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CN114805554B - 抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌的精制卵黄抗体注射剂及其制备方法 - Google Patents

抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌的精制卵黄抗体注射剂及其制备方法 Download PDF

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CN114805554B CN202210389078.1A CN202210389078A CN114805554B CN 114805554 B CN114805554 B CN 114805554B CN 202210389078 A CN202210389078 A CN 202210389078A CN 114805554 B CN114805554 B CN 114805554B
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Abstract

本发明公开了一种无色透明、效价高、堪与人免疫蛋白媲美的抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌的二联四价精制卵黄抗体注射剂。所述卵黄抗体含有副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型、血清13型以及猪链球菌2型抗原；所述副猪嗜血杆菌血清4型的菌株保藏号为CVCC NO：3953；所述副猪嗜血杆菌血清5型的菌株保藏号为CVCC NO：3956；所述副猪嗜血杆菌血清13型的菌株保藏号为CVCC NO：3958；所述猪链球菌2型的菌株保藏号为CCTCC NO：M2021457。本发明卵黄抗体纯度可达到90％以上，抗体效价最高可达8log2，常温保存1年抗体水平还能维持在7log2以上。

Description

抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌的精制卵黄抗体注射剂及其制备 方法
技术领域
本发明属于卵黄抗体的制备和应用领域，具体涉及抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌的精制卵黄抗体注射剂及其制备方法。
背景技术
猪链球菌(Streptococcussuis,SS)和副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪的引起上呼吸道传染病的两种重要病原菌，在国内猪群中持久广泛存在，造成猪群生长缓慢、免疫力低下等问题，严重影响生猪健康养殖。
猪链球菌(SS)为革兰氏阳性，需氧或兼性厌氧菌，不仅可以侵入血液循环造成肺炎，关节炎和淋巴结炎等，还可通过血脑屏障和胎盘屏障导致脑膜炎及母猪流产。同时，猪链球菌通过伤口及呼吸道等途径可以感染人，引发人的关节化脓性炎症，脑膜脑炎及心内膜炎等，严重的可致死亡，已被列为国家二类动物疫病。猪链球菌共有33个血清型，其中2型(SS2)流行最为广泛，且是一种人畜共患病。副猪嗜血杆菌(HPS)为短杆状的革兰氏阴性细菌，可引起猪的格氏病，以高热、关节肿胀、呼吸道紊乱及中枢神经针状为主要特征。10日龄以下仔猪极易从带菌母猪感染，断奶期仔猪常由于其母源抗体水平下降发病。目前已鉴定的副猪嗜血杆菌包括15种血清型，其中以 4型及5型最为常见。不同血清型毒力存在差异，其中4、5和13型菌株为中、高毒力菌株，常引起猪的心肌炎、肺炎、胸膜炎、脑膜炎和关节炎等症状，对生猪健康养殖造成巨大威胁。
目前，预防和治疗猪链球菌和副猪嗜血杆菌感染的主要方法是免疫接种和抗生素治疗。在预防方面，国内主要采用灭活疫苗。
专利CN101721696A公开了一种猪副嗜血菌血清4型、5型、13型三价油乳剂灭活疫苗。它是应用我国猪副嗜血菌三个主要的流行血清型和分离株作为抗原，通过用TSB肉汤培养扩繁24h后，经过0.3％甲醛灭活11～13h，三个血清型的抗原以1∶1∶1的比例混合，然后加入与抗原总体积相等的油相，再经乳化制备而成。该疫苗佐剂为白油，此佐剂疫苗副反应较大，会在注射部位形成炎症或肿胀；另外据研究资料显示，使用矿物油佐剂会在一定程度上激发和提高猪圆环等猪病的发病率。而且，该疫苗制备过程中，所获得的抗原没有灭活后灭活效果的判定及相关检验，无法得知抗原灭活是否完全，所获得的抗原不能作为制苗用抗原。
且随着病原流行株和混合感染，现有疫苗很难达到预期的免疫效果，且疫苗产生的抗体保护时间短，需多次免疫才能获得较强的免疫力，对猪只的应激也大；也有用敏感的抗生素进行治疗的，但随着抗生素的大量应用，耐药性日趋严重，治疗效果不佳，并存在肉制品中的抗生素残留问题等。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌的精制卵黄抗体注射剂及其制备方法，该卵黄抗体无色透明、效价高、堪与人免疫蛋白媲美，具有较好的安全性。
卵黄抗体不存在药物残留和耐药性的问题，是一种安全、高效、无公害的生物制品，可代替抗生素用于猪链球菌和副猪嗜血杆菌的日常预防和治疗。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌的卵黄抗体，所述卵黄抗体含有副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型、血清13型以及猪链球菌2型抗原；
所述副猪嗜血杆菌血清4型的菌株保藏号为CVCC NO：3953；
所述副猪嗜血杆菌血清5型的菌株保藏号为CVCC NO：3956；
所述副猪嗜血杆菌血清13型的菌株保藏号为CVCC NO：3958；
所述猪链球菌2型的菌株保藏号为CCTCC NO：M2021457。
术语“抗原”又称免疫原，是指任何刺激免疫应答的物质，是一种能够被抗体结合的分子，还能够诱导产生B-和/或T-细胞的体液免疫应答和/或细胞免疫应答，还具有一个或多个表位(B-和T-表位)。所述抗原包括杀死的、灭活的细菌，或其培养细胞制剂、上清液。其中，所述杀死的、灭活的细菌是指含有不再能够复制或生长的感染性生物体或病原体，病原体可通过各种方法包括冻融、化学处理(如用硫柳汞或福尔马林处理)、声处理、照射、热或任何其它足以阻止生物体复制或生长的常用方法来实现灭活而维持其免疫原性。
进一步地，所述二联四价灭活疫苗含副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型、血清13型、猪链球菌2型抗原稀释液灭活前菌落数分别不少于4×109CFU/mL。
进一步地，
所述卵黄抗体中，副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型、血清13型、猪链球菌2型的灭活抗原稀释液为等体积混合。
进一步地，所述副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型、血清13型、猪链球菌 2型的灭活抗原稀释液的总含量为疫苗总量的50％(V/V)。
进一步地，所述二联四价灭活疫苗还包括佐剂；所述佐剂含量为疫苗总量的50％(V/V)。
本发明所述“疫苗总量”是指抗原和佐剂的总量。
术语“佐剂”是指当与抗原连同投予时，使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。
进一步地，所述佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；进一步为弗氏完全佐剂。
本发明的第二方面是提供一种如上所述卵黄抗体的制备方法，包括：
(1)将副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型、血清13型以及猪链球菌2型抗原制备成二联四价灭活疫苗；
(2)用二联四价灭活疫苗免疫蛋鸡并分离提取免疫鸡蛋中的卵黄抗体。
本发明用副猪嗜血杆菌血清4、5、13型菌株制备的抗体可对三种血清型菌株产生良好的免疫保护效果，若只选用副猪嗜血杆菌血清4型和5型制备成灭活疫苗对13型菌株保护效果不佳，甚至无法产生免疫保护。
进一步地，所述免疫方式为腿部和/或胸部肌肉注射4次，每次免疫注射间隔2周。
进一步地，当抗体效价达1:128时，收集免疫鸡蛋，分离提取卵黄抗体。
本发明的第三方面是提供一种上述卵黄抗体在制备检测、预防和/或治疗副猪嗜血杆菌、猪链球菌感染引起的相关疾病的产品中的用途；
所述产品选自制剂、药物或饲料添加剂。
术语“预防和/或治疗”在涉及细菌感染时是指抑制细菌的复制、抑制细菌的传播或防止细菌在其宿主体内定居，以及减轻细菌感染所之疾病或病症的症状。若细菌荷载量减少、感染症状减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
有益效果：
本发明首次同时实现对副猪嗜血杆菌血清4、5、13型和2型猪链球菌的治疗和预防，本发明卵黄抗体可以作为饲料添加或治疗性生物制剂，而现有灭活疫苗仅用于免疫接种。
本发明精制卵黄抗体注射剂无色透明、效价高、堪与人免疫蛋白媲美，抗体纯度可达到90％以上，抗体效价最高可达8log2，在常温条件下保存1年抗体水平还能维持在7log2以上，具有较好的安全性，在临床上可达到一针多防的效果，降低成本，并可以满足不同用户的要求。
附图说明
图1为抗猪链球菌IgY的纯化及SDS-PAGE检测图，左边为纯化后IgY；M: 蛋白Marker；1、2分别表示纯化抗猪链球菌、副猪嗜血杆菌IgY蛋白条带。
具体实施方式
下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
若无特殊说明，本发明所述的实验方法均为常规方法；所述的生物材料，均可从商业途径获得。
实施例1
1.方法
1.1试验动物
BALB/c小鼠，15～20g，购自四川达硕试验动物中心；160日龄罗曼商品代蛋鸡，四川正大。
1.2菌种保藏
猪链球菌2型强毒分离株SMU-2020-ZQ2，分离自四川省绵阳市某猪场患败血症死亡猪，对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)为2.1×107CFU，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址是湖北省武汉市八一路299号武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M2021457。拉丁文名称：Streptococcus sp. SMU-2020-ZQ2。
副猪嗜血杆菌4型、5型和13型强毒分离株均来自四川省乐山市某猪场患呼吸道症状的死亡猪，菌株均保藏于中国兽医微生物菌株保藏管理中心，可从中国兽医微生物菌株保藏管理中心购买得到，地址为：北京市海淀区中关村南大街 8号，保藏号分别为CVCC NO：3953，CVCC NO：3956、CVCC NO：3958，保藏时间分别为2008年7月25日、2008年7月28日、2008年7月28日，对 BALB/c小鼠的LD50分别为4.6×108CFU，3.3×108CFU和5.6×108CFU。
1.3纯化免疫抗原的制备
1.3.1猪链球菌2型免疫抗原制备
猪链球菌2型(SMU-2020-ZQ2株)接种于含有5％犊牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)上，置于37℃的恒温培养箱内培养24h，挑取单个菌落(CFU) 接种到含有5％犊牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)上培养18～24h，用无菌 PBS(0.01mol，pH7.2)稀释至1×109CFU/mL的菌液，加甲醛至终浓度为0.3％， 37℃灭活72h，其间震荡摇匀5～6次；6000rpm离心分离沉淀菌体，用无菌PBS (0.01mol，pH7.2)重悬菌体，再离心洗涤2次，用PBS稀释细菌浓度为4×109CFU /mL的菌液。取菌液100μL涂布于5％牛血清的TSA培养平板上，置于37℃的恒温培养箱内培养72h，观察细菌菌落，并同时设立阴性对照和未灭活的细菌阳性对照。若阳性对照出现典型的SS2型菌落，而接种灭活菌液的培养基和阴性对照组的培养基没有出现菌落，表明SMU-2020-ZQ2菌液完全灭活。
1.3.2副猪嗜血杆菌4型、5型和13型免疫抗原制备
副猪嗜血杆菌4型(3953株)、5型(3956株)和13型(3958株)菌株分别接种于含5％犊牛血清和1％烟酰胺腺嘌呤二苷酸(NAD)的TSA上，37℃培养 24h～36h。挑取单个针尖大小、光滑透明的露珠状菌落，再次接种于含5％犊牛血清和1％NAD的TSB液体培养基中培养培养24～36h，用无菌PBS(0.01mol， pH7.2)稀释至1×109CFU/mL的菌液，加甲醛至终浓度为0.3％，37℃灭活72h，其间震荡摇匀5～6次；6000rpm离心分离沉淀菌体，用无菌PBS(0.01mol，pH7.2) 重悬菌体，再离心洗涤2次，用PBS稀释细菌浓度为4×109CFU/mL的菌液。取菌液100μL涂布于含5％犊牛血清和1％NAD的TSA培养平板上，置于37℃的恒温培养箱内培养72h，观察细菌菌落，并同时设立阴性对照和未灭活的菌落阳性对照。若阳性对照出现典型的针尖大小、光滑透明的露珠状菌落，而接种灭活菌液的培养基和阴性对照组的培养基没有出现菌落，表明菌液完全灭活。
1.3.3菌苗配置
将经检验灭活完全的猪链球菌(SMU-2020-ZQ2株)和副猪嗜血杆菌三种血清型菌株(3953株、3956株和3958株)等体积混合，再与弗氏完全佐剂等体积的混合，使之成为微粘性乳白色悬液，即分别制得的猪链球菌和副猪嗜血杆菌二联四价灭活疫苗。
1.3.4安全性检验
灭活疫苗安全性检验实验步骤如下：
1)无菌检测：取灭活疫苗100μL涂布于5％牛血清的TSA培养平板上，37℃培养24h后观察有无细菌生长。
2)安全性检测：将灭活疫苗在室温下回温，分别通过颈、背部皮下多点注射的方式接种6～8周龄SPF级BALB/c雌鼠，接种剂量为1mL/只，接种后饲养于西南民族大学动物医学实验室的动物房，并观察其采食和精神状态、注射部位有无红肿等异常情况。
安全性检验结果：灭活疫苗接种到BALB/c小鼠上，精神饱满，食欲正常，注射部位吸收良好，无红肿等任何不良异常现象，表明本研究制备的猪链球菌和副猪嗜血杆菌二联四价灭活疫苗具有良好的安全性，可用于后续试验。
1.4鸡群免疫和鸡蛋收集
选取健康无主要传染病，特别是无鸡白痢沙门氏菌的高产罗曼商品代蛋鸡，通过腿部和/或胸部肌肉分别注射免疫本研究制备的猪链球菌和副猪嗜血杆菌二联四价灭活疫苗1mL，连续免疫4次，每次间隔2周。
第4次免疫后，采集血清测定效价。当抗体凝集效价达到1：27以上时认为免疫合格，每天收集鸡蛋，做好标记，4℃保存备用。
1.5猪链球菌和副猪嗜血杆菌二联四价卵黄抗体效价的测定
第4次免疫后每隔7d免疫组和未免疫组随机采集3枚鸡蛋，42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15min，取出后晾干，用蛋清蛋黄分离器分离出蛋黄；将蛋黄放入无菌烧杯中，吹打混匀，取1mL混匀后的蛋黄，加入9mL去离子水中再混匀，并调节卵黄溶液的pH值至5.0～5.2；放入4℃冰箱静置4h后，取上清液，在4℃6000rpm/min离心25min，取上清保存备用。
采用平板凝集试验进行抗体效价测定。在玻板的网格中每格中央加入灭菌 PBS(0.01mol，pH7.2)50μL，然后吸取经处理的卵黄抗体样品50μL加入第一格中，用移液枪头充分混匀后，吸取混合液50μL加于第二格中，充分混匀，依次进行倍比稀释至第8格(即稀释1024倍)，吸出50μL弃去。第9、10格和第11 格分别作为抗原对照和阳性、阴性血清对照。然后向每格的液滴上加入检测用抗原50μL，用牙签搅匀。2～5min后观察玻板每格的凝集反应现象，阴性血清对照格轻度均匀浑浊(抗原被2倍稀释的状态)，判定为阴性，标为“－”，阳性对照格出现絮状块，判定为阳性，标为“+”。出现的凝块越多，液体越透明，则表明阳性反应越强，由弱到强分别标为“+”、“++”、“+++”、“#”。出项“++”以上凝集现象的血清最高稀释度为该份血清的效价(卵黄抗体在提取过程中已经进行了2log2的稀释)。
免疫鸡的卵黄抗体二免后7天开始检测特异性抗体，抗体效价于第4次免疫后7d猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌4型、5型和13型分别达到8log2、9log2、 8log2和8log2，4次免疫一年后抗体水平均可维持在7log2以上。
1.6IgY抗体的提取纯化
收集免疫后合格的鸡蛋，42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15min，取出后晾干，用蛋清蛋黄分离器分离出蛋黄，称取重量。按1:6～9比例加入纯化水稀释匀浆。用1moL/L盐酸溶液调pH4.8～6.0，2～8℃条件静止1-24h。 4000～20000r/min离心，去除沉淀物，取上清。在上清中加入10％-35％硫酸铵盐析，充分混匀，过夜沉淀。制得沉淀4000～20000r/min离心脱盐后取沉淀制得卵黄抗体粗提物，将硫酸铵上清液去除。制得沉淀用1/150～1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调pH4.8～6.0，充分溶解2～8℃过夜，取上清。制得上清液进行54-60℃，8～20h灭活抗体中微生物。灭活后上清液用截留相对分子量50-100kD超滤膜进行超滤。超滤液经除菌过滤后为IgY原液。制得IgY原液按照按照检测的抗体效价加稳定剂制成卵黄抗体制剂。
本发明在初步制备卵黄抗体过程中，发现粗制的卵黄抗体的纯度不高，且在动物试验中表现出的保护效率不加，因此，用硫酸铵法提取后再经超滤可以进一步纯化IgY，减少杂蛋白，纯化的IgY纯度较高，且杂带少，SDS-PAGE非还原电泳显示(图1)，所提取的抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌IgY的分子量为180kD 左右，凝胶成像软件分析IgY抗体纯度为90％以上。
SDS-PAGE变性电泳显示，所提取的抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌二联四价卵黄抗体IgY被区分为两条主要条带，65kDa为IgY重链，25kDa为IgY轻链。经测定，纯化精制的IgY成品对猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌4型、5型和13 型的凝集效价均达到8log2以上。
1.7卵黄IgY抗体溶血试验
无菌采集兔血数毫升，用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使其成脱纤血液。加入10倍体积的0.9％氯化钠溶液，摇匀，1000-1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次。
将所得红细胞用0.9％氯化钠溶液配成2％的混悬液。将制备好的卵黄抗体用0.9％氯化钠溶液按1:3稀释后作为供试品溶液，以无菌生理盐水为阴性对照，未灭活的猪链球菌培养物为阳性对照，分别加入EP管中。随后依次加入2％红细胞悬液、0.9％氯化钠溶液，混匀后，立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，间隔12小时观察1次，连续观察6天，并记录分析结果。
结果显示，阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生；同时，受试物管中的溶液在144小时内不发生溶血和凝聚，表明本研究制备的卵黄IgY抗体无溶血性，可以注射使用。
1.8猪链球菌和副猪嗜血杆菌二联四价精制卵黄抗体注射剂体外抑菌试验
1.8.1猪链球菌和副猪嗜血杆菌二联四价精制卵黄抗体注射剂对猪链球菌2 型体外抑菌效果评价
猪链球菌SMU-2020-ZQ2接种到含有5％牛血清的TSB中培养至菌浓度达 107CFU/mL，经200μL稀释的细菌悬浮液和200μL卵黄IgY抗体或PBS(对照组)。
在37℃下分别孵育1h和2h后，用PBS进行10倍稀释后，取0.1mL涂布到含有5％血清的TSA培养基，并在37℃下分别孵育24h，统计各孔细菌菌落数。每个稀释倍数做三个重复，每个样本重复三次，每次做3个平行。细菌减少百分比：[CFU(细菌+PBS)-CFU(细菌+抗体)]/CFU(细菌+PBS)×100。
1.8.2猪链球菌和副猪嗜血杆菌二联四价精制卵黄抗体注射剂对三种副猪嗜血杆菌体外抑菌效果评价
分别将三个不同血清型的副猪嗜血杆菌接种到含有5％牛血清和1％NAD的 TSB中培养至细菌浓度达107CFU/mL。
经200μL稀释的细菌悬浮液和200μL卵黄IgY抗体或PBS(对照组)，在 37℃下分别孵育1h和2h后，用PBS进行10倍稀释后，取0.1mL涂布到含有 5％血清的TSA培养基，并在37℃下分别孵育24h，统计各孔细菌菌落数。每个稀释倍数做三个重复，每个样本重复三次，每次做3个平行。计算细菌减少百分比。
抑菌实验结果见表1。
表1同培养时间(h)培养液中菌含量(cfu/ml)
与PBS组相比，IgY成品均能在体外能显著抑制猪链球菌和副猪嗜血杆菌的生长。
1.9猪链球菌和副猪嗜血杆菌二联四价精制卵黄抗体注射剂对小鼠的被动保护试验
80只BALB/c小鼠随机分成8组，每组10只，其中7组每天卵黄IgY抗体0.5mL滴口1次，连用3d，1组用0.5mL生理盐水滴口作为对照组，第4天后每组分别用5LD50的猪链球菌II型、副猪嗜血杆菌4型、5型和13型，以肌肉注射攻毒小鼠，判断卵黄IgY抗体对小鼠的保护率。
卵黄IgY抗体对小鼠的被动保护试验结果见表2。
表2卵黄IgY抗体对BALB/c小鼠的被动保护试验结果
结果显示：生理盐水滴口的小鼠于攻毒后均表现出明显的临床症状：消瘦、呼吸困难、被毛杂乱、精神沉郁、食欲下降等，攻毒后16h开始出现死亡，48h 内全部死亡。卵黄IgY抗体滴口的小鼠，对猪链球菌II型、副猪嗜血杆菌4型、 5型和13型菌株均具有良好的保护效果，保护效率都高于90％。攻毒猪链球菌 II型菌株后第3d，死亡2只小鼠，其余全部存活保护率为90％；攻毒副猪嗜血杆菌4型菌株后第2d，死亡1只小鼠，其余全部存活保护率为90％；攻毒副猪嗜血杆菌5型菌株后无小鼠死亡，保护率为100％；攻毒副猪嗜血杆菌13型菌株后第3d，死亡1只小鼠，其余全部存活保护率为90％。
综上所述，本发明提供的一种抗猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌4型、5型、 13型的二联四价精制卵黄抗体注射剂，纯化精制后卵黄抗体中IgY纯度可达到 90％以上，不溶血，对猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌4型、5型和13型的凝集效价均达到8log2以上；得到的IgY成品均能在体外能显著抑制猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌4型、5型、13型的生长，对攻毒小鼠保护率均高于90％，尤其是副猪嗜血杆菌5型菌株保护率达到100％。为猪链球菌和副猪嗜血杆菌病的临床治疗提供了一种安全、高效、无公害的生物制品，可代替抗生素用于猪链球菌和辅助嗜血杆菌的日常预防和治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌的精制卵黄抗体注射剂的制备方法，其特征在于，包括：
（1）将副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型、血清13型以及猪链球菌2型抗原制备成二联四价灭活疫苗；
所述副猪嗜血杆菌血清4型的菌株保藏号为CVCC NO：3953；
所述副猪嗜血杆菌血清5型的菌株保藏号为CVCC NO：3956；
所述副猪嗜血杆菌血清13型的菌株保藏号为CVCC NO：3958；
所述猪链球菌2型的菌株保藏号为CCTCC NO：M2021457；
（2）用二联四价灭活疫苗免疫蛋鸡并分离提取免疫鸡蛋中的卵黄抗体；所述免疫方式为腿部和/或胸部肌肉注射4次，每次免疫注射间隔2周；
当抗体效价达1:128 时，于第4次免疫后7d收集免疫鸡蛋，分离提取卵黄抗体，猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌4型、5型和13型的抗体效价分别达到8log2、9log2、8log2和8log2；
所述二联四价灭活疫苗含副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型、血清13型、猪链球菌2型抗原稀释液灭活前菌落数分别不少于4×109CFU /mL；
所述卵黄抗体中，副猪嗜血杆菌血清4型、血清5型、血清13型、猪链球菌2型的灭活抗原稀释液为等体积混合。
2. 根据权利要求1 所述的卵黄抗体注射剂的制备方法，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌血清4 型、血清5 型、血清13 型、猪链球菌2 型的灭活抗原稀释液的总含量为疫苗总量的50%
（V/V）。
3. 根据权利要求1 所述的卵黄抗体注射剂的制备方法，其特征在于，所述二联四价灭活疫苗还包括佐剂；所述佐剂含量为疫苗总量的50％ (V/V)；所述佐剂为弗氏完全佐剂。
4. 权利要求1~3 任意一项中所述的卵黄抗体在制备检测、预防和/或治疗副猪嗜血杆菌血清4 型、血清5 型、血清13 型、猪链球菌2 型感染引起的相关疾病的产品中的用途；
所述产品选自制剂、药物或饲料添加剂。
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