，已经一致地发现，总NKT细胞或I型NKT细胞缺陷动物对通过共刺激/共受体分子阻滞诱导耐受具有抗性(Seino等人，Proc Natl AcadSci USA,98:2577-81,2001；Jiang等人，J Immunol,175:2051-5,2005；Jiang等人，Am JTransplant,7:1482-90,2007)。值得注意的是，NKT细胞过继转移到此类小鼠中可恢复耐受性，这取决于干扰素(IFN)-γ、IL-10和/或CXCL16(Seino等人，Proc Natl Acad Sci USA,98:2577-81,2001；Oh等人，J Immunol,174:2030-6,2005；Jiang等人，J Immunol,175:2051-5,2005；Jiang等人，Am J Transplant,7:1482-90,2007；Ikehara等人，J ClinInvest,105:1761-7,2000)。另外，已证明I型NKT细胞对于诱导对角膜同种异体移植物的耐受性是必不可少的，并且已证明以IL-4依赖性方式预防移植物抗宿主病(Sonoda等人，JImmunol,168:2028-34,2002；Zeng等人，J Exp Med,189:1073-81 1999；Pillai等人，Blood.2009；113:4458-4467；Leveson-Gower等人，Blood,117:3220-9,2011)。
I型NKT细胞反应可取决于例如在血管化(心脏)或非血管化(皮肤)移植之后进行的移植类型，因为同种抗原排到分别驻留在脾脏或腋窝淋巴结中的I型NKT细胞。此外，可以例如通过多次注射α-GalCer来操纵I型NKT细胞以释放IL-10来操纵I型NKT细胞反应，这可以延长皮肤移植物的存活时间(Oh等人,J Immunol,174:2030-6,2005)。
在维持移植物抗肿瘤(GVT)活性的同时，实现同种异体免疫耐受性先前一直是同种异体造血细胞移植(HCT)的目标。认为免疫调节细胞群，包括NKT细胞和CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg)在确定耐受性和GVT中起关键作用。为此，最近已经应用了富集NKT和Treg细胞的降低强度的调节方法，并取得了一定的成功。具体而言，全淋巴照射(TLI)和抗胸腺细胞球蛋白(ATG)的方案已在儿童和成人中产生移植和对移植物抗宿主病的防护(GVHD)(Lowsky等人，New England Journal of Medicine.2005,353:1321-1331；Kohrt等人，Blood.2009；114:1099-1109；Kohrt等人，European Journal of Immunology.2010；40:1862-1869；Pillai等人，Pediatric Transplantation.2011；15:628-634)并且GVT似乎在其疾病特征致使他们处于高复发风险中的成年患者中得以维持(Lowsky等人，The NewEngland Journal of Medicine.2005,353:1321-1331；Kohrt等人，Blood.2009；114:1099-1109；Kohrt等人，European Journal of。Immunology.2010；40:1862-1869)。
该方案的小鼠临床前建模显示，GVHD防护取决于I型NKT细胞的IL-4分泌和调节能力，并且这些细胞在维持GVT的同时调节GVHD(Pillai等人，Journal of Immunology.2007；178:6242-6251)。此外，I型NKT来源的IL-4结果可驱动调节性CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的体内有效扩增，其本身调节供体内的效应CD8+ T细胞以防止致命的急性GVHD(Pillai等人，Blood.2009；113:4458-4467)。已经证实，I型NKT细胞依赖性免疫偏差导致调节性髓样树突细胞功能的发展和增强，转而诱导调节性CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的体内有效扩增并进一步增强对有害T细胞反应的防护(van der Merwe等人，J.Immunol.,2013；2013年11月4日)。
响应于感染，免疫系统通过活化病原体相关分子模式的受体(诸如在抗原呈递细胞(APC)上表达的Toll样受体(TLR))而依赖于复杂的信号网络，从而促进抗原特异性T细胞反应(Medzhitov和Janeway Jr,Science 296:298-300,2002)。例如，在此类反应期间，I型NKT细胞通过识别微生物来源的脂质抗原，或在TLR连接后通过APC来源的细胞因子结合或不结合自身或微生物来源的脂质的呈递进行应答。当与CD1d结合时，细菌抗原还可以直接刺激I型NKT细胞，其作用独立于TLR介导的APC活化(Kinjo等人，Nat Immunol,7:978-86,2006；Kinjo等人，Nature,434:520-5,2005；Mattner等人，Nature,434:525-9,2005；Wang等人，Proc Natl Acad Sci USA,107:1535-40,2010)。
此外，已经证实NKT(CD1d-/-)和I型NKT(Jα18-/-)细胞缺陷型小鼠与野生型小鼠相比对流感高度敏感(De Santo等人，J Clin Invest,118:4036-48,2008)。在该模型中，发现I型NKT细胞会阻遏在CD1d和Jα18-/-小鼠中扩增的髓源抑制性细胞(MDSC)的扩增(同前)。重要的是，尽管未确定I型NKT细胞活化的确切机制，但作者建议I型NKT细胞需要TCR-CD1d相互作用，因为I型NKT细胞向Jα18-/-而不是CD1d-/-小鼠的过继转移在PR8感染后阻遏MDSC扩增(De Santo等人，J Clin Invest,118:4036-48,2008)。因此，I型NKT细胞的另一种应用是增进对病原体(例如细菌、病毒、原生动物和蠕虫病原体)的免疫反应。
最后，已证实I型NKT细胞在调节和/或增进过敏性免疫反应中起关键作用，两者是通过细胞因子的分泌和通过其它免疫亚类(包括调节性Foxp3+细胞、APC和NK细胞)的调节(Robinson,J Allergy Clin Immunol.,126(6):1081-91,2010；Carvalho等人，ParasiteImmunol.,28(10):525-34,2006；Koh等人，Hum Immunol.,71(2):186-91,2010)。这包括特应性皮炎模型中的证据(Simon等人，Allergy,64(11):1681-4,2009)。
然而，在免疫疗法中应用人类先天性调节性I型NKT细胞的主要障碍是它们在包括人外周血在内的常见细胞疗法细胞产品中相对稀缺(Berzins等人，Nature ReviewsImmunology.2011；11:131-142；Exley等人，Current Protocols in Immunology,2010；第14章：第14-11单元；Exley和Nakayama,Clinical Immunology,2011；140:117-118)并且缺乏关于离体扩增的人类I型NKT细胞的明确表型和功能数据来验证扩增后的人类I型NKT细胞在治疗上的潜在应用。
尽管I型NKT细胞具有极大的免疫学重要性和治疗潜力，但本领域缺乏离体有效扩增足以允许其在治疗方法中使用的I型NKT细胞和/或调节其活性所必需的技术。
发明内容
根据一个方面，所述发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和细胞产物，所述细胞产物包含源自细胞因子杀伤T细胞群体的扩增和富集的超活化细胞因子杀伤细胞(SCKTC)群体，所述SCKTC的特征在于以下中的两项或多项：与未刺激、未活化的细胞因子杀伤T细胞对照群体相比，诱导细胞因子分泌、刺激SCKTC群体的增殖、SCKTC的细胞毒性提高以及调节SCKTC细胞表面上的一种或多种标志物的表达。根据一个实施方案，表达受调节的细胞因子是选自由IL-4、IL-5、IL-6或IL-10和IFNγ组成的组中的一种或多种。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC群体包含低表达的选自由IL-4、IL-5、1L-6和IL-10组成的组中的一种或多种细胞因子和高表达的IFNγ。根据另一个实施方案，将扩增和富集的SCKTC群体的细胞因子产生表征为Il-5-、IL-6-、Il-10-、IL-4低、IFNγ高。根据另一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IFN-γ的量为约5000pg/ml或更高。根据另一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量小于5pg/ml。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC群体的培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于1000。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC群体对靶细胞的杀伤率的范围为约25％至约75％，包括端值。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率比未扩增、未活化的细胞因子杀伤T细胞对照细胞的杀伤率高至少1.5倍。根据另一个实施方案，IFN-γ:IL-4比率为至少1000，并且扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率与未扩增、未活化的细胞因子杀伤T细胞对照细胞的杀伤率相比增加至少1.5倍。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC群体包含表达NKT细胞标志物的SCKTC亚群。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC细胞群体包含含有CD3+Vα24+细胞、CD3+Vα24-细胞或CD3+CD56+细胞中的一种或多种的SCKTC亚群。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC群体包含为CD3+CD56+的SCKTC亚群。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC群体包含表达1型NKT细胞标志物的SCKTC亚群。根据另一个实施方案，1型NKT细胞标志物包括TCR Vα和TCR Vβ标志物。根据另一个实施方案，表达1型NKT细胞标志物的SCKTC亚群包括表征为CD3+Vα24+、CD3+Vα24-或CD3+CD56+的细胞。根据另一个实施方案，源自细胞因子杀伤T细胞(CKTC)群体的扩增和富集的SCKTC群体占总CKTC群体的约40％至约60％。根据另一个实施方案，所述药物组合物包含稳定量的血清，所述血清对于扩增和富集的SCKTC群体保持其T细胞效应子活性是有效的。根据另一个实施方案，血清的稳定量为至少10％。根据另一个实施方案，血清是人血清。
根据另一方面，所述发明提供了一种制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含扩增和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞(SCKTC)群体，所述方法按顺序包括：
(a)分离包含细胞因子杀伤T细胞(CKTC)群体的单核细胞(MC)群体；
(b)任选地在无菌条件下将(a)的制备物运输至加工设施；
(c)在培养系统中培养MC群体；
(d)使步骤(c)的培养系统与α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)或其类似物或功能等同物以及与包含CD1d和αGalCer或其类似物或功能等同物的细胞群体接触，其中所述接触足以刺激CKTC群体的扩增；
(e)使步骤(d)的培养系统与IL-2、IL-7、IL-15和IL-12以预定的添加顺序和时间接触，并与包含CD1d和αGalCer的新鲜细胞群体的脉冲接触，其中所述接触足以刺激CTKC群体中的一些的活化并形成扩增和富集的SCKTC群体；
(f)从培养系统中收集扩增和富集的SCKTC群体，以形成SCKTC细胞产物；其中(f)的包含扩增和富集的SCKTC群体的细胞产物的特征在于以下中的一项或多项：与(a)的CKTC群体相比，分泌效应细胞因子的能力提高或细胞毒性提高；以及
(h)将细胞产物与药学上可接受的载体一起配制以形成药物组合物。
根据一个实施方案，(a)中的单核细胞(MC)的来源是血液。根据另一个实施方案，MC源自人类受试者。根据另一个实施方案，MC通过Ficoll-Paque梯度离心从全血中分离。根据另一个实施方案，所述方法包括在步骤(e)和(f)之间，将培养物从加工设施运输到治疗设施。根据另一个实施方案，运输步骤在添加IL12后约1小时至约24小时内开始。根据另一个实施方案，步骤(c)任选地包括在进行步骤(d)之前，使MC重新悬浮并将MC调节至约5×105个细胞/ml至约3×106个细胞/ml的浓度。根据另一个实施方案，步骤(e)包括将包含CD1d和αGalCer或其类似物或功能等同物的新鲜细胞群体的脉冲添加到培养系统中。根据一些实施方案，包含CD1d和αGalCer的新鲜细胞群体的脉冲数为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10。根据另一个实施方案，从步骤(d)至步骤(f)，将αGalCer或其类似物或功能等同物维持在恒定浓度。根据另一个实施方案，αGalCer或其类似物或功能等同物的浓度在约50ng/ml至约500ng/ml之间。根据另一个实施方案，从步骤(e)至步骤(f)，IL-2维持在恒定浓度。根据另一个实施方案，IL-2的浓度范围为约10U/ml至约100U/ml。根据另一个实施方案，从步骤(e)至步骤(f)，IL-7维持在恒定浓度。根据另一个实施方案，IL-7的浓度范围为约20ng/ml至200ng/ml。根据另一个实施方案，在培养的约第7天添加IL-2和IL-7。根据另一个实施方案，在培养的约第14天添加IL-15。根据另一个实施方案，在培养的约第20天添加IL-12。根据另一个实施方案，步骤(f)在培养的至少约第21天进行。根据另一个实施方案，从步骤(e)至步骤(f)，IL-15维持在恒定浓度。根据另一个实施方案，IL-15的浓度范围为约10ng/ml至约100ng/ml。根据另一个实施方案，从步骤(e)至步骤(f)，IL-12维持在恒定浓度。根据另一个实施方案，IL-12的浓度范围为约10ng/ml至约100ng/ml。根据另一个实施方案，所述方法还包括通过流式细胞术来表征SCKTC群体的细胞表面标志物的表达的步骤。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC细胞群体的亚群包含CD3+Vα24+细胞、CD3+Vα24-细胞或CD3+CD56+细胞中的一种或多种。根据另一个实施方案，亚群还包含Vβ11+细胞。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC细胞群体包含CD3+Vα24+Vβ11+细胞、CD3+Vα24-细胞或CD3+CD56+细胞的亚群。
根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC群体占所述CKTC总群体的约40％至约60％。根据另一个实施方案，将IL-2和IL-7同时添加到培养物中。根据另一个实施方案，将IL-2、IL-7和IL-15同时添加到培养物中。根据另一个实施方案，步骤(c)中的MC群体包含约5×105个细胞/ml至约3×106个细胞/ml。根据另一个实施方案，包含CD1d和α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)的细胞是抗原呈递细胞。根据另一个实施方案，抗原呈递细胞是树突细胞(DC)。根据另一个实施方案，树突细胞负载有αGalCer。根据另一个实施方案，负载有αGalCer的树突细胞源自MC并且是贴壁细胞。根据另一个实施方案，通过以下方法制备负载有αGalCer的树突细胞，所述方法包括：(a)分离单核细胞(MC)群体；(b)在培养系统中培养MC群体；(c)使所述培养系统与IL-4和GM-CSF接触，其中所述接触足以诱导MC分化为树突细胞；并且(d)使所述培养系统与αGalCer接触，其中所述接触足以使树突细胞负载αGalCer。根据制备负载有αGalCer的树突细胞的方法中的另一个实施方案，负载有αGalCer的树突细胞是贴壁细胞。根据另一个实施方案，在制备负载有αGalCer的树突细胞的方法中，IL-4的浓度为500U/ml。根据另一个实施方案，在制备负载有αGalCer的树突细胞的方法中，GM-CSF的浓度为50ng/ml。根据另一个实施方案，在制备负载有αGalCer的树突细胞的方法中，步骤(d)在步骤(b)之后约5天至约7天进行。根据另一个实施方案，在制备负载有αGalCer的树突细胞的方法中，步骤(b)中的MC群体包含约1×105个细胞/ml至约5×106个细胞/ml。根据另一个实施方案，在制备负载有αGalCer的树突细胞的方法中，步骤(b)-(d)在选自含有10％胎牛血清或10％自体血清的RPMI 1640培养基的培养基中进行。
根据另一个实施方案，用于制备组合物的方法还包括每2至3天在培养系统中补充培养基。根据另一个实施方案，步骤(c)-(f)在选自X-VIVO-15无血清培养基、含有10％胎牛血清或10％自体血清的RPMI 1640培养基中的培养基中进行。
根据另一方面，所述发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和包含通过所描述和要求保护的方法产生的增强和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞(SCKTC)群体的细胞产物。根据通过本文描述的方法产生的药物组合物的一个实施方案，扩增和富集的SCKTC细胞群体包含CD3+Vα24+Vβ11+细胞、CD3+Vα24-细胞或CD3+CD56+细胞的亚群。根据另一个实施方案，亚群还包含Vβ11+细胞。根据另一个实施方案，扩增和富集的SCKTC细胞群体包含CD3+Vα24+Vβ11+细胞、CD3+Vα24-细胞或CD3+CD56+细胞的亚群。
根据一些实施方案，所述药物组合物还包含选自由化学治疗剂、生物反应调节剂和免疫治疗剂组成的组的附加治疗剂。
根据一些实施方案，所述免疫治疗剂是抗体。根据一些实施方案，所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体、人抗体或嵌合抗体。
本公开所描述的组合物和方法提供了优于当前免疫疗法的许多优点。例如，虽然CAR-T疗法有望用于治疗各种癌症，但CAR-T疗法具有许多缺点。CAR T细胞疗法可触发一系列副作用，其中许多副作用开始很细微，但会迅速恶化。特别严重的并发症是细胞因子释放综合征(CRS)，也称为细胞因子风暴。一旦CAR-T细胞进入体内，它们就会引发大量释放细胞因子，从而召集免疫系统的其它要素参与对肿瘤细胞的攻击。CRS的特征在于发烧、低血压和呼吸功能不全伴血清细胞因子升高，包括白细胞介素6(IL-6)(Davila等人，Sci.Transl.Med.6,224ra25(2014)；CRS通常发生在T细胞输注的数天内CAR T细胞扩增峰值时。在患有广泛性癌症的患者中，该病状往往特别严重。
本发明的组合物和方法有利地绕过了CRS的问题，因为输注的细胞产物是自身的，并且细胞因子风暴已交付给细胞培养。
附图说明
图1A和图1B示出了实施例3中测定扩增的CTKC群体中的SCKTC靶细胞比例的流式细胞术实验结果；图1A示出了表达CD3+CD56+细胞标志物的细胞的比例。图1B示出了表达I型NKT细胞标志物的细胞的比例。
图2A-D示出了实施例4中添加细胞因子IL-12和IL-7的时间对扩增的CTKC群体中表达I型NKT细胞标志物的细胞比例的影响。使用流式细胞术来测定表达标志物TCR Vα24(Va24)和TCR Vβ11(Vb11)的细胞的存在，其中基于Va24+Vb11+细胞设置门。图2A示出了A组的结果，其中在培养开始时添加IL-2。图2B示出了B组的结果，其中在培养开始时同时添加IL-2和IL-7。图2C示出了C组的结果，其中在培养的第3天添加IL-2和IL-7。图2D示出了D组的结果，其中在培养的第7天添加IL-2和IL-7。
图3A-D示出了实施例5中添加细胞因子IL-15的时间对扩增的CTKC群体中表达I型NKT细胞标志物的细胞比例的影响。使用流式细胞术来测定表达TCR Vα24(Va24)和TCR Vβ11(Vb11)的细胞的存在，其中基于Va24+Vb11+细胞设置门。图3A示出了A组的结果，其中在培养的第7天同时添加IL-2和IL-7而未添加IL-15。图3B示出了B组的结果，其中在培养的第7天同时添加IL-2和IL-7并且在培养开始时添加IL-15。图3C示出了C组的结果，其中在培养的第7天同时添加IL-2和IL-7并且在培养的第7天添加IL-15。图3D示出了D组的结果，其中在培养的第7天同时添加IL-2和IL-7并且在培养的第14天添加IL-15。
图4A-D示出了实施例5中添加细胞因子IL-12的时间对扩增的CTKC群体中表达I型NKT细胞标志物的细胞比例的影响。使用流式细胞术来测定表达TCR Vα24(Va24)和TCR Vβ11(Vb11)的细胞的存在，其中基于Va24+Vb11+细胞设置门。图4A示出了A组的结果，其中在培养的第7天同时添加IL-2和IL-7，在培养的第14天添加IL-15，而未添加IL-12。图4B示出了B组的结果，其中在培养的第7天同时添加IL-2和IL-7，在培养的第14天添加IL-15，并且在培养开始时添加IL-12。图4C示出了C组的结果，其中在培养的第7天同时添加IL-2和IL-7，在培养的第14天添加IL-15，并且在培养的第7天添加IL-12。图4D示出了D组的结果，其中在培养的第7天同时添加IL-2和IL-7，在培养的第14天添加IL-15，并且在培养的第20天添加IL-12。
具体实施方式
本公开部分地基于发现用于制备包含细胞产物的药物组合物的离体方法，所述细胞产物包含分泌效应细胞因子的能力改善且细胞毒性改善的超活化细胞因子杀伤T细胞(SCKTC)的扩增和富集群体。因此，本公开提供了用于生成大量可进一步用于过继转移的功能性SCKTC的体外方法。
在描述本发明的组合物和方法之前，应理解的是本公开不限于描述的特定分子、组合物、方法学或方案，因为这些可变化。还应理解，说明书中使用的术语仅为了描述特定型式或实施方案的目的，并非旨在限制本公开的范围，本公开的范围只受所附权利要求限制。应当理解，这些实施方案不限于所描述的特定方法学、方案、细胞系、载体和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并非旨在限制本发明实施方案或权利要求的范围。此外，说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”等用于区分相似的要素，而不一定是用于描述先后顺序或时间顺序。应理解，这样使用的术语在适当的情况下可互换，并且本文描述的公开内容的实施方案能够以不同于本文描述或说明的顺序操作。
定义
除非另外限定，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有如一般由本领域的普通技术人员所理解的相同的含义。虽然类似或等同于本文中所描述的那些的方法和材料可以用于本公开的实施方案的实践或测试中，但现在描述的是优选的方法、装置和材料。本文提到的所有出版物通过引用并入。不得将本文任何条款视为允许本公开未经授权依靠现有公开内容先于此公开内容。
除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。
如本文中所用的术语“约”在指代诸如量、时距等可测量值时，意在涵盖从指定值±20％、±10％、±5％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％或±0.1％的变化，因为此类变化适用于进行所公开的方法。
如本文在说明书和权利要求书中所用，短语“和/或”应理解为意指这样连接的要素中的“一个或两个”，即在一些情况下连带存在而在其它情况下分别存在的要素。除非明确指出相反，否则可以任选地存在其它要素，而不是由“和/或”分句明确标识的要素，无论与明确标识的那些要素相关还是无关。因此，作为非限制性实例，连同开放式语言(诸如“包含”)一起使用时对“A和/或B”的提及可以指以下情况。根据一个实施方案，是指A而无B(任选地包括B以外的要素)在一些实施方案中，是指B而无A(任选地包括除A以外的要素)；在又一个实施方案中，是指A和B(任选地包括其它要素)；等等。
如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的各项时，“或”或“和/或”应解释为包括性的，即，包括许多要素或要素列表中的至少一种，但也包括一种以上，并且任选地包括另外未列出的项。仅明确指出相反的术语，诸如“仅一种”或“恰好一种”，或在权利要求书中使用时，“由......组成”将指恰好包括许多要素或要素列表中的一个要素。一般而言，如本文所用的术语“或”前面有排他性术语时应该仅解释为指示排他性替代(即“一种或另一种而不是两者”)，“任一种”、“其中一种”、“仅其中一种”或“恰好其中一种”、“基本上由......组成”在权利要求中使用时，应具有如同在专利法领域中使用的普通含义。
如本文所用，短语“从X至Y的整数”意指包括端点在内的任何整数。即，在公开范围的情况下，公开了包括端点在内的范围内的每个整数。例如，短语“从X至Y的整数”公开了1、2、3、4或5以及1至5的范围。
如本文所用，当用于定义产物、组合物和方法使，术语“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)，或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，诸如“包含(contains)”和“含有(contain)”)是开放式的且不排除附加的、未提及的要素或方法步骤。因此，当氨基酸序列可能是多肽的最终氨基酸序列的一部分时，该多肽“包含”该氨基酸序列。此类多肽可以具有多达数百个附加的氨基酸残基(例如，如本文所提及的标签和靶向肽)“基本上由……组成”意指排除具有任何重要意义的其它组分或步骤。因此，基本上由列举的组分组成的组合物将不排除痕量污染物和药学上可接受的载体。当此类氨基酸序列最终仅存在几个附加的氨基酸残基时，多肽“基本上由”该氨基酸序列组成。“由......组成”意指排除其它组分或步骤的超过痕量的要素。例如，当多肽不含任何氨基酸而是列举的氨基酸序列时，该多肽“由”氨基酸序列组成。
如本文所用，“基本上相等”意指在给定的测量度量下已知与异常或正常范围相关的范围内。例如，如果对照样品来自患病患者，则基本上相等是在异常范围内。如果对照样品来自已知未患正在测试的病状的患者，则基本上相等是在该给定指标的正常范围内。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可以使用类似或等同于本文所描述的那些的任何方法和材料，但现在描述的是优选的方法和材料。
如本文所用，术语“活化”、“刺激”、“增强”、“增加”和/或“诱导”(和类似术语)可互换使用，通常是指相对于自然、预期或平均值或相对于对照条件，直接或间接地改善或增加浓度、水平、功能、活性或行为的作用。“活化”是指通过细胞表面部分的连接诱导的初级反应。例如，在受体的情况下，此类刺激需要受体的连接和随后的信号转导事件。此外，刺激事件可以活化细胞并上调或下调分子的表达或分泌。因此，即使不存在直接的信号转导事件，细胞表面部分的连接也可导致细胞骨架结构的重新组织，或细胞表面部分的聚结，其中每种情况都可用以增强、修改或改变随后的细胞反应。
如本文所用，术语“活化性或活化的细胞因子杀伤性T细胞”或“CKTCl活化”意在指引起或导致CKTC的一种或多种细胞反应的过程，包括：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性及活化标志物的表达。如本文所用，“活化的细胞因子杀伤T细胞”是指已经接受活化信号并因此展示出一种或多种细胞反应的细胞因子杀伤T细胞，所述细胞反应包括增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性及活化标志物的表达。CKTC的活化可以包括以下一种或多种：诱导细胞因子从CKTC中分泌，刺激CKTC的增殖以及上调CKTC上细胞表面标志物的表达。细胞因子可以是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-15、TNF-α、TNF-β和IFN-γ中的一种或多种。根据某些实施方案，CKTC的活化可以包括IL-4、IL-5、Il-6、IL-10或IFN-γ中的一种或多种的分泌。适于测量CKTC活化的测定法是本领域已知的并且在本文中进行了描述。
术语“活性”是指负责预期治疗效果的所述发明的药物组合物的成分、组分或组成部分。
如本文所用，术语“施用”及其应用于哺乳动物、细胞、组织、器官或生物流体时的各种语法形式是指但不限于外源性配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物对受试者、细胞、组织、器官或生物流体等的接触。“施用”可以指例如治疗方法、药代动力学方法、诊断方法、研究方法、安慰剂和实验方法。“施用”还涵盖例如用试剂、诊断剂、结合组合物或用另一种细胞对细胞的体外和离体治疗。
如本文所用，术语“适应性细胞疗法”或“适应性转移”是指用于帮助免疫系统抵抗疾病的治疗，通过所述治疗从患者中收集的T细胞扩增(在培养实验室中生长)以增加能够抵抗该疾病的T细胞的数目。然后将这些T细胞送回患者体内。
如本文所用，术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体和全合成抗体，只要它们表现出所需的抗原结合活性。在自然界中，抗体是血清蛋白，血清蛋白分子的表面具有与其靶标上的小化学基团互补的小区域。这些互补区域(称为抗体结合位点或抗原结合位点)，每个抗体分子至少有两个，并且在一些类型的抗体分子中，有十个、八个或在一些物种中多达12个，可以与它们在抗原上的相应互补区域(抗原决定簇或表位)反应以将几个多价抗原分子连接在一起形成晶格。整个抗体分子的基本结构单元由四条多肽链组成，两条相同的轻(L)链(每条含有约220个氨基酸)和两条相同的重(H)链(每条通常含有约440个氨基酸)两条重链和两条轻链通过非共价键和共价键(二硫键)的组合保持在一起。该分子由两个相同的半部分组成，每个半部分具有由轻链的N端区域和重链的N端区域组成的相同抗原结合位点。轻链和重链两者通常协同形成抗原结合表面。
人抗体显示出两种轻链，κ和λ；免疫球蛋白的单个分子通常只是一种或另一种。在哺乳动物中，有五类抗体即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，每一类抗体都具有自身的重链类别。所有五种免疫球蛋白类别与其它血清蛋白的不同之处在于它们显示出广泛的电泳迁移率并且不同质。这种异种性-即例如单个IgG分子的净电荷彼此不同-是免疫球蛋白的固有特性。
常常与钥匙在锁中配合相比较的互补原理，涉及相对较弱的结合力(疏水键和氢键、范德华力和离子相互作用)，相对较弱的结合力只有在两个反应分子可以彼此非常接近并且确实如此接近，以致于一个分子的突出组成原子或原子团可以与另一个分子的互补凹陷或凹部配合时才能有效地起作用。抗原-抗体相互作用显示出高度特异性，这在许多水平上都表现出来。降到分子水平，特异性意指抗体与抗原的组合位点具有与无关抗原的抗原决定簇完全不相似的互补性。每当两种不同抗原的抗原决定簇具有某种结构相似性时，可能发生一种决定簇对另一种抗原的一些抗体的组合位点的一定程度的配合，并且这种现象会引起交叉反应。交叉反应对于了解抗原-抗体反应的互补性或特异性至关重要。免疫学特异性或互补性使得检测抗原中少量的杂质/污染物成为可能。
可以通过将来自免疫供体的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合以得到已建立的在选择性培养基中生长的小鼠杂交瘤克隆物来产生单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞是永生化杂交细胞，其是由分泌抗体的B细胞与骨髓瘤细胞体外融合产生的。体外免疫(是指培养物中抗原特异性B细胞的初级活化)是产生小鼠单克隆抗体的另一种得到确认的方式。
还可以通过聚合酶链反应(PCR)扩增来扩增来自外周血淋巴细胞的免疫球蛋白重链(VH)和轻链(Vκ和Vλ)可变基因的多种文库。可以通过使用PCR将重链和轻链V基因随机组合来制备编码单一多肽链的基因，在所述单一多肽链中重链和轻链可变结构域通过多肽间隔区连接(单链Fv或scFv)。然后可以通过与噬菌体尖端的次要外壳蛋白融合而克隆组合文库以在丝状噬菌体的表面上展示。
导向选择技术是基于人免疫球蛋白V基因与啮齿类动物免疫球蛋白V基因的改组。该方法需要(i)使人VL链库与和目标抗原有反应性的小鼠单克隆抗体的重链可变区(VH)结构域改组；(ii)选择抗原上的半人Fab；(iii)使用选定的VL基因作为第二次改组中人重链文库的“对接结构域”，以分离具有人轻链基因的克隆Fab片段；(v)通过用含有所述基因的哺乳动物细胞表达载体进行电穿孔来转染小鼠骨髓瘤细胞；并且(vi)使与抗原有反应性的Fab的V基因在小鼠骨髓瘤中表达为完整的IgG1抗体分子。
如本文所用，术语“抗原呈递”是指抗原以与MHC分子结合的肽片段的形式在细胞表面上展示。
如本文所用，术语“抗原呈递细胞(APC)”是指能够在其表面以可被免疫系统的特异性效应细胞识别的肽-MHC复合物的形式展示(“呈递”)一种或多种抗原，从而诱导针对所呈递的一种或多种抗原的有效细胞免疫反应的一类细胞。专业APC的实例是树突细胞和巨噬细胞，但表达I类MHC或II类分子的任何细胞都可以潜在地呈递肽抗原。APC可以是“人工APC”，意指经过工程改造以呈递一种或多种抗原的细胞。在T细胞能够识别外源蛋白质之前，必须在抗原呈递细胞或靶细胞内部对该蛋白质进行加工，使其能够在细胞表面以肽-MHC复合物的形式展示。
如本文所用，术语“抗原加工”是指外源蛋白质在细胞内降解为可以与MHC分子结合以呈递给T细胞的肽。
如本文所用，术语“自体”意在指源自相同个体。如本文所用，术语“同种异体”意在指源自两个遗传上不同的个体。
如本文所用，术语“自体吞噬”是指细胞对其自身细胞器和蛋白质在溶酶体中的消化和分解。
如本文所用，术语“生物标志物”(或“生物印记”)是指肽、蛋白质、核酸、抗体、基因、代谢物或用作生物状态指标的任何其它物质。它是一项客观测量的特征并且作为正常生物学过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的细胞指标或分子指标进行评估。如本文所用，术语“指标”是指源自一系列观察到的事实的任何物质、数目或比率，其可以揭示随时间推移的相对变化；或可见的信号、符号、标记、注释或症状，或其出现或存在的证据。提出的生物标记物一旦得到验证，就可以用于诊断疾病风险、个体中疾病的存在或为个体疾病定制治疗(药物治疗或施用方案的选择)。在评估潜在药物疗法时，可以将生物标志物用作自然终点的替代，诸如生存期或不可逆的发病率。如果治疗改变了生物标志物，并且该改变与健康状况改善有直接联系，则生物标志物可以用作评估临床益处的替代终点。临床终点是可以用于度量患者感觉、功能或生存方式的变量。替代终点是旨在代替临床终点的生物标志物；这些生物标志物经证明可预测置信度为监管机构和临床社区所接受的临床终点。
如本文所用，术语“癌症”意在指其中异常细胞不受控制地分裂并且能够侵袭其它组织的疾病。有100多种不同类型的癌症。大多数癌症都以其开始的器官或细胞类型来命名-例如，始于结肠的癌症称为结肠癌；始于皮肤黑素细胞的癌症称为黑素瘤。癌症类型可以分为更广泛的类别。癌症的主要类别包括：癌(意指始于皮肤或内衬或覆盖内部器官的组织的癌症，及其亚型，包括腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)；肉瘤(意指始于骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其它结缔组织或支持组织的癌症)；白血病(意指始于造血组织(例如骨髓)并引起大量异常血细胞产生并进入血液的癌症；淋巴瘤和骨髓瘤(意指始于免疫系统细胞的癌症)；以及中枢神经系统癌症(意指始于大脑和脊髓组织的癌症)。术语“骨髓增生异常综合征”是指一种类型的癌症，其中骨髓不能产生足够的健康血细胞(白血细胞、红血细胞和血小板)，并且血液和/或骨髓中存在异常细胞。骨髓增生异常综合征可变成急性骨髓性白血病(AML)。
如本文所用，术语“CD1d”意在指跨膜糖蛋白家族，其在结构上与MHC蛋白相关并且与β-2-微球蛋白形成异二聚体，所述异二聚体介导主要是自身或微生物来源的脂质和糖脂抗原呈递给T细胞。
如本文所用，术语“趋化因子”意在指一类趋化性细胞因子，其向白细胞发出信号朝特定方向移动。
如本文所用，术语“组分”意在指组成部分、要素或成分。
如本文所用，术语“组合物”意在指由两种或更多种物质的混合物形成的材料。
如本文所用，术语“病状”是指多种健康状态并且意在包括由任何潜在的机制或病症引起的病症或疾病。
如本文所用，术语“接触”及其各种语法形式意在指触及或紧靠或局部靠近的状态或条件。使组合物与靶标目的地接触可以通过技术人员已知的任何施用方式进行。
如本文所用，术语“共刺激分子”意在指键合在一起的一个或两个或更多个原子团，其在APC的细胞表面上展示，其在活化原初T细胞成为效应细胞中具有作用。例如，将外源抗原呈递给T细胞受体的MHC蛋白也需要与T细胞表面的互补受体结合的共刺激蛋白，以引起T细胞的活化。
如本文所用，术语“共刺激受体”意在指原初淋巴细胞上的细胞表面受体，通过该细胞表面受体，它们接收除通过抗原受体所接收到的那些信号以外的信号，并且该细胞表面受体对于淋巴细胞的完全活化是必需的。实例是B细胞上的CD30和CD40，以及T细胞上的CD27和CD28。
如本文所用，术语“同源帮助”意在指在与辅助T细胞紧密相互作用的情况下最有效发生的过程。
如本文所用，术语“培养”及其其它语法形式意在指细胞群体借此在人工培养基中的基质上生长和增殖的过程。
如本文所用，术语“细胞因子”是指由细胞分泌的对其它细胞具有多种作用的小的可溶性蛋白物质。细胞因子介导许多重要的生理功能，包括生长、发育、伤口愈合和免疫反应。它们通过与其位于细胞膜上的细胞特异性受体结合而起作用，从而允许在细胞内开始独特的信号转导级联反应，最终将导致靶细胞的生物化学和表型变化。细胞因子可以在局部和远离释放部位起作用。它们包括I型细胞因子，涵盖许多白细胞介素以及几种造血生长因子；II型细胞因子，包括干扰素和白细胞介素-10；肿瘤坏死因子(“TNF”)相关分子，包括TNFα和淋巴毒素；免疫球蛋白超家族成员，包括白细胞介素1(“IL-1”)；以及趋化因子，一种在多种免疫和炎症功能中起关键作用的分子家族。根据细胞的状态，相同的细胞因子可对细胞具有不同的作用。细胞因子常常调节其它细胞因子的表达，并引发其它细胞因子的级联反应。细胞因子的非限制性实例包括例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12/IL-23P40、IL13、IL-15、IL-15/IL15-RA、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、TGF-β、IFNγ、GM-CSF、Groα、MCP-1和TNF-α。
如本文所用，术语“树突细胞”或“DC”描述在各种淋巴组织和非淋巴组织中发现的向T细胞呈递外源抗原的形态相似的细胞的多样化群体，参见Steinman,Ann.Rev.Immunol.9:271-296(1991)。如本文所用，术语“源自”意在指涵盖用于从起源接收、获得或修改某物的任何方法。
如本文所用，术语“可检测的标志物”意在指选择标志物和测定标志物两者。术语“选择标志物”意在指可以选择或筛选经表达构建体转化的细胞的多种基因产物，包括抗药性标志物，可用于荧光活化细胞分选的抗原性标志物，粘附性标志物，诸如允许选择性粘附的粘附配体的受体等。
如本文所用，术语“可检测反应”意在指可以在有或无检测试剂的情况下进行的测定中检测到的任何信号或反应。可检测反应包括但不限于放射性衰变和能量(例如，荧光、紫外线、红外线、可见光)的发射、吸收、极化、荧光、磷光、透射、反射或共振转移。可检测反应还包括色谱迁移率、浊度、电泳迁移率、质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振波谱和x射线衍射。可替代地，可检测反应可以是用于测量生物材料的一种或多种特性的测定法的结果，所述特性诸如熔点、密度、电导率、表面声波、催化活性或要素组成。“检测试剂”是产生指示目标物质存在或不存在的可检测反应的任何分子。检测试剂包括多种分子中的任何一种，诸如抗体、核酸序列和酶。为了促进检测，检测试剂可以包含标志物。
如本文所用，术语“疾病”或“病症”是指健康受损或功能异常的状况。
如本文所用，术语“剂量”意在指规定一次服用的治疗物质的量。如本文所用，术语“最大耐受剂量”意在指不引起不可接受的副作用的最高药物或治疗剂剂量。
如本文所用，术语“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统的或在其内部产生的任何材料。
如本文所用，术语“富集”意在指增加所需物质的比例，例如，以与其在细胞群体中的自然频率相比增加细胞亚型的相对频率。通常认为正向选择、负向选择或两者对于任何富集方案都是必需的。选择方法包括但不限于磁性分离和FACS。不管用于富集的具体技术如何，选择过程中使用的特定标志物都至关重要的，因为发育阶段和活化特异性反应可以改变细胞的抗原特性。
如本文所用，术语“扩增细胞因子杀伤性T细胞(CKTC)群体”或“细胞因子杀伤T细胞(CKTC)扩增”意在指其中细胞因子杀伤T细胞群体经历一系列细胞分裂，从而在细胞数目上扩增(例如，通过体外培养)的过程。术语“扩增的超活化细胞因子杀伤T细胞”涉及通过细胞扩增获得的超活化细胞因子杀伤T细胞。
如本文所用，术语“表达”意在涵盖基因的可观测表型的产生，通常通过指导蛋白质的合成。它包括mRNA的生物合成、多肽的生物合成、多肽活化(例如，通过翻译后修饰)或通过改变亚细胞定位或募集到染色质来激活表达。
如本文所用，术语“Fas”意在指在淋巴细胞上发现的属于TNF超家族的2型膜蛋白。在表达Fas的细胞中，Fas配体(FasL)对细胞死亡受体Fas的接合导致由半胱天冬酶活化介导的凋亡性细胞死亡。
如本文所用，术语“流式细胞术”意在指用于询问细胞表型和特征的工具。当细胞或颗粒在液体流中移动通过激光(通过辐射的受激发射进行的光放大)/光束经过感测区时，它会感测细胞或颗粒。测量微观颗粒的相对光散射和颜色有区别的荧光。细胞的流式分析和区分基于大小、粒度以及细胞是否携带抗体或染料形式的荧光分子。当细胞穿过激光束时，光在所有方向上散射，并且与轴成小角度(0.5-10°)沿正向方向散射的光与球体半径的平方成正比并且因此与细胞或颗粒的大小成正比。光可进入细胞；因此，可以用荧色物连接的抗体标记90°光(直角，侧面)的散射光，或用荧光膜、细胞质或核染料染色。因此，可以利于细胞类型的区分、膜受体和抗原的存在、膜电位、pH、酶活性和DNA含量。流式细胞仪是多参数的，记录每个细胞上的几个测量值；因此，可以在异质群体中鉴定出同质亚群(Marion G.Macey,Flow cytometry:principles and applications,Humana Press,2007)。允许分离物理特征过于相似而无法通过大小或密度分开的不同细胞群体的荧光活化细胞分选术(FACS)，使用荧光标签来检测差异性表达的表面蛋白，从而允许在物理同质的细胞群体之间进行精细区别。
如本文所用，术语“制剂”和“组合物”在本文中可互换使用，是指包含所有活性成分和惰性成分的本发明产品。如本文所用，术语“药物制剂”或“药物组合物”是指用于预防、降低强度、治愈或以其它方式治疗目标病状或疾病的制剂或组合物。
如本文所用，术语“功能等同”或“功能上等同”在本文可互换使用，是指具有相似或相同的作用或用途的物质、分子、多核苷酸、蛋白质、肽或多肽。
如本文所用，术语“细胞生长”是细胞积聚质量并增加物理尺寸的过程。本质上细胞如何生长有许多不同的实例。在一些情况下，细胞大小与DNA含量成正比。例如，在不存在细胞分裂的情况下持续的DNA复制(称为内复制)会导致细胞大小增加。会成熟为粒状巨核细胞的巨核细胞，即骨髓中产生血小板的细胞，通常以这种方式生长。通过不同的策略，脂肪细胞可以通过积聚细胞内脂质生长到大约85至120μm。与内复制或脂质积聚不同，一些终末分化细胞(诸如神经元和心肌细胞)会停止分裂并生长而不会增加其DNA含量。这些细胞按比例增加其大分子含量(主要是蛋白质)，达到执行其特化功能所必需的程度。这涉及来自营养物和生长因子的细胞外线索与负责控制细胞能量利用率和大分子合成的细胞内信号传导网络之间的协调。受到最严格调节的细胞生长可能发生在分裂细胞中，其中细胞生长和细胞分裂显然是可分过程。通常，分裂细胞的大小必须随着每一次经过细胞分裂周期而增加，以确保维持一致的平均细胞大小。对于典型的分裂性哺乳动物细胞，生长发生在细胞周期的G1期并且与S期(DNA合成)和M期(有丝分裂)紧密协调。生长因子、激素和营养利用率的组合影响为细胞生长提供了外部线索。Guertin,D.A.,Sabatini,D.M.,“CellGrowth,”in The Molecular Basis of Cancer(第4版)Mendelsohn,J.等人编辑，Saunders(2015),179-190。
如本文所用，术语“细胞增殖”意在指引起细胞数目增加的过程，并且由细胞分裂与通过细胞死亡或分化引起的细胞损失之间的平衡来定义。
如本文所用，术语“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”(GM-CSF)意在指促进造血祖细胞的增殖和分化以及嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的产生的细胞因子。与其它细胞因子(诸如干细胞因子、IL-3、促红细胞生成素和血小板生成素)协同作用，它还刺激红系和巨核细胞祖细胞(Barreda,DR等人，Developmental&Comparative Immunol.(2004)28(50:509-554)。GM-CSF由多种细胞类型产生，包括基质细胞、Paneth细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、软骨细胞以及Th1和Th17 T细胞(Francisco-Cruz,A.等人，Medical Oncology(2014)31:774et al.)。
如本文所用，术语“免疫反应”和“免疫介导的”在本文中可互换使用，并且意在指受试者针对外源或自身抗原的免疫系统的任何功能表达，而无论这些反应的结果是对受试者有益还是有害。
如本文所用，术语“免疫调节(immunomodulatory)”、“免疫调节剂”和“免疫调节(immune modulatory)”在本文中可互换使用，是指能够通过表达趋化因子、细胞因子和免疫反应的其它介质来直接或间接增强或削弱免疫反应的物质、试剂或细胞。
如本文所用，术语“炎症”是指血管化组织对损伤作出应答的生理过程。参见，例如，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY,第4版,William E.Paul编辑，Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia(1999)，1051-1053，通过引用并入本文。在炎性过程中，涉及解毒和修复的细胞被炎症介质动员到受损部位。炎症的特征常常在于炎症部位的白细胞强烈浸润，特别是嗜中性粒细胞(多形核细胞)。这些细胞通过在血管壁或未受损的组织处释放有毒物质来促进组织损伤。传统上，炎症已分为急性反应和慢性反应。
如本文所用，术语“急性炎症”是指对急性损伤的快速、短暂(数分钟至数天)、相对均匀的反应，其特征在于流体、血浆蛋白和嗜中性白细胞的积聚。引起急性炎症的有害动因的实例包括但不限于病原体(例如细菌、病毒、寄生虫)、外源(例如石棉)或内源(例如尿酸盐晶体、免疫复合物)的异物以及物理(例如烧伤)或化学(例如烧碱)动因。
如本文所用，术语“慢性炎症”是指持续时间较长并且具有模糊且不确定的终止的炎症。当急性炎症持续存在时(无论是通过初始炎症动因的不完全清除还是作为在同一位置发生多次急性事件的结果)，慢性炎症就会取代。慢性炎症，包括淋巴细胞和巨噬细胞的流入以及成纤维细胞的生长，可导致长期或反复炎症活性部位的组织瘢痕形成。
如本文所用，术语“干扰素γ”(IFN-γ)意在指可溶性细胞因子，其是II型干扰素类别的成员，其由先天性和适应性免疫系统的细胞分泌。活性蛋白是与干扰素γ受体结合的同型二聚体，其触发细胞对病毒和微生物感染的反应。
如本文所用，术语“白细胞介素-2”(IL-2)意在指由一种类型的T淋巴细胞产生的一种类型的细胞因子，其增加其它T淋巴细胞和B淋巴细胞的生长和活性并影响免疫系统的发育。实验室制备的IL-2称为阿地白介素(aldesleukin)。
如本文所用，术语“白细胞介素4”(IL-4)是多效性细胞因子，其作用通常与干扰素γ的作用拮抗。因为IL-4R广泛表达，所以IL-4会影响几乎所有细胞类型。在T细胞中，IL-4对于Th2亚类的分化和生长至关重要。因此，IL-4促进对抗在细胞外生存和繁殖的病原体所必需的体液反应的建立。在B细胞中，IL-4刺激生长和分化并诱导II类MHC和FcεRII(CD23)的上调。IL-4还促进鼠类B细胞中的同种型转换为IgG1和IgE，但抑制向IgG2a、IgG2b和IgG3的转换。IL-4是肥大细胞的生长因子，并且在变态反应中起主要调节作用，因为这些涉及IgE介导的肥大细胞脱粒。IL-4对防御蠕虫也很重要，因为IL-4促进的IgE产生允许携带FcεRIIB的嗜酸性粒细胞进行有效的ADCC。在巨噬细胞中，IL-4抑制促炎性趋化因子和细胞因子(诸如TNF和IL-1β)的分泌，损害这些细胞产生活性氧和氮中间体的能力，并阻断IFNγ诱导的细胞粘附分子(诸如ICAM和E-选择素)的表达。然而，IL-4还可以诱导DC和巨噬细胞上调其IL-12的合成，从而提供负反馈机制来调节Th2反应。Mak、TW、Saunders、ME，第17章，“Cytokines and Cytokine Receptors,”in The Immune Response,Basic and ClinicalPrinciples(2006),Academic Press,第463-516页)。
如本文所用，术语“白细胞介素-7”(IL-7)或淋巴细胞生成素-1)意在指由覆盖并支持体内器官、腺体和其它结构的细胞产生的引起T淋巴细胞和B淋巴细胞生长的一种细胞因子。
如本文所用，术语“白细胞介素-12”(IL-12)意在指主要由B淋巴细胞和巨噬细胞产生的使其它免疫细胞产生细胞因子并增加T淋巴细胞的生长的一种细胞因子。它也可以阻断新血管的生长。
如本文所用，术语“白细胞介素-15”(IL-15)意在指通过其特异性受体IL-15Rα起作用的一种细胞因子，其是在呈递抗原的树突细胞、单核细胞和巨噬细胞上表达的。IL-15调节T细胞和自然杀伤细胞的活化和增殖。IL-15和IL-2共有许多生物学活性。发现它们结合常见的红细胞生成素受体亚基，并且可以竞争相同受体，因此对彼此的活性产生负调节。经证实CD8+记忆细胞的数目受IL-15和IL2之间的平衡控制。IL-15诱导JAK激酶的活化，以及转录激活因子STAT3、STAT5和STAT6的磷酸化和活化。对小鼠对应物的研究表明，IL-15可增加细胞凋亡抑制剂BCL2L1/BCL-x(L)的表达，这可能是通过STAT6的转录活化活性进行的，从而防止细胞凋亡。
如本文所用，术语“分离的”意在指通过一种或多种分离方法诸如但不限于机械分离或选择性培养将细胞从群体中分开。“分离的”细胞群体不一定是纯的。可能存在其它细胞类型。根据一些实施方案，特定细胞类型的分离群体是指纯度大于10％，纯度大于20％，纯度大于30％，纯度大于40％，纯度大于50％，纯度大于60％，纯度大于70％，纯度大于80％，纯度大于90％或纯度大于95％。
如本文所用，术语“Kaplan Meier图”或“Kaplan Meier存活曲线”意在指在以许多小间隔考虑时间的同时，临床研究受试者在给定的时间长度内存活的概率图。KaplanMeier图假设：(i)在任何时候，删失(即丢失)的受试者都具有与继续随访的受试者相同的存活前景；(ii)在研究早期和晚期招募的受试者的存活概率相同；(iii)事件(例如死亡)在规定的时间发生。在某个时间点计算事件发生的概率，将连续概率乘以任何较早计算出的概率，以获得最终估计值。在任何特定时间的生存概率按照生存的受试者数目除以有风险的受试者数目来计算。死亡、退出研究或从研究中删失的受试者不计为有风险。
如本文所用，术语“标记”意在指通过引入可追踪组成部分来区分化合物、结构、蛋白质、肽、抗体、细胞或细胞组分的过程。常见的可追踪组成部分包括但不限于荧光抗体、荧光团、染料或荧光染料、染色剂或荧光染色剂、标志物、荧光标志物、化学染色剂、差异染色剂、差异标记和放射性同位素。
如本文所用，术语“标志物”或“细胞表面标志物”在本文中可互换使用，是指在特定类型的细胞表面上发现的抗原决定簇或表位。细胞表面标志物可以利于细胞类型的表征、其鉴定及其最终分离。细胞分选技术基于细胞生物标志物，其中细胞表面标志物可以用于从细胞群体中进行正选择或负选择，即包含或排除。
如本文所用，术语“MHC(主要组织相容性复合物)分子”是指由主要组织相容性复合物(MHC)的基因编码的泛在细胞表面糖蛋白大家族中的一种。它们结合外源抗原的肽片段，并将其呈递给T细胞以诱导免疫反应。”由一系列高度多态性基因编码的I类MHC分子存在于几乎所有细胞类型上并且在病毒感染的细胞表面呈递病毒肽，在那里它们被细胞毒性T细胞识别。在I类MHC机制中，外源肽被内吞以在抗原呈递细胞内转运。然后，至少一些外源蛋白质被胞质蛋白酶体蛋白水解形成短肽，将短肽转运到抗原呈递细胞的内质网腔中。在那里，将外源肽负载到I类MHC分子上并通过囊泡转运到抗原呈递细胞的细胞表面，以被CD8+细胞毒性T细胞识别。癌细胞上的MHC I表达是T细胞检测和破坏所需的，并且细胞毒性T淋巴细胞(CTL、CD8+)需要I类MHC分子在靶细胞上呈递肿瘤抗原以将自身与非自身区分开来。肿瘤躲避宿主免疫反应最常见的方法之一是通过下调肿瘤细胞对I类MHC分子的表达，使得肿瘤具有低MHCI表达，从而致使任何内源性或治疗性抗肿瘤T细胞反应无效(Haworth等人，Pediatr Blood Cancer.2015年4月；62(4):571–576)。最常见的是，肿瘤细胞上MHC表达的丧失是由表观遗传事件和转录下调MHC基因座和/或抗原加工机制介导的。缺乏经过加工的肽抗原会导致MHC表达降低，因为空的MHC分子在细胞表面不稳定。
存在于专业抗原呈递细胞上的II类MHC分子将外源肽呈递给辅助T细胞。外源肽被内吞并且在内体的酸性环境中降解，这意味着所述肽从未呈递细胞溶质中，而是留在拓扑学上等同于细胞外空间的亚细胞区室中。肽与特化内体区室中的预装配的II类MHC蛋白结合，然后将负载的II类MHC分子转运到抗原呈递细胞的质膜上，呈递给CD4+辅助T细胞。(Alberts等人，Molecular Biology of the Cell第4版，Garland Science,New York(2002)第1407页)。通过从供体细胞表面获取II类MHC分子，也可以将抗原负载到抗原呈递细胞上。肽-MHC转移(变装(cross-dressing)”)涉及在供体细胞内生成肽-II类MHC复合物，将其随后转移到受者抗原呈递细胞中，然后受者抗原呈递细胞能够将完整、很大程度上未加工的肽-II类MHC复合物呈递给辅助T细胞。(Campana,S.等人，Immunol.Letters(2015)168(2):349-54)。当内源性抗原通过自噬降解时，也可以由II类MHC呈递(Schmid,D.等人(2007)Immunity 26(1):79-92)。
如本文所用，术语“修饰”或“调节”及其各种语法形式意在指调控、改变、适应或调整至某一量度或比例。关于对肿瘤细胞的免疫反应，这些术语意在指经由一种或多种重组DNA技术改变对肿瘤细胞的免疫反应的形式或特性，使得免疫细胞能够识别并杀伤肿瘤细胞。
如本文所用，术语“自然杀伤(NK)细胞”是指与T细胞和B细胞同一家族中的淋巴细胞，被分类为I类先天淋巴细胞。与需要抗原呈递细胞初免的细胞毒性T细胞相反，它们具有杀伤肿瘤细胞的能力而无需任何初免或事先活化。NK细胞分泌细胞因子，诸如IFNγ和TNFα，所述细胞因子作用于其它免疫细胞，如巨噬细胞和树突细胞，以增强免疫反应。NK细胞表面的活化受体识别在癌细胞和受感染细胞表面表达的分子并打开NK细胞。抑制性受体充当杀伤NK细胞的检查。大多数正常的健康细胞表达MHCI受体，将它们标记为“自身”。NK细胞表面的抑制性受体识别同源MHCI，其关闭NK细胞，防止其被杀伤。一旦决定杀伤，NK细胞就会释放出含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，从而导致靶细胞裂解。包括细胞因子分泌和细胞毒性在内的自然杀伤反应性受几种种系编码的抑制性受体和活化受体(诸如杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)和自然细胞毒性受体(NCR))的平衡所控制。靶细胞上I类MHC分子的存在作为NK细胞上I类MHC特异性受体即杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的一种此类抑制性配体。KIR受体的接合阻断NK活化，反常地保持了它们通过触发灭活信号来响应连续遭遇的能力。因此，如果KIR能够与I类MHC充分结合，则这种接合可覆盖杀伤信号并且允许靶细胞存活。相反，如果NK细胞不能与靶细胞上的I类MHC充分结合，则可以继续杀伤靶细胞。因此，那些表达低I类MHC并且被认为能够逃避T细胞介导的攻击的肿瘤可能反而对NK细胞介导的免疫反应敏感。
如本文所用，术语“自然杀伤T细胞”或“NKT”是指恒定自然杀伤T(iNKT)细胞，也称为I型NKT细胞，以及表达CD3和αβT细胞受体(TCR)(在本文中称为“自然杀伤αβT细胞”)或γΔTCR(在本文中称为“自然杀伤γΔT细胞”)的非恒定的(Vα24-和Vα24+)自然杀伤T细胞的所有亚类，其全部展示出对CD1抗原呈递的非蛋白质抗原应答的能力。所述发明的方法所涵盖的非恒定NKT细胞与I型NKT细胞共同之处是通常归因于自然杀伤(NK)细胞的表面受体的表达以及αβ或γΔTCR基因基因座重排/重组的TCR。
如本文所用，术语“恒定自然杀伤T细胞”与术语“iNKT”可互换使用，并且意在指表达T细胞受体(TCR)α的细胞的亚类，其表达受限的TCR库，该受限的TCR库在人类中由Vα24-Ja18 TCRα链组成，该链例如与Vβ11TCRβ链偶联。它涵盖CD3+Vα24+Vβ11+I型NKT细胞(CD3+CD4+CD8-Vα24+Vβ11+、CD3+CD4-CD8+Vα24+Vβ11+和CD3+CD4-CD8-Vα24+Vβ11+)以及那些可以通过基因表达或其它免疫分析确认为I型NKT细胞但具有下调的Vα24表面表达的细胞(CD3+Vα24-)的所有亚类。这包括表达或不表达调控转录因子FOXP3的细胞。与主要识别MHC分子呈递的肽抗原的常规T细胞不同，iNKT细胞识别非多态性1类MHC样CD1d呈递的糖脂抗原。
如本文所用，术语“模式识别受体”或“PRR”是指存在于细胞表面以识别细胞外病原体的受体；在感测到细胞内入侵者的内体中，最后在细胞质中。他们识别病原体的保守性分子结构，称为微生物特有的并且是微生物活力所必需的病原体相关分子模式(PAMP)。PRR分为四个家族：toll样受体(TLR)；核苷酸寡聚受体(NLR)；C型瘦素受体(CLR)和RIG-1样受体(RLR)。
如本文所用，术语“NKT细胞”是指包括CD3+Vα24+NKT细胞、CD3+Vα24-NKT细胞、CD3+Vα24-CD56+NKT细胞、CD3+Vα24-CD161+NKT细胞、CD3+γδ-TCR+ T细胞及其混合物的细胞群体。
如本文所用，术语“未扩增的”意在指尚未在培养物中(体外)生长以增加细胞群体中的细胞数目的细胞群体。
如本文所用，术语“总生存期”(OS)意在指从疾病(诸如癌症)诊断之日或开始治疗之日起，诊断患有该疾病的患者仍然存活时间长度。
如本文所用，术语“肠胃外”及其其它语法形式意在指不通过口腔或消化道在体内发生的物质的施用。例如，如本文所用的术语“肠胃外”是指通过注射的方式(即通过注射施用)或输注技术引入体内，注射包括例如皮下(即，在皮肤下注射)、肌内(即，向肌肉内注射)、静脉内(即，向静脉内注射)、鞘内(即，向脊髓周围或大脑蛛网膜下的空间注射)。
如本文所用，术语“穿孔素”意在指可以插入靶细胞膜并促进那些靶细胞裂解的分子。穿孔素介导的裂解受称为粒酶的酶增强。
如本文所用，“外周血单核细胞”或“PBMC”是指在外周血中发现的具有圆形核的免疫细胞，其留在Ficoll层的密度较低的上部界面(常常称为血沉棕黄层)上，并且是使用Ficoll分级分离方法时收集的细胞。这些细胞由淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞组成。在人类中，淋巴细胞占PBMC人口的大部分，其次是单核细胞，而树突细胞的百分比很小。
如本文所用，术语“药物组合物”意在指包含活性成分和药学上可接受的载体的组合物，其用于预防目标病状、综合征、病症或疾病，降低强度，治愈或以其它方式治疗。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意在指常规上可用于施用药物的任何基本上无毒的载体，在其中本发明的细胞产物将保持稳定并且可生物利用。药学上可接受的载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性以使其适于施用给受治疗的哺乳动物。它还应保持活性剂的稳定性和生物利用率。药学上可接受的载体可以是液体或固体，并且当与活性剂和给定组合物的其它组分组合时，应考虑计划的施用方式进行选择，以提供所需的体积、稠度等。
如本文所用，如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医疗判断范围内，适合与人和低等动物的组织接触使用而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应等并且与合理的益处/风险比相称的那些盐。当在药品中使用时，盐应该是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐。此类盐包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。同样，此类盐可以制备为碱金属盐或碱土金属盐，诸如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。“药学上可接受的”意指在合理的医疗判断范围内，适合与人和低等动物的组织接触使用而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应等并且与合理的益处/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，P.H.Stahl等人在“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,andUse”中详细地描述了药学上可接受的盐(Wiley VCH,Zurich,Switzerland:2002)。所述盐可在本发明中描述的化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或通过使游离碱官能团与合适的有机酸反应而单独地制备。代表性的酸加成盐的实例包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸酯、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。另外，碱性含氮基团可以用诸如以下的试剂季铵化：低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基的硫酸盐；长链卤化物，诸如癸基、月桂基、肉豆蔻基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，如苄基和苯乙基的溴化物等。因此可获得水溶性或油溶性或可分散产物。可用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括诸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸的无机酸，以及诸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸的有机酸。碱加成盐可以在本发明中描述的化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，方法是使含羧酸的部分与合适的碱，诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应。药学上可接受的盐包括但不限于：基于碱金属和碱土金属的阳离子，诸如锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等，以及非毒性季铵以及胺阳离子，包括铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺等。可用于形成碱加成盐的其它代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。药学上可接受的盐也可使用本领域中熟知的标准程序获得，例如通过使如胺的充足碱性化合物与提供生理可接受的阴离子的适合酸反应。也可制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙或镁)盐。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的此类类似物的本质性质是，当掺入蛋白质中时，该蛋白质与对相同蛋白质引发的但完全由天然存在的氨基酸组成的抗体有特异性反应性。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化。众所周知并且如上所述，认识到多肽可能不是完全线性的。例如，多肽可以由于泛素化而支化，并且它们可以是环状的，有或无支化，通常是由于翻译后事件，包括自然加工事件和不会自然发生的通过人为操纵而引起的事件的结果。环状多肽、支化多肽和支化的环状多肽也可以通过非翻译天然方法合成并且也可以通过完全合成方法来合成。根据一些实施方案，所述肽具有任何长度或大小。
如本文所用，术语“纯化”意在指不含多余或不希望有的元素。
如本文所用，关于癌症的术语“复发”意在指通常在无法检测到癌症的一段时间之后复发(回复)的癌症。癌症可能会回复到与原始(原发性)肿瘤相同的地方，或者回复到体内的另一个地方。
如本文所用，术语“抗药性癌症”意在指在此类治疗开始时或在此类治疗期间的某个时间对治疗无反应的癌症。
如本文所用，术语“分泌”及其各种语法形式意在指由细胞产生生理活性物质并将其移出形成它的细胞。
如本文所用，如本文所用的任何语法形式的术语“刺激”意在指诱导活化或增加活性。
如本文所用，术语“足以刺激NKT细胞扩增”是指促进I型NKT细胞优先扩增的信号传导事件或刺激的量或水平，例如α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)或其类似物或功能等同物的量。
如本文所用，术语“足以刺激NKT细胞活化”是指促进I型NKT细胞的细胞因子分泌或细胞杀伤活性的信号传导事件或刺激的量或水平，例如IL-2、IL-7、IL-15和IL-12的量。
如本文所用，术语“受试者”或“个体”或“患者”可互换使用，是指哺乳动物起源的动物物种的成员，包括人。
如本文所用，除非短语的上下文和用法另有说明，否则短语“有需要的受试者”意在指这样的患者：(i)将施用根据所述发明的免疫原性组合物(例如I型NKT细胞群体)，(ii)正在接受根据所述发明的免疫原性组合物(例如，I型NKT细胞群体)；或(iii)已经接受了根据所述发明的免疫原性组合物(例如I型NKT细胞群体)。
如本文所用，术语“超活化细胞因子杀伤T细胞”(或SCKTC)是指通过使CKTC在体外与细胞因子IL-2、IL-7、IL-15和IL-12以预定添加顺序和时间接触而衍生自细胞因子杀伤T细胞(CKTC)的细胞。
如本文所用，术语“T细胞受体”(TCR)意在指响应于抗原参与T细胞活化的整合膜蛋白的复合物。由大多数T细胞表达的TCR由α和β链组成。一小组T细胞表达由γ和δ链组成的受体。在α/βT细胞中有两个子谱系：表达共受体分子CD4的子谱系(CD4+细胞)和表达CD8的子谱系(CD8+细胞)。这些细胞在识别抗原的方式及其效应子功能和调节功能方面有所不同。
原初的常规CD4 T细胞可以分化为四个不同的T细胞群体，这一过程由它们在与抗原的初始相互作用过程中接收的信号模式决定。这4个T细胞群体是Th1、Th2、Th17和诱导调节性T(iTreg)细胞。作为细胞免疫反应的有效诱导物的Th1细胞，介导针对细胞内病原体的免疫反应，并负责诱导一些自身免疫性疾病。它们的主要细胞因子产物是IFNγ(增强在活化巨噬细胞中很重要的几种机制以增加其杀微生物活性)、淋巴毒素α(LTα)和对CD4 T细胞记忆很重要的IL-2。有效帮助B细胞发育为产生抗体的细胞的Th2细胞，介导宿主对细胞外寄生虫的防御，在哮喘和其它过敏性疾病的诱导和持续中很重要，并且产生IL-4、IL-5、IL-9、IL-10(其阻遏Th1细胞增殖并且可以阻遏树突细胞功能)、IL-13、IL-25(通过IL-17RB进行信号传导，增强c-kit-FcεRI-非淋巴细胞群体的IL-4、IL-5和IL-13的产生，充当Th2反应的起始因子以及扩增因子)和双调蛋白(amphiregulin)。Th2细胞产生的IL-4和IL-10阻断Th1细胞产生IFNγ。Th17细胞产生IL-17a、IL-17f、IL-21和IL-22。IL-17a可以诱导许多炎性细胞因子、IL6以及趋化因子(诸如IL-8)，并且在诱导炎性反应中起重要作用。Treg细胞在维持自我耐受和调节免疫反应中起关键作用。它们通过几种机制发挥其阻遏功能，其中一些机制需要细胞与细胞接触。在一些情况下，阻遏的分子基础是通过它们产生包括TGFβ、IL-10和IL-35在内的细胞因子。如果iTreg细胞来自原初CD4 T细胞，则T reg细胞产生的TGFβ也可导致诱导。CD4+ T细胞在其表面上携带对B细胞II类/肽复合物具有特异性的受体。B细胞活化不仅取决于T细胞通过其T细胞受体(TCR)的结合，而且这种相互作用还允许T细胞上的活化配体(CD40配体)与其在B细胞上的受体(CD40)结合以信号传导B细胞活化。Zhu,J.和Paul,WE,Blood(2008)112:1557-69)。静息原初CD8+T细胞受抗原呈递细胞初免时(所述抗原呈递细胞已经通过在诸如淋巴结和脾脏等次要淋巴器官中直接感染或交叉呈递而从感染的巨噬细胞获取了抗原)，通过大量扩增并分化为细胞毒性T淋巴细胞效应细胞而与病原体发生反应，所述效应细胞迁移到身体的各个角落以清除感染。然而，在大多数病毒感染中，CD8 T细胞的活化需要CD4效应T细胞帮助才能活化树突细胞，使其变得能够刺激完整的CD8 T细胞反应。识别APC呈递的相关抗原的CD4 T细胞可通过进一步活化APC来扩增原初CD8 T细胞的活化。树突细胞表达的B7首先活化CD4 T细胞以表达IL-2和CD40配体。CD40配体结合树突细胞上的CD40，传递增加树突细胞对B7和4-1BBL的表达的附加信号，进而为原初CD8 T细胞提供附加共刺激。活化的CD4 T细胞产生的IL-2也起促进效应CD T细胞分化的作用。
CD3(TCR复合物)是由四条不同链组成的蛋白质复合物。在哺乳动物中，该复合物含有一条CD3γ链、一条CD3δ链和两条CD3ε链，这些链与T细胞受体(TCR)和ζ链缔合以在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR、ζ链和CD3分子一起构成TCR复合物。CD3分子的细胞内尾含有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的保守性基序，该基序对于TCR的信号传导能力至关重要。在ITAM磷酸化后，CD3链可以结合ZAP70(ζ相关蛋白)，ZAP70是一种涉及T细胞信号传导级联反应的激酶。
如本文所用，术语“治疗剂”意在指提供治疗作用的药物、分子、核酸、蛋白质、代谢产物、组合物或其它物质。如本文所用，术语“活性”是指是产生预期治疗效果的原因的所述发明的组合物的成分、组分或组成部分。术语“治疗剂”和“活性剂”在本文中可互换使用。如本文所用，术语“治疗组分”是指消除、减少或防止特定疾病表现在一定百分比的群体中进展的治疗有效用量(即，施用的剂量和频率)。常用治疗组分的实力是ED50，它以对50％群体中的特定疾病表现具有治疗效果的特定用量来描述剂量。
如本文所用，术语活性剂的“治疗量”、“治疗有效量”、“有效量”或“药学有效量”可互换使用，是指足以提供预期治疗益处的量。然而，用量水平基于多种因素，包括损伤的类型、患者的年龄、体重、性别、身体状况、病状的严重程度、施用途径以及所采用的特定活性剂。因此，用量方案可以广泛变化，但是可以由医师使用标准方法常规性地确定。另外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药学有效量”包括所述发明的组合物的预防量或防止量。在所述发明的预防性或防止性应用中，将药物组合物或药物以足以消除或降低风险，减轻严重程度或延迟疾病、病症或病状的发作，包括该疾病、病症或病状的生物化学、组织学和/或行为症状，以及在该疾病、病症或病状发展过程中呈现的中间病理表型的量施用给对该疾病、病症或病状敏感或另外处于该疾病、病症或病状的风险中的患者。通常优选使用最大剂量，即根据一些医学判断的最高安全剂量。术语“剂量”和“用量”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗效果”意在指治疗结局，经判断其结果是合乎需要且有益的。治疗效果可包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现。治疗效果还可以包括直接或间接地阻止疾病表现的进展的减少或消除。
对于本文所述的任何治疗剂，有效量最初可以从初步的体外研究和/或动物模型中确定。治疗有效剂量也可以从人类数据中确定。可以基于所施用化合物的相对生物利用率和效力来调整所施加的剂量。基于以上所述方法和其它众所周知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力范围内。
下文总结了测定治疗效果的一般原理，所述原理可在通过引用并入本文的Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill(New York)(2001)的第1章中找到。
药代动力学原理提供了修改用量方案以获得所需程度的治疗功效且具有最小的不可接受的副作用的基础。在药物的血浆浓度可以测量并与治疗窗口相关的情形下，可以获得用量修改的其它指导。
如果药物产品含有相同的活性成分并且在强度或浓度、剂型和施用途径方面相同，则视为药物等同物。当两种产品中活性成分的生物利用速率和程度在合适的测试条件下没有显著差异时，则认为这两种药学上等同的药物产品是生物等效的。
如本文所用，术语“治疗”包括废除、基本上抑制、减缓或逆转病状的进展，基本上改善病状的临床症状或基本上防止病状的临床症状的出现。治疗还指实现以下一项或多项：(a)减轻疾病的严重程度；(b)限制所治病症所特有的症状的发展；(c)限制所治病症所特有的症状的恶化；(d)限制该疾病在先前患有该病症的患者中的复发；以及(e)限制先前该病症无症状的患者中的症状复发。
根据所述发明，可采用本领域技术人员水平内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。文献中全面解释了此类技术。参见，例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(本文中“Sambrook等人1989”)；DNACloning:A practical Approach，第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；OligonucleotideSynthesis(M J.Gait编辑1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985)；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins(1984)；AnimalCell Culture(R.I.Freshney,编辑(1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,(1986)；B.Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&amp；Sons,Inc.(1994)；等等。
制备包含含有扩增和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞(SCKTC)群体的细胞产物的药物组合物的方法
根据另一方面，本公开描述了一种制备包含扩增的超活化细胞因子杀伤T细胞(SCKTC)群体的药物组合物的方法，所述方法按顺序包括：
(a)分离包含细胞因子杀伤T细胞(CKTC)群体的单核细胞(MC)群体；
(b)任选地在无菌条件下将(a)的制备物运输至加工设施；
(c)在培养系统中培养MC群体；
(d)使步骤(c)的所述培养系统与α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)或其类似物或功能等同物，与包含CD1d和αGalCer或其类似物或功能等同物的细胞群体，或与两者接触，其中所述接触足以刺激CKTC扩增；
(e)使步骤(d)的所述培养系统与IL-2、IL-7、IL-15和IL-12以预定的添加顺序和时间接触，其中所述接触足以刺激CKTC活化并形成所述富集的SCKTC细胞群体；
(f)从所述培养系统中收集所述富集的SCKTC细胞群体，以形成SCKTC细胞产物；其中(f)的富集的SCKTC群体的特征在于以下的一项或多项：与(a)的所述CKTC群体相比，分泌效应细胞因子的能力提高或细胞毒性提高；并且
(g)将细胞产物与药学上可接受的载体一起配制以形成药物组合物。
根据一些实施方案，单核细胞的来源是血液。根据一些此类实施方案，血液是外周血并且MC是外周血MC(PBMC)。根据一些实施方案，PBMC源自人类受试者。根据一些实施方案，MC从Ficoll-Paque梯度级分中分离。
根据一些实施方案，(c)中的培养持续长达1天，长达2天，长达3天，长达4天，长达5天，长达6天，长达7天，长达8天，长达9天，长达10天，长达11天，长达12天，长达13天，长达14天，长达15天，长达16天，长达17天，长达18天，长达19天，长达20天，长达21天或更长。根据一些实施方案，(c)中的培养持续使至少一些CTKC粘附至培养系统表面有效的时间。根据一些实施方案，步骤(c)任选地包括在进行步骤(d)之前，使所述MC重新悬浮并将所述MC的浓度调节至约5×105个细胞/ml至约3×106个细胞/ml(包括端值)的范围。根据一个实施方案，步骤(c)任选地包括在进行步骤(c)之前使所述MC重新悬浮并将MC的浓度调节至约5×105个细胞/ml、约5.1×105个细胞/ml、约5.2×105个细胞/ml、约5.3×105个细胞/ml、约5.4×105个细胞/ml、约5.5×105个细胞/ml、约5.6×105个细胞/ml、约5.7×105个细胞/ml、约5.8×105个细胞/ml、约5.9×105个细胞/ml、约6×105个细胞/ml、约6.1×105个细胞/ml、约6.2×105个细胞/ml、约6.3×105个细胞/ml、约6.4×105个细胞/ml、约6.5×105个细胞/ml、约6.6×105个细胞/ml、约6.7×105个细胞/ml、约6.8×105个细胞/ml、约6.9×105个细胞/ml、约7×105个细胞/ml、约7.1×105个细胞/ml、约7.2×105个细胞/ml、约7.3×105个细胞/ml、约7.4×105个细胞/ml、约7.5×105个细胞/ml、约7.6×105个细胞/ml、约7.7×105个细胞/ml、约7.8×105个细胞/ml、约7.9×105个细胞/ml、约8×105个细胞/ml、约8.1×105个细胞/ml、约8.2×105个细胞/ml、约8.3×105个细胞/ml、约8.4×105个细胞/ml、约8.5×105个细胞/ml、约8.6×105个细胞/ml、约8.7×105个细胞/ml、约8.8×105个细胞/ml、约8.9×105个细胞/ml、约9×105个细胞/ml、约9.1×105个细胞/ml、约9.2×105个细胞/ml、约9.3×105个细胞/ml、约9.4×105个细胞/ml、约9.5×105个细胞/ml、约9.6×105个细胞/ml、约9.7×105个细胞/ml、约9.8×105个细胞/ml、约9.9×105个细胞/ml、约1×106个细胞/ml、约1.1×105个细胞/ml、约1.2×105个细胞/ml、约1.3×105个细胞/ml、约1.4×105个细胞/ml、约1.5×106个细胞/ml、约1.6×105个细胞/ml、约1.7×105个细胞/ml、约1.8×105个细胞/ml、1.9×105个细胞/ml、约2×106个细胞/ml、约2.1×105个细胞/ml、约2.2×105个细胞/ml、约2.3×105个细胞/ml、2.4×105个细胞/ml、约2.5×106个细胞/ml、约2.6×105个细胞/ml、约2.7×105个细胞/ml、2.8×105个细胞/ml、2.9×105个细胞/ml或约3×106个细胞/ml。
根据一些实施方案，所述αGalCer或其类似物或功能等同物为OCH。根据一个实施方案，所述αGalCer或其类似物或功能等同物为具有以下结构式的α-GalCer类似物：
Figure BDA0003160278680000581
根据一些实施方案，从步骤(c)至步骤(f)，将所述αGalCer或其类似物或功能等同物维持在恒定浓度。在另一个实施方案中，αGalCer或其类似物或功能等同物的浓度范围为约50ng/ml至约500ng/ml、约100ng/ml至约500ng/ml、约150ng/ml至约500ng/ml、约200ng/ml至约500ng/ml、约250ng/ml至约500ng/ml、约300ng/ml至约500ng/ml、约350ng/ml至约500ng/ml、约400ng/ml至约500ng/ml或约450ng/ml至约500ng/ml。根据一些实施方案，αGalCer或其类似物或功能等同物的浓度保持在以下浓度：约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约110ng/ml、约120ng/ml、约130ng/ml、约140ng/ml、约150ng/ml、约160ng/ml、约170ng/ml、约180ng/ml、约190ng/ml、约200ng/ml、约210ng/ml、约220ng/ml、约230ng/ml、约240ng/ml、约250ng/ml、约260ng/ml、约270ng/ml、约280ng/ml、约290ng/ml、约300ng/ml、约310ng/ml、约320ng/ml、约330ng/ml、约340ng/ml、约350ng/ml、约360ng/ml、约370ng/ml、约380ng/ml、约390ng/ml、约400ng/ml、约410ng/ml、约420ng/ml、约430ng/ml、约440ng/ml、约450ng/ml、约460ng/ml、约470ng/ml、约480ng/ml、约490ng/ml或约500ng/ml。
根据本文所述方法的一些实施方案，从步骤(e)至步骤(f)，IL-2维持在恒定浓度。根据一些实施方案，IL-2的浓度为约10U/ml至约100U/ml，例如约10U/ml至约100U/ml、约15U/ml至约100U/ml、约20U/ml至约100U/ml、约25U/ml至约100U/ml、约30U/ml至约100U/ml、约35U/ml至约100U/ml、约40U/ml至约100U/ml、约45U/ml至约100U/ml、约50U/ml至约100U/ml、约55U/ml至约100U/ml、约60U/ml至约100U/ml、约65U/ml至约100U/ml、约70U/ml至约100U/ml、约75U/ml至约100U/ml、约80U/ml至约100U/ml、约85U/ml至约100U/ml、约90U/ml至约100U/ml或约95U/ml至约100U/ml。根据一些实施方案，IL-2的浓度为约10U/ml、约15U/ml、约20U/ml、约25U/ml、约30U/ml、约35U/ml、约40U/ml、约45U/ml、约50U/ml、约55U/ml、约60U/ml、约65U/ml、约70U/ml、约75U/ml、约80U/ml、约85U/ml、约90U/ml、约95U/ml或约100U/ml。
根据本文所述方法的一些实施方案，从步骤(e)至步骤(f)，IL-7维持在恒定浓度。根据一些实施方案，IL-7的浓度为约10ng/ml至约200ng/ml，例如约10ng/ml至约200ng/ml、约20ng/ml至约200ng/ml、约30ng/ml至约200ng/ml、约40ng/ml至约200ng/ml、约50ng/ml至约200ng/ml、约60ng/ml至约200ng/ml、约70ng/ml至约200ng/ml、约80ng/ml至约200ng/ml、约90ng/ml至约200ng/ml、约100ng/ml至约200ng/ml、约110ng/ml至约200ng/ml、约120ng/ml至约200ng/ml、约130ng/ml至约200ng/ml、约140ng/ml至约200ng/ml、约150ng/ml至约200ng/ml、约160ng/ml至约200ng/ml、约170ng/ml至约200ng/ml、约180ng/ml至约200ng/ml或约190ng/ml至约200ng/ml。根据一些实施方案，IL-7的浓度为约10ng/ml、约15ng/ml、约20ng/ml、约25ng/ml、约30ng/ml、约35ng/ml、约40ng/ml、约45ng/ml、约50ng/ml、约55ng/ml、约60ng/ml、约65ng/ml、约70ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约85ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约110ng/ml、约15ng/ml、约120ng/ml、约125ng/ml、约130ng/ml、约135ng/ml、约140ng/ml、约145ng/ml、约150ng/ml、约155ng/ml、约160ng/ml、约165ng/ml、约170ng/ml、约175ng/ml、约180ng/ml、约185ng/ml、约190ng/ml、约195ng/ml或约200ng/ml。
根据一些实施方案，在培养的约第6天至第8天之间，在步骤(e)中添加IL-2。根据一些实施方案，在培养的约第6天，在步骤(e)中添加IL-2。根据一些实施方案，在培养的约第7天，在步骤(e)中添加IL-2。根据一些实施方案，在培养的约第8天，在步骤(e)中添加IL-2。
根据一些实施方案，在培养的约第6天至第8天之间，在步骤(e)中添加IL-7。根据一些实施方案，在培养的约第6天，在步骤(e)中添加IL-7。根据一些实施方案，在培养的约第7天，在步骤(e)中添加IL-7。根据一些实施方案，在培养的约第8天，在步骤(e)中添加IL-7。
根据一些实施方案，同时添加IL-2和IL-7。根据一些实施方案，在第7天同时添加IL-2和IL-7。
根据一些实施方案，在培养的约第13天至第15天之间，在步骤(e)中添加IL-15。根据一些实施方案，在培养的约第13天，在步骤(e)中添加IL-15。根据一些实施方案，在培养的约第14天，在步骤(e)中添加IL-15。根据一些实施方案，在培养的约第15天，在步骤(e)中添加IL-15。
根据一些实施方案，在培养的约第19天至第21天之间，在步骤(e)中添加IL-15。根据一些实施方案，在培养的约第19天，在步骤(e)中添加IL-12。根据一些实施方案，在培养的约第20天，在步骤(e)中添加IL-12。根据一些实施方案，在培养的约第21天，在步骤(e)中添加IL-12。
根据一些实施方案，步骤(f)至少在第21天进行。根据一些实施方案，步骤(f)在第21天进行。根据一些实施方案，步骤(f)在第22天进行。根据一些实施方案，步骤(f)在第23天进行。根据一些实施方案，步骤(f)在第24天进行。
根据本文所述方法的一些实施方案，从步骤(e)至步骤(f)，IL-15维持在恒定浓度。根据一些实施方案，IL-15的浓度为约10ng/ml至约100ng/ml，例如约10ng/ml至约100ng/ml、约15ng/ml至约100ng/ml、约20ng/ml至约100ng/ml、约25ng/ml至约100ng/ml、约30ng/ml至约100ng/ml、约35ng/ml至约100ng/ml、约40ng/ml至约100ng/ml、约45ng/ml至约100ng/ml、约50ng/ml至约100ng/ml、约55ng/ml至约100ng/ml、约60ng/ml至约100ng/ml、约65ng/ml至约100ng/ml、约70ng/ml至约100ng/ml、约75ng/ml至约100ng/ml、约80ng/ml至约100ng/ml、约85ng/ml至约100ng/ml、约90ng/ml至约100ng/ml或约95ng/ml至约100ng/ml。根据一些实施方案，IL-15的浓度为约10ng/ml、约15ng/ml、约20ng/ml、约25ng/ml、约30ng/ml、约35ng/ml、约40ng/ml、约45ng/ml、约50ng/ml、约55ng/ml、约60ng/ml、约65ng/ml、约70ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约85ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml或约100ng/ml。
根据本文所述方法的一些实施方案，从步骤(e)至步骤(f)，IL-12维持在恒定浓度。
根据一些实施方案，所述方法还包括在步骤(e)和(f)之间，将培养物从加工设施运输到治疗设施的步骤。根据一些实施方案，运输步骤在添加IL-12的至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时或至少24小时内开始。
根据一些实施方案，IL-12的浓度为约10ng/ml至约100ng/ml，例如约10ng/ml至约100ng/ml、约15ng/ml至约100ng/ml、约20ng/ml至约100ng/ml、约25ng/ml至约100ng/ml、约30ng/ml至约100ng/ml、约35ng/ml至约100ng/ml、约40ng/ml至约100ng/ml、约45ng/ml至约100ng/ml、约50ng/ml至约100ng/ml、约55ng/ml至约100ng/ml、约60ng/ml至约100ng/ml、约65ng/ml至约100ng/ml、约70ng/ml至约100ng/ml、约75ng/ml至约100ng/ml、约80ng/ml至约100ng/ml、约85ng/ml至约100ng/ml、约90ng/ml至约100ng/ml或约95ng/ml至约100ng/ml。根据一些实施方案，IL-12的浓度为约10ng/ml、约15ng/ml、约20ng/ml、约25ng/ml、约30ng/ml、约35ng/ml、约40ng/ml、约45ng/ml、约50ng/ml、约55ng/ml、约60ng/ml、约65ng/ml、约70ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约85ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml或约100ng/ml。
根据一些实施方案，所述方法还包括每2至3天在培养系统中补充培养基的步骤。根据一些实施方案，补充步骤包括将负载有αGalCer或其类似物或功能等同物的新鲜树突细胞的脉冲添加至培养系统。根据一些实施方案，包含CD1d和αGalCer的新鲜细胞群体的脉冲数为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10。
根据一些实施方案，步骤(c)-(f)在选自X-VIVO-15无血清培养基和含有10％胎牛血清(FBS)或10％自体血清的RPMI 1640培养基中的培养基中进行。
抗原呈递细胞
根据一些实施方案，包含CD1d和α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)的所述细胞是抗原呈递细胞。抗原呈递细胞是能够在其表面以可被免疫系统的特异性效应细胞识别的肽-MHC复合物的形式展示一种或多种抗原，从而诱导针对所呈递的一种或多种抗原的有效细胞免疫反应的一类细胞。专业APC的实例是树突细胞和巨噬细胞，但表达I类MHC分子或II类MHC分子的任何细胞都可以潜在地呈递肽抗原。根据一些实施方案，APC可以是经工程改造以呈递一种或多种抗原的细胞或细胞群体(即，人工APC(aAPC))。
根据一些实施方案，抗原呈递细胞是树突细胞(DC)。根据一些实施方案，树突细胞负载有αGalCer。根据另一个实施方案，负载有αGalCer的树突细胞源自MC并且是贴壁细胞。根据制备负载有αGalCer的树突细胞的方法中的另一个实施方案，负载有αGalCer的树突细胞是贴壁细胞。
根据一些实施方案，通过以下方法制备负载有αGalCer的树突细胞，所述方法包括：(a)分离单核细胞(MC)群体；(b)在培养系统中培养MC群体；(c)使所述培养系统与IL-4和GM-CSF接触，其中所述接触足以诱导MC分化为树突细胞；(d)使所述培养系统与αGalCer接触，其中所述接触足以使树突细胞负载αGalCer。
根据制备负载有αGalCer的树突细胞的方法的一些实施方案，当开始培养时，MC群体包含约1×105个细胞/ml至约5×106个细胞/ml。根据一些实施方案，MC群体为约1×105个细胞/ml、约1.5×105个细胞/ml、约1×105个细胞/ml、约1.5×105个细胞/ml、约3×105个细胞/ml、约3.5×105个细胞/ml、约4×105个细胞/ml、约4.5×105个细胞/ml、约5×105个细胞/ml、约5.5×105个细胞/ml、约6×105个细胞/ml、约6.5×105个细胞/ml、约7×105个细胞/ml、约7.5×105个细胞/ml、约8×105个细胞/ml、约8.5×105个细胞/ml、约9×105个细胞/ml、约9.5×105个细胞/ml、约1×106个细胞/ml、约1.5×106个细胞/ml、约2×106个细胞/ml、约2.5×106个细胞/ml、约3×106个细胞/ml、约3.5×106个细胞/ml、约4×106个细胞/ml、约4.5×106个细胞/ml或约5×106个细胞/ml。
根据一个实施方案，步骤(c)中IL-4的浓度为约500U/ml。根据一个实施方案，IL-4的浓度在约400-600U/ml之间，例如约400U/ml、约450U/ml、约500U/ml、约550U/ml、约600U/ml。根据一个实施方案，步骤(c)中GM-CSF的浓度为约50ng/ml。根据一个实施方案，步骤(c)中GM-CSF的浓度在约40-60ng/ml之间，例如约40ng/ml、约45ng/ml、约50ng/ml、约55ng/ml。或约60ng/ml。根据一个实施方案，步骤(d)在步骤(b)之后约5天至约7天进行。根据一个实施方案，步骤(d)在步骤(b)之后约5天进行。根据一个实施方案，步骤(d)在步骤(b)之后约6天进行。根据一个实施方案，步骤(d)在步骤(b)之后约7天进行。
根据一些实施方案，步骤(c)-(e)在选自含10％。FBS或自体血清的RPMI 1640培养基的培养基中进行。
用α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)和类似物刺激CKTC
在初次刺激后，尤其是非哺乳动物糖鞘脂(GSL)对α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)的响应后，I型NKT细胞产生大量干扰素(IFN)-γ和白细胞介素(IL)-4，导致DC、NK细胞、B细胞和常规T细胞的下游活化。α-GalCer(也称为KRN7000)是海绵神经酰胺(agelasphin)的简化糖脂类似物，海绵神经酰胺最初是从海绵(Agelas mauritianus)中分离出来的(Kobayahi等人，Oncol Res.1995；7(10–11):529)α-GalCer由α-连接的半乳糖、植物鞘氨醇和酰基链组成。I型NKT细胞TCR对α-GalCer-CD1d复合物的识别引起一系列细胞因子的分泌，以及强大免疫反应的引发。OCH是一种具有较短植物鞘氨醇链的α-GalCer类似物，刺激I型NKT细胞分泌比IFN-γ量更高的IL-4，从而触发针对Th2的免疫反应(Journal ofBiomedical Science 2017,24:22)。已经合成并测试了经过化学修饰以诱导比α-GalCer更精确和可预测的细胞因子图谱的合成糖脂或α-GalCer类似物。通过引用整体并入本文的Hung,J-T等人(Journal of Biomedical Science(2017)24:22)，描述了许多α-GalCer类似物。通过引用整体并入本文的美国专利号9,365,496也描述了各种具有以下结构式的α-GalCer类似物：
Figure BDA0003160278680000641
已经描述了另一类I型NKT细胞激动剂β-ManCer(O’Konek等人，J ClinInvest.2011年2月；121(2):683-94)。该化合物具有与α-GalCer(KRN7000)相同的神经酰胺结构，有助于与CD1d结合，并具有β-连接的甘露糖而不是α-连接的半乳糖。在该领域中据信，α-连接的糖部分是α-GalCer引起肿瘤免疫的关键特征。因此，出乎意料的是发现了β-ManCer相对强的抗肿瘤活性。虽然β-ManCer诱导的保护作用是I型NKT细胞依赖性的，但该保护作用不依赖于IFN-γ，而是依赖于TNF-α和一氧化氮合酶(NOS)。此外，与独特的保护机制一致，当使用次优剂量时，α-GalCer和β-ManCer协同诱导肿瘤免疫。另外，β-ManCer在I型NKT细胞中诱导长期无变应性的能力比α-GalCer弱得多(O’Konek等人，Clin CancerRes.2013年8月15日；19(16):4404-11)。与α-GalCer类似，β-ManCer可以增强肿瘤疫苗的作用(Mattarollo等人，Blood.2012年10月11日；120(15):3019-29)。因此，I型NKT细胞可以使用依赖于它们识别抗原的多个途径/机制。
根据一些实施方案，所述发明的CKTC群体包含CD3+ T细胞亚群。根据一些实施方案，CKTC群体包含NKT细胞亚群。根据一个实施方案，NKT细胞亚群包含CD3+Vα24+细胞。根据一个实施方案，NKT细胞亚群包含CD3+Vα24-细胞。根据一个实施方案，NKT细胞亚群包含CD3+CD56+细胞。根据一些实施方案，NKT细胞亚群包含1型NKT细胞亚群。根据一些实施方案，NKT细胞亚群的T细胞受体包含Vα24-Ja18 TCRα链。根据一些实施方案，NKT细胞亚群的T细胞受体包含Vα24-Ja18 TCRα链和Vβ11β链。根据一些实施方案，NKT细胞亚群识别CD1d呈递的糖脂抗原。根据一些实施方案，糖脂抗原是αGalCer或其类似物或功能等同物。
CKTC扩增和活化
当用α-GalCer刺激I型NKT细胞时，它们会产生IFN-γ。同时，它们通过CD40-CD40L相互作用活化抗原呈递细胞(APC)，尤其是诱导DC成熟并上调共刺激受体，诸如CD80和CD86。DC与I型NKT细胞相互作用时，也会产生IL-12。IL-12诱导其它T细胞产生更多的IFN-γ并与IFN-γ一起在下游效应子(诸如NK细胞、CD8+ T细胞和γδT细胞)的活化中起关键作用(Paget等人，J Immunol.2012年4月15日；188(8):3928-39)。I型NKT细胞与APC的相互作用向APC提供活化信号(即许可)，致使它们能够通过CD70和CCL17的诱导与CD8+ T细胞交叉初免(Taraban等人，J Immunol.2008年4月1日；180(7):4615-20；Fujii等人，ImmunolRev.2007年12月；220():183-98)。
根据一些实施方案，CKTC群体的活化可以包括以下一项或多项：诱导CKTC群体分泌细胞因子，刺激CKTC群体的增殖，或调节一种或多种标志物在CKTC细胞表面上的表达。根据一些实施方案，表达受调节的细胞因子是选自由IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6或IL-10组成的组中的一种或多种。
CKTC群体的活化和扩增可以通过如本文所述的各种测定法进行测量。可以测量的示例性活性包括增殖的诱导、CKTC群体中活化标志物的表达的诱导、CKTC群体的细胞因子分泌的诱导、CKTC群体中信号传导的诱导，以及CKTC群体的细胞毒活性的增加。
细胞因子分泌
可以通过测定细胞因子的分泌来评估或测量CKTC活化形成SCKTC，所述细胞因子包括γ干扰素(IFNγ)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)或白细胞介素10(IL-10)。根据一些实施方案，使用ELISA测定细胞因子分泌，例如γ干扰素(IFNγ)、IL-4、IL-5、IL-6或IL-10的分泌。可以使用ELISPOT(酶联免疫斑点)技术检测响应于本文所述的方法分泌给定细胞因子(例如，γ干扰素(IFNγ))的CKTC和SCKTC。例如，可以建立培养系统，借此将通过本文所述方法产生的CKTC或SCKTC群体在已经用抗IFNγ抗体包被的孔中进行培养。分泌的IFNγ被包被的抗体捕获，然后揭示有与发色底物偶联的第二抗体。局部分泌的细胞因子分子形成斑点，每个斑点对应一个分泌IFNγ的细胞。点的数目允许测定分析样品中分泌IFNγ的细胞的频率。还描述了ELISPOT测定法用于检测肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和分泌颗粒酶B的淋巴细胞(Klinman D,Nutman T.Current protocols in immunology.New York,N.Y:John Wiley&Sons,Inc.；1994.第6.19.1–6.19.8页，通过引用整体并入本文)。
可以使用细胞内细胞因子的流式细胞术分析测量培养上清液中的细胞因子含量，但未提供有关实际分泌细胞因子的NKT细胞数目的信息。当用分泌抑制剂(诸如莫能菌素或布雷菲德菌素A)处理淋巴细胞时，它们在活化后会在其细胞质内积聚细胞因子。固定和透化作用后，可以通过细胞计数法定量细胞内细胞因子。该技术允许测定产生的细胞因子、产生这些细胞因子的细胞类型以及每个细胞产生的细胞因子的数量。
根据一些实施方案，富集的SCKTC群体的细胞因子产生的特征在于IL-4低、IL-5低、IL-6低、IL-10低、IFNγ高。
根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IFN-γ的量为约5000pg/ml或更高。
根据一些实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量为约5pg/ml。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量为约4.5pg/ml。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量为约4pg/ml。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量为约3.5pg/ml。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量为约3pg/ml。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量为约2.5pg/ml。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量为约2pg/ml。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量为约1.5pg/ml。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量为约1pg/ml。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量在约1.0至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量在约1.5至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量在约2.0至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量在约2.5至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量在约3.0至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量在约3.5至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量在约4.0至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，所述细胞群体产生的IL-4的量在约4.5至约5pg/ml之间。
根据一些实施方案，IFNγ与IL-4的比率是CKTC和SCKTC的一种或多种T细胞效应子功能(诸如细胞杀伤和细胞活化)的指标。根据一些实施方案，所述方法对于达到至少为1000的IFNγ:IL4比率，比对照CTKC细胞增加至少1.5倍的杀伤率或两者是有效的。
根据一个实施方案，培养上清液中的IFN-γ:IL-4比率等于或大于1000。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于1200。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于1300。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1400。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于1500。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于1550。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1600。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1650。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1700。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1750。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1800。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1850。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1900。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1950。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2000。根据一个实施方案，IFNγ:IL-4比率等于或大于2050。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2100。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2150。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2200。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2250。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2300。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2350。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2400。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2450。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2500。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2550。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2600。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2650。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2700。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2750。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2800。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2850。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2900。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2950。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于3000。
细胞毒性
可以通过在所述方法的每个步骤中测定CKTC的细胞毒活性来评估CKTC活化形成SCKTC。
可以通过本领域技术人员已知的任何合适的技术来评估细胞毒活性。例如，可以在标准的细胞毒性测定中在适当的时间段之后测定包含通过本文所述方法产生的CKTC或SCKTC群体的样品的细胞毒活性。此类测定法可包括但不限于本领域中已知的铬释放CTL测定法和ALAMAR BLUE荧光测定法。
根据一些实施方案，通过离心收集细胞群体并评估针对K562细胞(高度未分化并且是粒细胞系列的，源自患有慢性髓性白血病的患者)的细胞毒性。已知源自慢性髓性白血病(CML)患者并表达B3A2 bcr-abl杂合基因的K562细胞系对凋亡性死亡特别有抵抗力。(Luchett i,F.等人，Haematologica(1998)83:974-980)。根据一个实施方案，将K562靶细胞和SCKTC以一种或多种效应子:靶标比率分配到孔中，所述比率例如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。孵育后，通过酶联免疫吸附测定读取器检测吸光度，并且可以计算杀伤率。根据其它实施方案，可以进行相同的测定，其中评估针对Jurkat细胞的细胞毒性(急性T白血病)(Somanchi等人，PLoS ONE 10(10):e0141074.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141074)。
根据一些实施方案，杀伤率可以用下式表示：
Figure BDA0003160278680000701
根据一些实施方案，包含SCKTC的CKTC群体的杀伤率的范围为约25％至约75％，包括端值。根据一些实施方案，包含SCKTC的CKTC群体的杀伤率的范围为约50％至约75％，包括端值。根据一些实施方案，包含SCKTC的CKTC群体的杀伤率为约25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％或75％。
根据一些实施方案，通过本发明的所述方法制备的包含SCKTC的CKTC群体的杀伤率比对照细胞(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少1.5倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的包含SCKTC的CKTC群体的杀伤率比对照细胞(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少2倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的包含SCKTC的CKTC群体的杀伤率比对照细胞(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少3倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的包含SCKTC的CKTC群体的杀伤率比对照细胞(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少3.5倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的包含SCKTC的CKTC群体的杀伤率比对照细胞(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少4倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的包含SCKTC的CKTC群体的杀伤率比对照细胞(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少4.5倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的包含SCKTC的CKTC群体的杀伤率比对照细胞(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少5倍。
增殖/扩增
本发明的所述方法诱导SCKTC扩增的能力可以通过使用荧光细胞染色染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行染色来评价。为了比较细胞扩增的初始速率，将细胞用CFSE染色以确定所述方法的各个步骤(即步骤(b)–(e))诱导SCKTC增殖的程度。CFSE染色提供了定量终点并允许同时对扩增的细胞进行表型分析。刺激后每天，从每种培养物中取出细胞等分试样并通过流式细胞术进行分析。CFSE染色使细胞高度发荧光。细胞分裂后，荧光减半，因此细胞分裂的次数越多，荧光变得越少。通过测量分裂一次、两次、三次等的细胞数目来量化所述方法诱导SCKTC增殖的能力。
为了确定所述方法促进SCKTC长期生长的程度，可以生成细胞生长曲线。与前述CFSE实验一样建立这些实验，但是不使用CFSE。培养每2-3天，将细胞从相应的培养物中移出并使用库尔特计数器进行计数，该计数器测量存在的细胞数和细胞的平均体积。平均细胞体积是何时再刺激细胞的最佳预测因子。另外，可以表征扩增的细胞的表型，以确定是否优先扩增特定亚类。
在每次再刺激之前，都要对扩增细胞群体进行表型分析，以确定定义SCKTC群体的特定标志物的存在。根据一些实施方案中，在每次再刺激之前，从每种培养物中取出细胞等分试样并使用前向散射(FS)对比90°光散射位图即细胞中的完整淋巴细胞群体，通过流式细胞术进行分析。在该位图上进行门控(矩形)，测量CD56对比CD3。进行双阳性门控，测量Vα24对比Vβ11。可以使用穿孔素和颗粒酶B细胞内染色进行总体测量以估计细胞溶解潜力。
根据一些实施方案，基于起始CKTC细胞的群体，SCKTC群体扩增到约100倍至约1,000,000倍，或约1,000倍至约1,000,000倍，例如约1,000倍至约100,000倍，即至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1000倍、至少约2000倍、至少约3000倍、至少约4000倍、至少约5000倍、至少约6000倍、至少约7000倍、至少约8000倍、至少约9000倍、至少约10,000倍、至少约11,000倍、至少约12,000倍、至少约13,000倍、至少约14,000倍、至少约15,000倍、至少约16,000倍、至少约17,000倍、至少约18,000倍、至少约19,000倍、至少约20,000倍、至少约21,000倍、至少约22,000倍、至少约23,000倍、至少约24,000倍、至少约25,000倍、至少约26,000倍、至少约27,000倍、至少约28,000倍、至少约29,000倍、至少约30,000倍、至少约31,000倍、至少约32,000倍、至少约33,000倍、至少约34,000倍、至少约35,000倍、至少约36,000倍、至少约37,000倍、至少约38,000倍、至少约39,000倍、至少约40,000倍、至少约41,000倍、至少约42,000倍、至少约43,000倍、至少约44,000倍、至少约44,000倍、至少约45,000倍、至少约46,000倍、至少约47,000倍、至少约48,000倍、至少约49,000倍、至少约50,000倍、至少约51,000倍、至少约52,000倍、至少约53,000倍、至少约54,000倍、至少约55,000倍、至少约56,000倍、至少约57,000倍、至少约58,000倍、至少约59,000倍、至少约60,000倍、至少约61,000倍、至少约62,000倍、至少约63,000倍、至少约64,000倍、至少约65,000倍、至少约66,000倍、至少约67,000倍、至少约68,000倍、至少约69,000倍、至少约70,000倍、至少约71,000倍、至少约72,000倍、至少约73,000倍、至少约74,000倍、至少约75,000倍、至少约76,000倍、至少约77,000倍、至少约78,000倍、至少约79,000倍、至少约80,000倍、至少约81,000倍、至少约82,000倍、至少约83,000倍、至少约84,000倍、至少约85,000倍、至少约86,000倍、至少约87,000倍、至少约88,000倍、至少约89,000倍、至少约90,000倍、至少约91,000倍、至少约92,000倍、至少约93,000倍、至少约94,000倍、至少约95,000倍、至少约96,000倍、至少约97,000倍、至少约98,000倍、至少约99,000倍、至少约100,000倍、至少约200,000倍、至少约300,000倍、至少约400,000倍、至少约500,000倍、至少约600,000倍、至少约700,000倍、至少约800,000倍、至少约900,000倍或至少约1,000,000倍。
标志物
根据本发明的一些实施方案，可以通过评估表征SCKTC的标志物的存在并由此测定细胞群体中SCKTC的百分比来测定使用如本文所述的方法进行的SCKTC的扩增。根据一些实施方案，可以使用流式细胞术，使用前向散射(FS)对比90o光散射位图即淋巴细胞完整的淋巴细胞群体来测定表达NKT细胞标志物的NKT细胞亚群的存在。在该位图上进行门控(矩形)，测量CD56对比CD3。进行双阳性门控，测量Vα24对比Vβ11。根据一些实施方案，可以通过CD3和CD56标志物的存在来确定NKT细胞的亚群(CD3+CD56+NKT细胞)。根据一个实施方案，用第一荧光标记物标记的抗CD3抗体(例如，市售的荧光标记的抗CD3抗体，诸如抗CD3太平洋蓝(PB)(BD Pharmingen，克隆#SP34-2))与用第二荧光标记物标记的抗CD56抗体(例如，市售的荧光标记的抗CD56抗体，诸如抗CD56-藻红蛋白(PE)-Cy7(BD Pharmingen，克隆#NCAM16.2))的结合可以用于测定细胞群体中CD3和CD56的表达，其中通过流式细胞术测量抗体结合的例如PB荧光或PE荧光，并基于CD3+CD56+细胞设置门。
根据一些实施方案，可以通过TCR Vα和TCR Vβ标志物的存在来测定I型NKT细胞的亚群。根据一个实施方案，用第一荧光标记物标记的抗TCR Vα抗体(例如，市售的荧光标记的抗TCR Vα抗体，诸如抗TCR Vα-PE(Beckman Coulter，克隆#C15))和用第二荧光标记物标记的抗-TCR Vβ抗体(例如，市售的荧光标记的抗TCR Vβ抗体，诸如抗TCR Vβ-异硫氰酸荧光素(FITC)(Beckman Coulter，克隆#C21))的结合可以用于测定细胞群体中Vα和Vβ的表达，其中通过流式细胞术测量抗体结合的例如PE荧光或FITC荧光，并基于Vα+Vβ+细胞设置门。
根据一些实施方案，NKT细胞亚群可以特征在于标志物CD3+Vα24+的表达。根据一些实施方案，I型NKT细胞亚群的特征在于标志物CD3+Vα24-的表达。根据一些实施方案，I型NKT细胞亚群包括以标志物CD3+CD56+为特征的细胞。根据一些实施方案，I型NKT细胞亚群包括特征在于标志物CD3+Vα24+、CD3+Vα24-、CD3+CD56+及其混合物的表达的细胞。
根据一些实施方案，富集的SCKTC群体占总CKTC群体的约40％至约60％，即由所述方法产生的总细胞群体的约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％。因此，基于所述方法步骤(c)中的MC数目(5x105/ml–3x 106/ml)、扩增程度(100到1,000,000倍)以及CTKC总群体中SCKTC的占比(40-60％)，根据一些实施方案，在针对SCKTC富集的扩增的、活化的群体中，SCKTC的数目范围为约2x 107个细胞/ml至约1.8x 1012个细胞/ml。
使用方法
受试者
本文描述的方法旨在与可体验到这些方法的益处的任何受试者一起使用。因此，“受试者”、“患者”和“个体”(可互换使用)包括人类以及非人类受试者，尤其是家养动物。
根据一些实施方案，所述受试者和/或动物是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、兔、绵羊，或非人灵长类动物，例如猴子、黑猩猩或狒狒。在其它实施方案中，所述受试者和/或动物是非哺乳动物。根据一些实施方案，受试者和/或动物是人。根据一些实施方案，人是小儿。根据其它实施方案，人是成人。根据其它实施方案，人是老年人。根据其它实施例，人可以被称为患者。
根据某些实施方案，人的年龄在以下范围：约0个月至约6月龄、约6至约12月龄、约6至约18月龄、约18至约36月龄、约1至约5岁、约5至约10岁、约10至约15岁、约15至约20岁、约20至约25岁、约25至约30岁、约30至约35岁、约35至约40岁、约40至约45岁、约45至约50岁、约50至约55岁、约55至约60岁、约60至约65岁、约65至约70岁、约70至约75岁、约75至约80岁、约80至约85岁、约85岁至约90岁、约90岁至约95岁或约95岁至约100岁。
根据一些实施方案，所述受试者是非人类动物，因此本公开涉及兽医用途。根据一些此类实施方案，所述非人类动物是家庭宠物。根据一些此类实施方案，所述非人类动物是家畜。
施用
包含本公开的细胞产物的药物组合物可以以适于待治疾病的方式施用。施用的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重性等因素来确定，但适当的用量可以通过临床试验确定。
含细胞产物的药物组合物的施用可以以适于特定疾病的任何方式进行，包括通过雾化吸入、注射、摄入、输注、植入或移植。本公开的药物组合物可以经肠胃外，例如经皮下、皮内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜外施用给患者。
根据一些实施方案，所述发明的药物组合物还可以通过直接注射至所需部位或全身性地施用于受试者。例如，可以将药物组合物直接注射到肿瘤或淋巴结中。
如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括特征在于对受试者的组织进行物理破坏和通过组织中的裂口进行药物组合物的施用的任何途径。肠胃外施用因此包括但不限于通过注射组合物，通过手术切口施加组合物，通过穿透组织的非手术伤口施加组合物等来施用药物组合物。例如，考虑到肠胃外施用包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射和肾透析输注技术。
根据一些实施方案，可以每天向患者施用含SCKTC群体的药物组合物。根据一些实施方案，可以通过连续输注向患者施用含SCKTC群体的药物组合物。根据一些实施方案，可以每天向患者施用含SCKTC群体的药物组合物两次。根据一些实施方案，可以每天向患者施用含SCKTC群体的药物组合物两次以上。根据一些实施方案，可以每隔一天向患者施用含SCKTC群体的药物组合物。根据一些实施方案，可以每周向患者施用两次含SCKTC群体的药物组合物两次。根据一些实施方案，可以每隔一周向患者施用含SCKTC群体的药物组合物。根据一些实施方案，可以每1、2、3、4、5或6个月、向患者施用含SCKTC群体的药物组合物。
根据一些实施方案，可以以在2周至一年或更长时间内，例如一个月至一年或更长时间，例如至少2周、4周、6周、8周、3个月、6个月、1年、2年内足以维持所施用的SCKTC在患者血流中的功能的给药方案(施用的剂量和周期)向患者施用包含含有SCKTC群体的细胞产物的药物组合物。
所需剂量的频率对技术人员而言将是显而易见的并且将取决于许多因素，诸如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度、动物的类型和年龄等。
可以将包含含有SCKTC群体的细胞产物的药物组合物与各种附加治疗剂(例如细胞因子、化疗药物、检查点抑制剂和/或抗病毒药物等)一起共同施用。可替代地，附加治疗剂可以在药物组合物或其任何置换物之前一小时、一天、一周、一个月或甚至更长时间施用。此外，附加治疗剂可以在施用药物组合物或其任何置换物之后一小时、一天、一周或甚至更长时间施用。频率和施用方案对本领域技术人员而言将是显而易见的并且将取决于许多因素，诸如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度、动物的年龄和健康状况、所施用的一种或多种附加治疗剂的特性、施用途径和包含SCKTC群体的药物组合物等。
根据一些方面，本公开提供了一种刺激对免疫细胞活化敏感的受试者的免疫细胞的方法，该方法包括使体内免疫细胞群体与有效刺激免疫细胞群体的量的药物组合物在体内接触，所述药物组合物包含含有本文所述的SCKTC的细胞产物。根据一个实施方案，免疫细胞群体包含树突细胞群体。根据一个实施方案，免疫细胞群体是CD8+T细胞群体。根据一个实施方案，免疫细胞群体是NK细胞群体。根据一个实施方案，免疫细胞群体包含MHC限制型T细胞群体。
根据一些实施方案，受试者患有对包含免疫疗法的治疗敏感的病症，所述免疫疗法包括施用含有本公开的细胞产物的药物组合物。
示例性实施方案包括癌症、癌前病状(意指可以或可能变成癌症的病状)、自身免疫性疾病和包含从个体自身组织产生的且针对个体自身组织的细胞和/或抗体的病症、炎性疾病或病症、与组织移植相关的病症(意指与以恢复体内功能为目标将人类细胞、组织或器官从供体向受者的转移(植入)有关的病症(移植))、移植后淋巴组织增生性病症、过敏性病症和感染(意指可能引起疾病的生物体侵入人体)。例如，包含含有治疗量的本发明的SCKTC群体的细胞产物的药物组合物可以用于治疗以MHC I呈递低为特征的疾病。根据一些实施方案，含有SCKTC细胞产物的药物组合物可以用于治疗患有不能接受化疗的晚期疾病的受试者，例如对化疗无反应或病得太重而没有合适的化疗治疗窗口的患者(例如，经历太多限制剂量或方案的副作用的受试者)。
根据一些实施方案，术语“治疗有效量”或剂量不一定意指立即治疗有效的量，而是包括能够在体内扩增(施用后)以提供治疗效果的剂量。
因此，提供了一种向患者施用亚治疗剂量的方法，该亚治疗剂量在体内SCKTC扩增和活化后仍变为治疗有效量以提供所需的治疗效果。根据一些实施方案，亚治疗剂量是小于治疗有效量的量。
包含含有扩增和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞群体的细胞产物的药物组合物
根据另一方面，所述发明提供了一种包含含有治疗量的扩增和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞(SCKTC)群体作为有效成分的细胞产物的药物组合物。除了一种或多种药学上可接受的载体外，此类药物组合物还可含有治疗有效剂量的，呈适于施用给受试者的形式的SCKTC群体。除了所述发明的细胞产物所提供的活性成分外，所述发明的药物组合物还可包括一种或多种相容活性成分，所述相容活性成分旨在为组合物提供另一种药效。如本文所用，“相容”意指此类组合物的活性成分能够以这样的方式彼此组合，使得在一般使用条件下不存在会大幅降低每种活性成分或组合物的功效的相互作用。
根据一些实施方案，扩增和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞(SCKTC)群体的特征在于以下的一项或多项：调节细胞因子分泌、刺激SCKTC群体增殖、调节SCKTC细胞表面上一种或多种标志物的表达或增加SCKTC对靶细胞群体的细胞毒活性。
细胞因子分泌
根据一些实施方案，扩增和富集的SCKTC群体的特征在于调节选自由IL-4、IL-5、IL-6或IL-10或IFNγ组成的组的一种或多种细胞因子的表达。根据一些实施方案，扩增和富集的SCKTC细胞群体包含具有细胞因子表达谱的细胞，所述细胞因子表达谱包括选自由IL-4、IL-5、1L-6和IL-10组成的组的一种或多种细胞因子的低表达和IFNγ的高表达。根据一些实施方案，富集的SCKTC群体的细胞因子产生的特征在于IL-5-、IL-6-、IL-、IFN-4低和IFNγ高。
根据一些实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IFN-γ的量为约5000pg/ml或更高。
根据一些实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量为约5pg/ml。根据一些实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量为约4.5pg/ml。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量为约4pg/ml。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量为约3.5pg/ml。根据一些实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量为约3pg/ml。根据一些实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量为约2.5pg/ml。根据一些实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量为约2pg/ml。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量为约1.5pg/ml。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量为约1pg/ml。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量在约1.0至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量在约1.5至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量在约2.0至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量在约2.5至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量在约3.0至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量在约3.5至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量在约4.0至约5pg/ml之间。根据一个实施方案，由扩增和富集的SCKTC群体产生的IL-4的量在约4.5至约5pg/ml之间。
根据一些实施方案，IFNγ与IL-4的比率是CKTC对照群体及扩增和富集的SCKTC群体的一种或多种T细胞效应子功能(诸如细胞杀伤和细胞活化)的指标。根据一个实施方案，培养上清液中的IFN-γ:IL-4比率等于或大于1000。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于1200。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于1300。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1400。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于1500。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于1550。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1600。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1650。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1700。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1750。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1800。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1850。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1900。根据一个实施方案，培养上清液中IFN-γ:IL-4的比率等于或大于1950。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2000。根据一个实施方案，IFNγ:IL-4比率等于或大于2050。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2100。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2150。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2200。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2250。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2300。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2350。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2400。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2450。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2500。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2550。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2600。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2650。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2700。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2750。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2800。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2850。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2900。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于2950。根据一个实施方案，培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于3000。
富集的SCTKC群体
本发明的所述方法诱导扩增和富集的SCKTC群体扩增的能力可以通过使用荧光细胞染色染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行染色来评价。为了比较细胞扩增的初始速率，将CKTC用CFSE染色以确定所述方法的各个步骤(即步骤(c)–(e))诱导SCKTC增殖的程度。CFSE染色提供了定量终点并允许同时对扩增的细胞进行表型分析。刺激后每天，从每种培养物中取出细胞等分试样并通过流式细胞术进行分析。CFSE染色使细胞高度发荧光。细胞分裂后，荧光减半，因此细胞分裂的次数越多，荧光变得越少。通过测量分裂一次、两次、三次等的细胞数目来量化所述方法诱导SCKTC增殖的能力。
为了确定所述方法促进SCKTC长期生长的程度，可以生成细胞生长曲线。与前述CFSE实验一样建立这些实验，但是不使用CFSE。培养每2-3天，将细胞从相应的培养物中移出并使用库尔特计数器进行计数，该计数器测量存在的细胞数和细胞的平均体积。平均细胞体积是何时再刺激细胞的最佳预测因子。另外，可以表征扩增的细胞的表型，以确定是否优先扩增特定亚类。
在每次再刺激之前，都要对扩增细胞群体进行表型分析，以确定定义SCKTC群体的特定标志物的存在。根据一些实施方案中，在每次再刺激之前，从每种培养物中取出细胞等分试样并使用前向散射(FS)对比90°光散射位图即细胞中的完整淋巴细胞群体，通过流式细胞术进行分析。在该位图上进行门控(矩形)，测量CD56对比CD3。进行双阳性门控，测量Vα24对比Vβ11。可以使用穿孔素和颗粒酶B细胞内染色进行总体测量以估计细胞溶解潜力。
根据一些实施方案，基于起始CKTC细胞的群体，SCKTC群体扩增到约100倍至约1,000,000倍，或约1,000倍至约1,000,000倍，例如约1,000倍至约100,000倍，即至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1000倍、至少约2000倍、至少约3000倍、至少约4000倍、至少约5000倍、至少约6000倍、至少约7000倍、至少约8000倍、至少约9000倍、至少约10,000倍、至少约11,000倍、至少约12,000倍、至少约13,000倍、至少约14,000倍、至少约15,000倍、至少约16,000倍、至少约17,000倍、至少约18,000倍、至少约19,000倍、至少约20,000倍、至少约21,000倍、至少约22,000倍、至少约23,000倍、至少约24,000倍、至少约25,000倍、至少约26,000倍、27,000倍、至少约28,000倍、29,000倍、30,000倍、至少约31,000倍、至少约32,000倍、至少约33,000倍、至少约34,000倍、至少约35,000倍、至少约36,000倍、至少约37,000倍、至少约38,000倍、至少约39,000倍、至少约40,000倍、至少约41,000倍、至少约42,000倍、至少约43,000倍、至少约44,000倍、至少约44,000倍、至少约45,000倍、至少约46,000倍、至少约47,000倍、至少约48,000倍、至少约49,000倍、至少约50,000倍、至少约51,000倍、至少约52,000倍、至少约53,000倍、至少约54,000倍、至少约55,000倍、至少约56,000倍、至少约57,000倍、至少约58,000倍、至少约59,000倍、至少约60,000倍、至少约61,000倍、至少约62,000倍、至少约63,000倍、至少约64,000倍、至少约65,000倍、至少约66,000倍、至少约67,000倍、至少约68,000倍、至少约69,000倍、至少约70,000倍、至少约71,000倍、至少约72,000倍、至少约73,000倍、至少约74,000倍、至少约75,000倍、至少约76,000倍、至少约77,000倍、至少约78,000倍、至少约79,000倍、至少约80,000倍、至少约81,000倍、至少约82,000倍、至少约83,000倍、至少约84,000倍、至少约85,000倍、至少约86,000倍、至少约87,000倍、至少约88,000倍、至少约89,000倍、至少约90,000倍、至少约91,000倍、至少约92,000倍、至少约93,000倍、至少约94,000倍、至少约95,000倍、至少约96,000倍、至少约97,000倍、至少约98,000倍、至少约99,000倍、至少约100,000倍、至少约200,000倍、至少约300,000倍、至少约400,000倍、至少约500,000倍、至少约600,000倍、至少约700,000倍、至少约800,000倍、至少约900,000倍或至少约1,000,000倍。
关于刺激增殖，根据一些实施方案，扩增和富集的SCKTC群体占总CTKC细胞群体的约40％至约60％，即总CTKC细胞群体的约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％。根据一些实施方案，SCKTC富集的扩增群体中SCKTC的数目为约2x 107个细胞/ml至约1.8x 1012个细胞/ml。
标志物表达
根据一些实施方案，流式细胞术(例如，使用前向散射(FS)对比90°光散射位图即淋巴细胞完整的淋巴细胞群体。在该位图上进行门控(矩形)，测量CD56对比CD3。进行双阳性门控，测量Vα24对比Vβ11)可用于表征扩增和富集的SCKTC群体的细胞标志物的表达。根据一些实施方案，扩增和富集的SCKTC群体包含表达NKT细胞标志物的细胞亚群。根据一些此类实施方案，可以通过CD3和CD56标志物的存在来确定表达NKT标志物的细胞亚群。根据一些实施方案，用第一荧光标记物标记的抗CD3抗体(例如，市售的荧光标记的抗CD3抗体，诸如抗CD3太平洋蓝(PB)(BD Pharmingen，克隆#SP34-2))与用第二荧光标记物标记的抗CD56抗体(例如，市售的荧光标记的抗CD56抗体，诸如抗CD56-藻红蛋白(PE)-Cy7(BDPharmingen，克隆#NCAM16.2))的结合可以用于测定扩增和富集的SCKTC群体中CD3和CD56的表达，其中通过流式细胞术测量抗体结合的例如PB荧光或PE荧光，并基于CD3+CD56+细胞设置门。
根据一些实施方案，扩增和富集的SCKTC群体包含表达I型NKT标志物的细胞亚群。根据一些此类实施方案，可以通过TCR Vα和TCR Vβ标志物的存在来确定表达1型NKT标志物的细胞亚群。根据一些实施方案，用第一荧光标记物标记的抗TCR Vα抗体(例如，市售的荧光标记的抗TCR Vα抗体，诸如抗TCR Vα-PE(Beckman Coulter，克隆#C15))和用第二荧光标记物标记的抗-TCR Vβ抗体(例如，市售的荧光标记的抗TCR Vβ抗体，诸如抗TCR Vβ-异硫氰酸荧光素(FITC)(Beckman Coulter，克隆#C21))的结合可以用于测定细胞群体中Vα和Vβ的表达，其中通过流式细胞术测量抗体结合的例如PE荧光或FITC荧光，并基于Vα+Vβ+细胞设置门。
根据一些实施方案，表达I型NKT细胞标志物的细胞亚群可以包含特征在于标志物CD3+Vα24+的表达的细胞。根据一些实施方案，表达1型NKT细胞标志物的细胞亚群包含特征在于标志物CD3+Vα24-的表达的细胞。根据一些实施方案，表达1型NKT细胞标志物的细胞亚群包括特征在于标志物CD3+CD56+的表达的细胞。根据一些实施方案，表达1型NKT细胞标志物的细胞亚群包括特征在于标志物CD3+Vα24+、CD3+Vα24-、CD3+CD56+及其混合物的表达的细胞。
细胞毒活性
可以通过本领域技术人员已知的任何合适的技术来评估细胞毒活性。例如，可以在标准的细胞毒性测定中在适当的时间段测定包含含有如本文所述的扩增和富集的SCKTC群体的细胞产物的药物组合物的细胞毒活性。此类测定法可包括但不限于本领域中已知的铬释放CTL测定法和ALAMAR BLUE荧光测定法。
根据一些实施方案，通过离心收集效应T细胞群体的样品并评估针对K562靶细胞(高度未分化并且是粒细胞系列的，源自患有慢性髓性白血病的患者)的细胞毒性。已知源自慢性髓性白血病(CML)患者并表达B3A2 bcr-abl杂合基因的K562细胞系对凋亡性死亡特别有抵抗力。(Luchetti,F.等人，Haematologica(1998)83:974-980)。根据一个实施方案，将根据本发明的所述方法制备的K562靶细胞和效应SCKTC的重复样品以一种或多种效应:靶标比率分配到孔中，所述比率例如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。孵育后，通过酶联免疫吸附测定读取器检测吸光度，并且可以计算杀伤率。根据其它实施方案，可以进行相同的测定，其中评估针对Jurkat细胞的细胞毒性(急性T白血病)(Somanchi等人，PLoS ONE 10(10):e0141074.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141074)。
根据一些实施方案，杀伤率可以用下式表示：
Figure BDA0003160278680000851
根据一些实施方案，扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率的范围为约25％至约75％，包括端值。根据一些实施方案，扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率的范围为约50％至约75％，包括端值。根据一些实施方案，扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率为约25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％或75％。
根据一些实施方案，通过本发明的所述方法制备的扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率比对照CKTC(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少1.5倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率比对照CTKC(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少2倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率比对照CTKC(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少3倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率比对照CKTC(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少3.5倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率比对照CKTC(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少4倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率比对照CKTC(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少4.5倍。根据一些实施方案，通过本发明的方法制备的扩增和富集的SCKTC群体的杀伤率比对照CKTC(例如，未经受步骤(c)-(e)所述的特定方法处理的细胞)增加至少5倍。
根据一些实施方案，扩增和富集的SCKTC群体的特征在于IFNγ:IL4的比率为至少1000，杀伤率比对照细胞增加至少1.5倍，或两者。
适于肠胃外施用的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载体诸如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。示例性的载体溶液也可以含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。如本文所用，术语“缓冲剂”是指其化学组成中和酸或碱而pH没有显著变化的溶液或液体。所述发明所设想的缓冲剂的实例包括但不限于杜氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液、5％葡萄糖水溶液(D5W)、正常/生理盐水(0.9％NaCl)。在一些实施方案中，输注溶液对受试者组织是等渗的。
所述发明的示例性药物组合物可包含细胞在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的悬浮液或分散体。通常将溶液认为是两种或多种物质的均质混合物；它经常但不一定是液体。在溶液中，溶质(或溶解的物质)的分子均匀地分布在溶剂分子中。分散体是两相系统，其中一个相(例如颗粒)分布在第二相或连续相中。悬浮液是一种分散体，其中细分物质与另一种物质组合，前者如此细分并混合，以至于它不会迅速沉淀出来。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠(盐水)溶液。
使用本领域已知的技术可以容易地制备本发明的其它组合物，诸如在宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.)的麦克出版公司(Mack Publishing Company)出版的Remington'sPharmaceutical Sciences第18版或第19版中所述的，其通过引用并入本文。
药物组合物的制剂可以适于推注施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射制剂可以单位剂型制备、包装或出售，诸如在含有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。肠胃外施用的制剂包括但不限于混悬剂、溶液、在油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂和可植入的缓释制剂或可生物降解制剂。此类制剂还可包含一种或多种附加成分，包括但不限于助悬剂、稳定剂或分散剂。
本文所述药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。一般而言，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与载体或一种或多种其它辅助成分缔合，然后，如果必要或期望，将产品成形或包装成所需的单剂量或多剂量单元。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于对人类进行伦理施用的药物组合物，但是本领域技术人员将理解，此类组合物通常适于施用给所有种类的动物。为了使组合物适于向各种动物施用，适于施用给人类的药物组合物的改性很好理解，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通(如果有)实验来设计和进行此类改性。
在本公开的方法中有用的药物组合物可以以适于口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺、鼻内、病灶内、颊、眼、静脉内、器官内或其它施用途径的制剂形式制备/配制、包装或出售。考虑到的其它制剂包括透射的纳米颗粒、脂质体制备物、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的制剂。
根据一些实施方案，可以首先施用所述发明的药物组合物，然后通过进一步施用来维持。例如，根据一些实施方案，所述发明的药物组合物可以通过一种注射方法施用，然后通过相同或不同的方法进一步施用。
本公开的药物组合物可以作为散装、单一单位剂量或作为多个单一单位剂量制备、包装或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含含预定量的活性成分，即扩增和富集的SCKTC群体的细胞产物的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用于受试者的活性成分的用量或此类用量的方便分数，例如此类用量的一半或三分之一。
本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载体和任何附加成分的相对量将根据所治受试者的特性、大小和状况以及进一步根据有待施用组合物的途径而变化。举例来说，组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
除了活性成分以外，根据一些实施方案，本公开的药物组合物还可包含一种或多种附加药物活性剂，例如细胞因子、化学治疗药物、检查点抑制剂和/或抗病毒药物等。
根据一些实施方案，可以在制造后将蛋白质稳定剂添加到包括扩增和富集的SCKTC群体的细胞产物，所述蛋白质稳定剂例如白蛋白，其可以充当稳定剂。根据一些实施方案，白蛋白是人白蛋白。根据一些实施方案，白蛋白是重组人白蛋白。根据一些实施方案，制剂中采用的白蛋白的最小量可为约0.5％至约25％(w/w)，即约0.5％、约1.0％、约2.0、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％(w/w)，包括中间值，诸如约12.5％(w/w)。
根据一些实施方案，药物组合物包含稳定量的血清。如本文所用，术语“稳定量”是指当包括在包含富集的SCKTC的所述发明的药物组合物的制剂中时，使这些细胞能够保持其T细胞效应子活性的血清的量。根据一些实施方案，所述血清是人类患者自体的人血清。根据一些实施方案，所述血清是合成血清。根据一些实施方案，血清的稳定量为至少约10％(v/v)。
根据一些实施方案，本发明的方法包括通过添加药学上可接受的赋形剂，尤其是如本文所述的赋形剂，例如稀释剂、稳定剂和/或防腐剂来制备药物组合物的另一步骤。
如本文所采用的术语“赋形剂”是通用术语，涵盖添加到SCKTC群体中的，不具有生物或生理功能，无毒且不与其它组分相互作用的所有成分。
一旦制备了药物组合物的最终制剂，就将其灌装到合适的容器中，例如输液袋或冷冻管。
根据一些实施方案，根据本公开的方法包括将包含含有扩增和富集的SCKTC群体的细胞产物的药物组合物或其药物制剂灌装到合适的容器，诸如输液袋中并将其密封形成细胞产品的另一步骤。
根据一些实施方案，将包括容器的产品例如在约-135℃下，例如在液氮的气相中冷冻储存和运输，所述容器灌装有包含含有扩增和富集的SCKTC群体的细胞产物的药物组合物。根据一些此类实施方案，所述制剂还可以含有冷冻保护剂，诸如DMSO。DMSO的量通常为约20％或更少，诸如约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(v/v)。
根据一些实施方案，本公开的方法包括冷冻药物组合物或包含本公开的扩增和富集的SCKTC群体的细胞产物的另一步骤。根据一个实施方案，通过控制速率的冷冻方法进行冷冻，例如以每分钟1℃降低温度，以确保形成的晶体很小并且不会破坏细胞结构。该方法可以继续直到样品达到约-100℃。
本公开的药物组合物的控释或缓释制剂可以通过采用其它常规技术制备。如本文所用，术语“控释”意在指其中药物从制剂中释放的方式和特性受到控制的任何含药物的制剂。这包括立即释放制剂和非立即释放制剂，非立即释放制剂包括但不限于持续释放制剂和延迟释放制剂。术语“持续释放”(也称为“延长释放”)在本文中以其常规含义使用，是指可在延长的时间段内提供药物的逐渐释放的药物制剂，并且优选地，尽管不一定，会在延长的时间段内导致药物水平基本恒定。术语“延迟释放”在本文中以其常规含义使用，是指其中在制剂的施用与药物从中释放之间存在时间延迟的药物制剂。“延迟释放”可能会或可能不会涉及药物在延长的时间段内的逐渐释放，因此可能会或可能不会是“持续释放”。如本文所用，术语“长期”释放意指将药物制剂构造和布置成在一段很长的时间例如几天内递送治疗水平的活性成分。
药物组合物可呈无菌可注射水性悬浮液或油性悬浮液形式制备、包装或出售。该悬浮液或溶液可以根据已知技术进行配制，并且除了活性成分外，还可以包含其它成分，诸如本文所述的分散剂、润湿剂或助悬剂。可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂诸如水或1,3-丁二醇来制备此类无菌注射制剂。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发性油，诸如合成的甘油单酯或甘油二酯。其它可肠胃外施用的制剂可以包括那些包含微晶形式、脂质体制备物形式或作为可生物降解的聚合物体系的组分的活性成分的制剂。用于持续释放或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水材料，诸如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。对于肠胃外施用，合适的媒介物由溶液(例如油性溶液或水溶液)以及悬浮液、乳液或植入物组成。水性悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质并且包括，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。
根据一些实施方案，本公开提供了一种将细胞产品从生产地或方便的收集点转移到治疗设施的方法，该细胞产品包含根据本发明的扩增的和富集的SCKTC群体。根据一些实施方案，在此类运输过程中维持细胞产品的温度。根据一些实施方案，例如，药物组合物可以在运输过程中储存在0℃以下，诸如-135℃。根据一些实施方案，在储存和/或运输期间监测药物组合物的温度波动。
本文所讨论的出版物仅为其在本申请的申请日之前的公开而提供并且每一个均通过引用整体并入。本文没有任何内容被解释为承认所述发明没有资格先于现有发明的这种出版物。此外，所提供的公布日期可不同于可能需要独立确认的实际公布日期。
受益于前面的描述和相关附图中给出的教导，本文阐述的发明的许多修改和其它实施方案将容易被这些发明所属领域的技术人员所想到。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施方案并且旨在将修改和其它实施方案包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用特定术语，但是这些术语仅在一般意义和描述性意义上而不是出于限制的目的使用。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何进行和使用所述发明的完整公开和描述，并且不意图限制发明人所认为的本发明范围，也不代表以下实验为所进行的所有或仅有的实验。已做出努力确保关于所使用的数字的正确性(例如，量、温度等)，但应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1.从外周血中分离单核细胞(MC)
以下程序描述了从人受试者的血液(更具体地是外周血)中分离MC：
1.获得30ml-50ml肝素抗凝人外周血并将其置于离心管中。将外周血用盐水按1:1的比例稀释并混合直至均匀。
2.在新的50mL离心管中装入15ml淋巴细胞分离溶液(Ficoll-Paque)；然后通过沿着管壁添加使均匀稀释的血液以1:2的聚蔗糖(ficoll):稀释血液体积比缓慢地在淋巴细胞分离液上成层，在之间形成明显分层，并将混合物以3000rpm离心30分钟。
3.离心完成后，收集血浆和Ficoll-Paque层之间界面处的单核细胞，置于新的50ml离心管中，用30ml的X-VIVO-15培养基冲洗，然后以800g离心5分钟。然后去除上清液。
4.将混合物添加到20ml的X-VIVO-15培养基中，通过移液使其混合均匀并在室温下以200g离心10分钟，然后去除上清液。将细胞重悬于10ml的X-VIVO-15培养基中并计数。
实施例2.诱导外周血单核细胞(PBMC)分化为树突细胞(DC)
以下程序描述了诱导PBMC分化为树突细胞的过程。
1.用含有10％FBS的RPMI 1640培养基将PBMC的浓度调至1×106个细胞/ml，并且将细胞接种在T25培养瓶中，在37℃下于5％的CO2中静态培养1小时。
2.从培养瓶中去除含有非粘附细胞的上清液。剩余细胞用含10％FBS的RPMI 1640培养基冲洗两次，然后转移到5ml含10％FBS的RPMI 1640培养基中，该培养基补充有细胞因子GM-CSF和IL-4，浓度分别为500U/ml和50ng/ml。
3.第4天，向培养系统补充3ml含有上述工作浓度(50ng/ml)的GM-CSF和IL-4的培养基。
4.第6天，将α-GalCer添加到培养系统中，直到满足100ng/ml的工作浓度。进行该步骤以使树突细胞负载α-GalCer。
5.第7天，收集负载有α-GalCer的树突细胞。
实施例3.具有高杀伤活性的细胞因子杀伤T细胞(CKTC)的体外扩大(意指扩增)
以下程序描述了体外扩大细胞因子杀伤T细胞(CKTC)以形成具有高杀伤活性的超活化CKTC的方法。
1.用X-VIVO-15培养基将PBMC的浓度调至3×106个细胞/ml。将α-GalCer添加到培养系统中，直至满足100ng/ml的工作浓度，并将细胞接种在6孔板中。
2.第3天，更换培养系统中的培养基并添加α-GalCer，直至满足100ng/ml的工作浓度。
3.第7天，将实施例2中获得的负载有α-GalCer的树突细胞(约1×105个细胞)添加到包含CKTC群体的培养系统中，并以如下工作浓度添加以下刺激因子：100ng/mlα-GalCer、100U/ml的IL-2和20ng/ml的IL-7。以与实施例2中所述相同的方式，回收PBMC管以诱导其分化为树突细胞以二次刺激CKTC。
4.第10天，补充培养系统中的培养基，并添加α-GalCer、IL-2和IL-7，直至满足各自的工作浓度(100ng/mlα-GalCer、100U/ml的IL-2和20ng/ml的IL-7)。
5.第14天，将负载有α-GalCer的树突细胞再次添加到CKTC细胞培养系统中，将刺激因子α-GalCer、IL-2和IL-7补充至各自的工作浓度，并将IL-15添加到培养系统中，达到20ng/ml。
6.第17天，补充培养系统中的培养基，并添加α-GalCer、IL-2、IL-7和IL-15，直至满足各自的工作浓度(100ng/mlα-GalCer、100U/ml的IL-2和20ng/ml的IL-7)。
7.第20天，补充培养系统中的培养基，并添加α-GalCer、IL-2、IL-7和IL-15，直至满足各自的工作浓度(100ng/mlα-GalCer、100U/ml的IL-2和20ng/ml的IL-7)，并且添加IL-12直至满足20ng/ml的工作浓度。
8.第21天，收集细胞。取出100μl扩增的超活化CTKC细胞产物并将其转移到以下荧光抗体中：抗TCR Vα-PE(Beckman Coulter，克隆#C15)、抗TCR Vβ-FITC(Beckman Coulter，克隆#C21)、抗CD3-PB(BD Pharmingen，克隆#SP34-2)、抗CD56-PE-Cy7(BD Pharmingen，克隆#NCAM16.2)。在4℃下孵育30分钟后，使用前向散射(FS)对比90°光散射位图淋巴细胞的完整淋巴细胞群体通过流式细胞术测量表达1型NKT细胞标志物的靶扩增超活化CKTC的比例。在该位图上进行门控(矩形)，测量CD56对比CD3。进行双阳性门控，测量Vα24对比Vβ11。如图1所示，扩增的超活化CKTC产物包括表达NKT标志物CD3+CD56+的细胞群体，达到表达1型NKT标志物的细胞的56.8％。
总的来说，约90％的SCKTC群体包含CD3+T细胞，并且约50％的SCKTC群体包含1型NKT细胞(数据未示出)。
实施例4.添加细胞因子IL-2和IL-7的时间对CKTC扩大/扩增的影响
在相同的培养条件下(37℃，CO2浓度为5％)，测试IL-2、IL-7或IL-2和IL-7两者对通过不同方法A、B、C和D培养的CKTC的影响，其中在培养开始时添加α-GalCer并维持到培养完成。对于A组，在培养开始时同时添加IL-2；对于B组，在培养开始时同时添加IL-2和IL-7；对于C组，第3天添加IL-2和IL-7；并且对于D组，第7天添加IL-2和IL-7。
第21天，取出通过方法A、B、C和D扩增的100μl CKTC，并分别与以下荧光抗体一起孵育：TCR Vα-PE和TCR Vβ-FITC。在4℃下孵育30分钟后，使用前向散射(FS)对比90°光散射位图即淋巴细胞完整的淋巴细胞群体，通过流式细胞术测量靶细胞的比例。在该位图上进行门控(矩形)，测量CD56对比CD3。进行双阳性门控，测量Vα24对比Vβ11。如图2所示，在A组至D组的CKTC中表达I型NKT细胞标志物的CKTC细胞的比例逐渐增加。结果表明，第7天添加细胞因子IL-2和IL-7可以导致表达I型NKT细胞标志物的CKTC细胞优先扩增，并且显著提高该细胞群体在CKTC扩增群体中的纯度。
实施例5.添加细胞因子IL-15的时间对扩增的CKTC比例的影响
在相同的培养条件下(37℃，CO2浓度为5％)，测试IL-15对通过不同方法A、B、C和D培养的CKTC的影响，其中在培养开始时添加α-GalCer，并且在第7天添加IL-2和IL-7，直至培养完成。对于A组，未添加IL-15；对于B组，在培养开始时同时添加IL-15；对于C组，第7天，添加IL-15；对于D组，第14天添加IL-15。
第21天，取出通过方法A、B、C和D扩增的100μl CKTC群体，并分别与以下荧光抗体一起孵育：抗TCR Vα-PE、抗TCR Vβ-FITC、抗CD3-PB和抗CD56-PE-Cy7。在4℃下孵育30分钟后，使用前向散射(FS)对比90°光散射位图即淋巴细胞完整的淋巴细胞群体，通过流式细胞术测量每个组中表达1型NKT细胞标志物的CKTC细胞的比例。在该位图上进行门控(矩形)，测量CD56对比CD3。进行双阳性门控，测量Vα24对比Vβ11。如图3所示，D组的CKTC群体中表达I型NKT细胞标志物的细胞的比例优于其它三组中表达1型NKT细胞标志物的细胞的比例。
实施例6.添加细胞因子IL-15的时间对扩大/扩增的CTKC细胞群体分泌细胞因子的能力的影响
扩增的CTKC细胞群体的上清液中IFN-γ与IL-4的比率用作评价扩增的CTKC细胞群体的效应子功能的指标。
使用CBA(流式微珠阵列)，测量实施例5中四组培养上清液中每一组中的IFN-γ:IL-4比率，由此评价表达NKT标志物的扩增的CKTC分泌效应细胞因子的能力。结果如表2所示。
表2.添加细胞因子IL-15的时间对表达NKT标志物的扩增CKTC群体分泌细胞因子的能力的影响
Figure BDA0003160278680000961
结果表明，在培养的第14天添加IL-15(D组)显著增加了扩增的CTKC群体的上清液中的IFN-γ:IL-4比率，使得与对照相比，扩增的CTKC群体分泌效应细胞因子的能力得到改善。
实施例7.添加细胞因子IL-15的时间对扩增的CTKC群体的杀伤能力的影响
乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的细胞质酶，可在细胞裂解后释放到细胞外环境中并在其底物上催化四唑盐(INT)产生红色产物，红色产物的量与细胞裂解物的量成正比。在该实例中，通过测量杀伤系统中INT的量，评价扩增的CTKC群体杀伤靶细胞的活性。使用LDH试剂盒(#CK12,DOJINDO)根据生产商或供应商提供的说明进行测量。
获得并离心K562靶细胞，并将靶细胞的密度调至1×105个细胞/mL。通过离心收集在上述方法A和D中培养的扩增和活化的CTKC效应细胞群体，并将效应子:靶标比率调至5:1、10:1和20:1。对于每个组，提供重复的孔。在37℃下于5％的CO2中孵育4小时且沉淀物充分溶解之后，通过酶联免疫吸附测定读取器检测吸光度，并计算杀伤率。使用以下公式测定杀伤率：杀伤率(％)＝(OD490实验孔-OD490阴性孔)/(OD490阳性孔-OD490阴性孔)×100％。结果示于表3。
表3.细胞因子IL-15对扩增的活化CKTC的杀伤能力的影响
Figure BDA0003160278680000971
结果表明，在培养的第14天添加IL-15(D组)显著提高扩增和活化的CKTC群体的杀伤能力。
实施例8.添加细胞因子IL-12的时间对扩增的CKTC群体中表达I型NKT细胞标志物的CKTC比例的影响
在相同的培养条件下(37℃，CO2浓度为5％)，测试通过A、B、C和D组的不同方法培养的CKTC的效应子功能，其中在培养开始时添加α-GalCer，在第7天添加IL-2和IL-7，并且在第14天添加IL-15，直至培养完成。对于A组，未添加IL-12；对于B组，在培养开始时同时添加IL-12；对于C组，第7天，添加IL-12；对于D组，第20天添加IL-12。
第21天，取出100μl通过方法A、B、C和D扩增的CKTC群体，并分别添加到以下荧光抗体中：TCR Vα-PE和TCR Vβ-FITC。在4℃下孵育30分钟后，使用前向散射(FS)对比90o光散射位图即淋巴细胞完整的淋巴细胞群体，通过流式细胞术测量细胞产物中靶细胞的比例。在该位图上进行门控(矩形)，测量CD56对比CD3。进行双阳性门控，测量Vα24对比Vβ11。如图4所示，D组表达I型NKT标志物的CTKC细胞的比例优于其它三组，这是因为较早添加IL-12可导致该比例降低。如果需要添加IL-12，则可以在稍晚阶段添加。
实施例9.添加细胞因子IL-12的时间对扩增的CKTC群体的杀伤能力的影响
取出K562靶细胞并用于测量实施例8中A组和D组中扩增的CKTC细胞的杀伤能力。结果示于表4。
表4.细胞因子IL-12对扩增的CTKC群体的杀伤能力的影响
Figure BDA0003160278680000981
结果表明，在第20天添加IL-12(D组)显著提高了扩增的CTKC群体的杀伤能力。
实施例10.对A549人非小细胞肺癌细胞的体外细胞毒性
针对非小细胞肺癌(NSCLC)靶标表征根据本文所述方法产生的离体扩增和活化的CKTC的细胞毒性。简言之，如以上方法中所述，扩增和活化CKTC。根据标准生长条件培养A549(ATCC编号CCL-185)NSCLC肿瘤细胞。收集A549细胞并以1x 106个细胞/mL将其重悬于PBS中。添加最终浓度为1μM的活细胞荧光染料CMFDA(Life Technologies Corp.)，并在4℃下孵育10分钟。洗涤肿瘤细胞并以约1×104个细胞/孔接种到96孔板中。以5:1、10:1或20:1的效应子:靶标比率将CKTC细胞添加到提前接种了靶细胞的孔中。每项实验按一式三份进行。将效应细胞和靶细胞共培养24小时后，收集每组中剩余的细胞并用7-氨基放线菌素D(7-AAD)进行标记。在4℃下孵育10分钟后，通过流式细胞术检测标记的靶细胞中7-AAD阳性细胞与总细胞的比率，以测定效应细胞对靶细胞的杀伤。
虽然已参考其具体实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应该理解可做出各种变化并且在不背离本发明的真实精神和范围的情况下可取代等效物。另外，可做出许多修改来使具体情况、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤适应于本发明的目的精神和范围。所有此类修改意图为处于所附权利要求书的范围内。

Claims (64)

1.一种制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含含有扩增和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞(SCKTC)群体的细胞产物，所述方法按顺序包括：
(a)分离包含细胞因子杀伤T细胞(CKTC)群体的单核细胞(MC)群体；
(b)任选地在无菌条件下将(a)的制备物运输至加工设施；
(c)在培养系统中培养所述MC群体；
(d)使步骤(c)的所述培养系统与α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)或其类似物或功能等同物以及与包含CD1d和αGalCer或其类似物或功能等同物的细胞群体接触，其中所述接触足以刺激所述CKTC群体的扩增；
(e)使步骤(d)的所述培养系统与IL-2、IL-7、IL-15和IL-12以预定的添加顺序和时间接触，并与包含CD1d和αGalCer或其类似物或功能等同物的新鲜细胞群体接触，其中所述接触足以刺激扩增的CTKC群体中的一些的活化，从而形成所述扩增和富集的SCKTC群体；并且
(f)从所述培养系统中收集所述扩增和富集的SCKTC群体，以形成SCKTC细胞产物；
其中(f)的包含所述扩增和富集的SCKTC群体的所述细胞产物的特征在于以下中的一项或多项：与(a)的所述CKTC群体相比，分泌效应细胞因子的能力提高或细胞毒性提高；以及
(g)用药学上可接受的载体配制(f)的包含所述扩增和富集的SCKTC群体的所述细胞产物，以形成包含含有所述扩增和富集的SCKTC群体的所述细胞产物的药物组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中(a)中的单核细胞(MC)的来源是血液。
3.如权利要求1所述的方法，其包括在步骤(e)和(f)之间，将所述培养物从所述加工设施运输到治疗设施。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述运输步骤在添加IL12后约1小时至约24小时内开始。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)任选地包括在进行步骤(d)之前，使所述MC重新悬浮并将所述MC调节至范围为约5×105个细胞/ml至约3×106个细胞/ml的浓度。
6.如权利要求1所述的方法，步骤(e)包括将包含CD1d和αGalCer t或其类似物或功能等同物的新鲜细胞群体添加到所述培养系统。
7.如权利要求1所述的方法，其中从步骤(d)至步骤(f)，将所述αGalCer或其类似物或功能等同物维持在恒定浓度。
8.如权利要求7所述的方法，其中αGalCer或其类似物或功能等同物的浓度在约50ng/ml至约500ng/ml之间。
9.如权利要求1所述的方法，其中从步骤(e)至步骤(f)，将IL-2维持在恒定浓度。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述IL-2的浓度范围为约10U/ml至约100U/ml。
11.如权利要求1所述的方法，其中从步骤(e)至步骤(f)，将所述IL-7维持在恒定浓度。
12.如权利要求11所述的方法，其中IL-7的浓度范围为约20ng/ml至200ng/ml。
13.如权利要求1所述的方法，其中在培养的约第7天添加IL-2和IL-7。
14.如权利要求1所述的方法，其中在培养的约第14天添加IL-15。
15.如权利要求1所述的方法，其中在培养的约第20天添加所述IL-12。
16.如权利要求1所述的方法，其中步骤(f)在培养的至少约第21天进行。
17.如权利要求1所述的方法，其中从步骤(e)至步骤(f)，将所述IL-15维持在恒定浓度。
18.如权利要求17所述的方法，其中IL-15的浓度范围为约10ng/ml至约100ng/ml。
19.如权利要求1所述的方法，其中从步骤(e)至步骤(f)，将所述IL-12维持在恒定浓度。
20.如权利要求19所述的方法，其中IL-12的浓度范围为约10ng/ml至约100ng/ml。
21.如权利要求1所述的方法，其还包括通过流式细胞术来表征所述扩增和富集的SCKTC群体的细胞表面标志物的表达的步骤。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述扩增和富集的SCKTC群体的亚群包含CD3+Vα24+Vβ11细胞、CD3+Vα24-细胞或CD3+CD56+细胞中的一种或多种。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述SCKTC的亚群还包含Vβ11+细胞。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增和富集的SCKTC群体占所述CKTC总群体的约40％至约60％。
25.如权利要求1所述的方法，其中将IL-2和IL-7同时添加到所述培养物。
26.如权利要求1所述的方法，其中将IL-2、IL-7和IL-15同时添加到所述培养物。
27.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中的所述MC群体包含约5×105个细胞/ml至约3×106个细胞/ml。
28.如权利要求1所述的方法，其中包含CD1和α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)的所述细胞是抗原呈递细胞。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞(DC)。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述树突细胞负载有αGalCer。
31.如权利要求30所述的方法，其中负载有αGalCer的所述树突细胞源自所述MC并且是贴壁细胞。
32.如权利要求30所述的方法，其中通过以下方法制备负载有αGalCer的所述树突细胞，所述方法包括：
(a)分离单核细胞(MC)群体；
(b)在培养系统中培养所述MC群体；
(c)使所述培养系统与IL-4和GM-CSF接触，其中所述接触足以诱导所述MC分化为树突细胞；
(d)使所述培养系统与αGalCer接触，其中所述接触足以使所述树突细胞负载αGalCer。
33.如权利要求32所述的方法，其中IL-4的浓度为500U/ml。
34.如权利要求32所述的方法，其中GM-CSF的浓度为50ng/ml。
35.如权利要求32所述的方法，其中步骤(d)在步骤(b)之后约5天至约7天进行。
36.如权利要求32所述的方法，其中步骤(b)中的所述MC群体包含约1×105个细胞/ml至约5×106个细胞/ml。
37.如权利要求32所述的方法，其中步骤(b)-(d)在选自含有10％胎牛血清或10％自体血清的RPMI 1640培养基的培养基中进行。
38.如权利要求1所述的方法，其还包括每2至3天在所述培养系统中补充所述培养基的步骤。
39.如权利要求1所述的方法，其中所述MC源自人类受试者。
40.如权利要求2所述的方法，其中所述MC通过Ficoll-Paque梯度离心从全血中分离。
41.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)-(f)在选自X-VIVO-15无血清培养基、含有10％胎牛血清或10％自体血清的RPMI 1640培养基的培养基中进行。
42.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和通过如权利要求1所述的方法产生的增强和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞(SCKTC)群体。
43.根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述增强和富集的SCKTC群体包含以下一种或多种的亚群：CD3+Vα24+Vβ11细胞、CD3+Vα24-、CD3+CD56+细胞。
44.根据权利要求43所述的药物组合物，其中所述亚群还包含Vβ11+细胞。
45.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和细胞产物，所述细胞产物包含源自细胞因子杀伤T细胞(CKTC)群体的扩增、活化和富集的超活化细胞因子杀伤T细胞(SCKTC)群体，所述SCKTC的特征在于以下中的两项或多项：与未刺激、未活化的细胞因子杀伤T细胞对照群体相比，诱导细胞因子分泌、刺激SCKTC增殖、提高SCKTC的细胞毒性以及调节的所述SCKTC的表面上的一种或多种标志物的表达。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，其中表达受调节的所述细胞因子是选自由IL-4、IL-5、IL-6或IL-10和IFNγ组成的组中的一种或多种。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，其包含低表达的选自由IL-4、IL-5、1L-6和IL-10组成的组中的一种或多种细胞因子和高表达的IFNγ。
48.根据权利要求46所述的药物组合物，其中将所述富集的SCKTC群体的细胞因子产生表征为IL-5-、IL-6-、IL-10-、IL-4低、IFNγ高。
49.根据权利要求48所述的药物组合物，其中由所述SCKTC群体产生的IFN-γ的量为约5000pg/ml或更高。
50.根据权利要求48所述的药物组合物，其中所述SCKTC群体产生的IL-4的量小于5pg/ml。
51.根据权利要求48所述的药物组合物，其中培养上清液中的IFNγ:IL-4比率等于或大于1000。
52.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述富集的SCKTC群体对靶细胞的杀伤率的范围为约25％至约75％，包括端值。
53.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述SCKTC群体的杀伤率比未扩增、未活化的细胞因子杀伤T细胞对照细胞的杀伤率高至少1.5倍。
54.根据权利要求45所述的药物组合物，其中IFN-γ:IL-4的比率为至少1000，并且杀伤率比未扩增、未活化的细胞因子杀伤T细胞对照细胞的杀伤率增加至少1.5倍。
55.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述扩增和富集的SCKTC群体包含表达NKT细胞标志物的SCKTC亚群。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述扩增和富集的SCKTC细胞群体包含含有CD3+Vα24+细胞、CD3+Vα24-细胞或CD3+CD56+细胞中的一种或多种的亚群。
57.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述扩增和富集的SCKTC群体包含是CD3+CD56+的SCKTC亚群。
58.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述扩增和富集的SCKTC群体包含表达1型NKT细胞标志物的SCKTC亚群。
59.根据权利要求58所述的药物组合物，其中所述1型NKT细胞标志物包括TCR Vα和TCRVβ标志物。
60.根据权利要求58所述的药物组合物，其中表达1型NKT细胞标志物的所述SCKTC亚群包括以标志物CD3+Vα24+、CD3+Vα24-或CD3+CD56+中的一种或多种的表达为特征的细胞群体。
61.根据权利要求45所述的药物组合物，其中源自细胞因子杀伤T细胞(CKTC)群体的扩增和富集的SCKTC群体占总CKTC群体的约40％至约60％。
62.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含稳定量的血清，所述血清对于所述扩增和富集的SCKTC群体保持其T细胞效应子活性是有效的。
63.根据权利要求62所述的药物组合物，其中所述血清的稳定量为至少10％。
64.根据权利要求62所述的药物组合物，其中所述血清是人血清。
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