CN114517193A - 一种γ-聚谷氨酸降解酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体公开了一种γ‑聚谷氨酸降解酶及其制备方法。本发明的γ‑聚谷氨酸降解酶是由地衣芽孢杆菌γ‑聚谷氨酸降解酶的第181位脯氨酸突变为天冬氨酸所形成的。所述γ‑聚谷氨酸降解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明在地衣芽孢杆菌γ‑聚谷氨酸降解酶的基础上进行定点突变(第181位脯氨酸点突变为天冬氨酸)，形成本发明的γ‑聚谷氨酸降解酶，可以有效提高γ‑聚谷氨酸降解酶的酶活，进一步提高γ‑聚谷氨酸的降解效率。

Description

一种γ-聚谷氨酸降解酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其是涉及一种γ-聚谷氨酸降解酶及其制备方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸(聚-γ-谷氨酸，poly-γ-glutamic acid，简称γ-PGA)是自然界中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，γ-PGA的结构为谷氨酸单元通过α-氨基和γ-羧基形成肽键的高分子聚合物。γ-聚谷氨酸的分子量分布在100kDa到10000kDa之间。γ-聚谷氨酸具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均有很大的商业价值和社会价值。

目前，γ-PGA的降解方法主要有物理降解、化学降解和生物酶降解。物理降解方法主要有高温、机械剪切力、超声波、紫外辐射等，制备的γ-PGA分子量范围分布较广，稳定性不佳；化学降解方法主要是通过添加酸(HCl)或碱(NaOH)水解γ-PGA，虽然水解效率高，但是外源引入化学试剂，影响γ-PGA的性质，对产品的纯化增加难度，并且易对环境造成污染；生物酶法是利用聚谷氨酸降解酶特异性地作用于γ-PGA的γ-谷氨酰胺键，使其键断裂而发生降解，反应条件较为温和，但是目前商品化的聚谷氨酸降解酶降解效率较低，因此，亟需一种降解效率效果佳的γ-聚谷氨酸降解酶。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种γ-聚谷氨酸降解酶及其制备方法。本发明通过对γ-聚谷氨酸降解酶进行定点突变，可以有效提高酶活，使得进一步提高γ-聚谷氨酸的降解效率。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一目的，本发明提供了一种γ-聚谷氨酸降解酶，为地衣芽孢杆菌γ-聚谷氨酸降解酶的第181位脯氨酸突变为天冬氨酸。

本发明通过SWISS-MODEL在线平台对γ-聚谷氨酸降解酶分子和γ-聚谷氨酸进行同源建模；获得潜在的突变位点181位脯氨酸；通过虚拟饱和突变对单个突变位点计算突变前后的分子间结合力变化；将地衣芽孢杆菌γ-聚谷氨酸降解酶的第181位脯氨酸突变为天冬氨酸以形成本发明的γ-聚谷氨酸降解酶。

经过点突变的γ-聚谷氨酸降解酶具有较高的酶活力，并且能够提高γ-聚谷氨酸的降解效率。

作为本发明所述γ-聚谷氨酸降解酶的优选实施方式，所述γ-聚谷氨酸降解酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明在地衣芽孢杆菌γ-聚谷氨酸降解酶蛋白序列的基础上将第181位脯氨酸点突变为天冬氨酸，获得突变后的γ-聚谷氨酸降解酶蛋白序列，以大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化，得到的基因序列命名为gene1，经过检测发现该γ-聚谷氨酸降解酶蛋白序列的酶活力较高，有利于γ-聚谷氨酸的降解。

第二目的，本发明提供了一种包含上述γ-聚谷氨酸降解酶的表达载体。

作为本发明所述γ-聚谷氨酸降解酶的表达载体的优选实施方式，所述表达载体包括大肠杆菌表达载体pSmart-Ⅰ。

第三目的，本发明提供了一种包含上述γ-聚谷氨酸降解酶或表达载体的宿主细胞。更优选地，所述宿主细胞为细菌

第四目的，本发明提供了一种药物制剂，包含上述的γ-聚谷氨酸降解酶。

所述药物制剂还包括药物上可用的辅料。

第五目的，本发明提供了一种编码上述γ-聚谷氨酸降解酶的基因。

第六目的，本发明提供了一种检测γ-聚谷氨酸降解酶的引物，所述引物如SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示。

第七目的，本发明提供了一种γ-聚谷氨酸降解酶的制备方法，包括以下步骤：

1)将上述γ-聚谷氨酸降解酶克隆至大肠杆菌表达载体中，获得大肠杆菌重组表达载体；

2)将携带γ-聚谷氨酸降解酶的大肠杆菌重组表达载体转化至宿主细胞中，挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化得到γ-聚谷氨酸降解酶。

所述纯化步骤包括将菌株破碎、包涵体洗涤、变性与复性、柱层析纯化等步骤。

第八目的，本发明提供了一种上述γ-聚谷氨酸降解酶在降解γ-聚谷氨酸中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：

本发明提供了一种γ-聚谷氨酸降解酶及其制备方法，本发明在地衣芽孢杆菌γ-聚谷氨酸降解酶的基础上进行定点突变(第181位脯氨酸点突变为天冬氨酸)，形成本发明的γ-聚谷氨酸降解酶，可以有效提高γ-聚谷氨酸降解酶的酶活，进一步提高γ-聚谷氨酸的降解效率。

附图说明

图1为大肠杆菌重组表达载体gene1-pSmart-Ⅰ的图谱；

图2为验证重组阳性克隆重组质量的酶切图谱；

图3为γ-聚谷氨酸降解酶表达量的检测图；

图4为γ-聚谷氨酸降解酶包涵体破碎与洗涤后的电泳图；

图5为γ-聚谷氨酸降解酶包涵体复性的电泳图；

图6为γ-聚谷氨酸降解酶纯化的电泳图；

图7为谷氨酸含量回归方程图；

图8为本发明γ-聚谷氨酸降解酶和未突变γ-聚谷氨酸降解酶的酶活力测试结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种γ-聚谷氨酸降解酶的制备方法，包括以下步骤：

1)构建大肠杆菌重组表达载体：通过NCBI Genbank数据库查询地衣芽孢杆菌γ-聚谷氨酸降解酶的蛋白序列，将获取的γ-聚谷氨酸降解酶进行点突变(第181位脯氨酸点突变为天冬氨酸)，得到突变后的γ-聚谷氨酸降解酶的蛋白序列(核苷酸序列为SEQ IDNO:1)，以大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化，得到的基因序列命名为gene1；将优化后的序列两段加入酶切位点Nde1、xho1后，进行全基因合成，克隆至大肠杆菌表达载体pSmart-Ⅰ中，获得大肠杆菌重组表达载体gene1-pSmart-Ⅰ(图谱如表1所示)。

酶切体系如下：

反应条件为：37℃，反应30min。通过1％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收酶切后的大肠杆菌重组表达载体gene1-pSmart-Ⅰ。

连接：将约100ng的大肠杆菌重组表达载体gene1-pSmart-Ⅰ的DNA转移到无菌微量离心管中，加入至少4倍摩尔量的目的片段，然后加入10×T4 DNA连接酶缓冲液(ligasebuffer)1μL，T4 DNA连接酶0.5μL——1μL，加无菌超纯水至10μL体积，充分混匀后用微量离心机将液体全部收集至管底，于16℃保温过夜。

2)转化γ-聚谷氨酸降解酶；

首先制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态菌：

①挑取大肠杆菌单菌落，接种于5ml无抗生素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养13h，至对数生长后期。将该菌悬液以1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD₆₀₀＝0.5；

②在无菌条件下将培养液转入离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃，然后4℃，4000rpm离心10min；

③弃去上清，倒置1min，以便将培养液流尽；

④用冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10ml轻轻悬浮细胞，充分混匀，冰上放置30min后，4℃下4000rpm离心10min；

⑤弃去上清，并倒置1min，以便最后的痕量培养液流尽；

⑥加入4ml预冷含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；⑦大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞100μL分装，贮存于-70℃保存备用。

转化：

①从-80℃超低温冰柜中取出一管(100μl)BL21(DE3)感受态菌，融化后插入冰上，冰浴5～10min。

②加入50ng构建好的大肠杆菌重组表达载体gene1-pSmart-Ⅰ，轻轻震荡后放置冰上30min。

③轻轻摇匀后插入42℃水浴中1～2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3～5min。

④在超净工作台中向上述各管中分别加入800μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。

⑤在超净工作台中取上述转化混合液100-300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

⑥在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30～60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

3)阳性克隆的筛选：

采用酶切图谱验证重组阳性克隆重组质量，所用内切酶为MluI和XhoI，反应体系为：

反应条件为：37℃，反应30min。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。

参考图2，可以验证重组阳性克隆重组质量，其中，图2中1表示：未切割大肠杆菌重组表达载体gene1-pSmart-Ⅰ的DNA；图2中2表示：Plasmid digested by MluI and XhoI；图2中3表示：DNA Marker。

4)PCR阳性克隆验证

将转化后37℃过夜培养的平板上生长的单菌落接种至10mL LB液体培养基中，并加入抗生素，37℃过夜培养。并通过菌液PCR鉴定是否为阳性克隆。菌液PCR体系如下：

Forward primer：GATTAAAAAGGCGGCGAACAAA；

Reverse primer：TCAAAGCCTTCTTTCGGGCT。

PCR程序如下：初始变性94℃，4min；变性94℃，30s，34个循环；退火50～54℃，30s；延伸72℃30s；结束延伸72℃10min；保存4℃。PCR扩增后，进行测序，经对比，与合成序列一致。

5)γ-聚谷氨酸降解酶的表达：

从-80℃取一管保存的菌，常温冻融，将上述菌按1：1000比例，接种于50μg/ml Kan的600ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.8-1.0；600ml发酵培养基(LB培养液)中加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，220rpm分别于37℃培养4h，22℃培养8h；5000rpm，4℃离心5min，离心去上清收集发酵菌体，-20℃保存；蛋白表达检测，将菌体进行破碎，破碎条件：150W功率，破碎1s，间隔1s，共15min。破菌缓冲液：TBS，pH7.4。

进行sds-page电泳检测，结果如图3所示(Lane1:Marker；Lane2:Whole celllysate-22℃；Lane3:Supernatant-22℃；Lane4:Whole cell lysate-37℃；Lane5:Supernatant-37℃)，在55-70KDa处有明显蛋白表达。

6)γ-聚谷氨酸降解酶的纯化；

①菌体破碎

将菌体按1：:10重悬在裂解液(50mM Tris-HCl)中，进行高压均质，200bar一次，800bar两次，9000rpm，4℃离心30min。收集包涵体。

②包涵体洗涤

用包涵体洗涤液(20mM Tris，2M Urea，5mM EDTA，3％Triton X-100)洗三次，去离子水洗1-3次。参考图4(Lane 1:Marker；Lane 2:Whole cell lysate；Lane 3:Supernatant；Lane 4:Wash by TritonX-100；Lane 5:Wash by TBS；Lane 6:Dissolved by8M Urea；Lane 7:Dissolved by 8M Urea-supernatant)。

③包涵体的变性与复性

使用1g/100ml的变性液(50mM Tris-HCl，pH8.5，8M Urea，50mMβ-ME)处理包涵体，室温，处理5h以上，至包涵体澄清透明，然后离心30min，9000rpm，4℃。按1:10比例将变性后包涵体缓慢加入复性液(50mM Tris-HCl，pH8.5)中，室温下静置过夜，如有浑浊9000rpm，4℃，离心30min，获得复性的蛋白溶液。参考图5(Lane 1:Marker；Lane 2:复性-Whole；Lane3:复性-Supernatant)。

④柱层析纯化：将复性的蛋白溶液进行柱层析，所用层析填料为Smart-NI，平衡液：TBS，pH7.4；洗脱液：TBS，250mM imidazole，pH7.4。按250mM imidazole的梯度进行洗脱，最终获得纯化后的γ-聚谷氨酸降解酶。参考图6(Lane 1:Marker；Lane 2:Loadsample；Lane 3:Flow through；Lane 4:Elution by 20mM imidazole；Lane 5:Elution by50mM imidazole；Lane 6:Elution by 250mM imidazole)。

试验例、酶活性检测

酶活性检测原理如下：γ-聚谷氨酸降解酶能将γ-PGA降解为谷氨酸，在ph9.6的硼砂缓冲溶液中，能与四氯对苯醌形成1:1比例的络合物，该络合物在350nm波长处有最大吸收。

1)谷氨酸含量回归方程

取7支20ml具塞刻度试管，预先洁净灭菌干燥，按表加入试剂，加水至20ml，以1号试管作为空白对照，350nm的波长下测定吸光度值。并建立通过吸光度值求谷氨酸含量的回归方程(参考图7)。

试剂	1	2	3	4	5	6	7
								谷氨酸标准液(ml)	0	2	4	6	8	10	12
H<sub>2</sub>O(ml)	18	16	14	12	10	8	6
								四氯对苯醌(ml)	2	2	2	2	2	2	2
谷氨酸含量(uM)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2
								OD<sub>350</sub>	0	0.121	0.241	0.362	0.481	0.607	0.716

2)检测实施例1制备的γ-聚谷氨酸降解酶的活性，与未突变的聚谷氨酸酶进行对比(未突变聚谷氨酸降解酶的制备方法参考论文地衣芽胞杆菌ATCC9945A中γ-聚谷氨酸降解酶基因的克隆、表达及降解性能鉴定)。

反应体系如下：10g/Lγ-PGA 5ml，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，酶100μg/ml 2ml，总体积7ml，反应温度30℃，分别在6h，12h，24h，48h，72h取样检测酶活性。

γ-聚谷氨酸降解酶比活力＝谷氨酸含量(uM)/(时间(min)*酶浓度(mg/mL)*体积(ml))。

结果如图8所示，本发明制备的γ-聚谷氨酸降解酶与未突变γ-聚谷氨酸降解酶相比酶比活力明显增强。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州远想医学生物技术有限公司

<120> 一种γ-聚谷氨酸降解酶及其制备方法

<130> 2021-12-22

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgattaaaa aggcggcgaa caaaaagctg gtgctgtttt gcggcattgc ggtgctgtgg 60

atgagcctgt ttctgaccaa ccataacgat gtgcgcgcgg ataccattgg cgaaaagatt 120

gcggaaaccg cgcgccagct ggaaggcgcg aaatatagct atggcggcga aaaaccgaaa 180

accggctttg atagcagcgg ctttgtgcag tatgtgtttc agagcctgga tattaccctg 240

ccgcgcaccg tgaaagaaca gagcactttg ggtagcagcg tgggccgtca gcagctggaa 300

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ggcgatattg tgttctttaa aggcaccacc gtgatgaacc cggcgattta tattggcaac 1140

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<211> 20

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<400> 3

tcaaagcctt ctttcgggct 20

Claims (10)

1.一种γ-聚谷氨酸降解酶，其特征在于，地衣芽孢杆菌γ-聚谷氨酸降解酶的第181位脯氨酸突变为天冬氨酸。

2.如权利要求1所述的γ-聚谷氨酸降解酶，其特征在于，所述γ-聚谷氨酸降解酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

3.一种包含如权利要求1或2所述的γ-聚谷氨酸降解酶的表达载体。

4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括大肠杆菌表达载体pSmart-Ⅰ。

5.一种包含如权利要求1或2所述的γ-聚谷氨酸降解酶或权利要求3的表达载体的宿主细胞。

6.一种药物制剂，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的γ-聚谷氨酸降解酶。

7.编码如权利要求1或2所述的γ-聚谷氨酸降解酶的基因。

8.一种检测γ-聚谷氨酸降解酶的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示。

9.一种γ-聚谷氨酸降解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将如权利要求1或2所述的γ-聚谷氨酸降解酶克隆至大肠杆菌表达载体中，获得大肠杆菌重组表达载体；

2)将携带γ-聚谷氨酸降解酶的大肠杆菌重组表达载体转化至宿主细胞中，挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化得到γ-聚谷氨酸降解酶。

10.一种如权利要求1或2所述的γ-聚谷氨酸降解酶在降解γ-聚谷氨酸中的应用。

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