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CN114480442A - 一种mRNA及包含其的新型冠状病毒mRNA疫苗 - Google Patents

一种mRNA及包含其的新型冠状病毒mRNA疫苗 Download PDF

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CN114480442A CN202011164144.2A CN202011164144A CN114480442A CN 114480442 A CN114480442 A CN 114480442A CN 202011164144 A CN202011164144 A CN 202011164144A CN 114480442 A CN114480442 A CN 114480442A
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李波
汤勇
杨锦霞
李涛
李冬丽
张乐
李佑平
熊恒
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Shenzhen Jinuoyin Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种分离的mRNA，其包括编码新冠病毒S1蛋白的mRNA，所述S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；其还包括以下(a)～(d)的一种或多种：(a)5’‑帽结构，(b)3’‑聚腺苷酸，(c)5’‑UTR，(d)3’‑UTR；还公开了DNA、包含其的组合物、脂质体纳米颗粒、针对新冠病毒的mRNA疫苗、药物组合物和试剂盒。所述mRNA在细胞中可高表达；经济高效且更安全、高效，结构更稳定，蛋白表达效率更高，能持续表达新冠病毒S1蛋白。将其制备成脂质体纳米颗粒/疫苗时，可实现使用极小剂量就能达到足够保护效果，且免疫原性降低，同时能激活机体免疫系统产生体液免疫和细胞免疫。

Description

一种mRNA及包含其的新型冠状病毒mRNA疫苗
技术领域
本发明涉及一种mRNA、可转录其的DNA、包含其的组合物、脂质体纳米颗粒、针对新型冠状病毒的mRNA疫苗、药物组合物和试剂盒。
背景技术
新冠肺炎是指由新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)引起的肺炎，是一种急性感染性肺炎，它具有人传染人的能力，感染初期病人有发热、乏力、干咳的症状,严重者可出现呼吸困难、呼吸窘迫综合征或脓毒症休克。冠状病毒(Coronavirus)是一个常见而又古老的病毒大家系，现今已确认的人源冠状病毒(Human Coronavirus，HCoVs)有6种，其中包括引起急性呼吸道综合征(SARS)的SARS冠状病毒(SARS-CoV)、引起中东呼吸道综合征(MERS)的MERS冠状病毒(MERS-CoV)以及引起新冠肺炎(COVID-19)的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
新型冠状病毒SARS-CoV-2的RNA基因组为单股、正链RNA，5’端的前约2/3长度区域编码非结构蛋白，剩余1/3区域编码结构蛋白，依次为棘突蛋白(Spike蛋白/S蛋白)、包膜蛋白(envelope/E)、膜蛋白(membrane/M)、核壳蛋白(nucleocapsid/N)以及附加蛋白。S蛋白是病毒表面最重要的跨膜糖蛋白，S蛋白又分为S1和S2两部分，其中N端为S1，S1上含有受体结合区，主要功能是与宿主细胞表面受体结合完成入侵；C端为S2，形成细长突起的柄部分，主要功能介导细胞间的融合和病毒遗传物质注入宿主细胞。新型冠状病毒SARS-CoV-2高度保守的S蛋白序列含有1273个氨基酸，其中S蛋白中与宿主细胞表面受体ACE2结合区域(RBD，receptor binding domain)为S蛋白的S1亚基，位于1-661位氨基酸。对于病毒而言，中和抗体能够完全阻止病毒进入人体细胞，病毒蛋白上抗体结合位点的位置和数量是影响人体产生中和抗体能力的重要因素。S1作为受体结合域，除RBD上有抗体结合位点，在RBD附近246-257位氨基酸处也存在一个强抗体结合位点。有研究表明(DNA vaccine encodingMiddle East respiratory syndrome coronavirus S1 protein induces protectiveimmune responses in mice,Vaccine,14Mar 2017,35(16):2069-2075)，以S蛋白的S1亚基为靶区域设计的疫苗，同样能引起机体的体液免疫和/或细胞免疫，避免或减缓冠状病毒对机体的感染，不仅如此，相比于S蛋白或RBD靶区域疫苗，以S1结构域为靶区域设计的疫苗可能引发机体产生更多的中和抗体，并且在小鼠中，S1疫苗引发的IgG2a/IgG1更加平衡，安全性更高。除了中和抗体，人体还依赖细胞毒性CD8+T细胞和辅助CD4+T细胞来完全清除病毒。有研究预测(Binbin Chen et al.,Potential T-cell and B-cell Epitopes of 2019-nCoV,bioRxiv,2020)，SARS-CoV-2病毒基因组上可能存在405个T细胞表位，其中S1部分的T细胞表位覆盖率相当高，可见除RBD外的S1序列区域仍然含有大量不可小觑的B细胞/T细胞表位。除此之外，有研究表明(Site-specific analysis of the SARS-CoV-2glycanshield,DOI:10.1101/2020.03.26.010322)，S1蛋白序列部分上包含13个的糖基化位点，其中RBD区域2个，糖基化参与调控蛋白质在组织和细胞中的定位、功能和活性，会影响细胞识别、细胞分化、信号转导、免疫应答等多种重要的生命活动。
疫苗是指为了预防、控制传染病的发生、流行，用于人体预防接种的疫苗类预防性生物制品。自2020年1月11日中国向全球分享了新型冠状病毒的基因序列开始，各国的疫苗研发工作都在紧锣密鼓地进行着。根据世界卫生组织的数据，现在全球有70多种针对新冠病毒的疫苗正在积极研发，其中有8个候选疫苗已进入临床阶段，主要包括以病毒载体疫苗、减毒/灭活疫苗、重组蛋白疫苗为代表的传统疫苗和以mRNA疫苗、DNA疫苗为代表的新型核酸疫苗。其中，灭活疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗都是通过将病原体本身或部分或其抗原基因注入机体内引起免疫反应。灭活疫苗目前存在的主要缺陷在于：1)一般免疫效果较弱，只能诱导产生体液免疫；2)诱导产生免疫反应持续时间较短，需要多次接种；3)灭活剂对病毒抗原有着不同程度的影响；4)各个抗原成分之间的疫苗应答不平衡，可能诱发其他疾病。腺病毒载体疫苗目前存在的主要缺陷在于：1)诱导产生免疫反应持续时间较短；2)缺乏靶向性，可能会感染正常细胞引起不良反应；3)若机体本身存在对腺病毒载体的免疫力，身体内的腺病毒抗体会转而攻击载体，令疫苗失效。DNA疫苗目前存在的主要缺陷在于：1)表达效率可能不高；2)病毒基因有整合到宿主染色体的风险；3)DNA需要入细胞核，再经转录、翻译等过程，过程长起效慢。
mRNA疫苗是将抗原蛋白的基因序列结合修饰序列，通过体外转录、纯化等工艺制备得到的mRNA，通过特定的递送系统(或载体)包裹mRNA，将其导入机体细胞(例如注射至人体)，随后mRNA在细胞内释放并表达目的蛋白、激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。具体为：免疫系统中最强大的抗原提呈细胞—树突状细胞(DC细胞)，一方面将完整的抗原呈递给B细胞，启动体液免疫反应，产生抗体，阻止病毒侵染宿主细胞，起预防作用；另一方面通过蛋白酶水解抗原，呈递给主要组织相容性复合物(MHC)上的CD8+和CD4+T细胞，启动细胞免疫反应，消灭已被病毒侵染的宿主细胞，起治疗作用。mRNA疫苗作为新兴疫苗，有着相比于其他疫苗的优势，但目前mRNA疫苗的研发仍处于临床研究阶段，还没有获批上市的mRNA疫苗，由此可见mRNA疫苗的研发仍存在不少难点。
mRNA疫苗的研制可分为mRNA疫苗的结构设计、mRNA的生产、mRNA的纯化和mRNA的递送几大步骤，其中mRNA疫苗的结构设计关系mRNA的稳定性和目的蛋白的表达能力，mRNA的递送技术关系到mRNA的转染效率和免疫反应的能力及类型，这两点是目前mRNA疫苗领域的开发难点与核心技术。
首先，mRNA疫苗结构多样化，mRNA中的帽子结构(Cap)的类型和加帽方式、5’UTR区的长度和来源、编码抗原蛋白的开放阅读框(open reading frame，ORF)、3’UTR区的长度和来源和Poly(A)尾的长度和加尾方式等都会影响到mRNA的稳定性和蛋白表达的效率。新型冠状病毒SARS-CoV-2的RNA基因组编码多种抗原蛋白，如棘突蛋白(Spike蛋白/S蛋白)、包膜蛋白(envelope/E蛋白)、膜蛋白(membrane/M蛋白)、核壳蛋白(nucleocapsid/N蛋白)等，如何选择能达到更好免疫效果的抗原蛋白是mRNA疫苗的首要难点。mRNA帽子结构(Cap)有三种：CAP 0型、CAP I型和CAP II型，UTR可来自任何自然界存在基因的UTR，即使是人源蛋白基因的UTR也有十几万种，因此疫苗设计需要从上亿种UTR组合中选择合适的组合来稳定mRNA、提高蛋白表达。除此之外，mRNA在体外转录过程中，转录质粒、加帽、加尾、几十种转录底物的选择都会影响mRNA的稳定性、转录效率和蛋白表达能力。其次，如何实现mRNA的高效转运也是阻碍mRNA疫苗研发的技术难点。由于mRNA自身稳定性差，易被体内外的核酸酶降解，所以在保证其安全性的基础上，有效和耐受性好的递送技术对于充分发挥mRNA疫苗的潜力是不可或缺的。目前mRNA疫苗递送技术有十几种，常用的安全的递送方式为载体递送，递送载体主要包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒和仙台病毒等；非病毒载体，如纳米脂质体颗粒(LNP)、无机纳米粒子、树状大分子等。即使是主流的LNP纳米脂质体粒子包裹RNA法，也需要从众多种脂质体材料中选择的最合适的材料及其配比。
考虑到上述传统疫苗安全性低、疗效不佳、生产周期长和产生免疫所需时间长等原因，而且疫苗研发所需时间长，各种疫苗存在着各自的优缺点和技术壁垒，进入临床的疫苗的安全性和有效性还未经证明，仍有失败的风险，目前仍然没有新冠病毒肺炎疫苗获批上市，也没有确定哪种疫苗的效果最好，因此开发新的冠状病毒的治疗药物及疫苗、积极防治新型冠状病毒感染(SARS-CoV-2)迫在眉睫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中商品化的新冠病毒疫苗不足等缺陷，提供了一种mRNA、可转录其的DNA、包含其的组合物、脂质体纳米颗粒、针对新冠病毒的mRNA疫苗、药物组合物和试剂盒。本发明的经过密码子优化后或者进一步经过修饰所得的mRNA在细胞中可以高表达；从而可以获得分子水平精准设计的类似于完全加工成熟的mRNA分子产品；不仅经济高效，而且所述mRNA更加安全、高效，结构更加稳定，蛋白表达效率更高，能够持续地表达新冠病毒S1蛋白。将本发明的mRNA制备成脂质体纳米颗粒/疫苗时，可以实现使用极小剂量就能达到足够的保护效果，且免疫原性有所降低，同时能够激活机体免疫系统产生体液免疫和细胞免疫。将本发明的mRNA制备成疫苗时，成本较低、生产周期短，有利于大规模工业生产。
本领域技术人员公知，mRNA不具有感染性和整合性，在体内是通过正常的途径降解的，不存在潜在的感染或插入突变的风险。完整结构的mRNA包含以下几个必要的元件，依次为帽子结构(Cap)、5’UTR区、编码抗原蛋白的开放阅读框(open reading frame，ORF)、3’UTR区和Poly(A)尾结构，其中帽子结构(Cap)、Poly(A)的长度和加尾方式以及UTR的长度和来源都会影响到mRNA的稳定性和蛋白表达的效率。mRNA疫苗结构设计需要从大量的元件数据库中筛选到提高mRNA的安全性、稳定性、有效性和翻译效率的结构。而本发明人通过大量实验和摸索，从上亿种mRNA疫苗可能的结构中，分析得到了一种能够安全、高效、稳定表达新冠病毒S1蛋白的mRNA序列，将其制备成疫苗等时能够同时激活机体免疫系统产生体液免疫和细胞免疫。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种分离的mRNA，其包括编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA，其中，所述S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述分离的mRNA还包括以下(a)～(d)中的一种或多种(在某一较佳实施例中可同时含有5’-帽结构、3’端聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR)：
(a)5’-帽结构，优选为CAP 0型、CAP I型或CAP II型的帽结构或其类似物；所述CAP 0型的帽结构优选为7-甲基鸟苷帽结构(又可写为7Me Gppp Pu(Pu为嘌呤核苷)或m7G5'ppp5'Np)，所述CAP I型的帽结构优选为N7mGpppAm(又可写为7Me Gppp XMe或m7G5'ppp5'NmpNp)；本发明中，所述的CAP I型的帽结构可以是通过选择目前常用的、稳定的重组痘苗病毒衍生酶和2’-O甲基转移酶两步酶法进行mRNA的体外加帽反应。从而使得加帽稳定，加帽效率高，不会出现部分mRNA加帽失败的结果，也不会在体外转录过程中与GTP发生竞争减少mRNA产量。
(b)3’-聚腺苷酸，其序列优选为包含16-150个腺苷核苷酸的序列，更优选包含50-120个腺苷核苷酸的序列；
(c)5’-UTR，所述5’-UTR优选为核糖体蛋白L32的5’-UTR，例如为人核糖体蛋白L32的5’-UTR，其序列优选如SEQ ID NO:3(5’-GGGGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATCAAGCTTACC-3’)所示；
(d)3’-UTR，所述3’-UTR的序列优选为β珠蛋白的3’-UTR和α珠蛋白的3’-UTR，例如为人β珠蛋白(HBB)的3’-UTR和人α珠蛋白(HBA)的3’-UTR，其序列优选如SEQ ID NO:4(5’-GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC-3’)或SEQ ID NO:7(5’-TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC-3’)所示。本发明中，所述的UTR(非编码区，Untranslated Region)可来源于脊椎动物、哺乳动物等，考虑到疫苗的安全性，优选人源蛋白基因UTR。
较佳地，所述免疫原性片段为所述S1蛋白的RBD结构域(receptor bindingdomain，RBD，受体结合结构域，负责识别细胞的受体)。
较佳地，所述的3’-聚腺苷酸通过体外酶促反应添加到所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA上。
较佳地，所述的3’-聚腺苷酸通过将其连接到包含所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA的转录模板DNA之后进行转录(通常是将所述的3’-聚腺苷酸提前设计在所述mRNA的转录模板DNA质粒上，然后进行转录)。
较佳地，所述分离的mRNA进一步包含以下(e)～(f)中的一种或两种：
(e)信号肽，所述信号肽优选为人IgE信号肽或人IgG信号肽或小鼠IgK信号肽；所述人IgE信号肽的序列如SEQ ID NO:5(MDWTWILFLVAAATRVHS)所示；所述人IgG信号肽的序列如SEQ ID NO:8(MGWSCIILFLVATATGVHS)所示；所述小鼠IgK信号肽的序列如SEQ ID NO:9(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)所示；其通常位于起始密码子之后，为一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。
(f)多核苷酸修饰，所述多核苷酸优选N1-甲基假尿苷(m1ΨTP)、假尿苷(Ψ)和5-甲基尿苷(m5U)中的一种或多种。
在某一较佳实施例中，所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人α珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸。例如所述的分离的mRNA从5’末端到3’末端依次由CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人α珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸组成(例如本发明实施例部分所述的SARS-CoV-2-A)。
在某一较佳实施例中，所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸。例如所述的分离的mRNA从5’末端到3’末端依次由CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸组成(例如本发明实施例部分所述的SARS-CoV-2-B、SARS-CoV-2-C或SARS-CoV-2-D)。
在某一较佳实施例中，所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含50个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸。例如所述的分离的mRNA从5’末端到3’末端依次由CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含50个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸组成(例如本发明实施例部分所述的SARS-CoV-2-E)。
在某一较佳实施例中，所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含16个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸。例如所述的分离的mRNA从5’末端到3’末端依次由CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含16个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸组成(例如本发明实施例部分所述的SARS-CoV-2-F)。
在某一较佳实施例中，所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、人IgE信号肽、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸。例如所述的分离的mRNA从5’末端到3’末端依次由CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、人IgE信号肽、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸组成(例如本发明实施例部分所述的SARS-CoV-2-G)。
在某一较佳实施例中，所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、人IgG信号肽、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸。例如所述的分离的mRNA从5’末端到3’末端依次由CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、人IgG信号肽、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸组成(例如本发明实施例部分所述的SARS-CoV-2-H)。
在某一较佳实施例中，所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、鼠IgK信号肽、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸。例如所述的分离的mRNA从5’末端到3’末端依次由CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、鼠IgK信号肽、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸组成(例如本发明实施例部分所述的SARS-CoV-2-I)。
在某一较佳实施例中，所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸，且经N1-甲基假尿苷的修饰。例如所述的分离的mRNA从5’末端到3’末端依次由CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸组成，且经N1-甲基假尿苷的修饰(例如本发明实施例部分所述的SARS-CoV-2-G1)。
在某一较佳实施例中，所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸，且经假尿苷的修饰。例如所述的分离的mRNA从5’末端到3’末端依次由CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸组成，且经假尿苷的修饰(例如本发明实施例部分所述的SARS-CoV-2-G2)。
在某一较佳实施例中，所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸，且经5-甲基尿苷的修饰。例如所述的分离的mRNA从5’末端到3’末端依次由CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述的编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其免疫原性片段的mRNA或其转录模板DNA或其变体、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸组成，且经5-甲基尿苷的修饰(例如本发明实施例部分所述的SARS-CoV-2-G3)。
本发明中，所述的分离的mRNA通常可以适合作为疫苗进行使用。
本发明中，所述的分离的mRNA通常可以为人工合成所得。
本发明中，所述的分离的mRNA通常还可以进一步经过其他修饰。
本发明中，为了保证蛋白完整的免疫原性和其稳定性，选择了新冠病毒的S1蛋白基因序列为本发明核酸的ORF(开放阅读框，open reading frame)。
在本发明某一较佳实施例中，所述分离的mRNA的序列如SEQ ID NO:10所示。
为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种分离的DNA，所述分离的DNA可转录如本发明第一方面所述的分离的mRNA。
较佳地，所述分离的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同源性的序列所示。
为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体中含有如本发明第一方面所述的分离的mRNA、如本发明第二方面所述的DNA。
较佳地，所述重组表达载体的骨架载体为pAAV-MCS、pcDNA 3.1(+)、pCMV-MCS、pEGFP-CTSB或pLVX-PAX1。在某一较佳实施例中，所述重组表达载体的骨架载体为pcDNA3.1(+)。
较佳地，所述重组表达载体的启动子为Lac乳糖操纵子、TAC启动子、TRC启动子或T7启动子。
为了解决上述技术问题，本发明第四方面提供了一种转化体，在宿主中导入如本发明第一方面所述的分离的mRNA、或如本发明第二方面所述的DNA、或如本发明第三方面所述的重组表达载体。
所述转化体的制备方法可为本领域常规的制备方法，例如为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述转化体的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。优选地，所述宿主细胞为原核细胞和/或真核细胞，优选为分离的哺乳动物细胞，更优选为哺乳动物受试者的细胞，进一步优选为哺乳动物受试者的分离的细胞，最优选为人受试者的分离的细胞。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
为了解决上述技术问题，本发明第五方面提供了组合物，其包含如本发明第一方面所述的分离的mRNA、或如本发明第二方面所述的DNA。
为了解决上述技术问题，本发明第六方面提供了一种脂质体纳米颗粒(或称为脂质体、脂质复合物/体、LNP)，其包含如本发明第一方面所述的分离的mRNA、如本发明第二方面所述的DNA和/或如本发明第五方面所述的组合物。
较佳地，所述脂质体纳米颗粒为长循环阳离子脂质体纳米颗粒，优选为经PEG或其衍生物修饰的长循环阳离子脂质体纳米颗粒；所述PEG的相对分子质量优选为2000～5000，例如为2000、3000、4000或5000。
更佳地，所述脂质体纳米颗粒还包括脂质体递送系统，其优选包括阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂，更优选包括20％～70％的阳离子脂质、10％～65％的结构脂质、5％～25％的辅助脂质和1％～10％的表面活性剂。
其中，所述阳离子脂质可以是优选自N,N-二烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N,N-二甲基-2,3-二甲氧基丙胺(DODMA)、1,2-二甲基氧基-3-(二甲氨基)乙氧基丙烷(Dlin-DAC)、2,2-二甲基苯胺-4-(2-二甲基氨基甲基)-[1,3]-二氧戊环(Dlin-KC2-DMA)和二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(Dlin-MC3-DMA)中的一种或多种，更优选自Dlin-KC2-DMA和Dlin-MC3-DMA中的一种或两种，最优选为Dlin-MC3-DMA；所述阳离子脂质的摩尔百分比优选为30％～60％，更优选为45％～55％，例如50％。其中，所述结构脂质可以是优选自胆固醇、胆固醇酯、固醇类激素、固醇类维生素和植物甾醇中的一种或多种，更优选自胆固醇、胆固醇酯和植物甾醇中的一种或多种，最优选为胆固醇；所述结构脂质的摩尔百分比优选为15％～50％，例如23％、28％、30％、33％、35％、38.5％、40％或48％。其中，所述辅助脂质可以是优选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的一种或多种，更优选为DSPC和/或DOPS，最优选为DSPC；所述辅助脂质的摩尔百分比优选为10％～20％，例如13％或15％。其中，所述表面活性剂可以是优选自DAG-PEG、DAA-PEG、DMG-PEG、Cer-PEG和DSPE-PEG中的一种或多种，更优选为PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)；所述表面活性剂的摩尔百分比优选为1％～5％；更优选为1％～3％，例如为1.5％或2％。
在某一较佳实施例中，所述脂质体纳米颗粒中的脂质体递送系统包括45％～55％的Dlin-MC3-DMA、30％～40％的胆固醇、10％～15％的DSPC和1％～3％的DMG-PEG2000；所述百分比为摩尔百分比。在此配比范围内的脂质体的粒径分布更集中，包封率和入胞率更高，效果更佳。
在某一较佳实施例中，所述脂质体纳米颗粒中的脂质体递送系统由20％的Dlin-MC3-DMA、65％的胆固醇、13％的DSPC和2％的DMG-PEG2000组成。
在某一较佳实施例中，所述脂质体纳米颗粒中的脂质体递送系统由70％的Dlin-MC3-DMA、15％的胆固醇、13％的DSPC和2％的DMG-PEG2000组成。
在某一较佳实施例中，所述脂质体纳米颗粒中的脂质体递送系统由50％的Dlin-MC3-DMA、35％的胆固醇、13％的DSPC和2％的DMG-PEG2000组成。
在某一较佳实施例中，所述脂质体纳米颗粒中的脂质体递送系统由50％的Dlin-MC3-DMA、35％的胆固醇、10％的DSPC和5％的DMG-PEG2000组成。
在某一较佳实施例中，所述脂质体纳米颗粒中的脂质体递送系统由50％的Dlin-MC3-DMA、35％的胆固醇、13％的DOPC和2％的DMG-PEG2000组成。
在某一较佳实施例中，所述脂质体纳米颗粒中的脂质体递送系统由50％的Dlin-MC3-DMA、28％的胆固醇、20％的DSPC和2％的DMG-PEG2000组成。
在某一较佳实施例中，所述脂质体纳米颗粒中的脂质体递送系统由50％的Dlin-MC3-DMA、23％的胆固醇、25％的DSPC和2％的DMG-PEG2000组成。
在某一较佳实施例中，所述脂质体纳米颗粒中的脂质体递送系统由50％的Dlin-MC3-DMA、38.5％的胆固醇、10％的DSPC和1.5％的DMG-PEG2000组成。
较佳地，所述脂质体递送系统与所述mRNA、所述DNA和/或所述组合物的质量比为(5-30):1，优选为(10-20):1；例如15:1。
针对上述的mRNA疫苗的递送系统通常可以经过工艺的改良，比如调整使用的辅料脂质体的组成，摩尔比，与mRNA混合的条件等。本领域人员应当理解的是，这些均应当在本申请的保护范围之内。
在某一较佳实施例中，所得脂质体纳米颗粒(以mRNA-LNP的形式)的平均粒径可以为50-100nm，包封率可以≥80％，可以将其作为新型冠状病毒SARS-CoV-2mRNA的核酸疫苗进行注射。
在某一较佳实施例中，所述的脂质体纳米颗粒可通过以下方法制得：将上述的mRNA溶解于pH6.8-7.4的PBS缓冲液，此为水相。将阳离子脂质纳米颗粒Dlin-MC3-DMA、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000，按摩尔百分比50:13:35:2溶于无水乙醇，此为有机相。采用微流体混合仪将有机相与水相按1:5的体积比混合，混合后除去溶液中的乙醇并浓缩mRNA浓度至0.5mg/mL。
本发明中，将mRNA以安全高效的LNP脂质体纳米颗粒的形式进行递送，不仅可以保护核酸不被降解，延长释放时间持续增强免疫反应，同时，通过改变脂质体的粒径和电荷，结合肌肉注射给药方式，实现更加精准的靶向给药，有助于提高mRNA疫苗的稳定性，延长机体免疫反时间、增加免疫应答类型。不仅可以产生强大的免疫反应，而且改善了mRNA疫苗耐受性，使其更好的发挥作用。
为了解决上述技术问题，本发明第七方面提供了一种mRNA疫苗，其包含如本发明第一方面所述的分离的mRNA、如本发明第二方面所述的DNA、如本发明第五方面所述的组合物和/或如本发明第六方面所述的脂质体纳米颗粒(从而引起适应性免疫反应)。该疫苗通常可以是针对SARS-CoV-2病毒的疫苗。
较佳地，所述mRNA疫苗还包括佐剂。
为了解决上述技术问题，本发明第八方面提供了一种药物组合物，其包含如本发明第一方面所述的分离的mRNA、如本发明第二方面所述的DNA、如本发明第五方面所述的组合物、如本发明第六方面所述的脂质体纳米颗粒和/或如本发明第七方面所述的mRNA疫苗，和任选地药学上可接受的载体。
为了解决上述技术问题，本发明第九方面提供了一种试剂盒，其包含如本发明第一方面所述的分离的mRNA、如本发明第二方面所述的DNA、如本发明第五方面所述的组合物、如本发明第六方面所述的脂质体纳米颗粒、如本发明第七方面所述的mRNA疫苗和/或如本发明第八方面所述的药物组合物。
较佳地，所述试剂盒还包含：使用说明、用于转染的细胞、辅剂、施用所述药物组合物的工具、药学可接受的载体和/或用于溶解或稀释所述mRNA、所述DNA、所述组合物、所述脂质体纳米颗粒、所述疫苗或所述药物组合物的药学可接受的溶液。
为了解决上述技术问题，本发明第十方面提供了如本发明第一方面所述的分离的mRNA、如本发明第二方面所述的DNA、如本发明第五方面所述的组合物、如本发明第六方面所述的脂质体纳米颗粒、如本发明第七方面所述的mRNA疫苗和/或如本发明第八方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染或SARS-CoV-2病毒感染所致疾病的药物中的应用。
此外，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的分离的mRNA、如本发明第二方面所述的DNA、如本发明第五方面所述的组合物、如本发明第六方面所述的脂质体纳米颗粒、如本发明第七方面所述的mRNA疫苗和/或如本发明第八方面所述的药物组合物在制备试剂盒中的应用。
此外，本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括编码所述mRNA的DNA分子，所述DNA分子能够转录得到所述mRNA；所述生物材料还可以是含有上述DNA分子的表达盒或载体，例如含有编码所述mRNA的质粒，以用来贮存所述mRNA的序列信息，或用于克隆所述DNA分子或表达DNA分子编码的蛋白；所述生物材料还可以为含有上述mRNA和/或DNA分子的微生物和/或细胞，以表达所述mRNA或DNA编码的蛋白，或实现DNA分子的克隆。所述DNA的核苷酸序列可以是优选如SEQ ID NO:6所示。
此外，本发明还提供了一种治疗和/或预防SARS-CoV-2病毒感染或SARS-CoV-2病毒感染所致疾病的方法，其包括(例如向个体受试者)施用如本发明第一方面所述的分离的mRNA、如本发明第二方面所述的DNA、如本发明第五方面所述的组合物、如本发明第六方面所述的脂质体纳米颗粒、如本发明第七方面所述的mRNA疫苗、如本发明第八方面所述的药物组合物和/或如本发明第九方面所述的试剂盒。
此外，本发明还提供了如本发明第一方面所述的分离的mRNA、如本发明第二方面所述的DNA、如本发明第五方面所述的组合物、如本发明第六方面所述的脂质体纳米颗粒、如本发明第七方面所述的mRNA疫苗、如本发明第八方面所述的药物组合物和/或如本发明第九方面所述的试剂盒在治疗和/或预防SARS-CoV-2病毒感染或SARS-CoV-2病毒感染所致疾病中的应用。
此外，本发明还提供了一种在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括对所述受试者施用如本发明第一方面所述的分离的mRNA、如本发明第二方面所述的DNA、如本发明第五方面所述的组合物、如本发明第六方面所述的脂质体纳米颗粒、如本发明第七方面所述的mRNA疫苗、如本发明第八方面所述的药物组合物和/或如本发明第九方面所述的试剂盒的步骤。较佳地，其中所述施用步骤可为本领域常规，例如可以为肌内施用，皮下施用，皮内施用，鼻内、阴道内或直肠内施用，局部施用等。
本发明中，所述“免疫原性片段”是指当施用于受试者时具有免疫原性并引起保护性免疫应答的蛋白质的一部分。在一个实施例中，所述的“免疫原性”或“免疫原性的”是指当蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体施用于动物时，蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体在动物体内引起免疫应答的先天能力。因此，在一个实施例中，“免疫原性”有所增强，通常是指当蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体施用于动物时，增加蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体在动物体内引起免疫应答的能力。在一个实施例中，蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体引起免疫应答的能力的增加可以通过针对蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体的更大数量的抗体，针对抗原或生物体的多样性更大的抗体，对蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体具有特异性的更大数量的T细胞，对蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体具有更强的细胞毒性或辅助T细胞应答等来测量。在一个实施例中，免疫原性片段也是抗原性的。在另一个实施例中，“抗原性”是指能够与免疫系统的抗原识别分子例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体特异性相互作用的片段。在另一个实施例中，抗原性片段包含至少约8个氨基酸(AA)的表位。具有抗原性的分子本身不必具有免疫原性，即能够在没有载体的情况下引发免疫应答。
本发明中，所述“变体”是指与群体的大部分不同但仍与常见模式足够相似以被视为其中一种例如剪接变体的氨基酸或核酸序列(或在其他实施例中为生物体或组织)。在一个实施例中，变体可以是序列保守变体，而在另一实施例中，变体可以是功能性保守变体。在一个实施例中，变体可以包含一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。
本发明中，所述“包括或包含”可以是指除了包括后面所列举的成分，还存在其他成分；也可以是指“由……组成”，即只包括后面所列举的成分而不存在其他成分。
本发明中，所述的“一种或多种”通常可以是指一种、两种、三种或更多种。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的经过密码子优化后或者进一步经过修饰所得的mRNA在细胞中可以高表达；从而可以获得分子水平精准设计的类似于完全加工成熟的mRNA分子产品；不仅经济高效，而且所述mRNA更加安全、高效，结构更加稳定，蛋白表达效率更高，能够持续地表达新冠病毒S1蛋白。将本发明的mRNA制备成脂质体纳米颗粒/疫苗时，可以实现使用极小剂量就能达到足够的保护效果，且免疫原性有所降低，同时能够激活机体免疫系统产生体液免疫和细胞免疫。将本发明的mRNA制备成疫苗时，成本较低、生产周期短，有利于大规模工业生产。
附图说明
图1为实施例2中SARS-CoV-2mRNA转染细胞的S1蛋白表达水平。
图2为实施例3中SARS-CoV-2mRNA转染细胞的S1蛋白表达水平。
图3为实施例4中SARS-CoV-2mRNA转染细胞的S1蛋白表达水平。
图4为实施例5中SARS-CoV-2mRNA转染细胞的S1蛋白表达水平。
图5为实施例7中mRNA-3疫苗免疫组小鼠血清抗SARS-COV-2IgG抗体效价(以上数值均为两复孔的平均值)。
图6为实施例7中mRNA-3疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ酶联免疫斑点分析(以上数值均为两复孔的平均值)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1新型冠状病毒SARS-CoV-2mRNA的ORF序列优化
本实施例从四个公开的数据来源(CNGBdb/GenBank/Genome Warehouse/GISAID)收集到69株全基因组数据，其中有10株来源GenBank的数据可同时获取到其蛋白序列，其余59株只有全基因组数据，使用病毒基因组ORF阅读器VIGOR对基因组序列进行注释，得到其余59株的S蛋白序列。VIGOR(病毒基因组ORF阅读器)是一种用于在流感病毒、轮状病毒、鼻病毒和冠状病毒亚型中进行基因预测的网络应用工具。VIGOR基于序列相似性搜索来检测蛋白质编码区，并且可以准确地检测基因组特定特征，例如移码、重叠基因、嵌入基因，并可以在单个多肽开放阅读框内预测成熟的肽段。该程序内置了针对流感和轮状病毒的基因分型功能。对于测试的RNA病毒基因组，VIGOR的特异性和敏感性大于99％。
Clustal Omega是一款新的多序列比对程序，它使用种子引导树和HMM轮廓图技术来生成三个或更多序列之间的比对。采用Clustal Omerga在线工具对69株S蛋白序列进行多序列比对分析，发现69株中的6株(8.70％)S蛋白S1序列共存在3个多态性位点，且多态性频率最高不超过4.35％，表明S蛋白S1序列的保守性高。因此，后续分析使用S蛋白(序列长度1273个氨基酸)保守性最高的其中一株病毒株(GenBank:MN908947)为基础进行抗原表位预测与疫苗的设计。
随着疫情全球爆发，公共数据库积累了越来越多的SARS-CoV-2全基因组序列，持续从公共数据库收集了411株新型冠状病毒SARS-CoV-2的全基因组序列，病毒株采集地点包括中国、东亚、美国、澳大利亚和欧洲，采集日期从2019年12月23日到2020年03月24日。411株新型冠状病毒SARS-CoV-2的全基因组序列，其中来源GenBank的数据可同时获取到其蛋白序列，其余全基因组序列经VIGOR工具进行基因组注释，Clustal Omega进行多序列比对，发现119株(28.95％)新型冠状病毒2019-nCOV的S蛋白S1序列共存在27个多态性位点，且只有1个位点的多态性频率为20.19％，其余位点的多态性频率均不超过1.22％，进一步说明S蛋白S1序列的保守性高。截止2020年04月15日，国家生物信息中心2019新型冠状病毒信息库基于5554条高质量人源新冠病毒全基因组序列变异分析，所有统计基于与2019-nCoV(MN908947)序列的比较分析鉴定，S蛋白S1序列的氨基酸变化位点为145个，且只有1个位点的变异频率为58.12％，其余位点的变异频率均不超过0.59％，说明选择MN908947的S蛋白S1序列作为该核酸疫苗的ORF，保守性高，可以覆盖38.84％的病毒株。
因此，确定SARS-CoV-2的S1蛋白所对应的基因序列为本发明核酸疫苗mRNA的ORF，序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例2新型冠状病毒SARS-CoV-2mRNA的3’UTR序列优化
本实施例中的SARS-CoV-2mRNA的3’UTR序列优化方案如表1所示，具体如下：
SARS-CoV-2mRNA序列关键元件是采用本领域常规的双酶法Cap1(利用牛痘病毒加帽酶及其他组份，将7-甲基鸟苷帽结构(Cap 0)加到RNA的5’末端，然后使用2’-O-甲基转移酶和SAM上的甲基转移至Cap0上形成Cap1)、人核糖体蛋白L32(PRL32)的部分5’UTR序列(序列如SEQ ID NO:3所示：5’-GGGGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATCAAGCTTACC-3’)、ORF为上述GenBank为MN908947的毒株基因组序列中编码S1蛋白的基因序列(如SEQ IDNO:1所示)和polyA序列(120个A，在质粒上提前加尾)。区别在于SARS-CoV-2-A mRNA采用人β珠蛋白(HBB)的3’UTR序列(序列如SEQ ID NO:4所示：5’-GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC-3’)，SARS-CoV-2-B mRNA采用人α珠蛋白(HBA)的3’UTR序列(序列如SEQ ID NO:7所示：TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC)。
表1 SARS-CoV-2mRNA疫苗的3’UTR的优化设计
Figure BDA0002745199660000161
体外转录工艺制备出来的上述SARS-CoV-2-A mRNA和SARS-CoV-2-B mRNA分别瞬时转染HEK 293T细胞，并用合适的抗S1蛋白抗体(义翘神州)染色，用FITC偶联的二级抗体(Alpha Diagnostic International)进行复染。转染后24小时，HEK 293T细胞用合适的抗S1蛋白抗体和用FITC偶联的二级抗体(1:500)染色，然后用流式细胞术(FACS)在BeckMan-CytoFLEX上使用进行分析。结果如图1所示(其中wfi组为空白对照，注射的注射用水)。
从图中结果可以看出，两组的S1蛋白表达量均较高，其中，SARS-CoV-2-B mRNA转染组转染细胞中的S1蛋白表达量高于SARS-CoV-2-A mRNA转染组(SARS-CoV-2-B mRNA转染组的表达量约为SARS-CoV-2-A mRNA转染组的1.5倍)，可见人β珠蛋白3’UTR序列比该人α珠蛋白3’UTR序列更有助于提高蛋白表达量。因此，确定人β珠蛋白3’UTR序列为本发明后续实验中优选的3’UTR。
实施例3新型冠状病毒SARS-CoV-2mRNA的Poly(A)的优化
本实施例中的SARS-CoV-2mRNA的序列优化方案如表2所示，具体如下：
SARS-CoV-2mRNA序列关键元件是采用双酶法Cap1、人核糖体蛋白L32(PRL32)的部分5’UTR序列、ORF为上述GenBank为MN908947的毒株基因组序列中编码S1蛋白的基因序列(如SEQ ID NO:1所示)、人β珠蛋白(HBB)3’UTR序列。
SARS-CoV-2-C和SARS-CoV-2-D的序列部分是一样的，区别在于SARS-CoV-2-CmRNA采用在pcDNA 3.1(+)质粒上提前加尾120A的方式，SARS-CoV-2-D mRNA采用体外酶促加尾120A的方式。SARS-CoV-2-C与SARS-CoV-2-E、SARS-CoV-2-F的除polyA外其他序列部分一样，也同样采用质粒上提前加尾的，区别在于polyA的数量分别为120A、50A和16A。
表2 SARS-CoV-2mRNA疫苗Poly(A)的优化设计
Figure BDA0002745199660000171
体外转录工艺制备出来的上述SARS-CoV-2-C mRNA、SARS-CoV-2-D mRNA、SARS-CoV-2-E mRNA和SARS-CoV-2-F mRNA分别瞬时转染HEK 293T细胞，并用合适的抗S1蛋白抗体(义翘神州)染色，用FITC偶联的二级抗体(Alpha Diagnostic International)进行复染。转染后24小时，HEK 293T细胞用合适的抗S1蛋白抗体和用FITC偶联的二级抗体(1:500)染色，然后用流式细胞术(FACS)在BeckMan-CytoFLEX上使用进行分析。结果如图2所示。
从图中结果可以看出，上述几组的S1蛋白表达量都较对照组显著提高，其中，SARS-CoV-2-C mRNA转染组转染细胞中的S1蛋白表达量明显高于SARS-CoV-2-E mRNA转染组(约为其1.5倍)和SARS-CoV-2-F mRNA转染组(约为其3倍)，可见Poly(A)尾的长度对mRNA的影响更为显著。除此之外，SARS-CoV-2-C mRNA转染组转染细胞中的S1蛋白表达量高于SARS-CoV-2-D mRNA转染组(约为其2倍)，说明加尾的方式同样对mRNA有影响。综上考虑，本发明后续实验中优选质粒上提前加尾120A的方式。
实施例4新型冠状病毒SARS-CoV-2mRNA的信号肽的优化
本实施例中的SARS-CoV-2mRNA的序列优化方案如表3所示，具体如下：
SARS-CoV-2mRNA序列关键元件是采用双酶法Cap1、人核糖体蛋白L32(PRL32)的部分5’UTR序列、人β珠蛋白(HBB)3’UTR序列和质粒加尾120A。
SARS-CoV-2-G、SARS-CoV-2-H和SARS-CoV-2-I的其他序列是一样的，区别在于SARS-CoV-2-G mRNA、SARS-CoV-2-H和SARS-CoV-2-I分别在上述GenBank为MN908947的毒株基因组序列中编码S1蛋白基因前端分别加上了人IgE信号肽(序列如SEQ ID NO:5所示：MDWTWILFLVAAATRVHS)、人IgG信号肽(序列如SEQ ID NO:8所示：MGWSCIILFLVATATGVHS)和鼠IgK(序列如SEQ ID NO:9所示：METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)信号肽，得到三个不同的ORF，分别对应表3中的“ORF-1”、“ORF-2”和“ORF-3”。
表3 SARS-CoV-2mRNA疫苗信号肽的优化设计
Figure BDA0002745199660000181
体外转录工艺制备出来的上述SARS-CoV-2-G mRNA、SARS-CoV-2-H mRNA和SARS-CoV-2-I mRNA分别瞬时转染HEK 293T细胞，并用合适的抗S1蛋白抗体(义翘神州)染色，用FITC偶联的二级抗体(Alpha Diagnostic International)进行复染。转染后24小时，HEK293T细胞用合适的抗S1蛋白抗体和用FITC偶联的二级抗体(1:500)染色，然后用流式细胞术(FACS)在BeckMan-CytoFLEX上使用进行分析。结果如图3所示。
从图中结果可以看出，上述几组的S1蛋白表达量都较对照组显著提高，其中，SARS-CoV-2-G mRNA转染组转染细胞中的S1蛋白表达量要高于SARS-CoV-2-H mRNA转染组(约为其2倍)和SARS-CoV-2-I mRNA转染组(约为其1.5倍)，可见使用人IgE信号肽比人IgG信号肽和鼠IgK信号肽更能提高蛋白表达量，因此本发明选择SARS-CoV-2-G作为后续实验mRNA疫苗的mRNA序列的来源，SARS-CoV-2-G的序列为如SEQ ID NO:6所示的DNA序列。
实施例5新型冠状病毒SARS-CoV-2mRNA的体外转录底物的优化
本实施例中的SARS-CoV-2mRNA来自于实施例3中优化得到的序列SARS-CoV-2-G，序列为SEQ ID NO:6，将其(序列SEQ ID NO:6后面还包括酶切位点AGAAGAGC)从载体上的T7启动子转录起始位点转录下来的mRNA的序列如SEQ ID NO:10所示。
选择三种人工修饰转录底物核苷酸替换传统的底物NTP，即N1-甲基假尿苷(m1ΨTP)、假尿苷(Ψ)、5-甲基尿苷(m5U)(兆维科)分别对应SARS-CoV-2-G1、SARS-CoV-2-G2和SARS-CoV-2-G3，对照采用传统底物NTP，为SARS-CoV-2-G4。
体外转录工艺制备出来的上述SARS-CoV-2-G1 mRNA、SARS-CoV-2-G2 mRNA、SARS-CoV-2-G3和SARS-CoV-2-G4的mRNA分别瞬时转染HEK 293T细胞，并用合适的抗S1蛋白抗体(义翘神州)染色，用FITC偶联的二级抗体(Alpha Diagnostic International)进行复染。转染后24小时，HEK 293T细胞用合适的抗S1蛋白抗体和用FITC偶联的二级抗体(1:500)染色，然后用流式细胞术(FACS)在BeckMan-CytoFLEX上使用进行分析。结果如图4所示。
从图中结果可以看出，SARS-CoV-2-G1 mRNA、SARS-CoV-2-G2 mRNA和SARS-CoV-2-G3 mRNA转染组转染细胞中的S1蛋白表达量均高于SARS-CoV-2-G4转染组，可见使用人工修饰转录底物核苷酸替换传统的底物NTP可以提高蛋白表达量。进一步地，SARS-CoV-2-G1mRNA转染组的S1蛋白表达量最高，说明N1-甲基假尿苷(m1ΨTP)的效果最好，因此后续实验中选择N1-甲基假尿苷(m1ΨTP)替换传统转录底物核苷酸NTP。
实施例6新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸疫苗的制备方法
将实施例5中的SARS-CoV-2-G1体外转录纯化得到的mRNA溶解于pH6.8-7.4的PBS缓冲液，此为水相。
表4 SARS-CoV-2mRNA疫苗LNP脂质体递送系统的优化设计
Figure BDA0002745199660000191
Figure BDA0002745199660000201
将LNP脂质体递送系统的四种组分按照上述表4中的摩尔百分比溶于无水乙醇，此为有机相。
采用微流体混合仪，以10mL/min的流速将有机相与水相按1:5的体积比混合，混合后除去溶液中的乙醇并浓缩mRNA浓度至0.5mg/mL，最终得到包裹SARS-CoV-2-G1 mRNA的脂质体纳米颗粒，其中LNP：mRNA(w/w)＝15:1，即为新型冠状病毒SARS-CoV-2mRNA核酸疫苗。检测粒径、PDI、包封率和入胞率，实验组A～G和组H(参考Corbett,Kizzmekia S.,et al."SARS-CoV-2mRNA Vaccine Development Enabled by Prototype PathogenPreparedness."bioRxiv(2020))的检测结果如表5所示。
表5不同组分LNP的粒径、PDI、包封率和入胞率检测结果
组别 粒径(nm) PDI 包封率(％) 入胞率(％)
A 105.47±4.06 0.071±0.06 39.9±5.58 82.17±3.66
B 63.30±5.42 0.068±0.02 20.8±5.47 77.56±4.30
C 86.11±1.28 0.067±0.03 90.3±3.01 92.51±2.52
D 74.81±1.99 0.065±0.05 92.4±3.73 87.39±4.58
E 90.34±9.89 0.109±0.05 83.4±4.14 88.93±3.38
F 81.39±7.03 0.191±0.04 87.6±4.86 90.93±3.03
G 85.83±1.90 0.296±0.07 32.9±5.74 77.28±2.26
H 80.20±5.52 0.209±0.08 91.4±3.21 87.66±3.64
从表5可以看出，阳离子脂质的含量对LNP的粒径大小有一些影响，适量DSPC辅助脂质的加入可以提高纳米脂质体颗粒的包封率和入胞率，综合考虑纳米脂质体颗粒的粒径、PDI、包封率和入胞率发现，上述所有组的表现均较好，其中C组的综合表现相对最好，因此选择C组的组分配比作为本mRNA疫苗的LNP纳米脂质体递送系统。
实施例7中和抗体滴度测定
mRNA选用实例5中的SARS-CoV-2-G1 mRNA进行小鼠免疫实验，疫苗载体按照实施例6中的配方制备。24只(雌雄各半)健康的BALB/c小鼠(南京集萃药康)随机分成4组，每组3雌3雄。同6只人源化ACE2小鼠(南京集萃药康)组成的一组作为试验系统。对照组注射市售PBS，BALB/c实验组分别免疫mRNA-3 10μg/只、mRNA-330μg/只、mRNA-3 100μg/只，如表6所示。
表6小鼠免疫原性实验分组及给药设计表
Figure BDA0002745199660000211
免疫实验共3次，均为小鼠后肢肌肉注射，每间隔3周免疫一次。第一次免疫为D1，在D18和D36异氟烷麻醉后从眼眶静脉取血，D57异氟烷麻醉后腹主动脉取血，分离血清。为监测每次免疫后疫苗组小鼠血清抗体的消长情况，采用间接ELISA法测定D18，D36，D57血清抗SARS-CoV-2IgG抗体效价，结果如图5所示：
结果表明，在D18可以检测到一定程度的小鼠免疫血清抗SARS-CoV-2IgG抗体，并且抗体效价与剂量高低有正相关关系。在D36、D57可以看到抗体水平随免疫次数的增加以及时间的延长逐渐升高。第三次免疫后，在100μg/只的高剂量组小鼠免疫血清抗SARS-CoV-2IgG抗体效价最高可达1:1479。
于D57实验终点，疫苗免疫组和对照组小鼠各3只，分离小鼠脾脏细胞，以SARS-CoV-2的S1蛋白作为特异性刺激物进行IFN-γELISpot检测，以刺激物存在时的SFU数与无刺激物时的SFU数的差值作图，结果如图6所示：
结果表明，经SARS-CoV-2的S1蛋白特异性抗原刺激后，疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌IFN-γ斑点形成细胞的数量均高于对照组，并且随着剂量增加表现出升高。进一步地，结果表明本mRNA疫苗可以有效激活小鼠免疫系统产生体液免疫和细胞免疫，产生大量中和抗体，显示出良好的安全性、有效性和长效性。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳吉诺因生物科技有限公司
<120> 一种mRNA及包含其的新型冠状病毒mRNA疫苗
<130> P20013130C
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1983
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gag 1983
<210> 2
<211> 661
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu
660
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人核糖体蛋白L32（PRL32）的部分5’UTR序列
<400> 3
ggggcgctgc ctacggaggt ggcagccatc tccttctcgg catcaagctt acc 53
<210> 4
<211> 132
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人β珠蛋白（HBB）3’UTR序列
<400> 4
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120
tattttcatt gc 132
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人 IgE信号肽
<400> 5
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser
<210> 6
<211> 2312
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 mRNA疫苗的完整核苷酸序列经密码子优化后的序列
<400> 6
gctagcgggg cgctgcctac ggaggtggca gccatctcct tctcggcatc aagcttaccg 60
ccaccatgga ctggacatgg atcttgttcc tggtggccgc cgccacaaga gtgcacagcg 120
tgaacctgac caccagaacc cagctgcccc ccgcctacac aaatagcttc acaagaggcg 180
tgtactaccc cgacaaggtg ttcaggagct ccgtgctgca ctccacacag gatctgtttc 240
tgcctttctt ttccaatgtg acctggtttc acgccatcca cgtgtccggc accaatggca 300
ccaagagatt tgataatcct gtgctgcctt tcaacgatgg cgtgtacttc gccagcaccg 360
agaagtccaa tatcatcaga ggctggatct ttggcaccac actggacagc aagacccaga 420
gcctgctgat cgtgaacaat gccacaaacg tggtcattaa ggtgtgcgag ttccagtttt 480
gcaacgatcc tttcctgggc gtgtactatc acaagaacaa caagagctgg atggagagcg 540
agttcagagt gtactccagc gccaacaact gcacattcga gtacgtgagc cagccctttc 600
tgatggacct ggagggcaag cagggcaact ttaagaacct gagggagttc gtgtttaaga 660
atatcgatgg ctacttcaag atctactcca agcacacccc catcaatctg gtgagagacc 720
tgcctcaggg ctttagcgcc ctggagcctc tggtggatct gcccatcggc atcaatatca 780
caaggttcca gacactgctg gccctgcaca ggtcctacct gacacctggc gattcctcct 840
ccggctggac cgccggagcc gctgcttact acgtgggcta cctgcagcct aggaccttcc 900
tgctgaagta caatgagaac ggcaccatca cagatgccgt ggattgcgcc ctggaccctc 960
tgagcgagac caagtgcaca ctgaagtcct ttacagtgga gaagggcatc taccagacct 1020
ccaatttcag agtgcagcct acagagagca tcgtgagatt tcccaacatc accaacctgt 1080
gtccttttgg cgaggtgttc aatgccacca gattcgccag cgtgtacgcc tggaacagga 1140
agaggatctc caactgtgtg gccgattaca gcgtgctgta caatagcgcc agcttctcca 1200
ccttcaagtg ctacggcgtg agccctacca agctgaatga cctgtgcttc accaatgtgt 1260
acgccgactc cttcgtgatc agaggcgacg aggtgaggca gatcgccccc ggacagaccg 1320
gcaagatcgc cgattacaac tacaagctgc ctgatgattt caccggctgt gtgatcgcct 1380
ggaactccaa taatctggac agcaaagtgg gcggcaatta caattacctg tacagactgt 1440
tcaggaagtc caatctgaag cctttcgaga gggatatctc caccgagatc taccaggccg 1500
gctccacccc ttgcaatggc gtggagggct tcaactgcta cttccctctg cagagctacg 1560
gcttccagcc cacaaatggc gtgggctacc agccctacag agtggtggtg ctgtccttcg 1620
agctgctgca cgcccccgcc acagtgtgtg gcccaaagaa gtccaccaat ctggtgaaga 1680
ataagtgtgt gaactttaac ttcaacggcc tgaccggcac aggcgtgctg accgagagca 1740
acaagaagtt tctgcctttt cagcagtttg gcagagacat cgccgacacc accgatgccg 1800
tgagggaccc tcagacactg gagatcctgg acatcacccc ctgttccttt ggcggcgtga 1860
gcgtgatcac acccggcaca aatacctcca accaggtggc cgtgctgtac caggatgtga 1920
attgtacaga ggtgcccgtg gccatccacg ccgatcagct gacccctaca tggagagtgt 1980
acagcaccgg cagcaatgtg ttccagacaa gagccggctg cctgatcggc gccgagcacg 2040
ttaacaattc ctacgagtga gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt 2100
tgttccctaa gtccaactac taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat 2160
tctgcctaat aaaaaacatt tattttcatt gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2312
<210> 7
<211> 119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> α珠蛋白的3'UTR序列
<400> 7
tgataatagg ctggagcctc ggtggccatg cttcttgccc cttgggcctc cccccagccc 60
ctcctcccct tcctgcaccc gtacccccgt ggtctttgaa taaagtctga gtgggcggc 119
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人IgG信号肽
<400> 8
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 小鼠IgK信号肽
<400> 9
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 10
<211> 2327
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 经修饰后的mRNA
<400> 10
gggagaccca agcuggcuag cggggcgcug ccuacggagg uggcagccau cuccuucucg 60
gcaucaagcu uaccgccacc auggacugga cauggaucuu guuccuggug gccgccgcca 120
caagagugca cagcgugaac cugaccacca gaacccagcu gccccccgcc uacacaaaua 180
gcuucacaag aggcguguac uaccccgaca agguguucag gagcuccgug cugcacucca 240
cacaggaucu guuucugccu uucuuuucca augugaccug guuucacgcc auccacgugu 300
ccggcaccaa uggcaccaag agauuugaua auccugugcu gccuuucaac gauggcgugu 360
acuucgccag caccgagaag uccaauauca ucagaggcug gaucuuuggc accacacugg 420
acagcaagac ccagagccug cugaucguga acaaugccac aaacgugguc auuaaggugu 480
gcgaguucca guuuugcaac gauccuuucc ugggcgugua cuaucacaag aacaacaaga 540
gcuggaugga gagcgaguuc agaguguacu ccagcgccaa caacugcaca uucgaguacg 600
ugagccagcc cuuucugaug gaccuggagg gcaagcaggg caacuuuaag aaccugaggg 660
aguucguguu uaagaauauc gauggcuacu ucaagaucua cuccaagcac acccccauca 720
aucuggugag agaccugccu cagggcuuua gcgcccugga gccucuggug gaucugccca 780
ucggcaucaa uaucacaagg uuccagacac ugcuggcccu gcacaggucc uaccugacac 840
cuggcgauuc cuccuccggc uggaccgccg gagccgcugc uuacuacgug ggcuaccugc 900
agccuaggac cuuccugcug aaguacaaug agaacggcac caucacagau gccguggauu 960
gcgcccugga cccucugagc gagaccaagu gcacacugaa guccuuuaca guggagaagg 1020
gcaucuacca gaccuccaau uucagagugc agccuacaga gagcaucgug agauuuccca 1080
acaucaccaa ccuguguccu uuuggcgagg uguucaaugc caccagauuc gccagcgugu 1140
acgccuggaa caggaagagg aucuccaacu guguggccga uuacagcgug cuguacaaua 1200
gcgccagcuu cuccaccuuc aagugcuacg gcgugagccc uaccaagcug aaugaccugu 1260
gcuucaccaa uguguacgcc gacuccuucg ugaucagagg cgacgaggug aggcagaucg 1320
cccccggaca gaccggcaag aucgccgauu acaacuacaa gcugccugau gauuucaccg 1380
gcugugugau cgccuggaac uccaauaauc uggacagcaa agugggcggc aauuacaauu 1440
accuguacag acuguucagg aaguccaauc ugaagccuuu cgagagggau aucuccaccg 1500
agaucuacca ggccggcucc accccuugca auggcgugga gggcuucaac ugcuacuucc 1560
cucugcagag cuacggcuuc cagcccacaa auggcguggg cuaccagccc uacagagugg 1620
uggugcuguc cuucgagcug cugcacgccc ccgccacagu guguggccca aagaagucca 1680
ccaaucuggu gaagaauaag ugugugaacu uuaacuucaa cggccugacc ggcacaggcg 1740
ugcugaccga gagcaacaag aaguuucugc cuuuucagca guuuggcaga gacaucgccg 1800
acaccaccga ugccgugagg gacccucaga cacuggagau ccuggacauc acccccuguu 1860
ccuuuggcgg cgugagcgug aucacacccg gcacaaauac cuccaaccag guggccgugc 1920
uguaccagga ugugaauugu acagaggugc ccguggccau ccacgccgau cagcugaccc 1980
cuacauggag aguguacagc accggcagca auguguucca gacaagagcc ggcugccuga 2040
ucggcgccga gcacguuaac aauuccuacg agugagcucg cuuucuugcu guccaauuuc 2100
uauuaaaggu uccuuuguuc ccuaagucca acuacuaaac ugggggauau uaugaagggc 2160
cuugagcauc uggauucugc cuaauaaaaa acauuuauuu ucauugcaaa aaaaaaaaaa 2220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2327

Claims (11)

1.一种分离的mRNA，其包括编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA，其中，所述S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述分离的mRNA还包括以下(a)～(d)中的一种或多种：
(a)5’-帽结构，优选为CAP 0型、CAP I型或CAP II型的帽结构；所述CAP 0型的帽结构优选为7-甲基鸟苷帽结构，所述CAP I型的帽结构优选为N7mGpppAm；
(b)3’-聚腺苷酸，其序列优选为包含16-150个腺苷核苷酸的序列，更优选包含50-120个腺苷核苷酸的序列；
(c)5’-UTR，所述5’-UTR优选为核糖体蛋白L32的5’-UTR，例如为人核糖体蛋白L32的5’-UTR，其序列优选如SEQ ID NO:3所示；
(d)3’-UTR，所述3’-UTR的序列优选为β珠蛋白的3’-UTR和α珠蛋白的3’-UTR，例如为人β珠蛋白的3’-UTR和人α珠蛋白的3’-UTR，其序列优选如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示；
较佳地：
所述的3’-聚腺苷酸通过体外酶促反应添加到所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA上，或者通过将其连接到包含所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA的转录模板DNA之后进行转录。
2.如权利要求1所述的分离的mRNA，其特征在于，其进一步包含以下(e)～(f)中的一种或两种：
(e)信号肽，所述信号肽优选为人IgE信号肽、人IgG信号肽或小鼠IgK信号肽；所述人IgE信号肽的序列优选如SEQ ID NO:5所示；所述人IgG信号肽的序列优选如SEQ ID NO:8所示；所述小鼠IgK信号肽的序列优选如SEQ ID NO:9所示；
(f)多核苷酸修饰，所述多核苷酸优选自N1-甲基假尿苷、假尿苷和5-甲基尿苷中的一种或多种；
较佳地：
所述的分离的mRNA，任选地从5’末端到3’末端，选自以下组：
(1)包括CAPI型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA、人α珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸；
(2)包括CAPI型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸；
(3)包括CAPI型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA、人β珠蛋白的3’-UTR和包含50个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸；
(4)包括CAPI型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA、人β珠蛋白的3’-UTR和包含16个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸；
(5)包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、人IgE信号肽、所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸；
(6)包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、人IgG信号肽、所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸；
(7)包括CAP I型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、鼠IgK信号肽、所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸；
(8)包括CAPI型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸，且经N1-甲基假尿苷的修饰；
(9)包括CAPI型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸，且经假尿苷的修饰；
(10)包括CAPI型的帽结构、人核糖体蛋白L32的5’-UTR、所述编码来源于SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的mRNA、人β珠蛋白的3’-UTR和包含120个腺苷核苷酸的3’-聚腺苷酸，且经5-甲基尿苷的修饰；
更佳地，所述分离的mRNA的序列如SEQ ID NO:10所示。
3.一种分离的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有如权利要求1或2所述的分离的mRNA、或、如权利要求3所述的DNA；
较佳地：
所述重组表达载体的骨架载体为pAAV-MCS、pcDNA 3.1(+)、pCMV-MCS、pEGFP-CTSB或pLVX-PAX1；和/或，所述重组表达载体的启动子为Lac乳糖操纵子、TAC启动子、TRC启动子或T7启动子。
5.一种转化体，其特征在于，在宿主中导入如权利要求1或2所述的分离的mRNA、如权利要求3所述的DNA、或、如权利要求4所述的重组表达载体；
较佳地，所述转化体的宿主细胞为原核细胞和/或真核细胞，优选为分离的哺乳动物细胞，更优选为哺乳动物受试者的细胞，进一步优选为哺乳动物受试者的分离的细胞，最优选为人受试者的分离的细胞。
6.一种组合物，其包含如权利要求1或2所述的分离的mRNA和/或如权利要求3所述的DNA。
7.一种脂质体纳米颗粒，其包含如权利要求1或2所述的分离mRNA、如权利要求3所述的DNA、和/或如权利要求6所述的组合物；
较佳地：
所述脂质体纳米颗粒为长循环阳离子脂质体纳米颗粒，优选为经PEG或其衍生物修饰的长循环阳离子脂质体纳米颗粒；所述PEG的相对分子质量优选为2000～5000，例如为2000、3000、4000或5000；
更佳地：
所述脂质体纳米颗粒还包括脂质体递送系统，其优选包括阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂，更优选包括20％～70％的阳离子脂质、10％～65％的结构脂质、5％～25％的辅助脂质和1％～10％的表面活性剂；
进一步更佳地：
所述阳离子脂质优选自DODAC、DDAB、DODMA、Dlin-DAC、Dlin-KC2-DMA和Dlin-MC3-DMA中的一种或多种，更优选自Dlin-KC2-DMA和Dlin-MC3-DMA中的一种或两种，最优选为Dlin-MC3-DMA；其摩尔百分比优选为30％～60％，更优选为45％～55％，例如50％；
和/或，所述结构脂质优选自胆固醇、胆固醇酯、固醇类激素、固醇类维生素和植物甾醇中的一种或多种，更优选自胆固醇、胆固醇酯和植物甾醇中的一种或多种，最优选为胆固醇；其摩尔百分比优选为15％～50％，例如23％、28％、30％、33％、35％、38.5％、40％或48％；
和/或，所述辅助脂质优选自DSPC、DOPC、DPPG、DOPS和DOPE中的一种或多种，更优选为DSPC和/或DOPS，最优选为DSPC；其摩尔百分比优选为10％～20％，例如13％或15％；
和/或，所述表面活性剂优选自DAG-PEG、DAA-PEG、DMG-PEG、Cer-PEG和DSPE-PEG中的一种或多种，更优选为PEG-DMG；其摩尔百分比优选为1％～5％；更优选为1％～3％，例如为1.5％或2％；
和/或，所述脂质体递送系统与所述mRNA、所述DNA和/或所述组合物的质量比为(5-30):1，优选为(10-20):1；例如15:1。
8.一种mRNA疫苗，其特征在于，其包含如权利要求1或2所述的分离的mRNA、如权利要求3所述的DNA、如权利要求6所述的组合物和/或如权利要求7所述的脂质体纳米颗粒；
较佳地，所述mRNA疫苗还包括佐剂。
9.一种药物组合物，其包含如权利要求1或2所述的分离的mRNA、如权利要求3所述的DNA、如权利要求6所述的组合物、如权利要求7所述的脂质体纳米颗粒和/或如权利要求8所述的mRNA疫苗，和任选地药学上可接受的载体。
10.一种试剂盒，其包含如权利要求1或2所述的分离的mRNA、如权利要求3所述的DNA、如权利要求6所述的组合物、如权利要求7所述的脂质体纳米颗粒、如权利要求8所述的mRNA疫苗和/或如权利要求9所述的药物组合物；
较佳地，所述试剂盒还包含：使用说明、用于转染的细胞、辅剂、施用所述药物组合物的工具、药学可接受的载体和/或用于溶解或稀释所述mRNA、所述DNA、所述组合物、所述脂质体纳米颗粒、所述疫苗或所述药物组合物的药学可接受的溶液。
11.如权利要求1或2所述的分离的mRNA、如权利要求3所述的DNA、如权利要求6所述的组合物、如权利要求7所述的脂质体纳米颗粒、如权利要求8所述的mRNA疫苗和/或如权利要求9所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染或SARS-CoV-2病毒感染所致疾病的药物中的应用。
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