CN114591857B - 一株高纤维降解率的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于细菌突变育种领域，具体涉及一株高纤维降解率的枯草芽孢杆菌及其应用。本发明通过重离子诱变获得枯草芽孢杆菌的突变菌株40‑1，经过诱变后，纤维素降解率提高了17.75％，酶活力提高了23.08％。经过12代传代培养，菌株具有良好的纤维降解稳定性。对其进行单因素优化试验后，最终得到突变菌株Bacillus subtilis 40‑1的培养时间为72h，温度为45℃，初始pH值为6.5。纤维素降解率为(67.79±0.49)％，较未优化时提高27.74％。与同类产纤维素酶的芽孢杆菌相比，突变菌株Bacillus subtilis 40‑1对纤维素有良好的降解能力，纤维素酶活力高，具有相当广阔的应用前景。

Description

一株高纤维降解率的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于细菌突变育种领域，具体涉及一株高纤维降解率的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

纤维素是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富的碳水化合物和可再生资源。由于纤维素β-糖苷键的结构特点，使其难于被降解和利用，大部分纤维素材料都作为废物丢弃，这不仅造成极大的资源浪费，而且导致环境污染。因此，如何将纤维素转化为可溶性糖并进而被利用，一直是中外学者关注的热点，但目前尚缺乏低成本且高效的纤维素降解方式，而纤维素降解方式又会影响后续降解产物的利用。在目前强酸、强碱和生物降解等方式中，生物降解存在污染小、副产物少和降解产物易利用等优点，是纤维素降解的主要方式。细菌和真菌均具有纤维降解能力，细菌纤维降解效率一般低于真菌，但后者种类少、生长速度较慢、对氧的需求较高、耗能多、生产成本高。相比之下，细菌具有来源广、种类多、生长快、耐受性强且环境适应力好等优势，故来源于细菌的纤维素酶在一些场合更具有应用意义。目前，国内外主要的研究方向是选育可以高效降解纤维素的菌种。自20世纪60年代以来,国内外共报道数千个具有纤维素降解能力的菌株，其中细菌主要有假单胞菌属和芽孢杆菌属。研究表示，产纤维素酶菌种若是筛选于自然界中，则其多存在产量小、活力低等缺点，难以满足实际生产的需求，因此需要通过人工方式对其进行诱变育种或基因工程改造，通过基因突变提高产量和生产性能，并筛选出与工业生产要求相符的菌株。相关学者利用多种诱变方法对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和放线菌等菌株进行高纤维素降解能力的诱变选育工作。在诱变选育的纤维素降解菌细菌中，芽孢杆菌属占有一定比例，其中的枯草芽孢杆菌作为重要的工业菌种，具有耐受不利条件能力强、耐高温、耐酸碱、培养周期短、安全性好等优势，且酶系丰富，可以产生多种水解酶，尤其是产生的纤维素酶系中内切葡聚糖苷酶活性较高，因此，在纤维降解尤其是用于饲料的纤维原料降解中具有一定的应用前景。然而，枯草芽孢杆菌产纤维素酶量较少，导致纤维素降解率相对不高，限制了其在有关纤维素降解工业中产业化的应用。为解决这一问题，需要选育一株具有高纤维素降解率的枯草芽孢杆菌。目前，国内外常用的育种的方法有诱变育种和基因工程育种等。与基因工程等方法相比，诱变育种具有安全性高、突变率高和操作简便等优势，因而诱变育种是目前工业常用的菌种性能改良的主要手段，但是由于紫外线、中子、γ射线和激光等传统诱变源的反复利用，导致许多工业菌株经诱变育种后产生了耐受性。重离子诱变作为一种新的诱变方法，具有突变率高、突变谱广、不易回复突变等优势。本研究采用传能线密度大的¹²C⁶⁺重离子束流对枯草芽孢杆菌进行诱变选育，通过初筛和复筛获得纤维素降解率较高的枯草芽孢杆菌，该菌株对纤维素资源化利用尤其是纤维素资源饲料化利用具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提高纤维素的降解率。

为解决上述技术问题，第一个方面本发明提供枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis，其菌株编号为40-1，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏号为GDMCC No.61840。

为解决上述技术问题，第二个方面本发明提供上述的枯草芽孢杆菌在降解纤维素的应用。

为解决上述技术问题，第三个方面本发明提供上述的枯草芽孢杆菌在制备降解纤维素的产品中的应用。

为解决上述技术问题，第四个方面本发明提供菌剂，所述菌剂的活性成分包括上述的枯草芽孢杆菌。

上述菌剂的活性成分可为上述枯草芽孢杆菌或/和上述枯草芽孢杆菌的代谢物(如发酵产物)，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。

所述菌剂可为降解纤维素的菌剂。

为解决上述技术问题，第五个方面本发明提供上述的菌剂在降解纤维素中的应用。

为解决上述技术问题，第六个方面本发明提供降解纤维素的方法，所述方法包括使用上述的枯草芽孢杆菌或上述的菌剂分解纤维素。

进一步地，上述的方法中，所述菌剂的制备方法包括用培养基培养上述的枯草芽孢杆菌，收集发酵产物，将所述发酵产物作为菌剂的成分。术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。

本发明中，所述培养物是将上述枯草芽孢杆菌40-1在微生物培养基中培养得到的物质(培养容器内的所有物质)。

进一步地，上述的方法中，所述培养基包括碳源和氮源，所述碳源为玉米皮，所述氮源为有机氮源和/或无机氮源，所述有机氮源为豆粕或蛋白胨，所述无机氮源为硫酸铵。

进一步地，上述的方法中，所述培养基中玉米皮的含量为20g/L，所述蛋白胨的含量为10g/L；所述培养基中玉米皮的含量为20g/L，所述豆粕的含量为5g/L；所述培养基中玉米皮的含量为20g/L，所述豆粕的含量为3.5g/L，所述硫酸铵的含量为1.5g/L。

进一步地，上述的方法中，所述培养的培养条件为：培养时间为72h，温度为45℃，初始pH值为6.5。

本发明中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。

本发明中所述固体培养基可由液体培养基中添加15g/L的琼脂粉制备得到。

优化获得的培养基配方包括：

玉米皮-蛋白胨发酵培养基(g/L)：玉米皮20.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5，其余为水。

玉米皮-豆粕发酵培养基(g/L)：玉米皮20.0、豆粕5.0、NaCl 5.0、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5，其余为水。

玉米皮-硫酸铵发酵培养基(g/L)：玉米皮20.0、豆粕3.5、硫酸铵1.5、NaCl 5.0、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5，其余为水。

本发明中，培养基配制用水为去离子水。

本发明取得的有益技术效果如下：

本研究选择一株具有较高纤维素酶活力的枯草芽孢杆菌为出发菌株进行重离子辐照诱变，通过80MeV/u的¹²C⁶⁺离子束辐照后，从羧甲基纤维素钠筛选培养基平板上分离出9株H/C值高的正突变菌株，其中突变菌株Bacillus subtilis 40-1的H/C值及纤维降解率提高的幅度最大，纤维素降解率经过诱变后提高了17.75％，内切葡聚糖苷酶活力经过诱变后提高了23.08％。经过12代传代培养，菌株具有良好的纤维降解稳定性。

对其进行单因素优化试验后，最终得到突变菌株Bacillus subtilis 40-1的最适发酵时间、温度、pH值分别为120h、45℃、6.5，优化发酵条件后，菌株的纤维素降解率为(67.79±0.49)％，较未优化时提高27.74％。与同类产纤维素酶的芽孢杆菌相比，突变菌株Bacillus subtilis 40-1对纤维素有良好的降解能力，纤维素酶活力高，具有广阔的应用前景。

保藏说明

菌种名称：枯草芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus subtilis

菌株编号：40-1

保藏机构：广东省微生物菌种保藏中心

保藏机构简称：GDMCC

地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼

保藏日期：2021年7月26日

保藏中心登记入册编号：GDMCC No.61840

附图说明

图1为5株枯草芽孢杆菌出发菌株的生长曲线。

图2为5株枯草芽孢杆菌出发菌株筛选结果。

图3为诱变前后刚果红培养基中透明圈变化。

图4为不同辐照剂量下致死率、正突变率结果。

图5为突变菌株复筛结果。

图6为菌株Bacillus subtilis 40-1纤维降解稳定性结果。

图7为重离子辐照诱变前后的菌体形态扫描电镜图；

其中：a为Bacillus subtilis CG-0(×10000)；b为Bacillus subtilis 40-1(×10000)；c为Bacillus subtilis CG-0(×50000)；d为Bacillus subtilis 40-1(×50000)；e为Bacillus subtilis CG-0(×150000)；f为Bacillus subtilis 40-1(×150000)。

图8为发酵时间对菌株Bacillus subtilis 40-1纤维降解能力的影响。

图9为发酵温度对出发菌株CG-0纤维降解能力的影响。

图10为发酵温度对优势菌株Bacillus subtilis 40-1纤维降解能力的影响。

图11为初始pH值对Bacillus subtilis 40-1纤维降解能力的影响。

图12为不同玉米皮添加量对菌株Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及酶活力的影响。

图13为不同种类有机氮源对菌株Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及酶活力的影响。

图14为不同豆粕添加量对菌株Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及酶活力的影响。

图15为硫酸铵替代量对菌株Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及酶活力的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CICC 24799、枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CICC 24739和枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CICC 24603购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。

下述实施例中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.7417(本发明中以GC-0表示)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.6757购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

本申请中，玉米皮来源于工业进行深加工生产的一种副产品，玉米籽粒经过浸泡、粉碎后分离出来的玉米表皮。下述实施例中；豆粕均为大豆粕，来源于工业中大豆经过提取豆油后得到的副产品，是畜牧和家禽的主要饲料原料。下述实施例中的玉米皮为内蒙古阜丰生物科技有限公司的产品；豆粕为秦皇岛金海食品工业有限公司的产品。

下述实施例中用到的培养基的组成分别如下：

牛肉膏蛋白胨液体培养基(g/L)：牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0；其余为去离子水。

牛肉膏蛋白胨固体培养基(g/L)：牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、琼脂粉15.0；其余为去离子水。

羧甲基纤维素钠筛选培养基(g/L)：羧甲基纤维素钠10.0、蛋白胨10.0、酵母提取粉5.0、NaCl 10.0、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5、琼脂20.0；其余为去离子水。

下述实施例中的发酵培养基，如无特别说明，均为如下玉米皮-蛋白胨发酵培养基(g/L)：玉米皮20.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5；其余为去离子水。上述培养基均用去离子水定容，并调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min。其中，玉米皮为粉碎过40目筛得到的颗粒。

实验中所需试剂的配制如下：

(1)DNS试剂的配制：准确称取6.3g 3，5-二硝基水杨苷、21.0g氢氧化钠颗粒、182.0g酒石酸钾钠、5.0g苯酚和5.0g亚硫酸钠。分别将其溶解后依次混合上述药品并用去离子水将其定容至1000mL。将配置好的DNS溶液过滤并将滤液倒入棕色试剂瓶中，避光保存，7天后方可使用，有效使用期为1年。

(2)0.5％刚果红溶液：称取刚果红0.005g，去离子水定容至100mL。

(3)0.5％NaCl溶液：称取氯化钠0.005g，去离子水定容至100mL。

(4)pH值为7.0的磷酸缓冲溶液：分别配制320mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和500mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，混匀后微调pH即可。

(5)葡萄糖标准溶液的配制：准确称取1g葡萄糖，去离子水定容至1000mL。

(6)pNP标准溶液的配制：准确称取0.1g pNP，去离子水定容至1000mL。

(7)1％羧甲基纤维素钠溶液：准确称取1g羧甲基纤维素钠，pH值为7的磷酸缓冲溶液定容至100mL。

(8)10％碳酸钠溶液：准确称取10.0g无水碳酸钠，去离子水定容至100mL。

(9)1mg/mL pNPC+1mg/mL葡萄糖酸内酯:准确称取0.1g pNPC和0.1g葡萄糖酸内酯，pH值为7的磷酸缓冲溶液定容至100mL。

(10)1mg/mL pNPG:准确称取0.1g pNPG，pH值为7.0的磷酸缓冲溶液定容至100mL。

下述实施例中，每组实验设置3个平行样品，数据结果用平均值±标准偏差显著性分析表示，实验数据采用SAS9.2进行方差分析，以P<0.05为有统计学差异，P<0.01为有显著统计学差异，P<0.001为有极其显著统计学差异。

实施例1、高纤维素降解的枯草芽孢杆菌的筛选

1.1、生长曲线测定

1.1.1、菌株活化及生长曲线测定方法

1)、菌株活化

将枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CICC 24799、枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CICC 24739、枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CICC 24603、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC 1.7417(本发明中以GC-0表示)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.6757从-70℃冰箱中取出，室温下令其缓慢解冻，然后取1mL菌液接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于恒温摇床中过夜培养，枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtilis subsp.subtilis)CICC 24799、枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilissubsp.subtilis)CICC 24739、枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilissubsp.subtilis)CICC 24603培养条件为37℃、180rpm，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC 1.7417和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.6757培养条件为30℃、180r/min，并测定其OD_600nm。

2)、生长曲线测定

将步骤1)活化好的菌液(OD_600nm＝0.8)按2％接种量接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃培养，并将菌液于0h、3h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、20h、24h分别取样3mL，以未接种培养基作空白，用UV-3200B紫外可见分光光度计在600nm波长下测定样品的吸光度，并在显微镜下观察细菌个数。以时间为横坐标，样品吸光度值为纵坐标绘制曲线即为菌体生长曲线。

1.1.2、生长曲线测定结果

5株枯草芽孢杆菌的生长曲线测定结果见图1，由图1可知5株枯草芽孢杆菌的生长趋势基本一致。即培养后0-5h为菌株生长延滞期，5-15h细胞数以几何级数增长，此阶段菌株生长进入对数生长期，15h后菌体产量达到了最高点，此阶段为菌株生长稳定期。菌体在对数生长期内，营养充足，生长迅速，代谢活性高，且此阶段细胞性质稳定统一，对理化因素较为敏感，易变异，重复性较好，所以一般选用处于该生长时期的细胞进行处理。由图1可知，Bacillus subtilis CGMCC 1.7417的生长情况明显优于其他4株菌，后期可重点关注该菌株的纤维降解能力及纤维素酶活力。综合考虑细胞生物量等因素，选择培养12h的菌体细胞进行后续实验。

1.2、纤维素降解率和内切酶活力测定

1.2.1、纤维素降解率的测定方法

纤维素降解率的测定方法具体如下：

1)标样的制备

分别称取2g葡萄糖容量瓶中，加入25mL 10％H₂SO₄溶液，定容至1L。

2)待测样品的制备

发酵液是指利用发酵培养基，摇床培养5天之后的液体。此步骤的目的是从摇床中取出发酵培养基进行离心，得到沉淀，干燥测样。

将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。

准确称取0.025g样品(干燥至恒重的玉米皮)，加入250μL 74％H₂SO₄溶液，在30℃水浴下保温反应60min，反应中不断搅拌以使样品与硫酸溶液充分接触，促使纤维素的分解。反应过后立即冰浴终止反应，加入7mL去离子水稀释。

葡萄糖样品的制备，分别准确称取葡萄糖0.05g，分别加入1mL 74％H₂SO₄溶液，在30℃水浴下保温反应60min，反应过程中不断用玻璃棒搅拌，使其和硫酸溶液充分接触，反应结束后立即冰浴终止反应，加入28mL去离子水稀释。

将滚管中制备好的样品压盖，在121℃、0.1Mpa下灭菌60min，结束后在100℃时迅速取出。

将样品摇晃均匀，使用针管抽取2mL样品过0.22μm水系针式过滤器，采用高效液相色谱测定样品中单糖(葡萄糖)含量，以单糖含量算出样品中纤维素的含量。

3)高效液相色谱的条件

表1.HPLC条件

4)纤维素算方法

单糖浓度：生物酸解损失率：

样品中糖的质量：

剩余葡萄糖的质量：

1.2.2、内切葡聚糖苷酶活力的测定

将100mL发酵培养基装于250mL的锥形瓶中，将5％的种子液(OD600nm＝0.8)接入发酵培养基，培养温度为30℃、摇床转速为180r/min，于0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取样。将发酵液在4℃、8000rpm/min离心15min，保留上清液，该上清液为粗酶液，测定内切葡聚糖苷酶的酶活力。

酶活力(U)定义：在50℃，pH7.0的条件下，每1mL粗酶液每分钟分解羧甲基纤维素钠产生1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)，计算公式如下：

其中，N：稀释倍数

C：根据测得吸光光度值，对照葡萄糖标准曲线计算得出葡萄糖浓度

T：反应时间(min)

V：酶液体积(mL)

25：比色管定容体积(mL)

具体测定步骤如下：

(1)葡萄糖标准曲线的测定

配制0.1mg/mL-0.7mg/mL的葡萄糖标准溶液，在试管中分别加入2mL葡萄糖标准溶液、3mL DNS试剂，摇匀，沸水浴10min，每个浓度三个平行样。反应结束后立即冰浴终止反应，定容至25mL，上下摇匀，用分光光度计测定其540nm处的吸光光度值并记录数据。

(2)对照组取500μL发酵液作为粗酶液，加入3mL DNS终止反应后添加1.5mL 1％CMC-Na溶液，混匀，煮沸10min，静置冷却后，加去离子水定容至25mL，上下摇匀，用分光光度计测定其540nm处的吸光光度值并记录数据。

(3)实验组取500μL粗酶液，取500μL发酵液作为粗酶液，添加1.5mL 1％CMC-Na溶液，混匀，50℃反应30min，加入3mL DNS终止反应后煮沸10min，静置冷却后，加去离子水定容至25mL，上下摇匀，用分光光度计测定其540nm处的吸光光度值并记录数据。

1.2.3、枯草芽孢杆菌纤维素降解率及酶活力测定结果

测定结果如表2和图2。结果表明：5株枯草芽孢杆菌的纤维素降解率均在30％-50％之间，而Bacillus subtilis CGMCC 1.7417的纤维素降解率较其他菌株高，同时内切葡聚糖苷酶活力也为最高值。Bacillus subtilis CGMCC 1.7417的纤维素降解率和内切葡聚糖苷酶活力分别为45.06±2.51％和1.77±0.03U/mL。

表2.出发菌株筛选结果

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。

本实施例是从5株枯草芽孢杆菌筛选出一株纤维素降解率较高的菌株，在测定5株枯草芽孢杆菌生长速度的情况下，进而对五株枯草芽孢杆菌的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力进行测定。综合考虑细胞生物量、纤维素降解率、纤维素酶活力等因素，Bacillussubtilis CGMCC 1.7417明显优于其他四株枯草芽孢杆菌。生长曲线测定结果显示，5株枯草芽孢杆菌虽然属于同一菌属，但Bacillus subtilis CGMCC 1.7417的生长速度明显快于另外四株枯草芽孢杆菌；通过纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力测定的结果发现Bacillus subtilis CGMCC 1.7417的纤维素降解率较其他菌株高，同时内切葡聚糖苷酶活力也为最高值。Bacillus subtilis CGMCC 1.7417的纤维素降解率和内切葡聚糖苷酶活力分别为45.06±2.51％和1.77±0.03U/mL。结合菌株细胞生物量及纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力的测定结果，选定Bacillus subtilis CGMCC 1.7417作为后续实验菌株。

实施例2、重离子诱变选育高效降解纤维素菌株

2.1、重离子辐照诱变及突变菌株初筛

2.1.1、实验方法

1)利用中科院近代物理研究所兰州重离子加速器国家实验室的兰州重离子研究装置(HIRFL)进行辐照诱变。将Bacillus subtilis CGMCC 1.7417培养至对数期，取2mL装入无菌辐照皿并用封口膜密封，之后用80MeV/u的¹²C⁶⁺离子束辐照，辐照剂量分别为0Gу、40Gу、80Gу、120Gу、160Gу和200Gу。

将未辐照的菌液进行不同浓度的稀释，取50μL稀释后的菌液，均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30℃恒温培养48h。根据最终平板上的菌落密度，确定最佳稀释梯度为10^-5。

2)将不同辐照剂量的菌液分别稀释至10^-5，取50μL菌悬液涂布于LB固体培养基上，30℃恒温培养48h。然后统计菌落数，按如下公式进行致死率的计算。

3)采用刚果红染色法筛选具有产纤维素酶能力的菌株，具体方法如下：

将上述活化好的菌株进行稀释，稀释梯度分别为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，并取40μL于羧甲基纤维素钠培养基上涂布，置于30℃恒温培养箱中培养。待菌落长出后在培养皿上滴加0.5％刚果红溶液染色15min，5％NaCl溶液脱色15min，产生纤维素酶的菌落周围会出现透明圈。记录透明圈与菌落直径。根据如下公式计算正突变率。将H/C值较大的菌株进行保存，用于后续实验。

2.1.2、诱变菌株致死率及正突变率计算结果

2.1.2.1、致死率计算结果

不同辐照剂量下枯草芽孢杆菌的致死率如表3和图4所示。

表3.不同辐照剂量下致死率

2.1.2.2、正突变率计算结果

根据透明圈直径与菌落直径之比计算枯草芽孢杆菌诱变的正突变率，结果见表4和图3、图4。

表4.不同辐照剂量下正突变率

如图4所示，随着辐照剂量的增大，菌株的正突变率呈现先增大后减小的趋势。综合分析，辐照剂量为120Gy时，正突变率最高，为84.23±2.06％，且此时H/C值最大。由此说明随着辐照剂量的增大，致死率也随之变化，致死率越高，DNA的损伤程度越严重，菌株的突变率越高，越易发现正突变。

当稀释梯度为10^-5时的数据计算致死率，由如表3和图4可知，该致死率曲线随着辐照剂量的增大先增大后降低，随着辐照剂量的增加，菌株存活率先急剧下降，随后菌株的存活率有所上升，最后再下降。在辐照剂量为120Gy时，菌株致死率最高，为68.37±2.61％。重离子束辐照诱变过程中，细胞存活曲线呈“马鞍型”变化趋势，即细胞存活率随注入剂量的增加先下降后上升再下降，说明细胞在高辐射剂量下仍可保持较高的突变率及存活率，突变谱大大增加致死率呈现马鞍形变化，符合重离子诱变特征。

观察菌落透明圈的变化，同时测量透明圈直径(H)与菌落直径(C)，其H/C值见表，枯草芽孢杆菌诱变前后透明圈变化如图3所示。

由图4和表5可知，枯草芽孢杆菌经重离子辐照诱变后，大多数菌落的透明圈变大，H/C值增大，说明其纤维素酶活力提高，为正突变；反之则为负突变。本实验于约1620个单菌落中，通过比较H/C值，初筛得到9株菌株，并按菌株辐照剂量进行命名，分别命名为40-1、CG-80-1、CG-120-1、CG-120-2、CG-120-3、CG-200-1、CG-200-2、CG-200-3、CG-200-4，原始菌株命名为CG-0。

表5.初筛结果

2.3、高纤维素降解菌株复筛

测定初筛获得的9株菌株的纤维素酶降解率测定方法和内切葡聚糖苷酶活力进行复筛，纤维素酶降解率测定方法和内切葡聚糖苷酶活力测定方法参照实施例1。

复筛结果如下表6和图5所示

表6.复筛结果

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)

由图5可知，与原始菌株相比，9株菌纤维素降解率均有提高，其中诱变菌株Bacillus subtilis 40-1(图中以CG-40-1表示)的纤维素降解率最高，为53.07±0.75％，相比CG-0的纤维素降解率提高了17.78％，酶活力也相应提高了17.51％，说明经重离子辐照诱变后枯草芽孢杆菌的纤维素降解率显著提高。与初筛结果相比，H/C值与纤维素降解率有一定的正相关性，说明初筛结果可靠。

2.4、纤维素降解稳定性测试

将复筛得到的突变株Bacillus subtilis 40-1进行连续传代培养12代，将100mL发酵培养基装于250mL的锥形瓶中，将5％的种子液(OD_600nm＝0.8)接入发酵培养基，培养温度为30℃、摇床转速为180r/min，参照实施例1的方法测定其纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力。

纤维素降解稳定性测定结果如下：

对诱变菌株Bacillus subtilis 40-1进行遗传稳定性分析，连续传代培养，每隔2代测其纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力，测定结果见表7和图6。

表7.40-1纤维降解稳定性结果

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)

由图6可知，菌株Bacillus subtilis 40-1的纤维素降解率约为52％，各代之间差异不显著，说明Bacillus subtilis 40-1的具有良好的遗传稳定性。通过遗传稳定性实验结果分析可知，重离子辐照对枯草芽孢杆菌是有致突变的作用，并且是可稳定遗传的变异。由此可以说明，重离子诱变选育的枯草芽孢杆菌突变株具有良好的遗传稳定性，不易回复突变。

综上所述，本实验通过重离子诱变得到高纤维降解率枯草芽孢杆菌，其纤维降解率显著提高，相比初始菌株Bacillus subtilis s CG-0提高了17.78％。经遗传稳定性分析，可知突变菌株Bacillus subtilis 40-1具有较好的遗传稳定性。

通过80MeV/u的¹²C⁶⁺离子束对Bacillus subtilis CGMCC 1.7417进行辐照诱变，辐照剂量分别为0Gу、40Gу、80Gу、120Gу、160Gу和200Gу。采用刚果红染色法对诱变后菌株进行初筛，于约1620个单菌落中，通过比较H/C值，初筛得到9株菌株；通过测定纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力进行复筛，最终得到一株纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力较高且具有良好遗传稳定性的突变株Bacillus subtilis 40-1。Bacillus subtilis40-1的纤维素降解率和内切葡聚糖苷酶活力分别为53.07±0.75％、2.08±0.03U/mL，相比Bacillus subtilis CG-0其纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力分别提高了17.78％、17.51％。

实施例3、突变菌株Bacillus subtilis 40-1的形态学鉴定

3.1、方法

利用扫描电镜观察Bacillus subtilis CG-0和Bacillus subtilis 40-1的细胞形态，样品制备方法如下：

1)取2mL对数生长期的菌液，于3000rpm/min的条件下离心5min，离心后弃上清液。用灭菌后的生理盐水溶液洗涤2-3次。每次均需重复上述离心操作。

2)将步骤1的沉淀中加入2.5％戊二醛进行细胞固定，于4℃冰箱放置4h。

3)完成步骤2后，于3000rpm/min的条件下离心5min，用灭菌后的生理盐水溶液洗涤3次。每次均重复上述离心操作。

4)进行乙醇梯度脱水，依次用30％、50％、70％、80％、90％的乙醇各脱水1次，100％乙醇脱水2次，每次脱水时间15-20min。每次均需重复上述离心操作。

5)用乙醇：叔丁醇＝1:1的液体置换1次，再用叔丁醇置换2次，每次20min，4℃冰箱放置30min。每次均需重复上述离心操作。

6)将样品冷冻干燥，把固定好的细胞喷金后，用日立场发射扫描电镜SU8200进行观察。

3.2、重离子辐照诱变对菌株细胞形态的影响

经重离子辐照诱变前后的细胞形态扫描电镜图如图7所示，放大倍数分别为1万倍、5万倍、15万倍。通过对比Bacillus subtilis CG-0和Bacillus subtilis 40-1的细胞形态可知，经重离子辐照诱变前后菌株的细胞形态相似，均为杆状柱形。但由放大5万倍数的电镜图上可以清晰看出经重离子辐照诱变后菌株细胞表面变得褶皱粗糙。综合分析，重离子辐照没有改变枯草芽孢杆菌细胞形态，但使细胞表面发生了细微改变。

Bacillus subtilis 40-1已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC No.61840。

实施例4、发酵条件优化

本实施例对经重离子辐照诱变后纤维素降解率提高最大的菌株Bacillussubtilis 40-1进行发酵条件和培养基成分优化，从而进一步提高纤维素降解率及酶活力，为工业化生产提高参考。

4.1、发酵条件优化

4.1.1、发酵时间优化

将Bacillus subtilis40-1进行摇瓶发酵，培养至对数生长期的种子液(OD_600nm＝0.8)接入发酵培养基，接种比例为5％，培养温度为30℃，摇床转速为180r/min，培养时间分别为24h、72h、120h、168h、216h。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。参照实施例1所述的方法测定其纤维素降解率及纤维素酶活力。

具体操作如下：

Bacillus subtilis 40-1种子液的制备：培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基(g/L)：牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0；其余为去离子水。当OD_600nm达到0.8时，进行接种。

将100mL的玉米皮-蛋白胨发酵培养基分别装于250mL的锥形瓶中，将5％的Bacillus subtilis 40-1种子液(OD_600nm＝0.8)接入发酵培养基，培养温度为45℃、摇床转速为180r/min，分别培养24h、72h、120h、168h、216h。每个培养温度设3个锥形瓶。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力。

玉米皮-蛋白胨发酵培养基的配制方法如下：玉米皮20.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，加入去离子水，调节pH至7.0-7.2，用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min。

突变菌株Bacillus subtilis 40-1在不同发酵时间下的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力测定结果见表8和图8。

表8.发酵时间对纤维降解能力的影响

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。

由表8和图8可知，在0-120h突变菌株Bacillus subtilis 40-1随着发酵时间的变化，纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力不断增大，120h之后纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力逐渐降低。原因可能是发酵后期培养基中营养物质不足，pH值发生变化及溶氧不足导致菌株性能下降，纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力降低。说明发酵120h时纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力达到最大，此时纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力分别为57.91±1.96％、2.33±0.02U/mL，且差异显著。因此，确定最佳发酵时间为120h。

4.1.2、发酵温度优化

将Bacillus subtilis 40-1进行摇瓶发酵，培养至对数生长期后接种，发酵温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，培养120h，其他条件一致。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及纤维素酶活力。

具体操作如下：

Bacillus subtilis 40-1种子液及玉米皮-蛋白胨发酵培养基的制备及参照4.1.1。

将100mL的玉米皮-蛋白胨发酵培养基分别装于250mL的锥形瓶中，将5％的Bacillus subtilis 40-1种子液(OD_600nm＝0.8)接入发酵培养基，摇床转速为180r/min，培养120h，培养温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。每个培养温度设3个锥形瓶。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力。

对照组(CG-0)与实验组的区别仅在于将菌株Bacillus subtilis 40-1替换为CG-0，其它操作完全相同。

不同发酵温度下纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力的测定结果见表9和图9图10(Bacillus subtilis 40-1以CG-40-1表示)。

表9.发酵温度对纤维降解能力的影响

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。

由表9和图9、图10可知，原始菌株Bacillus subtilis CG-0在发酵温度为35℃时纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力最大，此时纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力分别为48.24±1.09％、1.82±0.02U/mL，当温度逐渐升高时，纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力先增大后减小。当温度为45℃时纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力均达到峰值，分别为65.13±0.48％、2.59±0.04U/mL。由此可以说明，温度过高或过低都会影响菌株纤维素酶活力，可能原因是温度影响了菌株的生长繁殖，进而影响了产纤维素酶能力。枯草芽孢杆菌经重离子辐照诱变后，最适发酵温度由35℃提高为45℃。研究表明，发酵温度不仅会影响发酵速度，还会影响发酵产物的积累及活性。在工业生产中，较高的发酵温度有利于加快发酵速度，提高发酵效率，减少冷却水的使用量，降低能耗和生产成本。综合分析，确定突变菌株Bacillus subtilis 40-1(图10中以CG-40-1表示)的最佳发酵温度为45℃。

4.1.3、初始pH优化

将玉米皮-蛋白胨发酵培养基的初始pH值分别调为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在最优发酵温度下培养120h，其他条件不变。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。参照实施1的方法测定其纤维素降解率及纤维素酶活力。

具体操作如下：

Bacillus subtilis 40-1种子液的制备参照4.1.1。

将100mL的pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的玉米皮-蛋白胨发酵培养基分别装于250mL的锥形瓶中，将5％的Bacillus subtilis 40-1种子液(OD_600nm＝0.8)接入发酵培养基，培养温度为45℃、摇床转速为180r/min，培养120h。每种pH值的玉米皮-蛋白胨发酵培养基设3个锥形瓶。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力。

pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的玉米皮-蛋白胨发酵培养基的配制方法如下：玉米皮2.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，加入去离子水，分别调节pH至5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min。

诱变菌株在不同初始pH值条件下的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力测定结果见表10和图11。

表10.初始pH值对纤维降解能力的影响

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。

研究表明，pH对发酵过程的影响极大，pH会对发酵中代谢途径产生影响，同时也会影响发酵产物的活性。适当的pH会促进发酵，因此发酵过程中选择合适的pH值极为重要。由表10和图11可知，突变菌株Bacillus subtilis 40-1在pH 5.5至pH 7.5范围内均有酶活力，随着初始pH值的增大，纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力呈现先增大后减小的趋势。当初始pH为6.5时，纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力达到最高分别为67.79±0.49％、2.56±0.02U/mL，且差异极显著。而在pH≥6.5时，纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力均有所下降，说明Bacillus subtilis 40-1适在中性偏酸环境下生长。众多学者的研究结果也表明中性偏酸环境下产纤维素酶菌株酶活力更高，通过分析，确定Bacillus subtilis40-1的最佳初始pH值为6.5。

4.1.4、发酵条件正交优化实验

在单因素实验的基础上，对发酵时间、发酵温度、初始pH进行三因素两水平正交优化实验，实验计划表如表：

表11.正交实验因素与水平

正交优化发酵条件实验结果如下：

根据单因素实验结果，选择对实验结果影响较显著的因素，发酵时间、发酵温度已经初始pH值为实验因子，进行三因素两水平的正交实验，以纤维素降解率为考察指标。实验结果分析见表4-5、表4-6、表4-7，由极差分析所得最优组合为A₂B₂C₁，按照极差大小，影响纤维素降解率的三个个因素主次顺序依次为B＞A＞C，即发酵温度＞发酵时间＞初始pH，最优组合结果显示Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力达到最高分别为69.92±1.39％、2.47±0.02U/mL，为正交表中最大值。由此确定最优组合为A₂B₂C₁，即培养时间为72h，温度为45℃，初始pH值为6.5。

表12.不同玉米皮添加比例对纤维素降解率及酶活力的影响

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。

表13.L₆(2³)正交试验设计及结果

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。

表14.正交试验方差分析

4.2、培养基成分优化

4.2.1、碳源添加量优化

调节玉米皮-蛋白胨发酵培养基中玉米皮的添加量分别为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L，按照5％的接种量接种，培养时间为72h，温度为45℃，初始pH值为6.5。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及纤维素酶活力。

具体操作步骤如下：

Bacillus subtilis 40-1种子液的制备参照4.1.1。

分别配制玉米皮的添加量为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L和25g/L的玉米皮-蛋白胨发酵培养基。

将100mL玉米皮的添加量分别为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L和25g/L的玉米皮-蛋白胨发酵培养基分别装于250mL的锥形瓶中，将5％的Bacillus subtilis 40-1种子液(OD_600nm＝0.8)接入发酵培养基，培养温度为45℃、摇床转速为180r/min，培养72h。每种玉米皮添加量的玉米皮-蛋白胨发酵培养基设3个锥形瓶。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力。

玉米皮的添加量为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L和25g/L的玉米皮-蛋白胨发酵培养基的配制方法如下：分别添加玉米皮为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L和25g/L、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，加入去离子水，调节pH至6.5，用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min。

微生物细胞含碳量约占干重的50％，故除水分外，碳源是需要量最大的满足微生物生长繁殖所需的营养物。发酵过程中，将玉米麸皮作为唯一碳源，按不同比例的玉米麸皮添加到培养基中，Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及酶活力测定结果见表15和图12。

表15.不同玉米皮添加比例对纤维素降解率及酶活力的影响

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。

由表15和图12可知，随着玉米皮含量的增加，Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及酶活力不断提高，但当其添加量超过20g/L时，纤维素降解率及酶活力开始降低。当玉米麸皮含量为20g/L时，纤维素降解率及酶活力最大，分别为57.91±1.96％、2.33±0.02U/mL。在发酵过程中，碳源不足会影响菌体的正常生长，从而影响产量；同时，实验过程中发现玉米麸皮添加量大于20g/L时，液体发酵培养基的粘度增加，不易于氧气的供应。当碳源浓度非常高时，细菌会处于一个高渗的环境造成细菌对糖的利用减少和减慢。在实际生产中既要保证产量的的最大化，同时又要控制生产成本，因而选择适当的添加量极为重要。因此，本实验中玉米皮的最佳添加量为20g/L。

4.2.2、有机氮源种类优化

将4.2.1优化的玉米皮-蛋白胨发酵培养基中的氮源(蛋白胨)替换为豆粕、玉米浆，添加量均为1％。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及纤维素酶活力。

具体操作步骤如下：

Bacillus subtilis 40-1种子液的制备参照4.1.1。

配制有机氮源分别为蛋白胨、豆粕、玉米浆的发酵培养基。

将100mL有机氮源分别为蛋白胨、豆粕、玉米浆的发酵培养基装于250mL的锥形瓶中，将5％的Bacillus subtilis 40-1种子液(OD_600nm＝0.8)接入发酵培养基，培养温度为45℃、摇床转速为180r/min，培养72h。每种有机氮源的发酵培养基设3个锥形瓶。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力。

有机氮源分别为蛋白胨、豆粕、玉米浆的发酵培养基的配制方法如下：

玉米皮-蛋白胨发酵培养基添加玉米皮为20g/L、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，加入去离子水，调节pH至6.5，用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min。

玉米皮-豆粕发酵培养基添加玉米皮为20g/L、豆粕10.0g、NaCl 5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，加入去离子水，调节pH至6.5，用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min。

玉米皮-玉米浆发酵培养基添加玉米皮为20g/L、玉米浆10.0g、NaCl 5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，加入去离子水，调节pH至6.5，用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min。

氮是构成重要生命物质蛋白质和核酸等的主要元素，氮占细菌干重的12％-15％，故与碳源相似，氮源也是满足微生物生长繁殖所需的重要营养物质。发酵过程中，将玉米皮作为唯一碳源，将玉米麸皮按20g/L的添加量添加到培养基中，测定在不同氮源添加的情况下Bacillus subtilis 40-1的纤维素降解率及酶活力，测定结果见表16和图13。

表16.不同种类有机氮源对纤维素降解率及酶活力的影响

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。

由表16和图13可知，当以蛋白胨作为氮源时，Bacillus subtilis 40-1的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力最高，此时纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力分别为67.95±1.20％、2.69±0.01U/mL。当以豆粕作为氮源时，Bacillus subtilis 40-1的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力仅次于以蛋白胨作为有机氮源，此时纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力分别为44.49±1.00％、1.64±0.02U/mL。当以豆粕、玉米浆为氮源时，Bacillus subtilis 40-1的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力虽然远低于以蛋白胨作为氮源的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力，但为了与工业项目实现对接，本实验采用相对更为廉价的豆粕作为高纤维素降解率枯草芽孢杆菌发酵的氮源。

4.2.3、有机氮源添加量优化

确定最佳有机氮源后，对其浓度进行优化。分别添加2g/L、5g/L、7g/L、10g/L、15g/L的豆粕进行发酵，发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及纤维素酶活力。

具体操作步骤如下：

Bacillus subtilis 40-1种子液的制备参照4.1.1。

分别配制豆粕添加量为2g/L、5g/L、7g/L、10g/L和15g/L的玉米皮-豆粕发酵培养基。

将100mL豆粕的添加量分别为2g/L、5g/L、7g/L、10g/L和15g/L的玉米皮-豆粕发酵培养基分别装于250mL的锥形瓶中，将5％的Bacillus subtilis 40-1种子液(OD_600nm＝0.8)接入发酵培养基，培养温度为45℃、摇床转速为180r/min，培养72h。每种豆粕添加量的玉米皮-豆粕发酵培养基设3个锥形瓶。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力。

豆粕的添加量分别为2g/L、5g/L、7g/L、10g/L和15g/L的玉米皮-豆粕发酵培养基的配制方法如下：分别添加豆粕为2g/L、5g/L、7g/L、10g/L和15g/L、玉米皮20.0g、NaCl5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，加入去离子水，调节pH至6.5，用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min。

不同豆粕添加量对Bacillus subtilis 40-1的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力的影响见表17和图14。

表17.不同有机氮源添加量对纤维素降解率及酶活力的影响

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。

根据选定的氮源为豆粕，保持其他条件不变的情况下，分别按2g/L、5g/L、7g/L、10g/L、15g/L的豆粕添加量来检测对Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力的影响。结果如表17和图14所示，随着豆粕添加量的增加，Bacillus subtilis40-1的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力逐渐增加，当豆粕添加量超过7g/L时，40-1的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力呈现下降趋势，说明氮源浓度较高时，在保证细胞正常生长情况下，可促进菌株产酶。但是氮源过多，菌体繁殖旺盛从而影响产物的合成积累。当氮源添加量为7g/L时，Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力分别为50.17±1.43％、1.92±0.01U/mL；当氮源添加量为5g/L时，Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力分别为48.35±1.39％、1.87±0.01U/mL。由于氮源添加量为5g/L、7g/L时Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力差异不显著，为了降低生产成本，因此选择豆粕添加量为5g/L。

优化后的培养基配方为：玉米皮20g/L、豆粕5g/L、NaCl 5.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L；其余为去离子水。上述培养基均用去离子水定容，并调节pH至6.5，121℃灭菌20min。

4.2.4、无机氮源替代有机氮源替代量优化

确定最佳有机氮源添加量后，对其无机氮源替代有机氮源添加量进行优化。分别用硫酸铵替代10％、20％、30％、40％、50％的有机氮源进行发酵，发酵条件不变。培养120h，发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及纤维素酶活力。

具体操作步骤如下：

Bacillus subtilis 40-1种子液的制备参照4.1.1。

分别配制无机氮源替代量分别为0％、10％、20％、30％、40％、50％的玉米皮-豆粕发酵培养基。

将100mL无机氮源替代量分别为0％、10％、20％、30％、40％、50％的玉米皮-豆粕发酵培养基分别装于250mL的锥形瓶中，将5％的Bacillus subtilis 40-1种子液(OD_600nm＝0.8)接入发酵培养基，培养温度为45℃、摇床转速为180r/min，培养72h。每种无机氮源替代量的玉米皮-豆粕发酵培养基设3个锥形瓶。发酵结束后，将发酵液全部移至离心管中，在8000rpm/min下离心10min，舍弃上清液并将沉淀干燥至恒重，记录发酵前后玉米皮的重量变化。测定其纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力。

无机氮源替代量分别为0％、10％、20％、30％、40％、50％的玉米皮-豆粕发酵培养基的配制方法如下：

无机氮源替代量分别为0％、10％、20％、30％、40％、50％的玉米皮-豆粕发酵培养基中豆粕和硫酸铵添加量分别为5g/L和0g/L、4.5g/L和0.5g/L、4.0g/L和1.0g/L、3.5g/L和1.5g/L、3.0g/L和2.0g/L、2.5g/L和2.5g/L，其余组分相同(玉米皮20.0g、NaCl 5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g)，加入去离子水，调节pH至6.5，用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min。

昂贵的实验室营养物质(酵母膏和蛋白胨)的培养基，不适用于工业化生产。价格低廉的工业原料，并且可以保持较高的生产率和产量，是工业化生产的必要条件，因此本实验选择利用硫酸铵替代部分豆粕，测定在不同硫酸铵替代量的情况下Bacillus subtilis40-1的纤维素降解率及酶活力，测定结果表18和图15。

表18.无机氮源替代量对纤维素降解率及酶活力的影响

注：肩注小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。

保持其他条件不变的情况下，分别按0％、10％、20％、30％、40％、50％的硫酸铵替代蛋白胨量来检测对Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力的影响。结果如表18和图15所示，随着硫酸铵替代量的增加，Bacillus subtilis 40-1的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力先增加后降低，原因可能是少量添加硫酸铵后，诱导当Bacillus subtilis 40-1产蛋白酶，蛋白酶能够降解豆粕为更易被吸收的物质，当硫酸铵替代量为20％时，Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力分别为54.12±1.37％、2.13±0.02U/mL；当硫酸铵替代量为30％时，Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力分别为51.09±1.46％、2.01±0.01U/mL。由于氮源添加量为20％、30％时Bacillus subtilis 40-1纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力差异不显著，为了降低生产成本，因此选择硫酸铵替代蛋白胨的量为30％。

优化后的培养基配方为：玉米皮20g/L、豆粕3.5g/L、硫酸铵1.5g/L、NaCl 5.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L；其余为去离子水。上述培养基均用去离子水定容，并调节pH至6.5，121℃灭菌20min。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis，其菌株编号为40-1，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏号为GDMCC No.61840。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在降解纤维素中的应用。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备降解纤维素的产品中的应用。

4.菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

5.权利要求4所述的菌剂在降解纤维素中的应用。

6.降解纤维素的方法，其特征在于：所述方法包括使用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求4所述的菌剂分解纤维素。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述菌剂的制备方法包括用培养基培养权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，收集发酵产物，将所述发酵产物作为菌剂的成分。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述培养基包括碳源和氮源，所述碳源为玉米皮，所述氮源为有机氮源和/或无机氮源，所述有机氮源为豆粕或蛋白胨，所述无机氮源为硫酸铵。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述培养基中玉米皮的含量为20 g/L，所述豆粕的含量为3.5-5 g/L，所述蛋白胨的含量为10 g/L，所述硫酸铵的含量为0-1.5g/L。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于：所述培养的培养条件为：培养时间为72 h，温度为45℃，培养基初始pH值为6.5。

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