CN114507679A

CN114507679A - 一种马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR及其启动子的应用

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Publication number: CN114507679A
Application number: CN202111547981.8A
Authority: CN
Inventors: 季孔庶; 王登宝; 朱灵芝; 朱沛煌; 姚圣
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2041-12-16
Also published as: CN114507679B

Abstract

本发明公开了一种马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR及其启动子的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明将马尾松PmDXR基因利用农杆菌介导转化至拟南芥中，转基因拟南芥的DXR酶活性、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均高于野生型拟南芥。并从马尾松中克隆得到PmDXR基因的启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过构建pBI121‑ProDXR载体，瞬时转化法侵染本氏烟草，PmDXR基因启动子能驱动GUS基因在本氏烟草根、茎、叶中表达，且启动子没有明显的组织特异性。本发明在利用基因工程技术提高松树松脂产量性状上具有重要研究价值和应用前景。

Description

一种马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR及其启动子的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR及其启动子的应用。

背景技术

马尾松(Pinus massoniana)属于松科(Pinaceae)松属双维管束松亚属，树干较直，树皮呈红褐色，裂成不规则的鳞状块片；枝条平展或斜展；针叶多为2针一束，稀3针一束，长12-20cm；叶鞘最初为褐色，然后渐变为灰黑色，宿存。雄球花呈圆柱形聚生于新枝下部苞腋；雌球花单生或2-4个聚生于新枝近顶端；球果为卵圆形或圆锥状卵圆形，成熟前后颜色会发生变化，成熟前绿色，成熟时栗褐色。在我国松属树种中马尾松的分布较为广泛，从秦岭、淮河以南，云贵高原以东的17个省(自治区、直辖市)均有分布，具有适应性强、经济价值高等特点。马尾松的经济价值不仅体现在用材方面，在林产品加工方面更是为我国带来了巨大的经济效益。马尾松可分泌大量以萜类化合物为主的次生代谢物，这些次生代谢物称为松脂，松脂是松香、松节油工业的基础原料，广泛用于溶剂、消毒剂、清洁产品、香料、涂料等工业生物产品中。

马尾松松脂中的萜类化合物成分主要包括单萜、倍半萜和双萜，一般存在与松树的根、茎、叶和球果中。松脂不仅能带来巨大的经济效益，其组分对针叶树的防御体系也具有重要作用。在针叶树遭受生物或非生物刺激后，松脂可从树木的树脂道释放出来，同时新的松脂又可经诱导合成。目前，我国主要有6种松树可以采割松脂，但成规模采脂的只有马尾松、湿地松(Pinus elliottii)、云南松(Pinus yunnanensis)和思茅松(Pinus kesiyavar.langbianensis)，其中90％的松脂采自马尾松。我国的松脂产区以广西为主，调查显示2010年广西产区的马尾松松脂产量可占全国松脂产量的42％左右，总产量约为30万吨。为了推动松脂产业的发展，采用先进的技术筛选和培育高产脂的优良种质材料、营造高产脂工业原料林是提高松林资源利用率的有效途径。

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构(1-Deoxy-d-xylulose-5-phosphatereductase DXR)是MEP途径中的关键限速酶，催化MEP途径第2步反应，该酶需要辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、Mn²⁺、Co²⁺或Mg²⁺参与作用将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXP)转化为萜类合成的重要前体2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)。MEP途径定位于质体中，主要参与单萜、二萜和四萜类化合物的生物合成。MEP途径生成异戊二烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)的过程主要分为7步反应：第一步，丙酮酸和3-磷酸-甘油醛由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)催化生成DXP；第二步，DXP经1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)催化作用发生还原反应生成MEP；第三步，在NADPH存在下MEP经2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶(MCT)催化生成4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)；第四步，CDP-ME经4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK)的磷酸化作用生成4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸(CDP-MEP)；第五步，CDP-MEP在2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环焦磷酸合酶(MDS)作用下生成2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环焦磷酸(MEcPP)；第六步，MEcPP在1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶(HDS)作用下形成1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸(HMBPP)；最后HMBPP经1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)催化形成萜类化合物合成前体物质IPP。因此，通过马尾松的DXR基因的表达来提高下游目的产物的含量，对马尾松高产脂基因工程育种具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR及其启动子的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR或马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR的启动子在马尾松高产脂基因工程育种中的应用。

马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR，其核苷酸序列见GenBank：MK969119.1。

DXR是MEP途径中的关键限速酶，催化MEP途径第2步反应，主要参与单萜、二萜和四萜类化合物的生物合成。本申请从马尾松中克隆得到的萜类物质合成关键限速酶基因，命名为PmDXR。

以马尾松基因组DNA为模板扩增得到PmDXR基因起始密码子ATG上游序列1600bp，即马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR或马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR的启动子在提高植物光合色素含量中的应用。

马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR或马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR的启动子在提高植物DXR酶活性的应用。

进一步的，植物为马尾松或拟南芥。

本申请以模式植物拟南芥为受体植物，成功构建pCAMBIA1302-PmDXR过表达载体，并利用农杆菌介导转化至拟南芥中，培育得到转基因拟南芥，然后测定转基因拟南芥的DXR酶活性和光合色素含量。

马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR的启动子在驱动GUS基因在植物表达中的应用。

进一步的，植物为马尾松或烟草。

本申请将马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR的启动子插入含GUS基因的表达载体pBI121，以替换表达载体中已有的启动子，构建pBI121-ProDXR载体，并以本式烟草为瞬时转化对象，将克隆得到的pBI121-ProDXR载体通过瞬时转化的方法转入烟草并进行培育，PmDXR基因启动子能驱动GUS基因在本氏烟草根、茎、叶中表达。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明以模式植物本式烟草和拟南芥为受体植物，将马尾松PmDXR基因利用农杆菌介导转化至拟南芥中，通过培育得到转基因拟南芥，其中DXR酶活性、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均高于野生型拟南芥，形态学观测发现正常生长30d的转基因及野生型拟南芥在在薹轴生长上存在差异。并构建pBI121-ProDXR载体，瞬时转化法侵染本氏烟草，并进行GUS组织化学染色分析。结果显示，PmDXR基因启动子能驱动GUS基因在本氏烟草根、茎、叶中表达，且启动子没有明显的组织特异性。具有很好的实用性，将在植物育种以及抗逆性研究中具有很好的应用前景。

附图说明

图1是PmDXR基因在马尾松中的组织特异性表达图；图中，R：根；F：花；NS：幼茎；OS：老茎；NL：新叶；ML：成熟叶；X：木质部；P：韧皮部；

图2是PmDXR基因在不同处理马尾松幼苗中的表达图；图中，(A)为机械损伤处理，(B)为15％PEG6000渗透胁迫处理，(C)为0mM H₂O₂胁迫处理，(D)为500μM ETH处理，(E)为1mMSA处理；(F)为100μM MeJA处理；

图3是转基因拟南芥鉴定图；图中，M为NormalRun^TM 250bp-II DNA ladder；1-14为转基因拟南芥；15为野生型拟南芥；16为阳性对照pCAMBIA1302-PmDXR质粒；

图4是转基因拟南芥PmDXR基因相对表达量检测图；图中，WT为野生型拟南芥；R1-R12为转基因拟南芥；

图5是DXR酶活性测定图；图中，WT为野生型拟南芥；R1-R12为转基因拟南芥；

图6是转基因植株和野生型植株光合色素含量分析图；图中，WT为野生型拟南芥；R1-R12为转基因拟南芥；

图7是转基因植株和野生型植株表型观察图；图中，(A)为拟南芥莲座；(B)为拟南芥薹轴；(C)为干旱处理拟南芥；WT为野生型拟南芥，DXR为过表达PmDXR的拟南芥；a为干旱处理前土中生长20d拟南芥，b为干旱处理15d拟南芥，c为复水3天拟南芥；

图8是PmDXR启动子扩增产物图；图中，M为DNAMarker，PRO为PmDXR启动子；

图9是重组质粒的电泳检测图；

图10是不同组织的GUS染色情况图；

图11是PmDXR启动子激素胁迫响应分析图；

图12是PmDXR蛋白亚细胞定位图；图中A为绿色荧光效果图，B为叶绿体自发荧光效果图，C为明场效果图；D为叠加场效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。下述所有引物序列方向均是5′端到3′端。

实施例1马尾松PmDXR基因(GenBank：MK969119.1)的表达模式分析

一、PmDXR基因在马尾松中的组织特异性表达

利用qRT-PCR技术分析PmDXR基因在马尾松不同组织(根、幼茎、老茎、新叶、成熟叶、花、木质部和韧皮部)中的表达情况(图1)。将幼茎中的表达水平设为1，结果显示，PmDXR在所有组织中均有表达，且在不同组织中的表达具有差异性，PmDXR在木质部中表达最高，与成熟叶和根中PmDXR的表达量无显著差异，而显著高于其他组织中PmDXR的表达量。整体来看，木质部＞根＞成熟叶＞新叶＞韧皮部＞老茎＞幼茎＞花。

qRT-PCR反应体系(20μl)：2μl cDNA；10μl SYBR Green Master Mix；0.4μlqPmDXR-F；0.4μl qPmDXR-R；7.2μl ddH₂O。

反应程序如下：95℃；2min；95℃；10sec；55℃；30sec；72℃；30sec；40个循环。

二、PmDXR基因在不同处理马尾松幼苗中的表达

分别对两年生马尾松幼苗进行逆境胁迫(机械损伤、15％PEG6000渗透胁迫、10mMH₂O₂)和激素处理(500μM乙烯利ETH、1mM水杨酸SA和100μM茉莉酸甲酯MeJA)，并在不同时间段取样。逆境胁迫下qRT-PCR结果显示(图2中的(A)-(C))，在机械损伤处理后，除3h外，PmDXR基因的表达量在其他处理时间出现了不同程度的上调，在处理6h时表达量最高，为对照组的2.92倍。在PEG6000和H₂O₂处理后，PmDXR基因的表达水平在各处理时间点均有所下降。激素诱导处理下qRT-PCR结果显示(图2中的(D)-(F))，在ETH处理后，PmDXR在处理6h时略有上调。在SA处理后，PmDXR的表达量在6h时有所上调，其余处理时间点表达量均下降。在MeJA处理后，PmDXR基因的表达量在各处理时间点均有所下降。

实施例2构建马尾松PmDXR基因表达载体及转化拟南芥

一、载体的构建

取1ml保存于-80℃的含pCAMBIAl302载体的大肠杆菌菌液进行活化，取1-4ml过夜培养的菌液，利用质粒小提试剂盒提取质粒。取1μg提取的pCAMBIA1302质粒，利用Nco I限制性内切酶进行单酶切，根据单酶切后的pCAMBIA1302载体两端序列和PmDXR的ORF序列设计重组引物，进行PCR扩增。

连接体系如下：加入0.02×克隆载体碱基对数(ng)的线性化载体；0.04×插入片段碱基对数(ng)的插入片段；4μl 5×CE II Buffer；2μl Exnase II；加入ddH₂O至20μl。

置于PCR仪中37℃反应30min后立即置于冰上。

将构建成功的重组载体质粒转化到农杆菌感受态细胞GV3101中，转化方法如下：

(1)取10μl重组质粒加入到100μl处于冰水混合状态的农杆菌感受态中，轻轻拨打管底混匀，依次置于冰上、液氮、37℃水浴、冰浴各5min。

(2)加入700μl LB液体培养基放置于28℃恒温摇床振荡培养2.5h。

(3)吸取100μl左右的上清涂布于含50mg·L^-1卡那霉素(Kan)、25mg·L^-1利福平(Rif)的LB平板上，倒置于28℃培养箱培养2d。

(4)挑取生长状态良好的单克隆菌落进行PCR检测，将检测阳性的单克隆菌落扩大培养，在菌液中加入等体积的50％甘油，保存于-80℃用于后续实验。

二、拟南芥的播种与培养

(1)拟南芥种子消毒：在1.5ml的离心管中放入适量拟南芥种子，向离心管中加入1ml 75％乙醇，上下翻转45sec，用无菌水清洗后加入1ml 20％次氯酸钠，上下翻转5min，使用无菌水反复清洗5-6次。

(2)播种：用1ml移液枪将消毒完毕的拟南芥种子点播在1/2MS培养基上培养。

(3)拟南芥培养：将播种完拟南芥种子的培养基密封好，在4℃黑暗条件下培养2d，然后置于人工气候培养箱待其萌发与生长。大约一周后，将培养基中生长状态良好的拟南芥幼苗转移至营养土(黑土∶蛭石∶珍珠岩＝6∶2∶1)中继续培养，并用保鲜膜覆盖，第三天揭去保鲜膜。

三、花序浸染法转化拟南芥

(1)在超净工作台中，将含pCAMBIAl302-PmDXR重组质粒的农杆菌菌液划线培养于含50mg·L^-1Kan和25mg·L^-1Rif的LB平板上。

(2)挑取生长状态良好的单菌落，加入5ml含50mg·L^-1Kan和25mg·L^-1Rif的LB液体培养基，在28℃恒温摇床中200rpm培养过夜。

(3)取1ml过夜培养的菌液接种于50ml含50mg·L^-1Kan和25mg·L^-1Rif的LB液体培养基中，振荡培养至OD₆₀₀＝0.8左右。

(4)将菌液倒入50ml无菌离心管中，5000rpm离心10min收集菌体，加入50ml提前配制好的渗透缓冲液悬浮菌体沉淀。

(5)选取生长4周左右抽薹的拟南芥植株，去除已经开放的花蕾，将花序浸泡于侵染液中浸染30sec，浸染完成后覆盖保鲜膜。

(6)暗培养18-20h，用清水冲洗干净后继续放在培养箱培养。

(7)7-10d后，重复1-6步骤再次侵染。

(8)待拟南芥植株的种荚变黄后收获转基因T0代种子，为促进种子成熟，在种子即将成熟时应适当控制浇水次数。

四、转基因拟南芥植株的抗性筛选

(1)取适量收获的T0代种子至1.5ml离心管中，向离心管中加入1ml 75％乙醇，上下翻转45sec，用无菌水清洗后加入1ml 20％次氯酸钠，上下翻转5min，使用无菌水反复清洗5-6次。

(2)用1ml的移液枪将种子均匀点播在含30mg·L^-1潮霉素(Hyg)的1/2MS培养基上，于4℃暗培养2d后置于人工气候培养箱培养。

(3)大约培养2周后，将培养基中长出2片绿色真叶且根系正常生长的抗性幼苗移栽入营养土中，用保鲜膜覆盖，第三天揭去保鲜膜。

(4)种子成熟后单株分开收获T1代种子，继续播种筛选直至收获T2代种子以进行后续实施例操作。

五、转基因拟南芥分子水平检测

在1/2MS(含Hyg)培养基上进行初步的抗性筛选，未成功转化的阴性植株均不能正常生长，而阳性转基因植株则可以正常生长。将可以正常生长的拟南芥幼苗移至营养土中继续培养，以叶片为材料提取基因组DNA和RNA。首先以野生型和转基因拟南芥的基因组DNA为模板进行PCR扩增，成功转入PmDXR基因的拟南芥能够扩增出与质粒扩增产物大小一致的条带(图3)；然后对基因水平鉴定成功的转基因株系进行转录水平的鉴定(图4)，结果表明不同转基因植株的表达水平存在差异，在检测的12株转基因拟南芥中(编号分别命名为R1-R12)，编号为R8的拟南芥植株的表达量最高，其次为R12和R3。

具体实施步骤如下：

(1)剪取拟南芥新鲜叶片，使用DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取拟南芥基因组DNA，提取步骤严格按照说明书进行。用超微量分光光度计检测提取的拟南芥gDNA的浓度及OD260/280比值。

(2)以第一步得到的gDNA为模板，1302-CheckF为前引物，1302-PmDXR-R为后引物，进行PCR检测。

引物如下序列：

1302-CheckF：ACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCA；

1302-PmDXR-R：ACTAGTCAGATCTACCATGGTCAGACTGTGGCAGGCTCCAAG。

PCR扩增反应体系(50μl)：2μl拟南芥gDNA；25μl 2×

Master Mix；2μl1302-CheckF；2μl 1302-PmDXR-R；19μl ddH₂O。

反应程序：98℃ 3min；98℃ 15sec，55℃15sec，72℃ 1min，35个循环；72℃ 5min；4℃保持。

(3)提取DNA水平检测阳性植株的总RNA并反转录为cDNA，通过qRT-PCR检测转基因拟南芥中PmDXR基因的相对表达量，其中，内参基因为Actin2。

以阳性植株的马尾松幼苗为材料，利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总RNA；当马尾松总RNA的1％琼脂糖凝胶电泳图，条带清晰，且OD260/280、OD260/230在1.8-2.1之间时，可用于基因克隆。

以提取的RNA为模板，利用

One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒，按照说明书操作步骤合成cDNA第一链。

qRT-PCR体系与程序设置参考实施例1。

六、转基因拟南芥DXR酶活性和光合色素含量的测定

将转基因成功的拟南芥幼苗与野生型拟南芥幼苗同时培养在人工气候培养箱中。以拟南芥叶片为材料，由上海沪鼎生物科技有限公司测定转基因拟南芥的DXR酶活性、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。酶活性测定结果如图5所示，转基因拟南芥的DXR酶活性均高于野生型拟南芥，其中R5、R11和R12的DXR酶活性显著高于野生型拟南芥。R5的酶活性最高，达到了野生型的1.7倍，R11和R12的DXR酶活性约为野生型的1.5倍。这些结果说明PmDXR基因转化拟南芥后提升了DXR的酶活性。光合色素含量测定结果如图6所示，转基因拟南芥的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量较野生型均有提高。转基因拟南芥的叶绿素a含量是野生型的1.1-1.7倍，其中R1、R6、R7、R8、R12的叶绿素a含量显著高于野生型，R12的叶绿素a含量最高，为野生型的1.7倍，其次为R7，叶绿素a含量为野生型的1.4倍。转基因拟南芥的叶绿素b含量是野生型的1.3-2.0倍，除R5、R11外，其余转基因植株的叶绿素b含量均显著或极显著高于野生型，R4的叶绿素b含量最高。所有转基因拟南芥的类胡萝卜素含量均显著或极显著高于野生型，它们的类胡萝卜素含量是野生型的1.2-1.4倍，其中R1的类胡萝卜素含量最高，达210.4pg/ml。

七、转基因拟南芥表型观察

在相同的培养条件下培养转基因拟南芥和野生型拟南芥，正常生长30d后观察其莲座和薹轴生长差异(图7)。表型观察未发现过表达PmDXR的拟南芥与野生型拟南芥的莲座生长有明显差异，但薹轴生长存在差异，转基因拟南芥的薹轴明显低于野生型拟南芥。干旱处理拟南芥15d后发现，转基因拟南芥在缺水15d时的生长状况较野生型好，复水3d后，转基因拟南芥与野生型拟南芥均能逐渐恢复。

实施例3马尾松PmDXR启动子片段的克隆及在烟草中瞬时表达

一、马尾松gDNA的提取

使用DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取马尾松幼苗的基因组DNA，具体操作步骤需严格按照说明书进行。提取完成后，用超微量分光光度计检测马尾松gDNA的浓度和OD260/280比值。

二、PmDXR基因启动子引物设计

根据PmDXR基因序列设计3条退火温度较高的特异性下游引物pPmDXR-SP1、pPmDXR-SP2和pPmDXR-SP3，其中pPmDXR-SP2位于pPmDXR-SP1的内侧，pPmDXR-SP3位于pPmDXR-SP2的内侧。根据测序结果获得的侧翼序列设计特异性引物pPmDXR-F和pPmDXR-R。

引物序列如下：

pPmDXR-SP1：GTGAAGATGGCAGAGTCGCAGGAA；

pPmDXR-SP2：GCGAGTGTAGGGTGGAGGCTTATT；

pPmDXR-SP3：GGGCGGAGGATAAGACAAAGAAGA；

pPmDXR-F：TGGTAATGCAATGAAGTTGGGAGG；

pPmDXR-R：GGGGTGGAAAGGGGCGGAGGATAA。

参照Genome Walking试剂盒说明书进行3轮PCR扩增，具体PCR反应体系及程序设置如下：

(1)第一轮PCR反应液(50μl)配制如下：4μl gDNA；8μl dNTP Mixture(2.5mMeach)；5μl 10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺plus)；0.5μl LA Taq；1μl AP1 Primer；1μl SP1Primer；30.5μl ddH₂O。

(2)第一轮PCR反应条件如下：94℃1min；98℃1min；94℃30sec，64℃1min，72℃2min，共5个循环；94℃30sec，25℃3min，72℃2min；94℃30sec，64℃1min，72℃2min，94℃30sec，64℃1min，72℃2min，94℃30sec，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min。

(3)第二轮PCR反应液(50μl)配制如下：1μl第一轮PCR反应液；8μl dNTP Mixture(2.5mM each)；5μl 10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺plus)；0.5μl LA Taq；1μl AP1 Primer；1μl SP2 Primer；33.5μl ddH₂O。

(4)第二轮PCR反应条件如下：94℃30sec，64℃1min，72℃2min，94℃30sec，64℃1min，72℃2min，94℃30sec，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min。

(5)第三轮PCR反应液(50μl)配制如下：1μl第二轮PCR反应液；8μl dNTP Mixture(2.5mM each)；5μl 10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺plus)；0.5μl LA Taq；1μl AP1 Primer；1μl SP3 Primer；33.5μl ddH₂O。

(6)第三轮PCR反应条件如下：94℃30sec，641min，72℃2min，94℃30sec，64℃1min，72℃2min，94℃30sec，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min。

(7)凝胶电泳检测PCR产物、切胶回收目的条带、连接转化及阳性检测参照上述实施例操作过程，将菌检阳性的菌液送至北京擎科生物科技有限公司测序。

三、马尾松PmDXR启动子序列验证

PCR扩增验证启动子全长的PCR反应体系(50μl)如下：2μl gDNA；25μl 2×

Master Mix；2μl pPmDXR-F；2μl pPmDXR-R；19μl ddH₂O。

PCR程序设置如下：98℃3min；98℃15sec，55℃15sec，72℃ 1min，共35个循环；72℃ 5min；4℃保持。

PmDXR基因启动子扩增产物1.2％琼脂糖凝胶电泳见图8，测的核苷酸序列如如SEQID NO.1所示。

四、pBI121-ProDXR重组载体的构建

以pBI121-ProDXR-F和pBI121-ProDXR-R(ProDXR指PmDXR基因的启动子)为引物扩增得到两端带有酶切位点的PmDXR启动子片段，使用Hind III和Xba I限制性内切酶双酶切pBI121质粒，酶切产物与插入片段连接后转化大肠杆菌感受态细胞Trelief^TM5d，PCR检测单克隆菌落(图9)。随后对检测阳性的菌液进行测序验证，测序结果表明pBI121-ProDXR载体构建成功。

引物序列如下：

pBI121-ProDXR-F：GACCATGATTACGCCAAGCTTTGGTAATGCAATGAAGTTGGGA；

pBI121-ProDXR-R：ACCACCCGGGGATCCTCTAGAGGGGTGGAAAGGGGCGGA。

质粒酶切反应体系(50μl)如下：1μg pBI121质粒；5μl10×QuickCut Buffer；1μlHind III；1μl Xba I；加入ddH₂O至50μl。

五、农杆菌介导法瞬时转化烟草

将构建成功的pBI121-ProDXR重组质粒转化到农杆菌感受态细胞EHAl05中，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定。将检测阳性的单克隆菌落扩大培养至OD₆₀₀＝0.8左右后转化本氏烟草，具体方法如下：

(1)5000rpm离心10min收集菌体，加入50ml瞬时转化重悬液悬浮菌体沉淀，黑暗条件静置3h。

(2)将生长健壮的本氏烟草组培苗叶片制成叶盘，并将烟草的根和茎剪成小段，为避免失水萎蔫，将准备好的叶片、茎、根放置在无菌水中待用。

(3)在无菌滤纸上吸干水分，将准备好的烟草叶片、根、茎置于重悬液中，轻轻摇晃10min左右，用镊子取出，并用无菌滤纸吸干，然后将侵染过的烟草叶片、根、茎置于烟草共培养培养基上，于黑暗条件培养24h。

六、不同激素处理烟草叶片

暗培养24h后，将烟草叶片转移至分别含有100μmol·L^-1MeJA和100μmol·L^-1ABA、1mmol·L^-1GA的MS培养基上培养36h，以放置在MS₀培养基上的叶片作为对照。

七、β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)组织化学染色

将本氏烟草的叶片、根、茎分别放入5ml离心管中，加入适量GUS染色液，加入的GUS染色液需没过实验材料，37℃避光染色16h，倒掉染色液后加入70％乙醇进行脱色，每隔3h换一次乙醇，脱色完成后在体视显微镜下观察烟草的染色情况并拍照记录。GUS组织化学染色分析结果表明(图10)，GV3101空菌株阴性对照没有GUS蓝色信号，pBI121瞬时转化烟草根、茎、叶的GUS染色颜色最深，pBI121-ProDXR瞬时转化的烟草经GUS染色后其根、茎、叶均呈现蓝色，但较阳性对照pBI121的染色颜色浅。由此说明proPmDXR可以驱动GUS基因在烟草根、茎、叶中表达。

将共培养24h的烟草叶片转移至分别含有100μmol·L^-1MeJA、100μmol·L^-1ABA、1mmol·L^-1GA的MS培养基上处理36h，GUS染色后观察染色结果，分析不同激素对PmDXR启动子的影响。结果表明(图11)，经ABA、MeJA处理后，ProDXR驱动的GUS染色效果强于对照，颜色较未作处理的烟草叶片深，GA处理后GUS染色效果与未作处理相较略弱。

实施例4马尾松PmDXR蛋白亚细胞定位

pBI121-GFP载体上包含绿色荧光蛋白基因，可作为标记基因同目的基因连接表达。根据pBI121-GFP载体序列与PmDXR基因的ORF序列(删除终止密码子)设计重组引物。利用瞬时转化法将PmDXR-GFP转化至本氏烟草叶片中，在人工气候培养箱中暗培养2d，用激光共聚焦显微镜检测荧光GFP在细胞中的表达位置。结果显示，pBI121-GFP空载体定位在整个烟草叶表皮细胞中，PmDXR-GFP定位在烟草叶表皮细胞的叶绿体中(图12)。

具体操作如下：

(1)在含50mg·L^-1Kan和25mg·L^-1Rif的LB平板上划线培养含PmDXR-GFP重组质粒的农杆菌。

(2)挑取生长状态良好的单菌落于20ml含50mg·L^-1Kan和25mg·L^-1Rif的LB液体培养基中，振荡培养至OD₆₀₀＝0.8左右(同时培养P19菌株)。

(3)将菌液转移至50ml无菌离心管中，在高速冷冻离心机中4℃，5000rpm离心10min以收集菌体。

(4)向离心管中加入与菌液等体积的瞬时转化重悬液，涡旋混匀后，与P19重悬液等体积混合，室温避光放置3h。

(5)用一次性注射器将重悬液注射入本氏烟草叶片，室温下暗培养48h。

(6)用激光共聚焦显微镜LSM710观察本氏烟草叶表皮细胞中GFP融合蛋白的瞬时表达。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR及其启动子的应用

<130> 1

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1600

<212> DNA

<213> PmDXR基因启动子(Artificial)

<400> 1

tggtaatgca atgaagttgg gagggggagg tcacgggttc gacctgccct ccgcccatcc 60

cttaatacat ttttccgccc attgaatttt ccattcaatt atttacatat atggggattt 120

ggatatagtt caatgccttt ggatttacta tggaattata tatatttcta aaaaatacaa 180

tttccacata atattcatca tgaacccata attccacctt ggaggacatt gggcaatttc 240

accttcacac agccaaattg gcaaatccta aagtgacact tgtcacaacc ttattggaaa 300

atactaaaga agattcccat catgctcact gtactgccat gtcatcattc tgtcctgttt 360

agaaaaacga acaacaggca ttttctcctt catccaaact cggtttttag tgaaacgaat 420

tgcattgtga tcgtcttgac gagacagaca cagtcgtaca tgtttcgagc caatacaaga 480

actttgattt tttgatgccc taaatttctc aacataacgc acccattccc aaagcacaaa 540

tgccaatggt caaaacccat taaaactaaa agtaatggaa tgctgcatat agtctatgcc 600

aaaatttttg gattaagcat gatccacttt aatagatgga atatcttctg cctgaaccac 660

aatgaagacc gactctaaga gatctttaag agtaagatgt gagagccatg ggtgtagggc 720

atccttaaag gatctagact gagaggaaga gggcacaccc cagcctttgg ctccatcgtt 780

taatcttgaa attaaaaagc ttgaagcatc cttggttatg ccataatcat cgagcaaatt 840

tctttcttga agctacctac cactgtgaag gagttgcata aacatggagg ggattcccat 900

ccgatcttga attctagcta cgagtgaaga gaccatgtta gcgaatttca cctaaatata 960

taaaataccc cctgagattg gtctcacaaa gaccaaaatg ttcaagaggt ttctgtcctc 1020

agcttgaatg catgaagaac cctatgacaa aagaagttcc ccttgatttc aatgatctac 1080

aacaattaca ccaagatgag ggggattcaa acaaaatgtc gagtcttgaa gcaaaaaatc 1140

ttccacaaac agggtggcag tggctcaagg cattagggtt tccatcgcga taactaaaaa 1200

cttcgattta atttttcata tttttattta tgaaaactac tcttaaaata aatctcaatt 1260

ctttatttct aataattatt aaaaatattt tgaaattatt aaattattaa aatattcggt 1320

tgcctggctc tctaggcaag gccccctcaa acgcacttta ctattatcaa gtcaacatca 1380

ttatcgagtc aacaccatta gttagttata tgtatagaag tgacacatgt acaacgggac 1440

atgaaaatta ttgacacagt ggaaatgggt agccgtggga aagatacccc tgtattttgg 1500

agtttagcgg aggaacgcaa atggcattcc gcatggtgtc caattccact actacattgc 1560

ttgattcttc tttgtcttat cctccgcccc tttccacccc 1600

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 1302-CheckF(Artificial)

<400> 2

acagtctcag aagaccaaag ggca 24

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 1302-PmDXR-R(Artificial)

<400> 3

actagtcaga tctaccatgg tcagactgtg gcaggctcca ag 42

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> pPmDXR-SP1(Artificial)

<400> 4

gtgaagatgg cagagtcgca ggaa 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> pPmDXR-SP2(Artificial)

<400> 5

gcgagtgtag ggtggaggct tatt 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> pPmDXR-SP3(Artificial)

<400> 6

gggcggagga taagacaaag aaga 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> pPmDXR-F(Artificial)

<400> 7

tggtaatgca atgaagttgg gagg 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> pPmDXR-R(Artificial)

<400> 8

ggggtggaaa ggggcggagg ataa 24

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> pBI121-ProDXR-F(Artificial)

<400> 9

gaccatgatt acgccaagct ttggtaatgc aatgaagttg gga 43

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> pBI121-ProDXR-R(Artificial)

<400> 10

accacccggg gatcctctag aggggtggaa aggggcgga 39

Claims

1.一种马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR在马尾松高产脂基因工程育种中的应用。

2.一种马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR在提高植物光合色素含量中的应用。

3.一种马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR在提高植物DXR酶活性的应用。

4.权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为马尾松或拟南芥。

5.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR的启动子在马尾松高产脂基因工程育种中的应用。

6.核苷酸序列如SEQ D NO.1所示的马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR的启动子在提高植物光合色素含量中的应用。

7.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR的启动子在提高植物DXR酶活性的应用。

8.权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为马尾松或拟南芥。

9.马尾松萜类物质合成相关酶基因PmDXR的启动子在驱动GUS基因在植物表达中的应用。

10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物为马尾松或烟草。