CN106011060A

CN106011060A - 一种体外激活和扩增nkt样细胞的方法

Info

Publication number: CN106011060A
Application number: CN201610497248.2A
Authority: CN
Inventors: 王超; 李政媛
Original assignee: Beijing Taiwan Henderson Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Taiwan Henderson Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2016-10-12
Also published as: US10443041B2; US20180002665A1

Abstract

本发明涉及一种体外激活和扩增NKT样细胞的方法。本发明的方法利用来源于同种异体或异种受试者的有核体细胞在体外激活和增殖受试者的NKT样细胞，该方法可以提高NKT样细胞的整体数量、提高活化标志的表达和增加杀伤性效应分子的数量。

Description

一种体外激活和扩增NKT样细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种体外激活和扩增NKT样细胞的方法，具体地，涉及一种利用同种异体或异种来源的有核体细胞体外激活和扩增哺乳动物的淋巴细胞中的CD8⁺NKT样细胞亚群的方法。

背景技术

1987年，三个独立的研究小组分别报道了一群表达中等强度的αβTCR而不表达CD4和CD8的T细胞群体^[2-4]；1990年Sykes报道了一种表达NK1.1同时也表达αβTCR的细胞亚群^[5]。1995年，“NKT”细胞作为专有名词第一次出现，并特指一群表达NK1.1(小鼠CD161c)标志的T细胞亚群^[6]。在小鼠的研究中，根据NKT细胞的CD1d限制性和TCR的多样性，Godfrey将NKT细胞分为三种类型^[7]：I型NKT细胞、II型NKT细胞和NKT样细胞。I型NKT细胞是能够识别CD1d递呈的α-Galcer脂类抗原的一群NKT细胞，II型NKT细胞则能识别CD1d递呈的除α-Galcer外的脂类抗原，NKT样细胞包括除I型NKT细胞、II型NKT细胞外的其他NKT细胞亚群。其中，I型NKT细胞免疫学特征和功能的研究最为广泛，又被称为经典NKT细胞；目前文献资料中提到的NKT细胞大多是指此NKT细胞类型。由于CD1d四聚体技术的成熟，以及CD1d缺陷转基因小鼠的出现，目前对NKT细胞的研究大多集中于经典NKT细胞(I型NKT细胞)。然而，I型NKT细胞仅为NKT细胞群体的一个亚群；NKT细胞中50％以上细胞均为NKT样细胞^[7]。NKT样细胞则为既不依赖于CD1d分子，又表达多样TCR链的NKT细胞亚群。然而，目前对NKT样细胞的研究较少。已有的研究表明，NKT样细胞具有抗肿瘤效应。β2微球蛋白缺陷小鼠体内存在一群非依赖CD1d分子的NKT样细胞，该细胞能够在体外杀伤多种肿瘤细胞^[8]。

中国专利申请号CN 201510494011.4涉及一种新型NKT样细胞亚群及其治疗肿瘤的用途。该NKT样细胞亚群中包含的NKT样细胞为CD8⁺细胞，并且被证明是NKT样细胞中具有强力抗肿瘤效应的细胞亚群。在该申请中，通过分离受试者自体的淋巴细胞并分选出NKT样细胞亚群，并通过添加细胞因子或细胞因子组合来对该NKT样细胞亚群进行扩增。

对于分选后的CD8⁺NKT样细胞的扩增，在CN 201510494011.4中通过添加特定的细胞因子或细胞因子组合来实现。然而，该申请中没有提及其他在体外活化和扩增CD8⁺NKT样细胞的方式和可能性。

发明内容

经过发明人大量的研究，出人意料地发现在体外通过将来自一个受试者的淋巴细胞与来自与该受试者不同的另一受试者的有核体细胞共培养，不仅可以大幅增加淋巴细胞中CD8⁺NKT样细胞的数量，还可以引起活化标志物(如CD25、CD44、CD69)的表达以及杀伤性效应分子(GranzymeB、Perforin)的增加。

因此，本发明的目的是提供一种体外激活和扩增NKT样细胞的方法(下面有时简称为“本发明的方法”)，该方法包括以下步骤：1)提供获自第一受试者的淋巴细胞并培养；2)提供获自第二受试者的有核体细胞；3)将所述第二受试者的所述有核体细胞加入至所述第一受试者的所述淋巴细胞的培养物中，并将得到的混合培养物继续培养足以使所述淋巴细胞的数量扩增至少10～1000倍；和4)从所述淋巴细胞中分选出NKT样细胞或富含NKT样细胞的亚群；其中所述NKT样细胞的细胞表面表达CD8分子(下面有时简称为“CD8⁺NKT样细胞”)，所述有核体细胞的细胞上表达免疫共刺激分子；所述第二受试者与所述第一受试者是同种异体或异种的哺乳动物。

在一个实施方案中，第一受试者的淋巴细胞与第二受试者的有核体细胞上可以表达不同类型的MHC-I类分子。

在一个实施方案中，有核体细胞可以是免疫细胞或非免疫细胞。

在一个优选实施方案中，非免疫细胞可以是成纤维细胞。

在另一个优选实施方案中，免疫细胞可以是抗原递呈细胞，抗原递呈细胞可以选自内皮细胞、树突状细胞和B细胞中的任一种，优选树突状细胞。

在另一个优选实施方案中，免疫细胞可以选自粒细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞和NKT样细胞中的任一种，优选巨噬细胞、B细胞和NKT样细胞。

在一个实施方案中，CD8⁺NKT样细胞的细胞表面上可以表达CD3和CD56(或CD161c)，但不表达Vα24TCR。CD8⁺NKT样细胞的细胞表面上还可以表达TCRαβ。

在一个优选的实施方案中，第二受试者与所述第一受试者可以是半相合的同种异体。

在另一个实施方案中，第二受试者与第一受试者可以是异种的。

在另一个实施方案中，在本发明的方法的步骤3)之前，可以将在步骤2)中获得的第二受试者的有核体细胞与肿瘤抗原孵育使得有核体细胞吞噬肿瘤抗原。

在另一个实施方案中，可以将在本发明的方法的步骤2)中获得的第二受试者的有核体细胞进行选自下列中的任一项的处理：热灭活、放射线灭活、化学试剂固定、冷冻处理和超声裂解处理。

在一个实施方案中，在本发明的方法的步骤3)之前，向在步骤2)中获得的有核体细胞的培养物中添加细胞因子以扩增或活化有核体细胞。

在另一个实施方案中，在本发明的方法的步骤3)中将有核体细胞以与淋巴细胞的1:1000～1:1，优选1:100～1:1，更优选1:10～1:1，最优选1:1的比例加入至淋巴细胞的培养物中。

在另一个实施方案中，本发明的方法还可以包括：向本发明的方法的步骤4)中分选出的NKT样细胞亚群的培养物中添加能够刺激T细胞增殖和活化的细胞因子，从而将NKT样细胞进一步扩增10～1000倍。

本发明的方法较CN 201510494011.4中的活化和扩增方法更为简单和高效，不仅可以省略在培养体系中添加细胞因子的步骤，而且更容易大规模地在体外活化和扩增CD8⁺NKT样细胞，还可以进一步引起活化标志物(如CD25、CD44、CD69)的表达以及杀伤性效应分子(Granzyme B、Perforin)的增加，由此增强CD8⁺NKT样细胞的生物学效应如抗肿瘤效应。

附图说明

以下参照附图说明本发明的优选实施方案并详细描述本发明的上述和其他特征、方面和优势。要理解的是，此意在举例说明而非限制本发明。在附图中：

图1图示了小鼠CD8⁺NKT样细胞的表型，在图中黑线代表分子表达水平，灰线代表相应同型对照的表达水平。

图2图示了小鼠CD8⁺NKT样细胞与NK细胞、iNKT细胞和CTL细胞的表型差异，填充区域代表同型对照的表达水平，空心区域代表相应分子的表达水平。

图3图示了体外培养7天的小鼠树突状细胞的显微照片。

图4图示了体外培养7天的小鼠树突状细胞的表型检测结果。浅灰色表示同型对照荧光强度，黑色表示实测样本荧光强度。

图5图示了同种异体(小鼠)有核体细胞(树突状细胞)体外刺激后小鼠脾脏细胞的培养体系中CD3⁺CD161c⁺细胞的比例变化。

图6图示了异种(大鼠)有核体细胞(腹腔巨噬细胞)体外刺激后小鼠脾脏细胞的培养体系中CD3⁺CD161c⁺细胞的比例变化。

图7比较了半相合小鼠树突状细胞与普通同种异体树突状细胞体外刺激后，小鼠脾脏细胞的培养体系中CD3⁺CD161c⁺细胞的比例变化。

图8图示了同种异体(小鼠)有核体细胞(树突状细胞)体外刺激后小鼠脾脏细胞的培养体系中活化细胞的比例变化。

图9图示了同种异体(小鼠)有核体细胞(树突状细胞)体外刺激后小鼠脾脏细胞的培养体系中发挥杀伤活性的细胞的比例变化。

具体实施方式

除非另外定义，本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域中的一般技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文中所述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用于实施或测试本发明，但是现在描述优选的方法和材料。本文中引用应用的全部出版公开物和专利申请通过引用整体结合于本文中。本文中没有任何内容可以被解释为承认本发明无权通过在先发明而使早于本公开内容的日期获得授权。

必须注意，用于本文中和所附权利要求中时，单数形式“一个”、“某个”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地规定。

定义

“NKT细胞”：NKT细胞的定义有广义和狭义两种。广义的NKT细胞是指既表达NK细胞表面标志(小鼠为CD161c，人为CD56)又表达T细胞表面标志的细胞群体。随着脂类抗原结合CD1d四聚体技术的发展，研究人员在小鼠的研究中发现一群能够结合负载脂类抗原α-GalCer的CD1d四聚体的细胞亚群，该群体大多既表达NK细胞表面标志，又表达T细胞表面标志，且分泌大量细胞因子，发挥免疫调节作用；这群细胞根据Godfrey定义，为I型NKT细胞，即狭义NKT细胞。目前这群细胞研究最为广泛，也最为深入，因此这群细胞被称为经典NKT细胞。现有文献资料中提及的NKT细胞主要是指狭义NKT细胞。在本发明中，如果未明确指明，当提及NKT细胞时均是指广义NKT细胞。

“iNKT细胞”：即狭义NKT细胞，由于该群体表达恒定TCR链(对于小鼠为Vα14Jα18，对于人为Vα24Jα18)，又被称为invariant NKT细胞(在本文中有时简称为iNKT细胞)^[7]。

“NKT样细胞”：NKT样细胞是指既表达NK细胞表面标志(在小鼠中为CD161c，在人中为CD56)，又表达T细胞表面标志(例如，TCR和/或CD3)，发育不依赖于CD1d分子的细胞亚群。这群细胞的特点是单个细胞的表面可以各自表达不同类型的TCR，但这群细胞不包括表面表达Vα24TCR(人)或Vα14TCR(小鼠)的细胞^[7]。该细胞群体的定义是与经典或狭义NKT细胞相对的(就Vα24TCR或Vα14TCR而言)。

“Vα24TCR”在本发明中是指表达Vα24基因的TCR序列。经典免疫学理论认为，TCR序列重排导致T细胞的TCR序列具有多样性，但是某些特殊表达TCR的细胞亚群却偏好表达某一类型的TCR序列。如经典NKT细胞偏好表达Vα24TCR。“Vα14TCR”的定义与“Vα24TCR”类似。

“CD1d限制性”在本发明中是指免疫细胞的发育对于CD1d分子的依赖性。在NKT细胞群体中，经典NKT细胞被认为是CD1d限制性，NKT样细胞被认为是非CD1d限制性。

“CD8⁺”在本发明中是指细胞表面上表达CD8标志。

肿瘤抗原：在本发明中是指由于肿瘤细胞基因突变导致肿瘤细胞表达，而正常组织细胞不表达的分子。

半相合：指单倍型相合。在本发明中，“第二受试者与第一受试者是半相合的同种异体”是指第二受试者与第一受试者有直系的亲缘关系，即，亲缘半相合，例如，以人为例，第二受试者可以是第一受试者的父母、子女或兄弟姐妹等。

CD8⁺NKT样细胞

如无另外特殊的说明，在本发明中，NKT样细胞均是指CD8⁺NKT样细胞。

根据本发明，CD8⁺NKT样细胞的表面上可以表达CD3和CD56(或CD161c)，但不表达Vα24TCR(Vα14TCR)，即其表型可以表示为CD3⁺CD56⁺CD8⁺Vα24TCR^-或CD3⁺CD161c⁺CD8⁺Vα14TCR^-。

在一个具体的实施方案中，CD8⁺NKT样细胞的表面上还可以表达TCRαβ，即表型为TCRαβ⁺CD3⁺CD56⁺CD8⁺Vα24TCR^-或TCRαβ⁺CD3⁺CD161c⁺CD8⁺Vα14TCR^-。

图1图示了CD8⁺NKT样细胞的表型。在图1中，可以看出小鼠CD8⁺NKT样细胞表达T细胞谱系标志CD3和TCRβ，也表达NK细胞谱系标志NK1.1(CD161c)，但不表达iNKT的谱系标志CD1d。另外，从图1中还可以看出，CD8⁺NKT样细胞表达T细胞活化标志CD44、CD62L和CD122，以及NK细胞受体NKG2A/C/E、NKG2D、Ly49G₂和CD27。这些结果表明这群细胞兼具NK细胞和T细胞的功能特征。

图2图示了小鼠CD8⁺NKT样细胞与NK细胞、iNKT细胞和CTL细胞的表型差异。从图2中可以看出：(1)与NK细胞相比，小鼠CD8⁺NKT样细胞表达NK细胞标志NK1.1(CD161c)、NKG2A/C/E、CD27和Ly6G，但比NK细胞多表达TCRβ和CD3；(2)与CTL细胞相比，小鼠CD8⁺NKT样细胞表达T细胞谱系标志TCRβ和CD3，但不表达NK细胞受体；(3)与iNKT细胞相比，CD8⁺NKT样细胞不能结合负载脂类抗原的CD1d四聚体。上述结果表明本发明的CD8⁺NKT样细胞是独立于现有技术中已发现的任何一群具有确定表型的免疫细胞亚群的新的免疫细胞亚群。

表1比较了小鼠CD8⁺NKT样细胞与NK细胞、iNKT细胞和CTL细胞的表型差异。

	CD8⁺NKT样细胞	NK细胞	CTL细胞	iNKT细胞
					CD3	+	-	+	+
TCRβ	+	-	+	+
					NK1.1	+	+	-	+
CD1d四聚体	-	-	-	+
					CD69	+	+	+	+
NKG2A/C/E	+	+	-	+
					CD27	+	+	+	+
NKG2D	+	+	-	+

上面的表1以表格的形式总结了图2的结果，从表1可以清楚地显示小鼠CD8⁺NKT样细胞与NK细胞、iNKT细胞和CTL细胞的表型差异。

体外激活和扩增NKT样细胞的方法

本发明提供了体外激活和扩增CD8⁺NKT样细胞的方法，该方法包括以下步骤：1)提供获自第一受试者的淋巴细胞并培养；2)提供获自第二受试者的有核体细胞；3)将第二受试者的有核体细胞加入至第一受试者的淋巴细胞的培养物中，并将得到的混合培养物继续培养足以使淋巴细胞的数量扩增至少10～1000倍的时间；和4)从淋巴细胞中分选出NKT样细胞或富含NKT样细胞的亚群。

在本发明中，第一受试者和第二受试者均可以是哺乳动物，哺乳动物可以是选自牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔科动物、猪科动物、骆驼科动物、啮齿类动物和灵长类动物等的动物，包括但不限于牛、马、山羊、绵羊、猫、兔、猪、骆驼、羊驼、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物(诸如猿、猴、狒狒、猩猩)和人，优选是牛、马、犬、山羊、绵羊、猪、骆驼、大鼠、小鼠、猴和人，更优选是人。

在本发明中，第一受试者与第二受试者可以是同种异体的或异种的。例如，若第一受试者是小鼠，第二受试者可以是小鼠(同品系或不同品系)；第一受试者是小鼠；第二受试者也可以是选自上面的非小鼠的任意哺乳动物，例如大鼠。优选地，第二受试者可以是与第一受试者半相合的同种异体哺乳动物。

在本发明中，对于第一受试者来说，特别优选的是第二受试者是半相合的同种异体，由于保留了与第一受试者相同的单倍体，在这种情况下来自第二受试者的有核体细胞尤其是DC和B细胞，可以分别诱导第一受试者体内特异性和非特异性CD8⁺NKT样细胞以及特异性和非特异性CTL的激活，由此进一步增强了对体内肿瘤细胞的双向抑制作用。而在不相合的同种异体或异种的情况下，来自第二受试者的有核体细胞仅诱导非特异性CD8⁺NKT样细胞以及非特异性CTL的激活。

如无特殊说明，上述对哺乳动物的描述和定义适用于本文中提到哺乳动物的所有章节、段落、任何实施方案、实施例以及权利要求书。

在本发明的体外扩增CD8⁺NKT样细胞的方法中，获得淋巴细胞的方法不受限制，可以采用本领域中公知的方法，例如密度梯度离心等。

在本发明的方法中，淋巴细胞的培养方法不受限制，可以采用本领域中已知的培养方法以及相应的培养基、步骤和培养条件。

根据本发明，有核体细胞的细胞上可以表达免疫共刺激分子，诸如CD40、CD80、CD86分子，能够充分活化CD8⁺NKT样细胞。

在一个优选的实施方案中，第一受试者的淋巴细胞与第二受试者的有核体细胞上可以表达不同的MHC I类分子，例如，第一受试者MHC-I类分子类型可以为HLA-A*0203，则第二受试者MHC-I类分子类型可以为HLA-A*0206。

在优选的实施方案中，在本发明的方法的步骤3)中以有核体细胞与淋巴细胞的1:1000～1:1，优选1:100～1:1，更优选1:10～1:1，最优选1:1的比例将有核体细胞加入至淋巴细胞的培养物中。

在另一个实施方案中，在步骤(3)中，在有核体细胞与淋巴细胞的共培养体系中添加终浓度为50IU～5000IU/ml的白细胞介素2(IL-2)。

在本发明的方法中，在步骤(3)中，有核体细胞与淋巴细胞的共培养体系一般培养7～30天后，共培养体系中就能够获得数量增加10～1000倍的体外激活的CD8⁺NKT样细胞亚群。

在本发明的方法中所采用的细胞分选技术是本领域中所熟知的，可以采用本领域中常用的方法或设备来完成，在本发明中不受任何限制。只要是可以利用表面标志物来分选细胞的技术、方法和设备均可以在本发明中使用。例如，可以采用磁性分选技术或流式细胞术。细胞分选技术例如磁性分选技术或流式细胞术的具体实施方法可以在许多科学文献中找到，或按照设备或仪器生产厂商的说明书或推荐实验流程实施，本领域技术人员完全有能力获得这些具体实施方法或实验流程。

对于表面标志物，可以根据受试者的物种种类(例如人、小鼠、狗等)以及需要分选和富集的目标细胞占最终分离细胞的比例范围(例如，50％、60％、70％、80％或90％以上)来选择一种或多种标志物的组合。例如，对于人的CD8⁺NKT样细胞，可以选择CD3、CD56、CD8和Vα24TCR的组合，为了更高的富集率，还可以增加TCRαβ，即CD3、CD56、CD8、Vα24TCR和TCRαβ的组合(即，分选出TCRαβ⁺CD3⁺CD56⁺CD8⁺Vα24TCR^-NKT样细胞)。对于小鼠，可以选择CD3、CD161c、CD8和Vα14TCR的组合，为了更高的富集率，还可以增加TCRαβ，即CD3、CD161c、CD8、Vα14TCR和TCRαβ的组合(即，分选出TCRαβ⁺CD3⁺CD161c⁺CD8⁺Vα14TCR^-NKT样细胞)。

在本发明中，CD8⁺NKT样细胞的培养条件不受特别的限制。对于培养基，可以采用常规用于T细胞培养的培养基，例如RPMI-1640培养基。对于培养条件，可以采用本领域中T细胞培养的常用条件，例如，温度37℃、CO₂浓度5％，每3～5天更换一次培养基。

如果分选出的CD8⁺NKT样细胞达不到所需的数量，可以向CD8⁺NKT样细胞亚群的培养物中添加能够刺激T细胞增殖和活化的细胞因子，将CD8⁺NKT样细胞进一步扩增10～1000倍。能够刺激T细胞增殖和活化的细胞因子可以包括但不限于GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、4-1BBL等，可以使用上述因子的任一种或任意组合。

CN 201510494011.4中证明CD8⁺NKT样细胞具有强于NK细胞和经典CTL的抗肿瘤效应，并且能够以抗原特异性和非抗原特异性的方式负向调控免疫应答。因此，在一个优选实施方案中，为了让CD8⁺NKT样细胞获得抗原特异性抗肿瘤作用，可以在本发明的方法的步骤3)之前，将在步骤2)中获得的第二受试者的有核体细胞与肿瘤抗原孵育使得有核体细胞吞噬所述肿瘤抗原，从而在与第一受试者的淋巴细胞共孵育后，其中的CD8⁺NKT样细胞亚群获得针对该肿瘤抗原的特异性杀伤作用。例如先将某些乳腺癌患者肿瘤组织表达的Her2分子与第二受试者的有核体细胞孵育，再用该有核体细胞刺激第一受试者的淋巴细胞，就可以获得针对该肿瘤抗原的特异性杀伤作用的CD8⁺NKT样细胞亚群。

第二受试者的有核体细胞

在本发明中，有核体细胞可以是免疫细胞或非免疫细胞。优选地，非免疫细胞可以是成纤维细胞。优选地，免疫细胞可以是抗原递呈细胞，所述抗原递呈细胞可以选自内皮细胞、树突状细胞和B细胞中的任一种，优选树突状细胞。免疫细胞还可以选自粒细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞和NKT样细胞中的任一种，优选巨噬细胞、B细胞和NKT样细胞。这些细胞的采集和分离方法可以采用本领域中常用的方法和规程。

获自第二受试者的有核体细胞可以是选自下列中的任一种细胞：从第二受试者新鲜分离的有核体细胞、将获自所述第二受试者的分离的有核体细胞经长期培养获得的建系细胞、或向从第二受试者新鲜分离的有核体细胞的培养体系中添加细胞因子(生长因子或激活因子，详述见下)扩增或活化后获得的细胞群。

因此，在一个优选实施方案中，可以在本发明的方法的步骤3)之前，向在步骤2)中获得的有核体细胞的培养物中添加细胞因子以扩增或活化有核体细胞。上述的细胞因子可以选自生长因子诸如成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长因子、粒细胞/单核细胞集落刺激因子，或激活因子诸如肿瘤坏死因子α，或它们的任意组合。

作为一个具体实施例，可以添加如下的细胞因子组合：成纤维细胞生长因子(FGF)0.1～10ng/ml，内皮细胞生长因子(EGF)0.01～1ng/ml，粒细胞/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)1～1000ng/ml，白细胞介素4(IL-4)0.1～100ng/ml，白细胞介素6(IL-6)0.1～100ng/ml，脂多糖(LPS)0.1～10ng/m，肿瘤坏死因子α(TNF-α)1～100ng/ml。要理解上述的具体实施例仅为了说明的目的，不意在以任何方式限制本发明的范围。

在本发明中，有核体细胞也可以制备成细胞制剂以便于保存和多次使用。具体地，在本发明的步骤2)中获得第二受试者的有核体细胞后，可以将有核体细胞进行下列的处理：热灭活、放射线灭活、化学试剂固定、冷冻处理或超声裂解处理。

图3图示了实施例3中获得的有核体细胞(主要为骨髓中的造血前体细胞)的培养物中添加多种细胞因子培养7天得到的成熟树突状细胞的形态。所添加的细胞因子包括：粒细胞/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)100ng/ml，白细胞介素4(IL-4)50ng/ml，肿瘤坏死因子α(TNF-α)50ng/ml。从图3中可以看出，成熟树突状细胞的形态为树突长且丰富、胞体较小的细胞形态。

图4图示了小鼠成熟树突状细胞的免疫学表型。从图4可以看出，与未成熟树突状细胞相比，小鼠成熟的树突状细胞高表达CD11c、CD40、CD80、CD86、Ia。该结果表明，可将上述分子标志作为小鼠成熟树突状细胞的标志。

CD8⁺NKT样细胞的体外激活和扩增

图5图示了同种异体(小鼠)有核体细胞(树突状细胞)体外刺激后小鼠脾脏细胞的培养体系中CD3⁺CD161c⁺细胞的比例变化。按照实施例5的步骤，在C57BL/6小鼠淋巴细胞中添加同种异体小鼠(DBA小鼠)树突状细胞。培养第14天检测细胞亚群中CD3⁺CD161c⁺细胞的比例。图5可以看出，与刺激前相比(图中显示为“刺激前”)，添加同种异体树突状细胞(图中显示为“刺激后”)能够有效促进CD8⁺NKT样细胞的比例增加。

图6图示了异种(大鼠)有核体细胞(腹腔巨噬细胞)体外刺激后小鼠脾脏细胞的培养体系中CD3⁺CD161c⁺细胞的比例变化。按照实施例6的步骤，在C57BL/6小鼠淋巴细胞中添加异种(大鼠)腹腔巨噬细胞。培养第14天检测细胞亚群中CD3⁺CD161c⁺细胞的比例。图6可以看出，与刺激前相比(图中显示为“刺激前”)，添加异种腹腔巨噬细胞(图中显示为“刺激后”)能够有效促进CD8⁺NKT样细胞的比例增加。

图7比较了半相合小鼠树突状细胞与普通同种异体树突状细胞体外刺激后，小鼠脾脏细胞的培养体系中CD3⁺CD161c⁺细胞的比例变化。按照实施例7的步骤，在C57BL/6小鼠淋巴细胞中加入按照实施例1方案获取的同种异体(DBA小鼠)或半相合(C57BL/6小鼠与DBA小鼠的杂交F1代小鼠)树突状细胞。培养第14天比较两者细胞亚群中CD3⁺CD161c⁺细胞的比例。图7可以看出，与同种异体小鼠树突状细胞(图中显示为“同种异体”)相比，添加半相合小鼠树突状细胞(图中显示为“半相合小鼠”)更能有效促进CD8⁺NKT样细胞的比例增加。

图8图示了同种异体(小鼠)有核体细胞(树突状细胞)体外刺激后小鼠脾脏细胞的培养体系中活化细胞的比例变化。按照实施例5的步骤，在C57BL/6小鼠淋巴细胞中添加同种异体小鼠(DBA小鼠)树突状细胞。培养第14天检测培养培养体系中CD25/CD44/CD69细胞的比例。表达CD25/CD44/CD69分子是活化淋巴细胞的标志。图8可以看出，与不加同种异体树突状细胞(图中的“未处理”组)相比，添加同种异体树突状细胞(图中的“同种异体DC刺激”组)能够有效促进活化细胞(CD25⁺细胞、CD44⁺细胞、CD69⁺细胞)的比例增加。

图9图示了同种异体(小鼠)有核体细胞(树突状细胞)体外刺激后小鼠脾脏细胞的培养体系中发挥杀伤活性的细胞的比例变化。按照实施例5的步骤，在C57BL/6小鼠淋巴细胞中添加同种异体小鼠(DBA小鼠)树突状细胞。培养第14天检测CD8T细胞中Granzyme B⁺/Perforin⁺细胞的比例。Granzyme B和Perforin是颗粒释放途径相关分子，其高表达表明该细胞具有杀伤靶细胞的能力。图9可以看出，与不加同种异体树突状细胞(图中的“未处理”组)相比，添加同种异体树突状细胞(图中的“同种异体DC刺激”组)能够有效促进表达Granzyme B或Perforin的细胞比例增加，提示该刺激能够有效提高培养体系中细胞的杀伤活性。

以下实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明，但而不是要限制本发明的范围。当阅读说明书并参考公知常识时，其它实施方案对本领域技术人员来说将是显而易见的。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂公司购买得到。此外，下列实施例中未注明的具体实验条件，可参考经典实验书目的条件或供应商的建议条件。除非另外说明，否则百分比为质量体积比。

实施例1：小鼠CD8⁺NKT样细胞表型检测

(1)分离C57BL/6小鼠脾脏细胞，用密度为1.083的Ficoll液进行密度梯度离心，分离其中的单个核细胞。

(2)按照stemcell公司panNK阳性分选试剂盒的要求，分选小鼠脾脏细胞中的panNK阳性细胞。具体操作步骤如下：

①将脾脏单个核细胞用PBS缓冲液重悬于10⁸/mL；

②按照50μL/mL细胞悬液的用量添加CD49b-PE(CD49b是panNK的标志)，室温避光孵育15分钟；

③按照100μL/mL细胞悬液的用量添加cocktail液，室温避光孵育15分钟；

④按照50μL/mL细胞悬液的用量添加磁珠，室温避光孵育10分钟；

⑤向细胞悬液中添加PBS至2.5mL，转移入5mL BD Falcon流式细胞仪上样管中，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑥拿起磁铁，倾倒掉阴性细胞；

⑦2.5mL PBS重悬细胞，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑧拿起磁铁，倾倒掉阴性细胞；

⑨从磁铁中取出BD Falcon流式细胞仪上样管，500μL PBS重悬阳性细胞。

(3)200μL PBS重悬阳性细胞，标记10μL APC标记的α-GalCer-loadedCD1d tetramer(Proimmune公司)，4℃孵育30分钟。

(4)1mL PBS洗涤一遍，500μL PBS重悬细胞，50μL/管分装样本后标记(以下荧光抗体非特殊说明，均购自BioLegend公司)：

管①标记TCRβ-FITC，CD8-PerCP，CD3-APC-Cy7，NK1.1-PE-Cy7；

管②标记TCRβ-FITC，CD8-APC-Cy7，NKG2D-PE-Cy7，CD44-PerCP；

管③标记TCRβ-APC-Cy7，CD8-PerCP，KLRG1-PE-Cy7，Ly49G2-FITC(eBioscience公司)；

管④标记TCRβ-APC-Cy7，CD8-PerCP，CD27-PE-Cy7，NKG2A/C/E-FITC；

管⑤标记TCRβ-APC-Cy7，CD8-PE-Cy7，CD62L-FITC，CD122-PerCP；

管⑥－⑩标记上述抗体相应的同型对照抗体(来自BioLegend公司)，不再赘述。

(5)各样本管4℃孵育30分钟。

(6)各样本管加1mL PBS，1500rpm离心10分钟，弃上清。

(7)重复步骤(6)，300μL PBS重悬细胞。

(8)BD FACSAria II流式细胞仪上样，对CD8⁺DX5⁺TCRβ⁺CD1d Tetramer^-细胞(小鼠CD8⁺NKT样细胞)进行表型检测。

结果显示，小鼠CD8⁺NKT样细胞既表达T细胞谱系标志CD3和TCRβ，也表达NK细胞谱系标志NK1.1(CD161c)，但不表达iNKT的谱系标志CD1d。另外，从图1中还可以看出，本发明的CD8⁺NKT样细胞表达T细胞活化标志CD44、CD62L和CD122，以及NK细胞受体NKG2A/C/E、KLRG1、NKG2D、Ly49G₂和CD27。

实施例2：小鼠CD8⁺NKT样细胞与NK细胞、iNKT细胞和CTL细胞的表型差异

①将脾脏单个核细胞用PBS缓冲液重悬于10⁸/mL；

⑥拿起磁铁，倾倒掉阴性细胞；

⑦2.5mL PBS重悬细胞，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑧拿起磁铁，倾倒掉阴性细胞；

(4)1mL PBS洗涤一遍，500μL PBS重悬细胞，50μL/管分装样本后标记(均购自BioLegend公司)：

管①标记TCRβ-FITC，CD8-PerCP，CD3-APC-Cy7，NK1.1-PE-Cy7

管②标记TCRβ-FITC，CD8-APC-Cy7，NKG2D-PE-Cy7

管③标记TCRβ-APC-Cy7，CD8-PerCP，KLRG1-PE-Cy7，Ly6G-FITC

管④标记TCRβ-APC-Cy7，CD8-PerCP，CD27-PE-Cy7，NKG2A/C/E-FITC

管⑤－⑧标记上述抗体相应的同型对照抗体(来自BioLegend公司)，不再赘述。

(5)各样本管4℃孵育30分钟。

(6)各样本管加1mL PBS，1500rpm离心10分钟，弃上清。

(7)重复步骤(6)，300μL PBS重悬细胞。

(8)BD FACSAria II流式细胞仪上样，设门关注CD8⁺DX5⁺TCRβ⁺CD1dTetramer^-细胞(小鼠CD8⁺NKT样细胞)、CD8^-DX5⁺TCRβ⁺CD1d Tetramer⁺细胞(小鼠iNKT细胞)、CD8⁺DX5^-TCRβ⁺CD1d Tetramer^-细胞(小鼠CD8⁺T细胞)、DX5⁺TCRβ^-细胞(小鼠NK细胞)，并分析其表型。

结果显示，本发明的小鼠CD8⁺NKT样细胞与NK细胞、iNKT细胞和CTL细胞的表型差异。从图2中可以看出：(1)与NK细胞相比，CD8⁺NKT样细胞表达NK细胞标志NK1.1(CD161c)、NKG2A/C/E、CD27、KLRG1和Ly6G，但比NK细胞多表达TCRβ和CD3；(2)与CTL细胞相比，CD8⁺NKT样细胞表达T细胞谱系标志TCRβ和CD3，但不表达NK细胞受体；(3)与iNKT细胞相比，CD8⁺NKT样细胞不能结合负载脂类抗原的CD1d四聚体。

实施例3小鼠有核体细胞的制备

(1)体外诱导树突状细胞的制备：

取C57BL/6小鼠股骨骨髓造血前体细胞，添加50ml含有粒细胞/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)100ng/ml，白细胞介素4(IL-4)50ng/ml，肿瘤坏死因子α(TNF-α)50ng/ml的10％胎牛血清的1640培养基，体外培养7天后添加LPS 5ng/ml刺激24小时，可得成熟的小鼠树突状细胞。

该细胞形态如图3所示。经流式细胞仪检测结果表明，该细胞表达Ia、CD40、CD80、CD86、CD11c，为成熟的树突状细胞表型(见图4)。

(2)体外活化B淋巴细胞的制备：

新鲜分离C57BL/6小鼠脾脏细胞，以5×10⁶/ml的密度在添加小鼠IL-610ng/ml、IL-4 10ng/ml和LPS 5ng/ml的含10％胎牛血清的1640培养基中培养72小时，即可得到活化的B淋巴细胞。

(3)小鼠巨噬细胞的制备：

①麻醉或处死C57BL/6小鼠，切开腹部皮肤，暴露腹膜；

②将5ml冷的PBS缓冲液透过腹膜注射入小鼠腹腔，充分吹打后回收，得到腹腔盥洗液；

③将腹腔盥洗液离心后计数，采用磁性分选系统，用CD11b磁珠进行分选，收集阳性细胞，即为小鼠巨噬细胞。

实施例4乙醇固定的有核体细胞制剂的制备

(1)制备人或动物的有核体细胞(例如，实施例3中制备的有核体细胞)；

(2)以5×10⁷/ml密度重悬于生理盐水中，加入乙醇并达到50％的乙醇终浓度，4℃孵育15分钟；

(3)700g离心10分钟，弃上清，用50ml生理盐水重悬，静置5分钟；

(4)再重复步骤(3)两遍；

(5)10ml生理盐水重悬后，-80℃储存备用。

实施例5小鼠同种异体有核体细胞体外对CD8+NKT样细胞的激活

(1)新鲜分离C57BL/6小鼠脾脏细胞，以5×10⁶/ml重悬于添加100IU/ml白细胞介素2、10％胎牛血清的1640培养基中，并以每孔1ml体积接种于24孔细胞培养板；添加5×10⁴DBA/2小鼠树突状细胞；

(2)培养第7天，添加5×10⁴DBA/2小鼠树突状细胞；

(3)培养第14天，收集细胞。培养后细胞分群经流式细胞仪检测，结果表明，与刺激前相比较，刺激后培养体系中CD3⁺CD161c⁺细胞比例升高(见图5)。同时应用流式细胞仪检测刺激后培养体系中CD25⁺细胞、CD44⁺细胞、CD69⁺细胞的比例(见图8)，以及Granzyme B⁺细胞、Perforin⁺细胞的比例(见图9)。

实施例6大鼠有核体细胞(异种细胞)体外对小鼠CD8+NKT样细胞的激活

(1)新鲜分离C57BL/6小鼠脾脏细胞，以5×10⁶/ml重悬于添加100IU/ml白细胞介素2、10％胎牛血清的1640培养基中，并以每孔1ml体积接种于24孔细胞培养板；添加5×10⁴Lewis大鼠腹腔巨噬细胞；

(2)培养第7天，添加5×10⁴Lewis大鼠腹腔巨噬细胞；

(3)培养第14天，收集细胞。培养后细胞分群经流式细胞仪检测，结果表明，与刺激前相比较，刺激后培养体系中CD3⁺CD161c⁺细胞比例升高(见图6)。

实施例7小鼠半相合树突状细胞体外对小鼠CD8+NKT样细胞的激活

(1)新鲜分离C57BL/6小鼠脾脏细胞，以5×10⁶/ml重悬于添加100IU/ml白细胞介素2、10％胎牛血清的1640培养基中，并以每孔1ml体积接种于24孔细胞培养板；添加5×10⁴C57BL/6小鼠与DBA/2小鼠杂交F1代小鼠的树突状细胞；

(2)培养第7天，添加5×10⁴C57BL/6小鼠与DBA/2小鼠杂交F1代小鼠的树突状细胞；

(3)培养第14天，收集细胞。培养后细胞分群经流式细胞仪检测，结果表明，与DBA/2小鼠树突状细胞刺激相比，半相合小鼠树突状细胞刺激后培养体系中CD3⁺CD161c⁺细胞比例升高更为明显(见图7)。

本发明提供了以下的实施方案：

1.一种体外激活和扩增NKT样细胞的方法，包括以下步骤：

1)提供获自第一受试者的淋巴细胞并培养；

2)提供获自第二受试者的有核体细胞；

3)将所述第二受试者的所述有核体细胞加入至所述第一受试者的所述淋巴细胞的培养物中，并将得到的混合培养物继续培养足以使所述淋巴细胞的数量扩增至少10～1000倍；和

4)从所述淋巴细胞中分选出NKT样细胞或富含NKT样细胞的亚群；

其中所述NKT样细胞的细胞表面表达CD8分子，所述有核体细胞的细胞上表达免疫共刺激分子；所述第二受试者与所述第一受试者是同种异体或异种的哺乳动物。

2.实施方案1所述的方法，其特征在于所述第一受试者的淋巴细胞与所述第二受试者的有核体细胞上表达不同类型的MHC-I类分子。

3.实施方案1或2所述的方法，其特征在于所述有核体细胞是免疫细胞或非免疫细胞。

4.实施方案3所述的方法，其特征在于所述非免疫细胞是成纤维细胞。

5.实施方案3所述的方法，其特征在于所述免疫细胞是抗原递呈细胞。

6.实施方案5所述的方法，其特征在于所述抗原递呈细胞选自内皮细胞、树突状细胞和B细胞中的任一种，优选树突状细胞。

7.实施方案3所述的方法，其特征在于所述免疫细胞选自粒细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞和NKT样细胞中的任一种，优选巨噬细胞、B细胞和NKT样细胞。

8.实施方案1-7中任一项所述的方法，其特征在于所述NKT样细胞的细胞表面上表达CD3和CD56，但不表达Vα24TCR。

9.实施方案1-7中任一项所述的方法，其特征在于所述NKT样细胞的细胞表面上表达CD3和CD161c，但不表达Vα14TCR。

10.实施方案8或9所述的方法，其特征在于所述NKT样细胞的细胞表面上还表达TCRαβ。

11.实施方案1-10中任一项所述的方法，其特征在于所述免疫共刺激分子选自CD40、CD80和CD86中的任一种或其任意组合。

12.实施方案1-11中任一项所述的方法，其特征在于所述哺乳动物选自牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔科动物、猪科动物、骆驼科动物、啮齿类动物和灵长类动物，优选牛、马、犬、山羊、绵羊、猫、兔、猪、骆驼、羊驼、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物和人，更优选牛、马、犬、山羊、绵羊、猪、骆驼、大鼠、小鼠、猴和人。

13.实施方案1-12中任一项所述的方法，其特征在于所述第二受试者是与所述第一受试者半相合的同种异体。

14.实施方案1-13中任一项所述的方法，其特征在于所述第二受试者与所述第一受试者是异种的。

15.实施方案1-14中任一项所述的方法，其特征在于在步骤3)之前，将在步骤2)中获得的所述第二受试者的所述有核体细胞与肿瘤抗原孵育使得所述有核体细胞吞噬所述肿瘤抗原。

16.实施方案1-15中任一项所述的方法，其特征在于在步骤3)之前，将在步骤2)中获得的所述第二受试者的所述有核体细胞进行选自下列中的任一项的处理：热灭活、放射线灭活、化学试剂固定、冷冻处理和超声裂解处理。

17.实施方案1-16中任一项所述的方法，其特征在于在步骤3)中所述有核体细胞以与所述淋巴细胞的1:1000～1:1，优选1:100～1:1，更优选1:10～1:1，最优选1:1的比例加入至所述淋巴细胞的培养物中。

18.实施方案1-17中任一项所述的方法，其特征在于所述有核体细胞是从所述第二受试者新鲜分离的或分离后经长期培养后获得的建系细胞。

19.实施方案1-18中任一项所述的方法，其特征在于在步骤3)之前，向在步骤2)中获得的所述有核体细胞的培养物中添加细胞因子以扩增或活化所述有核体细胞。

20.实施方案19所述的方法，其特征在于所述细胞因子选自生长因子诸如成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长因子、粒细胞/单核细胞集落刺激因子，或激活因子诸如肿瘤坏死因子α或其任意组合。

21.实施方案1-20中任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括：

5)向步骤4)中分选出的所述NKT样细胞或富含NKT样细胞的亚群的培养物中添加能够刺激T细胞增殖和活化的细胞因子，将所述NKT样细胞进一步扩增10～1000倍。

22.实施方案21所述的方法，其特征在于所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15和4-1BBL中的任一种或其任意组合。

23.实施例1-22中任一项所述的方法，其特征在于所述NKT样细胞上的淋巴细胞活化标志物的表达增加。

24.实施方案23所述的方法，其特征在于所述淋巴细胞活化标志物选自CD25、CD44和CD69中的任一种或其任意组合。

25.实施例1-22中任一项所述的方法，其特征在于所述NKT样细胞上的杀伤性效应分子的表达增加。

26.实施方案25所述的方法，其特征在于所述杀伤性效应分子选自Granzyme B和Perforin中的任一种或其组合。

除非明确地不包括或者其它限制，将本文所引用的每篇文献(包括任何交叉引用的或相关的专利或专利申请)在此以引用方式全文并入本文。对任何文献的引用不是认可：其作为本文所公开的或要求保护的任何发明的现有技术，或者其单独或与任何其它参考文献组合，或者参考、提出、建议或者公开任何此类的发明。此外，当本文中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中同一术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本文中赋予该术语的含义或定义。

虽然已经举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明实质和范围的情况下可以做出多种其他改变和变型。因此，在随附的权利要求书中包括属于本发明范围内的所有这些改变和变型。

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Claims

1.一种体外激活和扩增NKT样细胞的方法，包括以下步骤：

1)提供获自第一受试者的淋巴细胞并培养；

2)提供获自第二受试者的有核体细胞；

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述第一受试者的淋巴细胞与所述第二受试者的有核体细胞上表达不同类型的MHC-I类分子。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有核体细胞是免疫细胞或非免疫细胞。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述非免疫细胞是成纤维细胞。

5.权利要求3所述的方法，其特征在于所述免疫细胞是抗原递呈细胞。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于所述抗原递呈细胞选自内皮细胞、树突状细胞和B细胞中的任一种，优选树突状细胞。

7.权利要求3所述的方法，其特征在于所述免疫细胞选自粒细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞和NKT样细胞中的任一种，优选巨噬细胞、B细胞和NKT样细胞。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于所述NKT样细胞的细胞表面上表达CD3和CD56，但不表达Vα24TCR。

9.权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于所述NKT样细胞的细胞表面上表达CD3和CD161c，但不表达Vα14TCR。

10.权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述NKT样细胞的细胞表面上还表达TCRαβ。