CN102363755B - 一种链霉菌及其生产阿霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的链霉菌，通过培养它制备阿霉素或其类似物的方法。本发明的链霉菌Streptomyces sp.H323(CGMCC4827)是一种全新的菌种，其在含有可同化碳源和氮源的营养培养基中，并在通氧的条件下通过发酵可生产阿霉素或其类似物。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的链霉菌，通过发酵培养该菌产生阿霉素或其类似物的方法。
背景技术
蒽环类抗生素(如阿霉素、柔红霉素、表阿霉素)是最广泛应用的抗肿瘤药物。阿霉素和柔红霉素的结构基本相同(差异只在一个羟基上，如下式I)，柔红霉素只对急性白血病(leukemia)有效，而阿霉素对恶性肿瘤的治疗范围则很宽。
| R1 | R2 | R3 | |
| 柔红霉素 | C(O)CH3 | H | OH |
| 阿霉素 | C(O)CH2OH | H | OH |
| 表阿霉素 | C(O)CH3OH | OH | H |
1974年，美国专利US3,803,124公开了阿霉素可由发酵产物柔红霉素通过化学半合成而制得。目前，通过柔红霉素半合成是工业化生产阿霉素的方法。意大利的法玛西雅厄普约翰公司在中国专利CN1147835A中公开了一种由柔红霉素通过酶法转化制备阿霉素的方法。此外，美国专利US3,590,028公开了一株阿霉素产生菌种Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCCNo.27952。美国专利US4,012,284公开了另外一株阿霉素产生菌种Streptomyces peucetius ATCCNo.29050。
现有技术中虽然有报道阿霉素产生菌种，但还停留在实验室阶段，未形成产业化。因此，寻找能够产生阿霉素的新微生物菌种和新的制备方法的工作仍在继续进行中。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的能产生阿霉素或其类似物的微生物菌种，一种新的链霉菌H323，其保藏编号为CGMCC4827。
本发明还提供新的链霉菌H323(CGMCC4827)(Streptomyces sp.H323)，其可以应用于生产阿霉素或其类似物，或者应用于产生含有阿霉素的药物组合物。
本发明还提供了一种采用链霉菌H323(CGMCC4827)制备阿霉素或其类似物的方法。该方法包括采用链霉菌H323(CGMCC4827)在含有可同化的碳、氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的过程。
上述可同化的碳源选自淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇之一或上述物质的组合。
上述可同化的氮源选自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐之一或上述物质的组合。
所述发酵培养的温度为20℃-40℃，优选25℃-30℃，pH为6.5-7.5之间，优选6.8左右；培养时间为144-216小时；通氧量为0.5-1.0vvm。
所述发酵方式为液体深层发酵。
阿霉素可通过以下方法进行检测：
色谱柱为C18柱，5μm，4.6×250mm；
流动相：缓冲液∶乙腈∶甲醇＝500∶500∶60；
缓冲液：取十二烷基硫酸钠1.44g和磷酸0.68ml溶于500ml超纯水中；
流速：1.35ml/min；
检测波长：254mn；
进样量：10μl。
本发明中所采用的阿霉素产生菌种还可以为链霉菌H323(CGMCC4827)、链霉菌H323(CGMCC4827)自发的突变株或通过常规的诱变得到的突变株，优选阿霉素产生菌为链霉菌H323(CGMCC4827)。
链霉菌H323(Streptomyces sp.)(CGMCC4827)的微生物菌种于2011年5月4日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC4827，并登记入册，证明存活。
上述菌株主要生物学特征为：菌落颜色桔黄色偏红，菌落形态较圆整，表面有褶皱突起，直径大小为中型(约6mm左右)，无孢子，基内菌丝发达，菌丝与培养基结合紧密，不易挑起。
本发明描述了Streptomyces sp.H323的形态学和分子水平上的特征，经过和已知的阿霉素产生菌进行形态学和分子水平的比较，可以认定Streptomyces sp.H323属于链霉菌属，但它不同于已知的阿霉素产生菌Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC No.27952，Streptomycespeucetius ATCC No.29050，而是一种全新的菌种。
本发明与原工艺相比具有以下优点：
1.简化生产工艺。本发明所述菌种能够通过直接发酵方法生产阿霉素或其类似物，省去了从柔红霉素经化学合成得到阿霉素的工艺，有利于降低生产成本和减少环境污染。
2.提高发酵单位。本发明所述菌种产生阿霉素或其类似物的产量较原始菌种有了大幅度的提高，有利于实现工业化生产。
附图说明：
图1为本发明菌株的菌落形态；
a：ISP2培养基添加微量元素.
b：ISP3培养基.
c：ISP4培养基.
d：ISP2培养基.
图2为本发明的菌株的菌丝形态；
a：×400倍菌丝形态.
b：×1000倍菌丝形态.
图3为本发明的菌株在摇瓶中的发酵过程曲线(-■-：阿霉素产量； 
总糖；-△-：还原糖；-□-：pH值)；
图4为本发明菌株产生的阿霉素的HPLC图谱；
图5为本发明菌株产生的阿霉素的ESI/MS分析图谱；
图6为本发明菌株产生的阿霉素的1H-NMR图谱；
图7为本发明菌株产生的阿霉素的13C-NMR图谱。
具体实施方式
实施例1：菌株来源
Streptomyces sp.H323系从中国东南沿海的浙江省台州市一废弃农场土壤中分离得到的原始菌株，通过诱变选育得到阿霉素生产菌株。该菌株在ISP2斜面培养基中28℃培养10-12天后，在无菌条件下用接种铲将菌丝体刮下，在磨口试管中磨碎菌丝体并悬浮于无菌水中，制得菌悬液，供NTG(亚硝基胍)诱变处理。
称取NTG晶体10mg，溶解在10ml无菌Tris缓冲液(pH8.0)中，再用移液管加入1ml菌悬液，置于28℃培养基中旋转式或往复式摇床上振荡处理30min。将处理过的菌悬液经适当稀释涂布于ISP2平板上。未作诱变处理的菌悬液亦经适当稀释涂布于ISP2平板作为对照。28℃培养10天后，检查菌落数，并计致死率。
挑选经过NTG诱变后的单菌落1000株，进行摇瓶发酵，HPLC检测阿霉素产量。结果筛选出最高产突变菌株Streptomyces sp.H323。
实施例2：菌种鉴定
该菌株主要生物学特征为：菌落颜色桔黄色偏红，菌落形态较圆整，表面有褶皱突起，直径大小为中型(约6mm左右)，无孢子，基内菌丝发达，菌丝与培养基结合紧密，不易挑起。具体菌落形态和菌丝形态如图1和图2所示。
根据放线菌16S rRNA保守序列设计下列引物，并由上海生工生物工程公司合成：
上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
下游引物：5’-AAGGA GGTGATCCAGCCGCA-3’
利用上述引物对该菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR体系为：
PCR循环条件：95℃预变性5min，循环参数95℃变性1min，52℃复性45s，72℃延伸 1.5min，重复35个循环后，72℃再延伸10min，最后4℃保温。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。选用条带清晰的产物进行纯化。
扩增产物经凝胶电泳回收，并连接到T载体后进行测序，获得了该菌株16S rDNA一级结构的序列。通过在Genebank数据库中进行相似性搜索(blast)，结果发现其与波塞链霉菌变种Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC No.27952的16S rDNA序列同源性为96％。与另一株波塞链霉菌Streptomyces peucetius ATCC No.29050的16S rDNA序列同源性为97％。
综上所述，H323属于链霉菌属，但它不同于已知的阿霉素产生菌Streptomyces peucetiussubsp.caesius ATCC No.27952和Streptomyces peucetius ATCC No.29050。Streptomyces sp.H323是一株全新的菌种。
实施例3：制备阿霉素
(1)斜面菌丝体的制备与培养
斜面孢子培养基配方(g/L)：酵母抽提物4，麦芽抽提物10，葡萄糖4，琼脂20，消前pH6.5-6.8，试管30×200mm，装量20mL，经121℃灭菌20分钟后，冷却到50-60℃摆斜面，接入一环菌丝体经28±1℃培养10天后，菌丝成熟。
(2)种子液的制备与培养
种子培养基配方(g/L)：可溶性淀粉30，葡萄糖10，黄豆饼粉20，CaCO32，NaCl 3，消前pH6.5，摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL，经121℃灭菌20分钟。菌体接种量为105-106c.f.u./mL，培养温度28±1℃，250rpm，摇床振荡培养48小时，这时培养液pH7.0-7.5，菌丝浓度为15-20％(体积百分比)。
(3)阿霉素发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：玉米淀粉80，酵母粉30，CaCO33，NaCl 3，消前pH6.8，摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL，经121℃灭菌20分钟。将种子液以5-10％(体积百分比)的接种量接入，在28±1℃，250rpm摇床振荡培养7天，发酵结束后HPLC测阿霉素单位，测得单位为200mg/L。
实施例4：制备阿霉素
(1)种子罐种子液的制备
在20L种子罐中投入15L的种子培养基(种子培养基的配比见实施例3，同时添加0.3％ 的豆油作消泡剂)，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下30分钟，待冷却后，接入200ml摇瓶种子液，培养温度28±1℃，搅拌转速200rpm，通气量1vvm，培养48小时，此时pH7.0-7.5，菌丝浓度为15-25％。
(2)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基的配方与前述实施例3相同，但要添加0.05％PPG作为消泡剂，发酵罐50L，投料体积为35L，消前pH6.8，消后pH7.0，于121℃下蒸汽灭菌30分钟，冷却后，接入约3.5L种子罐培养液，发酵温度28±1℃，搅拌桨转速150-200rpm，通气量为0.8-1.0vvm，发酵培养7天，放罐，测得阿霉素发酵单位为300mg/L。
实施例5：制备阿霉素
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，可溶性淀粉20，酵母粉10，酵母抽提物5，玉米浆粉5，黄豆饼粉10，CaCO34，MgSO4·7H2O 1，NaCl 3，pH6.5，摇瓶装液量为30mL/250mL三角瓶，经121℃灭菌30分钟。从实施例3的斜面挖一块菌丝体接入种子培养基，置于摇床上28℃培养45hr。然后2.5ml的种子培养液接入发酵培养基(g/L)：麦芽糊精100，黄豆饼粉30，麸质粉2.5，NaCl 2，CaCO33，FeSO4·7H2O 0.001，MnCl2·4H2O 0.003，CoCl2·6H2O 0.01，ZnSO4·7H2O0.005，pH6.8。发酵培养基装量为25mL/250mL三角瓶，121℃灭菌30分钟，置于摇床上28℃培养7天。HPLC检测，发酵单位为280mg/L。
实施例6：制备阿霉素
种子培养液的制备按照实施例5进行。然后2.5ml的种子培养液接入发酵培养基(g/L)：淀粉100，酵母粉30，黄豆饼粉3，NaCl 2，CaCO33，FeSO4·7H2O 0.001，MnCl2·4H2O 0.003，ZnSO4·7H2O 0.005，pH6.8。发酵培养基装量为25mL/250mL三角瓶，121℃灭菌30分钟，置于摇床上28℃培养7天。HPLC检测，发酵单位为300mg/L。
实施例7：制备阿霉素类似物
种子培养液和发酵培养基的制备及培养按照实施例3进行。发酵结束后HPLC测阿霉素类似物单位，其中柔红霉素为60mg/L，双氢柔红霉素为20mg/L。
Claims (7)
1.一种链霉菌(Streptomyces sp.)H323，其保藏编号为CGMCC No.4827且具有产生阿霉素的能力。
2.根据权利要求1所述的链霉菌H323在制备阿霉素中的应用。
3.一种发酵生产阿霉素的方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的链霉菌H323，在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的步骤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇之一或上述物质的组合。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述可同化的氮源选自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐之一或上述物质的组合。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白胨为胰蛋白胨。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为20℃-40℃，pH为6.5-7.5之间，培养时间为144-216小时。
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