CN114381384B

CN114381384B - 一种提高安普霉素发酵单位的种子培养基及其应用

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Publication number: CN114381384B
Application number: CN202011137283.6A
Authority: CN
Inventors: 李继安; 林惠敏; 郭瑞玲; 孟宪纬; 张建斌; 李亚军; 詹佳弘; 杨子艳; 赵明芳; 袁笑端
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: CN114381384A

Abstract

本发明公开了一种提高安普霉素发酵单位的种子培养基及其用途。所述种子培养基包括：(1)3％碳源，所述碳源包括葡萄糖和玉米淀粉；(2)1.4～3.9％氮源，所述氮源除包括花生粉外，还包括酵母膏、蛋白胨、热榨豆粉和/或酵母粉YP200中的一种或多种；和(3)0.1～0.28％无机盐，所述无机盐包括碳酸钙，且余量为水，所述％为占发酵培养基的质量体积百分比g/100mL。所述种子培养基能够改善培养过程中菌丝易断裂的现象，使菌丝形态变得粗壮而连续，使发酵产量由3.02g/L提升到至少5.42g/L。

Description

一种提高安普霉素发酵单位的种子培养基及其应用

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，涉及一种提高安普霉素发酵单位的种子培养基及其应用。

背景技术

安普霉素是一种广泛应用的广谱抗生素，安普霉素在培养过程中，摇瓶种子中菌丝体极易断裂成片段，直接影响了最终发酵产量。目前提高安普霉素的方法主要是进行菌种的基因工程改造及菌种选育，但效果并不明显。

洪文荣等(洪文荣,郭养浩,孟春,等.暗霉素产生菌F-211发酵工艺完善的研究[J].中国药科大学学报,2000,31(1):61-65)通过孢子直接接种和空气搅拌得到生长良好的菌丝，有效提高安普霉素的发酵单位，但总发酵效价最高也仅为3.8g/L。

孙桂梅等(孙桂梅.安普霉素的菌种选育[D].吉林大学,2006)使用的基础培养基为：G 2.0％、G10 0.5％、WS 4.0％、SBP 5.0％、PCP 2.0％、SA 0.2％、MgSO₄ 0.2％、CaCO₃0.5％、DCA 0.03％，摇瓶种子采用二级种子摇瓶的方式进行培养，通过菌种选育使安普霉素发酵产量由最终效价达到4.9g/L。

发明内容

为解决现有技术中生产安普霉素的菌丝体易断裂且发酵效价较低的问题，本发明提供一种提高安普霉素发酵单位的种子培养基及其应用。本发明通过优化安普霉素的种子培养基配方，改善其培养过程中菌丝体易断裂的现象，使其菌丝形态由细碎的变为粗壮而连续，提高发酵效价。

为解决上述技术问题，本发明所提供技术方案之一为：一种种子培养基，所述种子培养基包括：

(1)3％碳源，所述碳源包括葡萄糖和玉米淀粉；

(2)1.4～3.9％氮源，所述氮源除包括花生粉外，还包括酵母膏、蛋白胨、、热榨豆粉和/或酵母粉YP200中的一种或多种；和

(3)0.1～0.28％无机盐，所述无机盐包括碳酸钙，还包括硫酸镁、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钾和硫酸钾中的一种或多种，

且余量为水，所述％为占发酵培养基的质量体积百分比g/100mL。

较佳地，所述碳源为1.0％葡萄糖和2.0％玉米淀粉。

较佳地，所述氮源选自以下组：

(1)花生粉、酵母膏和蛋白胨；

(2)花生粉、热榨豆粉和酵母粉YP200；

(3)花生粉和热榨豆粉；或

(4)花生粉和酵母粉YP200。

所述氮源选自组(1)，所述花生粉含量为1.0～3.5％、所述酵母膏含量为0.1％、所述蛋白胨含量为0.3％，安普霉素最终发酵效价为5.42～6.77g/L；所述氮源选自组(2)，所述花生粉含量为1.14％～1.7％、所述热榨豆粉含量为0.57％～1.13％、所述酵母粉YP200含量为0.57％～1.13％，安普霉素最终发酵效价为6.70～7.46g/L；所述氮源选自组(3)，所述花生粉含量为2.27％、所述热榨豆粉含量为1.13％，安普霉素最终发酵效价为6.97g/L；所述氮源选自组(4)，所述花生粉含量为2.27％、所述酵母粉YP200含量为1.13％，安普霉素最终发酵效价为6.80g/L，

优选地，所述氮源选自组(2)，氮源总含量为3.4％；最优选地，所述氮源为1.7％花生粉、1.13％热榨豆粉和0.57％酵母粉YP200，安普霉素最终发酵效价为7.46g/L。

较佳地，所述无机盐选自以下组：(1)碳酸钙、硫酸镁；(2)碳酸钙、氯化钠；(3)碳酸钙、氯化钾；(4)碳酸钙、硫酸钾；(5)碳酸钙、磷酸氢二钾；(6)碳酸钙、磷酸氢二钾和硫酸镁。

当所述无机盐选自组(1)～(4)中的一组时，该组中每种组分的含量均为0.1％，安普霉素最终发酵效价为7.50～7.97g/L；当所述无机盐为组(5)时，其中所述碳酸钙含量为0.1％、所述磷酸氢二钾含量为≤0.2％但不为0，安普霉素最终发酵效价为7.46～8.59g/L；当所述无机盐为组(6)时，其中所述碳酸钙含量为0.1％、所述磷酸氢二钾含量为0.1％、所述硫酸镁含量为≤0.08％但不为0，安普霉素最终发酵效价为8.59～8.93g/L；

优选地，所述无机盐为0.1％碳酸钙、0.1％磷酸氢二钾和0.08％硫酸镁，安普霉素最终发酵效价为8.93g/L。

所述培养基pH为7.0～7.4。

为解决上述技术问题，本发明所提供技术方案之二为：一种发酵生产安普霉素的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)在如权利要求1～6所述的种子培养基中培养，得种子液；

(2)将(1)制得的种子液按5～20％，优选10％比例加入发酵培养基中进行发酵，离心即得含安普霉素的发酵液；所述％为种子液占发酵培养基的体积百分比；

优选地，(1)中所述黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)为ATCC17920菌株。

较佳地，(1)中所述培养的条件为：37℃、200～240rpm震荡培养22～24个小时；和/或，(2)中所述发酵的条件为37℃、200～240rpm震荡培养6～7天，所述离心优选12000rpm。

较佳地，所述发酵培养基包括：葡萄糖4.0％，冷豆粉4.0％，海豚蛋白胨1.0％，氯化铵0.5％，硫酸镁0.4％，氯化锰0.03％，硫酸锌0.003％，硫酸亚铁0.005％，碳酸钙0.5％，豆油1.0％，余量为水，pH为7.0～7.1。

为解决上述技术问题，本发明所提供技术方案之三为：上述种子培养基在生产安普霉素中的用途。

本发明通过优化摇瓶种子培养基，改善了其培养过程中菌丝易断裂的现象，菌丝形态变得粗壮而连续，尤其是对培养基中的碳源和氮源进行优化后，明显改善了菌丝体的生长形态，发酵产量由3.02g/L提升至5.42～8.93g/L。在本发明一优选实施例中，安普霉素发酵效价提高196％，极大的降低了企业生产成本，具有重要的工业价值。

附图说明

图1为种子培养基优化前后菌丝形态对比图。左：种子培养基优化前，右：种子培养基优化后。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实验方法：

一、实验材料

1.仪器

仪器	型号	生产厂家
			Agilent 1200一体化液相色谱仪	G4290AA	安捷伦科技有限公司
电子天平	JA2003	上海天平仪器厂
			恒温培养箱	2020	SHELAB
高速离心机	AccuSpinFRM	BACKMAN
			超净工作台	TH-CB-103A	无锡净化设备厂
摇床	ZHWY-1112B	上海智成分析仪器公司
			光学显微镜	E100	尼康公司
超声清洗机	SB-5200D	宁波新芝生物科技
			立式压力蒸汽灭菌器	YXQ-LS-50S11	上海博迅实业有限公司

2.试剂

3.菌种

本发明可采用菌种黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)的菌株，例如保藏编号为ATCC 17920菌株，或其阻断突变株(武慧渊，安普霉素产生菌的研究，学位论文，沈阳药科大学，1998)。以下实施例使用了ATCC 17920菌株。

4.培养基

培养基一：斜面培养基(g/100mL)：可溶性淀粉2.0，牛肉膏0.1，磷酸氢二钾0.05，氯化钠0.05，硫酸镁0.05，硫酸亚铁0.001，硝酸钾0.1，琼脂粉1.4，余量为水，灭菌前pH7.2-7.4。

培养基二：基础种子培养基(g/100mL)：葡萄糖1.0，玉米粉0.5，冷豆粉1.0，酵母膏0.1，蛋白胨0.3，碳酸钙0.1，余量为水，pH自然。

培养基三：基础发酵培养基(g/100mL)：葡萄糖4.0，冷豆粉4.0，海豚蛋白胨1.0，氯化铵0.5，硫酸镁0.4，氯化锰0.03，硫酸锌0.003，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.5，豆油1.0，余量为水，灭菌前pH调至7.0-7.1。

二、方法

1.培养方法

灭菌条件：121℃，20min；

在无菌条件下，用已灭菌的接种针将保存有黑暗链霉菌的冻干管中接种到装有斜面培养基的茄子瓶中培养，斜面培养第四天可见表面白色菌体，第五天或者第六天，颜色加深，并看到白色孢子生成，继续培养直到可以看到培养基表面产生大量白色孢子，培养基基体本身由于黑暗链霉菌色素的产生变成灰褐色。此斜面可进行传代或者接种使用。

根据种子培养基配方配制种子培养基，无菌条件下，用灭菌接种铲轻轻划破长有孢子的斜面培养基，挖取尽量薄的1cm×2cm左右的长满孢子的斜面培养基，接种到已经灭好菌的种子培养基中，摇床37℃，240rpm，22-24个小时，摇瓶中培养物变成黄色浑浊物，摇之，有流动感，粘度较大，贴壁均匀滑下。镜检菌丝成团状，向四周发散，菌丝较长，无杂菌，pH 7.5-7.6。

根据摇瓶发酵培养基配方，配制发酵培养基，调pH 7.0-7.1，250mL锥形瓶装量35mL，灭菌。无菌条件接种10％，置于摇床37℃，240rpm，培养6-7天。发酵液12000rpm离心，取上清进行柱前衍生化后用高效液相色谱仪测发酵单位。

2.检测方法

1)流动相：水相0.5％醋酸溶液，有机相纯乙腈

2)液相条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(4.6mm×250mm，5μm)；

流速1.0mL/min；进样2μL；检测波长350nm；柱温30℃；梯度洗脱。

三、结果

文中所述％含量均为质量体积百分比g/100ml。

本发明最优化的种子培养基及其组分含量为葡萄糖1.0％，玉米淀粉2.0％，花生粉1.7％，热榨豆粉1.13％，酵母粉YP200 0.57％，硫酸镁0.08％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.1％，灭菌前pH7.2，余量为水。

实施例1种子培养基玉米粉的单一替代实验

以基础培养基配方为对照，在氮源、无机盐等成分保持不变的条件下，对玉米粉进行完全替代实验。摇瓶发酵6天，采用高效液相测发酵单位。

优化后的配方为：葡萄糖1.0％，玉米淀粉0.5％，冷豆粉1.0％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.3％，碳酸钙0.1％，余量为水。

实施例2种子培养基玉米淀粉含量实验

以上述实施例1优化后的培养基配方为对照，将玉米粉用玉米淀粉替代，在氮源、无机盐等其他成分保持不变的条件下，对玉米淀粉的用量进行考察。

摇瓶发酵6天，采用高效液相测发酵单位。

优化后的配方为：葡萄糖1.0％，玉米淀粉2.0％，冷豆粉1.0％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.3％，碳酸钙0.1％，余量为水。

实施例3种子培养基中冷豆粉的单一替代实验

以实施例2优化后的培养基配方为对照，在碳源、无机盐等其他成分保持不变的条件下，采用热榨豆粉、中温豆粉、豆粕、羽毛粉、花生粉、酵母膏等对冷豆粉进行完全替代，其中替代氮源用量均为1.0％，摇瓶发酵6天，采用高效液相测发酵单位。

根据以上实验的结果，花生粉的效果最好，优化后的配方为：葡萄糖1.0％，玉米淀粉2.0％，花生粉1.0％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.3％，碳酸钙0.1％，余量为水。

实施例4种子培养基中花生粉的用量实验

以实施例3优化后的培养基配方为对照，在碳源、无机盐等其他成分保持不变的条件下，对花生粉的用量进行考察。摇瓶发酵6天，采用高效液相测发酵单位。

根据以上实验的结果，花生粉含量1.0～3.5％效果都优于现有技术。其中最优化的配方为：葡萄糖1.0％，玉米淀粉2.0％，花生粉3.0％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.3％，碳酸钙0.1％，余量为水。

实施例5种子培养基中氮源不同配比实验

由于实验结果中热榨豆粉和酵母粉YP200也表现出了较好的效果，而原有配方中酵母膏和蛋白胨价格较贵，故保持总氮源为3.4％的前提下，直接用热榨豆粉和酵母粉YP200代替酵母膏和蛋白胨，并考察热榨豆粉、花生粉和酵母粉YP200三者的配比，设计了如下的实验摇瓶发酵6天，以实施例4中优化后的配方为对照，采用高效液相测发酵单位。

实验组号	对照	1	2	3	4	5	6
								效价(g/L)	6.77	6.82	6.97	6.80	7.46	6.70	5.01

根据以上实验的结果，上述氮源组合的效果均优于现有技术，其中最优化的配方为：葡萄糖1.0％，玉米淀粉2.0％，热榨豆粉1.13％、花生粉1.7％，酵母粉YP200 0.57％，碳酸钙0.1％，余量为水。

实施例6种子培养基中无机盐的添加实验

以实施例5优化后的培养基作为对照，进行无机盐以及微量元素添加实验，其他成分和用量保持不变，摇瓶发酵6天，高效液相测发酵效价。无机盐添加，用量均为0.1％。

根据以上实验的结果，添加硫酸镁、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钾或硫酸钾后效果均优于对照和现有技术，其中最优化的配方为：葡萄糖1.0％，玉米淀粉2.0％，热榨豆粉1.13％、花生粉1.7％，酵母粉YP200 0.57％，碳酸钙0.1％，磷酸氢二钾0.1％，余量为水。

实施例7种子培养基中磷酸氢二钾的添加实验

在无机盐的添加实验中，磷酸氢二钾表现出较好的发酵效果，因此以上述实施例5优化后的培养基为对照，考察磷酸氢二钾的添加量，摇瓶发酵6天，高效液相测发酵效价。

根据以上实验的结果，上述添加含量效果均优于现有技术，其中最优化的配方为：葡萄糖1.0％，玉米淀粉2.0％，热榨豆粉1.13％、花生粉1.7％，酵母粉YP200 0.57％，碳酸钙0.1％，磷酸氢二钾0.1％，余量为水。

实施例8种子培养基中硫酸镁的添加实验

在无机盐的替代实验中，硫酸镁也表现出较好的发酵效果，因此以上述实施例7优化后的培养基为对照，考察硫酸镁的添加量，摇瓶发酵6天，高效液相测发酵效价。

根据以上实验的结果，上述添加含量均优于现有技术，其中最优化配方为：葡萄糖1.0％，玉米淀粉2.0％，热榨豆粉1.13％、花生粉1.7％，酵母粉YP200 0.57％，碳酸钙0.1％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.08％，余量为水。

对比实施例

采用基础种子培养基(g/100mL)：葡萄糖1.0g，玉米粉0.5g，冷豆粉1.0g，酵母膏0.1g，蛋白胨0.3g，碳酸钙0.1g，水100ml，pH自然。摇瓶发酵6天，采用高效液相测发酵单位。得安普霉素发酵单位3.02g/L。

Claims

1.一种种子培养基，其特征在于，所述种子培养基包括：

(1)3％碳源，所述碳源为1.0％葡萄糖和2.0％玉米淀粉；

(2)3.4％氮源，所述氮源为1.7％花生粉、1.13％热榨豆粉和0.57％酵母粉YP200；

和，(3)0.28％无机盐，所述无机盐为0.1％碳酸钙、0.1％磷酸氢二钾和0.08％硫酸镁，且余量为水，所述％为占发酵培养基的质量体积百分比g/100mL。

2.如权利要求1所述的种子培养基，其特征在于，所述培养基的pH为7.2。

3.一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)菌株在如权利要求1或2所述的种子培养基中培养，得种子液；

(2)将(1)制得的种子液按5～20％比例加入发酵培养基中进行发酵，离心即得含安普霉素的发酵液；所述％为种子液占发酵培养基的体积百分比。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，(1)中所述黑暗链霉菌为ATCC 17920菌株；和/或，

(2)将(1)制得的种子液按10％比例加入发酵培养基中进行发酵，离心即得含安普霉素的发酵液。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，(1)中所述培养的条件为：37℃、200～240rpm震荡培养22～24个小时；和/或，(2)中所述发酵的条件为37℃、200～240rpm震荡培养6～7天。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述离心为12000rpm。

7.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：葡萄糖4.0％，冷豆粉4.0％，海豚蛋白胨1.0％，氯化铵0.5％，硫酸镁0.4％，氯化锰0.03％，硫酸锌0.003％，硫酸亚铁0.005％，碳酸钙0.5％，豆油1.0％，余量为水，pH为7.0～7.1。

8.如权利要求1或2所述的种子培养基在生产安普霉素中的用途。