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CN114634564B - 猫用三联卵黄抗体、制剂及制备方法与用途 - Google Patents

猫用三联卵黄抗体、制剂及制备方法与用途 Download PDF

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CN114634564B CN202210407205.6A CN202210407205A CN114634564B CN 114634564 B CN114634564 B CN 114634564B CN 202210407205 A CN202210407205 A CN 202210407205A CN 114634564 B CN114634564 B CN 114634564B
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猫用三联卵黄抗体、制剂及制备方法与用途。其中，所述三联卵黄抗体包括猫细小病毒卵黄抗体、猫疱疹病毒卵黄抗体和猫杯状病毒卵黄抗体。本发明提供的三联卵黄抗体可用于预防和辅助治疗猫瘟、猫鼻支和猫传染性鼻结膜炎，保护率高、效果好。特别是对猫瘟腹泻具有良好的治疗效果或辅助治疗效果，能够显著缩短猫瘟腹泻的治疗时间。本发明拓展了猫瘟腹泻的治疗途径，为猫瘟腹泻的治疗提供了新的方向。

Description

猫用三联卵黄抗体、制剂及制备方法与用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猫用三联卵黄抗体、制剂及制备方法与用途。
背景技术
猫瘟又称猫泛白细胞减少症、猫传染性肠炎，是由猫细小病毒(Felineparvovirus，FPV)引起的一种急性高度接触性传染病，临床表现多以突发高热、顽固性呕吐、腹泻、脱水、循环障碍及白细胞急剧减少为主要特征。该病具有高度传染性，在疫苗接种不全或未接种的猫中传染性更强，多感染3～5月龄的幼猫。母猫如果在怀孕期感染猫瘟，会造成死胎、流产和初生小猫患有神经症状等问题。FPV除感染家猫外，还能感染其他猫科动物(如虎、豹)、鼬科动物(如貂)及熊科(如浣熊)。猫瘟具有极强的致死率，通常情况下，对1岁以下的猫的致死率为50％～60％，对5月龄以下的幼猫的死亡率高达80％～90％。
猫鼻支是猫科动物的一种上部呼吸道急性传染病，该病具有传染性强、发病急、高度接触性的特点，又称为传染性鼻气管炎或病毒性鼻气管炎，由猫疱疹病毒I型(Felineherpesvirus type 1，FHV-1)引起，一般经呼吸道和消化道传染。猫鼻支的感染不分季节性，各种年龄猫均易感，尤其未免疫或免疫不全的幼猫或体质弱的猫易感。
猫杯状病毒感染又称猫传染性鼻-结膜炎，是由猫杯状病毒(Felinecalicivirus，FCV)引起的猫科动物的一种多发性口腔和呼吸道疾病，主要症状是口腔溃疡、发热、打喷嚏、结膜炎、慢性胃肠炎等。近几年出现的一些强毒株可引起急性全身性疾病，造成很高的死亡率，严重危害感染动物的健康。猫杯状病毒呈世界分布，不仅感染猫，也可感染所有猫科动物，如虎、狮子、豹等，对野生动物的健康也造成了一定威胁。
临床上，猫的上述三种疾病交叉混合感染较多，通常还继发细菌感染，症状更加复杂。相关技术中，尚缺乏针对上述三种病毒的抗病毒特效药，一旦感染发病，常采用对症治疗或施用抗生素的方式进行治疗，但治疗效果和治疗特异性较差，而且普遍存在耐药性和毒副作用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有猫瘟、猫鼻支和猫杯状病毒感染治疗方法中存在的治疗效果和治疗特异性较差，且存在耐药性和毒副作用的问题，从而提供一种猫用三联卵黄抗体、制剂及制备方法与用途。
为此，本发明提供一种猫用三联卵黄抗体，包括：猫细小病毒卵黄抗体、猫疱疹病毒卵黄抗体和猫杯状病毒卵黄抗体。
可选的，在所述三联卵黄抗体中，所述猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:512，所述猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:64，所述猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:64。
优选的，在所述三联卵黄抗体中，所述猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:1024，所述猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:128，所述猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:128。
可选的，所述猫细小病毒卵黄抗体、所述猫疱疹病毒卵黄抗体和所述猫杯状病毒卵黄抗体均可以为中和抗体。可以采用领域内的常用方法对所述三联卵黄抗体中各卵黄抗体的抗体效价进行检测。
本发明还提供了一种药物制剂，包括本发明任一项所述的三联卵黄抗体以及药学上可接受的辅助成分。
可选的，所述药物制剂可以为固体制剂，所述辅助成分包括维生素C、蔗糖、葡萄糖或苯甲酸钠中的至少一种。
可选的，在所述固体制剂中，所述猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:1024，所述猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:128，所述猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:128。
可选的，所述药物制剂为液体制剂，所述辅助成分包括葡萄糖和三氯叔丁醇，和/或，山梨醇或甘露醇。
可选的，在所述液体制剂中，所述猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:2048，所述猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:128，所述猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:128。
本发明还提供了上述任一项所述的三联卵黄抗体或上述任一项所述的药物制剂在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗由猫细小病毒、猫疱疹病毒和猫杯状病毒中至少一种病毒感染引起的动物疾病的药物中的用途。
可选的，所述预防包括紧急预防；所述辅助治疗包括与抗炎、止吐、止泻、滴鼻和点眼中的至少一种共同进行辅助治疗。
可选的，所述猫细小病毒感染引起的动物疾病包括猫瘟；所述猫瘟的临床症状包括精神沉郁、食欲下降、体温升高、呕吐、腹泻和/或粪便检出FPV阳性；所述腹泻包括水样或血样腹泻；所述食欲下降包括食欲轻微减退、食欲减退或食欲费绝。
可选的，所述猫疱疹病毒感染引起的动物疾病包括消化道疾病和呼吸道疾病；所述呼吸道疾病的临床症状包括精神沉郁、食欲减退、眼鼻分泌物增多、咳嗽、打喷嚏、鼻塞、不喜动、眼结膜水肿、结膜炎、和/或眼鼻分泌物检出FHV阳性：所述眼鼻分泌物呈水样或者粘稠状。
可选的，所述猫杯状病毒引起的动物疾病包括口腔疾病和呼吸道疾病；所述口腔疾病的临床症状包括流口水、口腔溃疡；所述呼吸道疾病的临床症状包括发热、精神沉郁、打喷嚏、眼或鼻出现粘液性或浓性分泌物、结膜炎、分泌物增多、气管炎和/或支气管炎。
可选的，所述猫细小病毒、猫疱疹病毒和猫杯状病毒混合感染引起的动物疾病症状包括呕吐、腹泻、血便、眼鼻有水样或者脓性分泌物或口腔溃疡。
可选的，所述用途包括在制备口服药物或注射药物中的用途。
可选的，所述用途是指在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗猫瘟腹泻的药物中的用途。所述猫瘟腹泻可以是感染猫瘟病毒(猫细小病毒)后引发的腹泻，所述辅助治疗可以是指与其他用于治疗猫瘟腹泻的药物联合用药以治疗猫瘟腹泻，也可以是指与用于治疗猫瘟病毒感染的其他症状的药物联合用药以治疗猫瘟腹泻。
本发明还提供了一种三联卵黄抗体的制备方法，所述制备方法包括：
(1)制备三联灭活疫苗，其中，所述三联灭活疫苗为灭活猫细小病毒无血清浓缩液、灭活猫疱疹病毒无血清浓缩液、灭活猫杯状病毒无血清浓缩液以及弗氏佐剂的乳化液，其中，所述灭活猫细小病毒无血清浓缩液、所述灭活猫疱疹病毒无血清浓缩液和所述灭活猫杯状病毒无血清浓缩液的总体积与所述弗氏佐剂的体积之比为1:1；所述灭活猫细小病毒无血清浓缩液由无血清培养的猫细小病毒液经浓缩和灭活后得到，浓缩倍数为2～3倍，猫细小病毒液中猫细小病毒的含量不低于106.0TCID50/0.1ml；所述灭活猫疱疹病毒无血清浓缩液由无血清培养的猫疱疹病毒液经浓缩和灭活后得到，浓缩倍数为2～3倍，猫疱疹病毒液中猫疱疹病毒的含量不低于106.5TCID50/0.1ml；所述灭活猫杯状病毒无血清浓缩液由无血清培养的猫杯状病毒液经浓缩和灭活后得到，浓缩倍数为2～3倍，猫杯状病毒液中猫杯状病毒的含量不低于106.5TCID50/0.1ml；
(2)利用混合饲料饲喂25～26周龄的产蛋母鸡，控制饲喂环境温度为13～25℃，空气湿度为55％～65％，每天光照时间不少于15h，其中，以所述混合饲料的总重量为基准，所述混合饲料中含有0.02～0.05wt％的L-茶氨酸、0.02～0.05wt％的卡瓦胡椒、0.005～0.01wt％的维生素E、0.004～0.012wt％的硫酸锌以及0.01～0.03wt％的牛磺酸；
(3)于操作(2)中开始饲喂后1～2周，暗光下，利用操作(1)制备的三联灭活疫苗对所述产蛋母鸡依次进行3次免疫，其中，第一次免疫的免疫剂量为1～1.5ml/只，免疫部位为颈部皮下和双侧腿部肌肉；第二次免疫的免疫剂量为1.5～2ml/只，免疫部位为颈部皮下和胸部肌肉；第三次免疫的免疫剂量为2～2.5ml/只，免疫部位为颈部皮下和胸部皮下；第一次免疫与第二次免疫的时间间隔为10～15天，第二次免疫与第三次免疫的时间间隔为15～21天；
(4)3次免疫结束后，当蛋黄中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:512，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:64，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:64时，收集免疫鸡蛋；
(5)对免疫鸡蛋进行消毒，无菌分离蛋黄。
可选的，所述制备方法还包括对所述蛋黄进行抗体提取处理和纯化处理的操作。
可选的，浓缩2～3倍，是指浓缩后病毒液的体积为浓缩前的1/2～1/3，或者浓缩后病毒液中病毒浓度为浓缩前的2～3倍。
某些优选实施方式中，灭活病毒无血清浓缩液可以采用如下方法制备：分别将猫细小病毒、猫疱疹病毒和猫杯状病毒在F-81细胞(猫肾细胞)中进行无血清培养，然后经浓缩和灭活，分别得到灭活猫细小病毒无血清浓缩液、灭活猫疱疹病毒无血清浓缩液和灭活猫杯状病毒无血清浓缩液。
本发明还提供了一种液体药物制剂的制备方法，包括：取上述制备方法中无菌分离后的蛋黄，匀浆，经消毒处理后，加入3～5体积倍的磷酸盐缓冲液，然后加入终浓度为0.1～1wt％的正辛酸，静置，离心，弃沉淀，取上清液，进行6～10倍浓缩，备用；向所述上清液中加入终浓度为1～3wt％的葡萄糖和终浓度为0.3～0.5wt％的三氯叔丁醇，以及终浓度为0～0.5wt％的山梨醇或者终浓度为0～5wt％的甘露醇，混合，调节pH值为6.0～6.5，得到的混合物进行过滤。
本发明还提供了一种固体药物制剂的制备方法，包括：取上述制备方法中无菌分离后的蛋黄，匀浆，经消毒处理后，加入药学上可接受的辅助成分，混合后，冻干。
可选的，所述辅助成分可以为维生素C、蔗糖和苯甲酸钠，每1000克蛋黄加入10～15g维生素C、50～100g蔗糖和1～1.5g苯甲酸钠。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的猫用三联卵黄抗体，同时含有猫细小病毒卵黄抗体、猫疱疹病毒卵黄抗体和猫杯状病毒卵黄抗体，三种抗体均具有较高的抗体效价，而且三种抗体之间具有协同增效作用，这显著提升了所述三联卵黄抗体对猫瘟、猫鼻支和猫杯状病毒感染的治疗效果。
2.本发明提供的猫用三联卵黄抗体，包括猫细小病毒卵黄抗体、猫疱疹病毒卵黄抗体和猫杯状病毒卵黄抗体。本发明实施例分别利用含有所述三联卵黄抗体的药物和含有猫瘟单抗的药物对患有猫瘟腹泻的患猫进行治疗，发现所述三联卵黄抗体对猫瘟腹泻的治疗效果明显优于猫瘟单抗，治疗时间明显缩短，因此，本发明提供的三联卵黄抗体对猫瘟腹泻具有良好的治疗效果或辅助治疗效果，能够显著缩短猫瘟腹泻的治疗时间。本发明拓展了猫瘟腹泻的治疗途径，为猫瘟腹泻的治疗提供了新的方向。
3.本发明提供的猫用三联卵黄抗体，由含有猫细小病毒抗原、猫疱疹病毒抗原和猫杯状病毒抗原的联合抗原直接免疫产蛋母鸡得到，因此具有纯天然、成本低、基本无耐药性和毒副作用且特异性好的优点。
4.本发明提供的猫用三联卵黄抗体的制备方法，利用无血清的灭活病毒浓缩液作为疫苗，一方面能够使得产蛋母鸡针对一种病毒产生多种类型的抗体，另一方面无血清的疫苗能够减轻产蛋母鸡的应激反应，避免产蛋母鸡的产蛋率大幅降低，再一方面能够避免产蛋母鸡产生抗血清抗体，增加目标抗体的纯度和水平；
在产蛋母鸡26～27周龄时开始进行免疫，此时母鸡处于产蛋高峰期，能够避免产蛋母鸡由于受免疫刺激的影响而产蛋率无法达到正常水平；而且，在开始免疫前一周对产蛋母鸡进行特殊饲喂，使产蛋母鸡镇静以进一步减轻免疫应激反应，同时增加产蛋母鸡的营养和抵抗力，增强产蛋母鸡的特异性免疫反应强度；
采用特定的免疫位点并在产蛋母鸡处于睡眠状态的暗光下进行三次免疫，同时对免疫剂量和免疫间隔时间进行优化，显著增强了免疫后产蛋母鸡的目标抗体水平以及目标抗体维持时间。
5.本发明提供的猫用三联卵黄抗体的制备方法，操作简单，制备成本较低，能够在一次制备过程中制备得到三种具有较高抗体效价的卵黄抗体。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明实施例中涉及的生物材料来源或分离方法如下：
F-81细胞(来源：ATCC)；猫细小病毒(刘碧涛，任常宝，张晓战等.猫细小病毒的分离鉴定[J].动物医学进展，2013,34(9)：124-127.)；猫疱疹病毒(张硕，李纯玲，汪葆玥等.猫疱疹病毒I型的分离与鉴定[J].实验动物科学.2012,7(2)：21-25.)；猫杯状病毒(高玉伟，夏咸柱，扈荣良等.猎豹与虎猫杯状病毒的分离及其超变区基因比较研究[J].中国预防兽医学报.2003,25(3)：179-182.)；产蛋母鸡(品种：农大三号，来源：曲周县北农大禽业有限公司)。
本发明实施例中涉及的试剂来源如下：
弗氏佐剂(来源：Sigma，批号：P191204)；白油佐剂(来源：郑州爱德佳生物技术有限公司，批号：202104005S)；维生素C(来源：石药集团维生药业(石家庄)有限公司，批号：1211024527)；蔗糖(来源：广西糖业集团大新制糖有限公司，批号：20210220051204)；苯甲酸钠(来源：天津市永大化学试剂有限公司，批号：20210514)；正辛酸(来源：国药集团化学试剂有限公司，批号：20201210)；葡萄糖(来源：国药集团化学试剂有限公司，批号：20160531)；三氯叔丁醇(来源：国药集团化学试剂有限公司，批号：20200918)；猫瘟单抗(田丽红，华育平.虎源猫瘟病毒VP2蛋白特异性单克隆抗体的制备[J].经济动物学报，2010,14(2)：67-70.)。
实施例1
本实施例提供一种猫用三联卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)三联灭活疫苗的制备
分别利用F-81细胞对猫细小病毒(FPV)、猫疱疹病毒(FHV)和猫杯状病毒(FCV)进行培养(培养液为DMEM培养基)，培养至F-81细胞发生80％以上的CPE(致细胞病变效应)后，培养物反复冻融3次，于3000r/min的条件下离心收集培养的各病毒液，并测定各病毒液中病毒的TCID50。经测定，猫细小病毒液中FPV的病毒含量为1×106.5TCID50/0.1ml，猫疱疹病毒液中FHV的病毒含量为1×107.0TCID50/0.1ml，猫杯状病毒液中FCV的病毒含量为1×106.5TCID50/0.1ml。
分别将收集到的三种无血清病毒液浓缩2倍后，进行灭活处理(灭活条件为：终浓度0.055～0.2wt％的甲醛，38℃，36小时)，得到三种灭活病毒无血清浓缩液，三种灭活病毒无血清浓缩液混合后再与弗氏佐剂按照1:1的体积比进行混合乳化，制成含有灭活FPV、灭活FHV和灭活FCV的三联灭活疫苗。
(2)产蛋母鸡的饲喂
用混合饲料饲喂25～26周龄的产蛋母鸡，控制饲喂环境温度为13～25℃，空气湿度为55％～65％，每天光照时间不少于15h，其中，以所述混合饲料的总重量为基准，所述混合饲料中含有0.05wt％的L-茶氨酸、0.03wt％的卡瓦胡椒、0.006wt％的维生素E、0.01wt％的硫酸锌以及0.01wt％的牛磺酸；
(3)产蛋母鸡的免疫
于操作(2)中开始饲喂后1周，暗光下，利用步骤(1)得到的三联灭活疫苗对健康状态和产蛋率良好的产蛋母鸡进行注射免疫，免疫次数为三次，第一次免疫剂量为1.5ml/只，免疫部位为颈部皮下和双侧腿部肌肉；第二次免疫剂量为2ml/只，免疫部位为颈部皮下和胸部肌肉；第三次免疫剂量为2.5ml/只，免疫部位为颈部皮下和胸部皮下；前两次免疫之间间隔14天，第三次免疫在第二次免疫后21天进行。
第三次免疫后，收集鸡蛋，鸡蛋经蛋清蛋黄分离后，分别测定蛋黄中FPV卵黄抗体、FHV卵黄抗体和FCV卵黄抗体的中和抗体效价，当免疫鸡蛋中的FPV卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:512，FHV卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:64，FCV卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:64时，大量收集免疫鸡蛋。
(3)对步骤(2)中收集的免疫鸡蛋进行消毒，无菌分离蛋黄，得到猫用三联卵黄抗体。
本实施例中收集第三次免疫后第10～180天的免疫鸡蛋，180天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率平均为78.5％。对本实施例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:1024，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:256，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128。
实施例2
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本实施例中，第一次免疫剂量为1ml/只，第二次免疫剂量为2ml/只，第三次免疫剂量为2ml/只。
本实施例中收集第三次免疫后第12～150天的免疫鸡蛋，150天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率平均为79.1％。对本实施例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:1024，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128。
实施例3
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本实施例中，第一次免疫剂量为1.5ml/只，第二次免疫剂量为1.5ml/只，第三次免疫剂量为2.5ml/只。
本实施例中收集第三次免疫后第10～150天的免疫鸡蛋，150天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率平均为79.2％。对本实施例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:1024，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128。
实施例4
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本实施例中，前两次免疫之间间隔10天，第三次免疫在第二次免疫后21天进行。
本实施例中收集第三次免疫后第15～150天的免疫鸡蛋，150天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率平均为78.5％。对本实施例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:1024，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128。
实施例5
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本实施例中，前两次免疫之间间隔15天，第三次免疫在第二次免疫后15天进行。
本实施例中收集第三次免疫后第15～120天的免疫鸡蛋，120天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率平均为78.9％。对本实施例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:1024，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128。
实施例6
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本实施例中三种病毒液的浓缩倍数为3倍。
本实施例中收集第三次免疫后第8～180天的免疫鸡蛋，180天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率平均为78.1％。对本实施例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:1024，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:256，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128。
实施例7
本实施提供一种猫用三联卵黄抗体蛋黄粉的制备方法：
分别将实施例1～6中收集的免疫鸡蛋分别进行表面消毒，无菌分离蛋黄，匀浆，经巴氏消毒和病毒灭活处理后，每1000克蛋黄加入10g维生素C、50g蔗糖和1.5g苯甲酸钠，充分混匀后进行低温冻干，得到猫用三联卵黄抗体蛋黄粉。
实施例8
本实施提供一种猫用三联卵黄抗体注射剂的制备方法：
分别将实施例1～6中收集的免疫鸡蛋分别进行表面消毒，无菌分离蛋黄，匀浆，经巴氏消毒和病毒灭活处理后，先加入3体积倍的pH为7.2的磷酸盐缓冲液混匀，再于搅拌条件下加入终浓度为0.1wt％的正辛酸，2～8℃静置过夜或者室温放置4～6小时后，于8000r/min的转速下离心20分钟，弃掉沉淀，留取上清液，6倍浓缩，加入终浓度为2wt％的葡萄糖和终浓度为0.5wt％的三氯叔丁醇，充分混匀，调节pH值为6.0，用0.22μm滤膜进行抽滤，除菌去杂质，得到卵黄抗体注射剂。
对比例1
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本对比例中利用等量的白油佐剂替换弗氏佐剂。由于抗体水平一直低于要求，故在三免后21天对母鸡进行了第四次免疫。
本对比例中收集第四次免疫后第10～60天的免疫鸡蛋，60天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率为76.9％。对本对比例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:512，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:64，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:64。
对比例2
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本对比例中三种病毒液不经浓缩，灭活后直接混合，再与弗氏佐剂等体积混合乳化得到本对比例的三联灭活疫苗。
本对比例中收集第三次免疫后第15～120天的免疫鸡蛋，120天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率为82.6％。对本对比例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:512，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:64，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:64。
对比例3
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本对比例步骤(1)中制备三联灭活疫苗时使用的培养液为添加有2％体积百分含量胎牛血清的DMEM培养基。
本对比例中收集第三次免疫后第10～160天的免疫鸡蛋，160天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率为73.2％。对本对比例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:512，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:64，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:64。
对比例4
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本对比例步骤(2)中利用常规全价饲料(厂家：北京兴农饲料有限公司)，并在自然条件下饲喂产蛋母鸡。
本对比例中收集第三次免疫后第10～175天的免疫鸡蛋，175天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率为55.1％。对本对比例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:1024，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:128。
对比例5
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本对比例步骤(2)中使用30～31周龄的产蛋母鸡。
本对比例中收集第三次免疫后第10～170天的免疫鸡蛋，170天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率为45.6％。对本对比例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:512，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:64，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:64。
对比例6
按照实施例1的方法制备猫用三联卵黄抗体，不同的是：本对比例步骤(3)中三次免疫的注射位点均为两侧腿部肌肉。
本对比例中收集第三次免疫后第10～130天的免疫鸡蛋，130天后鸡蛋中的各卵黄抗体的效价低于收集标准，停止收集，收集期间，产蛋母鸡的产蛋率为79.1％。对本对比例中制得的猫用三联卵黄抗体进行效价测定，其中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:512，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:64，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价为1:64。
实验例1
本实验例用于说明本发明的猫用三联卵黄抗体在FPV、FHV和FCV感染中的应用。按照实施例7和8的方法，将实施例1中收集的免疫鸡蛋制成三联卵黄抗体蛋黄粉(本实验例中以下简称“蛋黄粉”)或者三联卵黄抗体注射剂(本实验例中以下简称“注射剂”)。
1.1猫用三联卵黄抗体在FPV感染中的应用
1.1.1试验设计
选取25只8～12周龄断奶幼猫，随机分成5组，每组5只，分别为第1组(口服蛋黄粉组，预防)、第2组(注射注射剂组，预防)、第3组(攻毒后治疗组)、第4组(攻毒对照组)和第5组(空白对照)。具体试验方案为：
第1组：攻毒前，每日口服蛋黄粉，1g/只，连续服用5天。
第2组：攻毒前，每日皮下注射注射剂，1ml/只，连续注射5天。
第3组：攻毒前，正常饮食。
第4组：攻毒前，正常饮食。
第5组：整个试验期间，正常饮食。
第6日，对第1～4组进行FPV细胞培养毒口服攻毒，FPV病毒效价为105TCID50/0.1ml，剂量为300μl/猫。第5组完全和第1～4组隔开喂养。每日观察并记录猫的状态，连续观察两周。发病判定标准为：精神沉郁、食欲减退、体温升高、呕吐、腹泻、粪便检出FPV阳性等。
1.1.2试验结果
结果显示，攻毒对照组(第4组)发病率100％，死亡率100％，与攻毒对照组相比，口服蛋黄粉组(第1组)和注射注射剂组(第2组)具有很好的紧急预防作用，发病率均为40％，试验结束，均存活。攻毒后治疗组(第3组)，攻毒后第4天至第5天开始出现明显的猫瘟临床症状，此时开始治疗，治疗方式为：每天口服蛋黄粉，1.5g/kg，2次/日，同时，进行退烧、消炎、止吐、止泻等辅助治疗(阿莫西林克拉维酸钾、奥美拉唑和复合维生素B，按照规定剂量用药)。从治疗开始第3天，2只猫腹泻或者血便明显减轻，体温逐渐正常；第4天，共有3只猫腹泻症状明显减轻，腹泻转为软便，饮食增加；第5天，5只猫腹泻症状均改善，食欲明显增加，至第7天，精神状态完全恢复、临床症状消失，食欲恢复到试验前甚至增加，第7天后继续吃3天蛋黄粉，进行巩固。空白对照组(第2组)猫无任何猫瘟临床症状，试验成立。
以上结果显示，本发明的猫用三联卵黄抗体对FPV感染具有很好的紧急预防作用和明显的治疗效果，且治愈率为100％。
表1卵黄抗体紧急预防试验
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备注*：1级(临床症状相对较轻)：体温升高、精神沉郁、食欲轻微减退，偶尔呕吐、轻微腹泻，粪便检出FPV阳性；2级(临床症状相对较重)：体温升高、嗜睡、精神沉郁、食欲减退，呕吐、水样或血样腹泻，粪便检出FPV阳性；3级(临床症状严重)：体温升高，精神极度沉郁、食欲费绝、呕吐、水样或血样腹泻，粪便检出FPV阳性。
1.2猫用三联卵黄抗体在FHV感染中的应用
1.2.1试验设计
选取20只8～12周龄断奶幼猫，随机分成4组，每组5只，分别为第1组(口服蛋黄粉组，预防)、第2组(注射注射剂组，预防)、第3组(攻毒后治疗组)、第4组(攻毒对照组)。空白对照用“1.1猫用三联卵黄抗体在FPV感染中的应用”的第5组空白对照作参考。具体试验方案为：
第1组：攻毒前，每日口服蛋黄粉，1g/只，连续服用5天。
第2组：攻毒前，每日皮下注射注射剂，1ml/只，连续注射5天。
第3组：攻毒前，正常饮食。
第4组：攻毒前，正常饮食。
第6日，对第1～4组进行FHV细胞培养毒滴鼻攻毒，FHV病毒效价为105.5TCID50/0.1ml，剂量为300μl/猫。每日观察并记录猫的状态，连续观察两周。发病判定标准为：精神沉郁、食欲减退、打喷嚏、眼鼻分泌物增多并呈水样或者粘稠状、咳嗽、鼻塞、不喜动、眼结膜水肿、结膜炎、眼、鼻分泌物检出FHV阳性等。
1.2.2试验结果
结果显示，攻毒对照组(第4组)发病率100％，死亡率100％，与攻毒对照组相比，口服蛋黄粉组(第1组)和注射注射剂组(第2组)具有很好的紧急预防作用，发病率分别为60％和40％，试验结束，均存活。攻毒后治疗组(第3组)，攻毒后第4天至第5天开始出现明显的猫鼻支临床症状，此时开始治疗，治疗方式为：每天口服蛋黄粉，1.5g/kg，2次/日，同时，进行消炎、滴眼辅助治疗(阿莫西林克拉维酸钾、贝特赛特滴眼液，按照规定剂量用药)。从治疗开始第3天，病猫的临床症状得到明显改善，从无食欲变得能自主喝水，第4天，症状稍微减轻，第5天，食欲恢复且能自主饮食，健康状况明显好转，至第7天，精神状态完全恢复、临床症状基本消失，食欲恢复到试验前甚至增加，第7天后继续吃3天蛋黄粉，进行巩固。
以上结果显示，本发明的猫用三联卵黄抗体对FHV感染具有很好的紧急预防作用和明显的治疗效果，且治愈率为100％。
1.3猫用三联卵黄抗体在FCV感染中的应用
1.3.1试验设计
选取20只8～12周龄断奶幼猫，随机分成4组，每组5只，分别为第1组(口服蛋黄粉组，预防)、第2组(注射注射剂组，预防)、第3组(攻毒后治疗组)、第4组(攻毒对照组)。空白对照用“1.1猫用三联卵黄抗体在FPV感染中的应用”的第5组空白对照作参考。具体试验方案为：
第1组：攻毒前，每日口服蛋黄粉，1g/只，连续服用5天。
第2组：攻毒前，每日皮下注射注射剂，1ml/只，连续注射5天。
第3组：攻毒前，正常饮食。
第4组：攻毒前，正常饮食。
第6日，第对1～4组进行FCV细胞培养毒滴鼻攻毒，FCV病毒效价为2×105.0TCID50/0.1ml，剂量为500μl/猫。每日观察并记录猫的状态，连续观察两周。发病判定标准为：发热、精神沉郁、打喷嚏、眼或鼻出现粘液性或浓性分泌物、结膜炎、流口水、口腔溃疡、分泌物增多、气管炎、支气管炎、眼、鼻分泌物检出FCV阳性等。
1.3.2试验结果
结果显示，攻毒对照组(第4组)发病率100％，出现典型的口腔溃疡、眼鼻分泌物增多、发热、打喷嚏，精神沉郁、饮食减少等症状，死亡率40％，与攻毒对照组相比，口服蛋黄粉组(第1组)和注射注射剂组(第2组)具有很好的紧急预防作用，发病率分别为40％和60％，试验结束，均存活。攻毒后治疗组(第3组)，攻毒后第3天开始出现明显的临床症状，主要表现为口腔和舌部水泡，随后发生溃疡、食欲减少、精神不佳以及眼、鼻分泌物增多。从出现典型症状开始对攻毒后治疗组(第3组)的发病猫治疗，治疗方式为：每天口服蛋黄粉，1.5g/kg，2次/日，同时，进行消炎、退烧、抗病毒和溃疡面处理等辅助治疗(多西环素、干扰素、贝特塞特滴眼液和维生素B2，按照规定剂量用药)。从治疗开始第5天，病猫的临床症状得到明显改善，口腔水泡减少、溃疡逐渐开始愈合，至第7天，精神状态恢复、临床症状基本消失，第7天后继续吃3天三联卵黄粉，进行巩固。
以上结果显示，本发明的猫用三联卵黄抗体对FCV感染具有很好的紧急预防作用和明显的治疗效果，且治愈率为100％。
实验例2
本实验例用于说明本发明的猫用三联卵黄抗体在FPV、FHV和FCV混合感染中的应用。按照实施例7和8的方法，将实施例1中收集的免疫鸡蛋制成三联卵黄抗体蛋黄粉或者三联卵黄抗体注射剂。
选择临床上同时感染猫瘟、猫疱疹和猫杯状病毒的8～15周龄幼猫15只，FPV、FHV和FCV核酸检测阳性，症状表现为呕吐、腹泻或者血便、眼鼻有水样或者脓性分泌物、口腔有不同面积的溃疡。试验猫随机分3组，每组5只。组1用三联卵黄抗体蛋黄粉进行治疗，每天喂2次，1.5g/次，同时，进行消炎、退烧、止吐、抗病毒等辅助治疗(阿莫西林克拉维酸钾、奥美拉唑、赛瑞宁、干扰素、贝特塞特滴眼液和复合维生素B，按照规定剂量用药)。组2用三联卵黄抗体注射剂治疗，每天1次，1ml/次，同时，进行消炎、退烧、止吐、抗病毒等辅助治疗(阿莫西林克拉维酸钾、奥美拉唑、赛瑞宁、干扰素、贝特塞特滴眼液和复合维生素B，按照规定剂量用药)；组3用猫瘟单抗进行注射治疗，每天1次，1ml/次，同时，进行消炎、退烧、止吐、抗病毒等辅助治疗(阿莫西林克拉维酸钾、奥美拉唑、赛瑞宁、干扰素、贝特塞特滴眼液和复合维生素B，按照规定剂量用药)。结果显示，三种方式治愈率分别为100％、100％和80％。
组1，治疗第4天，3只猫腹泻和血便明显改善，食欲增加；第6天，2只猫眼鼻分泌物均减轻，整体的临症状均减轻，腹泻或血便明显减轻；第8天，4只猫眼鼻分泌物均明显改善，4只猫临床症状基本消失，腹泻和血便变为软便，口腔溃疡逐渐愈合，体温正常；第10天，5只猫临床症状均消失。
组2，治疗第4天，2只猫腹泻和血便明显改善，食欲增加；第6天，3只猫眼鼻分泌物明显减轻；第8天，5只猫眼鼻分泌物均明显减轻，其中3只无腹泻或血便；第9天，临床症状基本消失，口腔溃疡痊愈，体温正常，第10～11天，5只猫临床症状均消失。
组3，治疗第4天，2只猫腹泻减轻；第6天，3只猫腹泻或血便减轻；第8天，2只猫眼鼻分泌物改善，4只猫腹泻和血便变为软便，体温正常；第10天，3只猫眼鼻分泌物明显减少，2只猫眼鼻分泌物变粘稠，4只猫腹泻或血便均逐渐好转；第12天，1只猫咪因腹泻和发热持续，转为肺炎；第13天，转为肺炎的猫死亡；第15天，剩余4只猫所有临床症状消失，口腔溃疡痊愈，体温正常。
以上结果显示，三联卵黄抗体蛋黄粉对改善猫瘟病毒引起的腹泻具有很好的辅助治疗效果，对于腹泻的治疗效果稍优于卵黄抗体注射剂，病程缩短1天左右；三联卵黄抗体蛋黄粉和猫瘟单抗相比，整体治疗时间缩短5天左右。三联卵黄抗体注射剂的治疗效果亦优于猫瘟单抗，病程缩短4～5天。以上结果说明，本发明的猫用三联卵黄抗体具有明显的治疗效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种三联卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)制备三联灭活疫苗，其中，所述三联灭活疫苗为灭活猫细小病毒无血清浓缩液、灭活猫疱疹病毒无血清浓缩液、灭活猫杯状病毒无血清浓缩液以及弗氏佐剂的乳化液，其中，所述灭活猫细小病毒无血清浓缩液、所述灭活猫疱疹病毒无血清浓缩液和所述灭活猫杯状病毒无血清浓缩液的总体积与所述弗氏佐剂的体积之比为1:1；所述灭活猫细小病毒无血清浓缩液由无血清培养的猫细小病毒液经浓缩和灭活后得到，浓缩倍数为2～3倍，猫细小病毒液中猫细小病毒的含量不低于106.0TCID50/0.1ml；所述灭活猫疱疹病毒无血清浓缩液由无血清培养的猫疱疹病毒液经浓缩和灭活后得到，浓缩倍数为2～3倍，猫疱疹病毒液中猫疱疹病毒的含量不低于106.5TCID50/0.1ml；所述灭活猫杯状病毒无血清浓缩液由无血清培养的猫杯状病毒液经浓缩和灭活后得到，浓缩倍数为2～3倍，猫杯状病毒液中猫杯状病毒的含量不低于106.5TCID50/0.1ml；
(2)利用混合饲料饲喂25～26周龄的产蛋母鸡，控制饲喂环境温度为13～25℃，空气湿度为55％～65％，每天光照时间不少于15h，其中，以所述混合饲料的总重量为基准，所述混合饲料中含有0.02～0.05wt％的L-茶氨酸、0.02～0.05wt％的卡瓦胡椒、0.005～0.01wt％的维生素E、0.004～0.012wt％的硫酸锌以及0.01～0.03wt％的牛磺酸；
(3)于操作(2)中开始饲喂后1～2周，暗光下，利用操作(1)制备的三联灭活疫苗对所述产蛋母鸡依次进行3次免疫，其中，第一次免疫的免疫剂量为1～1.5ml/只，免疫部位为颈部皮下和双侧腿部肌肉；第二次免疫的免疫剂量为1.5～2ml/只，免疫部位为颈部皮下和胸部肌肉；第三次免疫的免疫剂量为2～2.5ml/只，免疫部位为颈部皮下和胸部皮下；第一次免疫与第二次免疫的时间间隔为10～15天，第二次免疫与第三次免疫的时间间隔为15～21天；
(4)3次免疫结束后，当蛋黄中猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:512，猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:64，猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:64时，收集免疫鸡蛋；
(5)对免疫鸡蛋进行消毒，无菌分离蛋黄。
2.一种利用权利要求1所述的制备方法制备的猫用三联卵黄抗体，其特征在于，包括：猫细小病毒卵黄抗体、猫疱疹病毒卵黄抗体和猫杯状病毒卵黄抗体。
3.根据权利要求2所述的三联卵黄抗体，其特征在于，在所述三联卵黄抗体中，所述猫细小病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:1024，所述猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:128，所述猫杯状病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:128。
4.一种药物制剂，其特征在于，包括权利要求2或3所述的三联卵黄抗体以及药学上可接受的辅助成分。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为固体制剂，所述辅助成分包括维生素C、蔗糖、葡萄糖或苯甲酸钠中的至少一种；
或，所述药物制剂为液体制剂，所述辅助成分包括葡萄糖和三氯叔丁醇，和/或，山梨醇或甘露醇。
6.权利要求2或3所述的三联卵黄抗体或者权利要求4或5所述的药物制剂在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗由猫细小病毒、猫疱疹病毒和猫杯状病毒中至少一种病毒感染引起的动物疾病的药物中的用途。
7.一种液体药物制剂的制备方法，其特征在于，包括：
取权利要求1中无菌分离后的蛋黄，匀浆，经消毒处理后，加入3～5体积倍的磷酸盐缓冲液，然后加入终浓度为0.1～1wt％的正辛酸，静置，离心，弃沉淀，取上清液，进行6～10倍浓缩，备用；
向所述上清液中加入终浓度为1～3wt％的葡萄糖和终浓度为0.3～0.5wt％的三氯叔丁醇，以及终浓度为0～0.5wt％的山梨醇或者终浓度为0～5wt％的甘露醇，混合，调节pH值为6.0～6.5，得到的混合物进行过滤。
8.一种固体药物制剂的制备方法，其特征在于，包括：
取权利要求1中无菌分离后的蛋黄，匀浆，经消毒处理后，加入药学上可接受的辅助成分，混合，冻干。
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