CN114364377A - 可用于治疗具有kras或hras突变或扩增的癌症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明技术涉及可用于针对具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体的癌症、肿瘤和赘生物治疗癌症、减慢肿瘤生长、逆转肿瘤生长、减慢赘生物生长、逆转赘生物生长、减慢赘生物增殖和/或逆转赘生物增殖的方法，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增。

Description

可用于治疗具有KRAS或HRAS突变或扩增的癌症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年7月15日提交的美国临时申请号62/874,474的权益和优先权，将其通过引用以其整体并入本文。

美国政府权利

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的HD075698和国立科学基金会授予的1752506的政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。

技术领域

本发明技术涉及可用于针对具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体的癌症、肿瘤和赘生物治疗癌症、减慢肿瘤生长、逆转肿瘤生长、减慢赘生物生长、逆转赘生物生长、减慢赘生物增殖和/或逆转赘生物增殖的方法，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复(duplication)或基因扩增。

发明内容

在一方面，本发明技术提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物以治疗癌症；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；并且其中所述癌症具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增。在本文的任何实施方案中，与健康对照细胞相比，癌症可能展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

在一方面，本发明技术提供了一种减慢或逆转受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；其中所述有效量是有效减慢或逆转所述肿瘤生长的量；并且其中所述肿瘤是具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体的癌症的肿瘤，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增。在本文的任何实施方案中，与健康对照细胞相比，癌症可能展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

在一方面，本发明技术提供了一种减慢或逆转受试者的赘生物生长和/或减慢或逆转所述受试者的赘生物的增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；其中所述有效量是有效减慢或逆转所述赘生物生长和/或减慢或逆转所述赘生物增殖的量；并且其中所述赘生物是具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体的癌症的赘生物，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增。在本文的任何实施方案中，与健康对照细胞相比，癌症可能展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

附图说明

图1展示了根据工作实施例，在永生化的小鼠胚胎成纤维细胞中RAS诱导的损伤，绘制了在指示浓度的多西环素的存在下相对于初始接种密度贴壁细胞数随时间的变化。误差条代表标准偏差(n＝3)。

图2提供了根据工作实施例，在引入多西环素后24h，载体/iKRas细胞的免疫印迹。双尾t检验(n＝3)：多西环素配对的iKRas和载体的像素密度。将TBP加载对照或磷酸化/总体比率用于归一化。

图3提供了根据工作实施例，用于细胞周期底物的载体/iKRas的72h免疫印迹。双尾t检验(n＝3)；多西环素配对的MEF的像素强度。将TBP用于归一化。

图4提供了根据工作实施例，含有γH2A.X正信号的免疫荧光图像的积分强度的定量。误差是平均值±SEM(单向方差分析，n＝3，各自20x的10个成像视场)。

图5提供了根据工作实施例，JNK(上图)或ATF-2(下图)的载体/iKRas的24h和72h免疫印迹。双尾t检验(n＝3)；多西环素配对的MEF的像素强度。将磷酸化/总体比率用于归一化。

图6提供了根据工作实施例，SA-β-半乳糖苷酶测定(左图，比例尺＝30μm)，和针对HP1γ细胞核聚集的间接免疫荧光(右图，比例尺＝10μm)。β-Gal彩色图像被解卷积并且分析以得出针对每个条件表示的正平均值±标准偏差％(n＝10x放大倍率的3x10个成像视场)。使用5+聚集细胞核/总细胞核来计算阳性SAHF％(针对每个条件表示的平均值±标准偏差，n＝40x放大倍率的3x 10个成像视场)。

图7提供了根据工作实施例，使用二庚酰基硫代-PC底物和DNTB色原对细胞裂解物或调节培养基的泛sPLA2活性测定。误差条代表标准偏差(n＝3)。

图8提供了根据工作实施例，使用硫代-PAF底物和DNTB色原对细胞裂解物或调节培养基的泛-PAF-AH活性测定。使用10kDa膜旋转过滤所有样品。误差条代表标准偏差(双尾t检验，n＝3)。LOD：检测限。

图9提供了根据工作实施例，用PLA2G7A抗体(红色二抗)染色的iKRas或载体的共聚焦免疫荧光成像的结果。蓝色＝Hoechst核染色。比例尺＝10μm。

图10提供了根据工作实施例，所指示的永生化MEF系的传感器发射波长的定量。误差条代表标准偏差(双尾t检验，n＝3x 12-15个成像视场)。

图11展示了根据工作实施例，在用途径抑制剂或PAF-AH诱导剂处理的细胞中的脂质报告物反应，提供了来自24h处理的培养物的报告物发射波长。误差是平均值±SD(相对于媒介物的单向方差分析，n＝3x 12-15个成像视场)。包括每种抑制剂的报道的靶标的示意图。

图12展示了根据工作实施例，在用途径抑制剂或PAF-AH诱导剂处理的细胞中的脂质报告物反应，提供了在有或没有转导的K-rasG12V的Atg5双敲除SV40LT MEF中的报告物发射波长。在单独实验中，将细胞暴露于蛋白酶抑制剂混合物(20μM亮抑蛋白酶肽、20μM胃蛋白酶抑制剂、10μM E-64)5小时。误差为平均值±SD(双尾t检验，n＝3x 12-15个成像视场)。

图13提供了根据工作实施例，溶血磷脂的细胞内膜报告物测定的结果，其中将来自诱导型经扩增iKRas系的传感器的发射中心波长与单等位基因敲入系eKRas的传感器的发射中心波长进行比较。

图14展示了根据工作实施例，在用途径抑制剂或PAF-AH诱导剂处理的细胞中的脂质报告物反应，提供了用100nM地塞米松盐处理24h的培养物的报告物发射波长。误差为平均值±SD(双尾t检验，n＝3x 12-15个成像视场)。

图15提供了根据工作实施例，溶血磷脂的细胞内膜报告物测定的结果，其中展示了在24小时诱导期期间来自与以下指定药物一起孵育的载体/iKRas细胞的传感器发射波长的定量：20nM伐瑞拉迪、MJ-33；75nM BEL；500nM MAFP；50nM达雷拉迪、利勒拉迪、ML256、AA39-2；800nM P11；1μM TSI-01。误差条代表标准偏差(双尾t检验相比于媒介物或用括号指示；相对于媒介物的单向方差分析，n＝3x 12-15个成像视场)。

图16提供了根据工作实施例，溶血磷脂的细胞内膜报告物测定的结果，其中展示了在24h诱导期期间来自与20μM±-α-生育酚一起孵育的载体/iKRas细胞的传感器发射中心波长。误差条代表标准偏差(双尾t检验，n＝3x 12-15个成像视场)。

图17提供了来自iKRas的12-25,000x成像的电子显微照片(n＝25个视场)的定量。误差是平均值±SD(相对于载体的单向方差分析)。

图18提供了经由在500nm处硫氰酸盐离子色原的定量，载体对照和iKRas细胞裂解物的总脂质氢过氧化物。误差条代表标准偏差(双尾t检验，n＝3)。LOD：检测限。

图19提供了与图18类似，但是是针对用媒介物或达雷拉迪(50nM)处理的iKRas细胞的定量。

图20展示了根据工作实施例，第7组sPLA2底物和产物脂质对细胞增殖的影响，提供了贴壁细胞数量随着掺入培养基中的脂质浓度的变化。误差条代表标准偏差(n＝3)。

图21提供了与图20类似，但是是针对暴露于10μM的每种脂质的iKRas或eKRas细胞系。

图22提供了在暴露于10μM lysoPC或cPAF脂质24小时后载体/iKRas的免疫印迹。双尾t检验(n＝3)：配对的iKRas的像素密度和载体处理条件。将TBP加载对照或磷酸化/总体比率用于归一化。PAF-R：血小板活化因子受体。

图23展示了根据工作实施例，第7组sPLA2靶向对细胞存活的影响，提供了在暴露于45nM siRNA后96小时的贴壁细胞数量的变化。误差线代表标准偏差(单向方差分析，n＝3)。

图24展示了根据工作实施例，第7组sPLA2靶向对细胞存活的影响，提供了来自独立实验的LDH活性的变化。数据显示为平均值±SEM(单向方差分析，n＝3)。

图25展示了根据工作实施例，第7组sPLA2靶向对细胞存活的影响，提供了几种细胞系响应于达雷拉迪的活力。N＝3个重复试样；误差条代表标准偏差。

图26展示了根据工作实施例，达雷拉迪对eKRas和野生型(WT)MEF的影响。将细胞铺板如正文所述用于活力测试。将达拉雷迪以高于其体外EC₅₀(10-1000nM)的浓度的滴定到细胞培养物中。N＝3个重复试样，误差±SD；数据拟合S形剂量反应。

图27展示了根据工作实施例，第7组sPLA2靶向对细胞存活的影响，提供了在第0天用KP肺细胞注射并且在第1天(D1)或第6天(D6)开始每天用媒介物或达拉雷迪(darapladip)(Darap，10mg/kg)处理(口服灌饲)的小鼠的存活研究的结果。N(媒介物)＝8，N(Darap，D1)＝8，N(Darap，D6)＝9。

具体实施方式

全文使用如以下所定义的以下术语。

如本文及所附权利要求中所用，除非本文另有指示或根据上下文明显矛盾，否则在描述要素的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)的单数冠词，如“一个/一种(a/an)”和“所述”和类似指示物应视为同时覆盖单数和复数。除非本文中另有指示，否则本文中列举的数值范围仅旨在用作个别地提到落在该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值纳入说明书中如同其在本文中个别列举一般。除非本文中另有指示或与上下文明确矛盾，否则本文所述的所有方法都能以任何合适的顺序来进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有例子或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明实施方案并且不会对权利要求的范围产生限制。不应将说明书中的任何语言视为指示任何未要求保护的要素是必不可少的。

如本文所用，“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上将根据其使用的上下文而变化。如果本领域普通技术人员考虑到使用所述术语的上下文时对所述术语的使用不清楚，则“约”将意指特定术语的至多加或减10％-例如，“约10wt.％”将理解为意指“9wt.％至11wt.％”。应当理解，当“约”在一个术语之前时，所述术语应被解释为公开“约”所述术语以及不通过“约”修饰的术语-例如“约10wt.％”公开了“9wt.％至11wt.％”以及公开了“10wt.％”。

如本公开文本中使用的短语“和/或”将被理解为意指单独地所述成员的任一个或其中任两个或更多个的组合-例如，“A、B和/或C”将意指“A、B、C、A和B、A和C、或B和C”。

如由本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述相同的范围并使相同的范围能够分解成至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围都可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包括所列举的数字，并且是指可以随后分解成如上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员可理解，范围包括每一个别成员。因此，例如，具有1-3个原子的基团是指具有1、2或3个原子的基团。类似地，具有1-5个原子的基团是指具有1、2、3、4或5个原子的基团，等等。

本文所述的化合物的药学上可接受的盐在本发明技术的范围内，并且包括保留所需的药理活性并且不是生物学上不希望的酸或碱加成盐(例如，所述盐没有过度毒性、致敏性或刺激性，并且是可生物利用的)。当本发明技术的化合物具有碱性基团(例如像氨基)时，药学上可接受的盐可以是用如下酸形成：无机酸(如盐酸、氢硼酸、硝酸、硫酸和磷酸)、有机酸(例如，海藻酸、甲酸、乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、富马酸、草酸、酒石酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、萘磺酸和对甲苯磺酸)或酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)。当本发明技术的化合物具有酸性基团(例如像羧酸基团)时，它可以用以下形成盐：金属(如碱金属和碱土金属(例如，Na+、Li⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺))、氨或有机胺(例如，二环己胺、三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺)或碱性氨基酸(例如，精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸)。可以在化合物的分离和纯化期间原位制备此类盐，或者通过分开地使经纯化的化合物(以其游离碱或游离酸形式)分别与合适的酸或碱反应，并且分离由此形成的盐来制备此类盐。

本领域技术人员将理解，本发明技术的化合物可以展现出互变异构、构象异构、几何异构和/或立体异构的现象。由于说明书和权利要求内的结构式图仅可以代表可能的互变异构、构象异构、立体异构或几何异构形式中的一种，因此应当理解，本发明技术涵盖具有本文所述的一种或多种用途的化合物的任何互变异构、构象异构、立体异构和/或几何异构形式以及这些各种不同形式的混合物。

“互变异构体”是指化合物的彼此平衡的异构形式。异构形式的存在和浓度将取决于化合物所在的环境，并且可能会有所不同，这取决于例如化合物是固体还是处于有机溶液或水性溶液中。例如，在水性溶液中，喹唑啉酮可以展现出以下异构形式，其被称为彼此的互变异构体：

作为另一个例子，在质子有机溶液(例如，水)中，胍可以展现出以下异构形式，其也被称为彼此的互变异构体：

由于结构式对代表化合物的限制，应当理解本文所述化合物的所有化学式代表化合物的所有互变异构形式，并且在本发明技术的范围内。

化合物的立体异构体(也称为光学异构体)包括结构的所有手性、非对映异构和外消旋形式，除非明确指示特定的立体化学。因此，如根据描绘清楚的，用于本发明技术的化合物包括在任何或所有不对称原子处的富集的或拆分的光学异构体。可以将外消旋混合物和非对映异构混合物以及单独的光学异构体分离或合成为基本上不含其对映异构或非对映异构伴侣，并且这些立体异构体均在本发明技术的范围内。

本发明技术的化合物可以作为溶剂化物，特别是水合物存在。可以在化合物或包含化合物的组合物的制造期间形成水合物，或者由于化合物的吸湿性，可以随时间形成水合物。本发明技术的化合物也可以作为有机溶剂化物(包括DMF、醚和醇溶剂化物等)存在。任何特定的溶剂化物的鉴定和制备均在合成有机或药物化学领域的普通技术人员的技能范围内。

贯穿本公开文本，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过识别引用来引用。此外，还在本公开文本内的是参考引用文献的阿拉伯数字，在权利要求之前提供了其全面的书目细节。将这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用特此并入本公开文本。在通过引用并入的文本中包含的定义与本公开文本中的定义相抵触的程度上，将其排除。

本发明技术

应激诱导的过早衰老是一种延迟或中止癌发生的肿瘤抑制机制。通过RAS/RAF(促有丝分裂MAP激酶级联的重要组分)的组成型信号传导可以在体外和体内触发增殖延迟、细胞凋亡^{1,2,3,4,5,6,7,8}、和DNA损伤反应⁹。^{7,10,11,12,13}虽然此过程可以抑制肿瘤引发，但是致癌基因诱导的衰老(OIS)可能是有害的，因为存活细胞通过例如氧化损伤和复制缺陷而失去基因组稳定性。^{14,15,16,17,18}与此思想一致，内源性突变体KRAS表达在发展异性小鼠胚胎中引起变恶性肿瘤前的组织缺陷：衰老、p21^waf1/cip1过表达、DNA损伤应答、突变等位基因不稳定性、和总体发育迟缓。^19,20,21,22最近，上皮细胞和成纤维细胞已经被用于重演致癌基因诱导的损伤；例如，描述了先天炎症基因表达表型(衰老炎症反应SIR、和衰老相关分泌表型SASP)。^{23, 24}OIS被认为通过启动阻滞、局部炎症和细胞外通信而对细胞损伤发生迅速反应。转录组分析和组织学通常显示编码分泌磷脂酶A2(sPLA2)(保守的炎症酶)的基因在具有ras致癌基因的恶性组织和细胞中的表达。然而，sPLA2酶是经典的白细胞产物，并且它们在癌症生物学中的作用仍然不清楚。有趣的是，有证据表明，sPLA2酶活性的产物溶血磷脂和相关物质在细胞衰老期间大量产生。²⁵此外，一些sPLA2直接参与衰老。^26,27,28,29这些观察结果促使诸位发明人评价sPLA2(最初在动物毒液和发炎关节中研究的大的丝氨酸水解酶家族，其对于心血管、脂质和白细胞信号传导^30,31,32是不可或缺的)在致癌基因RAS诱导的损伤的背景下的作用。

为此，诸位发明人调查了在致癌基因RAS诱导的损伤的小鼠模型中sPLA2的参与。将组成型KRAS或HRAS使用Tet-ON逆转录病毒质粒(扩增模型，iKRas)或通过小鼠胚胎中内源重组(单等位基因模型，eKRas)引入SV40小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中。²³诸位发明人将来自致癌基因RAS扩增的细胞损伤程度与过度增殖的内源突变体进行比较。致癌基因扩增系展现出独特且醒目的p21^waf1/cip1过表达、多西环素剂量依赖性阻滞、衰老相关标记物、DNA损伤和SIR/SASP基因表达。使用内体脂质的酶促和脂质组测定和纳米传感器，诸位发明人发现，第7组sPLA2亚型(第7组包括pla2g7，PLA2G7A(也称为脂蛋白相关的磷脂酶A2)和pafah2，PLA2G7B(也称为血小板活化因子乙酰水解酶2))显示在RAS扩增后上调的活性。诸位发明人发现RAS损伤引起脂质氢过氧化和内源氧化剂的增加，与动员的第7组sPLA2酶的专用氧化磷脂清除作用一致。在暴露于不可降解的第7组底物脂质上刺激细胞阻滞、p21^{waf1 /cip1}和磷酸化的ERK。第7组sPLA2亚型的敲低选择性地杀伤了RAS突变体。出乎意料地是，诸位发明人发现在小鼠的Kras^G12D/+/p53^-/-肺癌模型中，先前在动脉粥样硬化和阿尔茨海默病的临床试验中测试的达雷拉迪(潜在的第二代第7组酶抑制剂)预防RAS转化细胞中的溶血磷脂积累，优先杀伤具有致癌基因ras的系，并且延长存活。

因此，在一方面，本发明技术提供了治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物以治疗癌症；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256(统称为或单独称为“本发明技术的化合物”等；也称为“所述化合物”)；并且其中所述癌症具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增。以下在方案1中提供了达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2和ML256中的每一种的结构式。

方案1.

在本文的任何实施方案中，与健康对照细胞相比，癌症可能展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

在一方面，本发明技术提供了一种减慢或逆转受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；其中所述有效量是有效减慢或逆转所述肿瘤生长的量；并且其中所述肿瘤是具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体的癌症的肿瘤，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增。在本文的任何实施方案中，与健康对照细胞相比，癌症可能展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

在一方面，本发明技术提供了一种减慢或逆转受试者的赘生物生长和/或减慢或逆转所述受试者的赘生物的增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；其中所述有效量是有效减慢或逆转所述赘生物生长和/或减慢或逆转所述赘生物增殖的量；并且其中所述赘生物是具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体的癌症的赘生物，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增。在本文的任何实施方案中，与健康对照细胞相比，癌症可能展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

“有效量”是指产生所需效果所需的化合物或组合物的量。在本文公开的任何实施方案和/或方面中(为了简单起见，在下文中称为“在本文所公开的任何实施方案中”等)，可以相对于受试者来确定有效量。如本文所用，“受试者”或“患者”是哺乳动物，如猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。通常，所述受试者是人，并且优选患有或怀疑患有癌症、肿瘤和/或赘生物的人。术语“受试者”和“患者”可互换使用。有效量的一个例子包括产生用于治疗性(药学)用途(包括但不限于减小肿瘤块)的可接受的毒性和生物利用度水平的量或剂量。在本文公开的任何实施方案中，所述有效量可以是有效治疗癌症、治疗肿瘤、缩小肿瘤、治疗赘生物、缩小赘生物和/或增加受试者存活的量。举例来说，包括本发明技术的化合物的本文任何实施方案的有效量可以是从约0.01μg至约200mg的化合物(如约160mg的化合物)。作为另一个例子，本发明技术的化合物的有效量可以是(按照化合物的质量/患者的质量)从1×10^–5g/kg至1g/kg、1×10^–3g/kg至1.0g/kg、0.01mg/kg至100mg/kg、0.01mg/kg至约20mg/kg，或优选从0.25mg/kg至10mg/kg-因此，在本文公开的任何实施方案中，本发明技术的化合物的有效量可以是约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约0.15mg/kg、约0.2mg/kg、约0.25mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg/约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg，或包括这些值的任两个或在这些值的任两个之间的任何范围(例如像，约0.25mg/kg至约10mg/kg)。

本文公开的任何实施方案的方法可以包括向所述受试者施用药物组合物，其中所述药物组合物包括有效量的本发明技术的化合物以及药学上可接受的载体或一种或多种赋形剂、填充剂或药剂(除非另有说明和/或指定，否则以下统称为“药学上可接受的载体”)。因此，本发明的技术还提供了药物组合物和药物，所述药物组合物和药物包含本文公开的任何实施方案的化合物和药学上可接受的载体。所述组合物可用于本文所述的方法和治疗方法(为了便于参考，本发明技术的药物和药物组合物在本文中可以统称为“组合物”或“本发明技术的组合物”等)。药物组合物可以以单位剂型包装。当向有需要的受试者施用时，单位剂型通过减少肿瘤来有效治疗肿瘤。通常，包含本发明技术的化合物的单位剂量将根据患者考虑因素而变化。此类考虑因素包括例如年龄、方案、病症、性别、疾病程度、禁忌证、伴随疗法等。基于这些考虑因素的示例性单位剂量也可以通过本领域技术人员调整或修改。例如，对于一名患者，包含本发明技术的化合物的单位剂量可以从1×10^–4g/kg至1g/kg，优选1×10^–3g/kg至1.0g/kg变化。本发明技术的化合物的剂量也可以从(按照化合物的质量/患者的质量)1×10^–5g/kg至1g/kg、1×10^–3g/kg至1.0g/kg、0.01mg/kg至100mg/kg、0.01mg/kg至约20mg/kg，或优选地从0.25mg/kg至10mg/kg变化-因此，在本文公开的任何实施方案中，所述剂量可以是约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约0.15mg/kg、约0.2mg/kg、约0.25mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg，或包括这些值中的任两个和/或在这些值中的任两个之间的任何范围(例如像，约0.25mg/kg至约10mg/kg)。合适的单位剂型包括但不限于肠胃外溶液、口服溶液、散剂、片剂、丸剂、胶囊锭(gelcap)、胶囊剂、锭剂、栓剂、贴剂、鼻腔喷雾剂、注射剂、可植入的缓释配制品、粘液膜剂、局部涂膜剂(topicalvarnishes)、脂质复合物、液体等

药物组合物和药物可以通过将一种或多种本发明技术的化合物与药学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等混合来制备。此类组合物可以例如呈以下形式：颗粒剂、散剂、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、混悬剂或溶液。本发明的组合物可以被配制用于多种施用途径，例如通过口服、肠胃外、局部、直肠、经鼻、阴道施用或经由植入的储库。肠胃外或全身施用包括但不限于皮下、静脉内、腹膜内和肌内注射。以下剂型是作为例子给出的，而不应该解释为限制本发明技术。

对于口服、经颊和舌下施用，散剂、混悬剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、胶囊锭和囊片作为固体剂型是可接受的。这些可以例如通过如下方法来制备：将本发明技术的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐或互变异构体与至少一种添加剂(如淀粉或其他添加剂)混合。合适的添加剂是蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、海藻酸盐、几丁质、壳聚糖、果胶、黄芪胶、阿拉伯胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯。任选地，口服剂型可以含有有助于施用的其他成分，如惰性稀释剂、或润滑剂(如硬脂酸镁)、或防腐剂(如对羟基苯甲酸酯或山梨酸)、或抗氧化剂(如抗坏血酸、生育酚或半胱氨酸)、崩解剂、粘结剂、增稠剂、缓冲液、甜味剂、调味剂或香料。片剂和丸剂可以用本领域已知的合适包衣材料进一步处理。

用于口服施用的液体剂型可以呈以下形式：药学上可接受的乳剂、糖浆、酏剂、混悬剂和溶液，其可以含有惰性稀释剂(如水)。可以使用无菌液体(如但不限于油、水、醇和这些的组合)将药物配制品和药物制备成液体混悬剂或溶液。可以添加药学上合适的表面活性剂、助悬剂、乳化剂用于口服或肠胃外施用，并且可以包括天然的和经修饰的环糊精化合物。

如上所述，混悬剂可以包括油。此类油包括但不限于花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。混悬剂制剂还可以含有脂肪酸酯，如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化脂肪酸甘油酯。混悬剂配制品可以包含醇，如但不限于乙醇、异丙醇、十六醇、丙三醇和丙二醇。醚(如但不限于聚(乙二醇))，石油烃(如矿物油和矿脂)；非质子溶剂(如二甲基亚砜)；和/或水也可以用于混悬剂配制品中。

可注射剂型通常包括水性混悬剂或油混悬剂，其可以使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来制备。可注射形式可以在溶液相中或呈用溶剂或稀释剂制备的混悬剂的形式。可接受的溶剂或媒介物包括无菌水、林格氏溶液或等渗水性盐溶液。可替代地，可以将无菌油用作溶剂或助悬剂。通常，所述油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成油、脂肪酸、单甘油酯、二甘油酯或三甘油酯。

对于注射，所述药物配制品和/或药物可以是适合于用如上所述的适当溶液重构的粉末。这些的例子包括但不限于冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒、沉淀物或微粒。对于注射，所述配制品可以任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些的组合。

本发明技术的化合物可以通过鼻或口腔吸入施用至肺。用于吸入的合适的药物配制品包括含有任何适当的溶剂和任选的其他化合物(如但不限于稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度改性剂及其组合)的溶液、喷雾剂、干粉或气雾剂。载体和稳定剂随着特定化合物的要求而变化，但是通常包括非离子表面活性剂(Tween类、Purronic类或聚乙二醇)、无害的蛋白质(像血清白蛋白)、山梨聚糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(如甘氨酸)、缓冲液、盐、糖或糖醇。水性和非水性(例如，在氟碳推进剂中)气雾剂通常用于通过吸入来递送本发明技术的化合物。

用于局部(包括经颊和舌下)或透皮施用本发明技术的化合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶、溶液和贴剂。活性组分可以在无菌条件下与药学上可接受的载体或赋形剂，以及可能需要的任何防腐剂或缓冲液混合。散剂和喷雾剂可以例如用赋形剂(如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末、或这些物质的混合物)制备。软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶还可以含有赋形剂，如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。吸收促进剂也可用于增加本发明技术的化合物跨越皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜(例如，作为透皮贴剂的一部分)或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制此类通量的速率。

除了上述那些代表性剂型之外，药学上可接受的赋形剂和载体是本领域技术人员通常已知的，因此被包括在本发明技术中。此类赋形剂和载体描述于例如“RemingtonsPharmaceutical Sciences”Mack Pub.Co.,New Jersey(1991)和“Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,”第20版,编辑:Alfonso R Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore(2000)，中，将其各自通过引用并入本文。

如下所述，本发明技术的配制品可以被设计为短效、快速释放、长效和持续释放。因此，所述药物配制品也可以被配制用于控制释放或缓慢释放。

本发明组合物还可以包含例如胶束或脂质体、或一些其他胶囊化形式，或者可以以延长释放的形式施用以提供延长的储存和/或递送作用。因此，可以将所述药物配制品和药物压缩成微丸或圆柱体，并且作为贮库型注射剂或作为植入物(如支架)肌内或皮下植入。此类植入物可以采用已知的惰性材料，如硅酮和可生物降解的聚合物。

在本文的任何实施方案中，可以根据受试者的疾病状况、年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食，药物的剂量间隔、施用途径、排泄率和组合来调节具体剂量。含有有效量的任何上述剂型都完全在常规实验的范围之内，因此也完全在本发明技术的范围之内。本领域技术人员能够通过将本发明技术的化合物以渐增量简单地施用至患者直至例如在受试者中肿瘤块减小来容易地确定有效量。本发明技术的化合物可以以约0.1至约1,000mg/天的范围内的剂量水平向患者施用(同上进一步详细讨论)。对于体重约70kg的正常成年人，在每天约0.01至约100mg/kg体重范围内的剂量是足够的(同上进一步详细讨论)。然而，所用的具体剂量可以变化或可以调节，如本领域普通技术人员所适当考虑的那样。例如，剂量可以取决于多种因素，包括患者的要求、与肿瘤相关的癌症的严重程度和所使用的化合物的药理学活性。对特定患者的最佳剂量的确定是本领域技术人员熟知的。可以容易地采用各种测定和模型系统来确定根据本发明技术的治疗的治疗有效性。本发明技术的组合物(以及有效量的确定)和方法的有效性也可以通过减小肿瘤块、减缓肿瘤的生长、和/或增加受试者的存活来证明。对于本文所述的每个指示条件，与安慰剂处理的或其他合适的对照受试者相比，测试受试者将展现出由受试者的障碍导致的或与其相关的一种或多种症状的10％、20％、30％、50％或更高的减少，高达75％-90％或95％或更高的减少。

在一方面，将本发明技术的化合物以适合于治疗用途的量或剂量(例如，包括在本发明技术的任何实施方案的药物组合物中)向患者施用。通常，包含本发明技术的化合物的单位剂量将根据患者考虑因素而变化。此类考虑因素包括例如年龄、方案、病症、性别、疾病程度、禁忌证、伴随疗法等。基于这些考虑因素的示例性单位剂量也可以通过本领域技术人员调整或修改。例如，对于一名患者，包含本发明技术的化合物的单位剂量可以从1×10^–4g/kg至1g/kg，优选1×10^–3g/kg至1.0g/kg变化。本发明技术的化合物的剂量也可以从0.01mg/kg至100mg/kg，优选从0.1mg/kg至10mg/kg变化。

本发明技术的化合物也可以例如通过有机部分或缀合物的共价附接来修饰，以改善药代动力学特性、毒性或生物利用度(例如，增加的体内半衰期)。缀合物可以是直链或支链亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。聚合物基团可以包含可以由本领域普通技术人员调节的分子量，以改善例如药代动力学特性、毒性或生物利用度。示例性缀合物可以包括聚链烷二醇(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮和脂肪酸或脂肪酸酯基团，其中的每一个均可以独立地包含从约八至约七十个碳原子。与本发明技术的化合物一起使用的缀合物也可以作为接头连至例如任何合适的取代基或基团、放射性标记(标记物或标签)、卤素、蛋白质、酶、多肽、其他治疗剂(例如，药物或药品)、核甘酸、染料、寡核苷酸、脂质、磷脂和/或脂质体。在一方面，缀合物可以包括聚乙烯胺(PEI)、聚甘氨酸、PEI和聚甘氨酸的杂合物、聚乙二醇(PEG)或甲氧基聚乙二醇(mPEG)。缀合物还可以将本发明技术的化合物与例如标签(荧光或发光物)或标记物(放射性核素、放射性同位素和/或同位素)连接起来以包含本发明技术的探针。在一方面，与本发明技术的化合物一起使用的缀合物可以改善体内半衰期。与本发明技术的化合物一起使用的其他示例性缀合物以及其应用和相关技术包括通常由美国专利号5,672,662描述的那些，将其通过引用特此并入本文。

在本文公开的任何实施方案中，所述癌症可以是(和/或所述肿瘤可以是如以下的癌症的肿瘤，和/或所述赘生物可以是如以下的癌症的赘生物)：鳞状细胞癌、软组织肉瘤、口腔黑色素瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症、卡波西肉瘤(软组织肉瘤)、艾滋病相关淋巴瘤(淋巴瘤)、肛门癌、阑尾癌、胃肠道类癌瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、皮肤的基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(包括尤因肉瘤和骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤(肺癌)、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(胃肠道)、原发灶不明癌、心脏(心)肿瘤、儿童脑癌、生殖细胞肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、宫颈癌、胆管癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓增殖性瘤、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管原位癌(DCIS)、胚胎性肿瘤、髓母细胞瘤、子宫内膜癌(子宫癌)、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤(头颈癌)、颅外生殖细胞肿瘤、眼癌、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、骨肉瘤、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠道间质瘤(GIST)(软组织肉瘤)、生殖细胞肿瘤、儿童中枢神经系统生殖细胞肿瘤(脑癌)、儿童颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、睾丸癌、妊娠滋养细胞疾病、毛细胞白血病、头颈癌、心脏肿瘤、肝细胞(肝)癌、组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、眼内黑色素瘤、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肾(肾细胞)癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌(头颈癌)、白血病、唇腔癌(头颈癌)、肝癌、肺癌、淋巴瘤、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌(皮肤癌)、间皮瘤、转移性癌症、转移性原发灶隐匿的鳞状颈癌(头颈癌)、中线道癌伴nut基因变化、口腔癌(头颈癌)、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/血浆细胞瘤、蕈样真菌病(淋巴瘤)、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病、髓性白血病、骨髓增生性瘤、鼻腔和副鼻窦癌(头颈癌)、鼻咽癌(头颈癌)、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)、乳头瘤病(儿童喉部)、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌(头颈癌)、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌(头颈癌)、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、血浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤(肺癌)、妊娠和乳腺癌、原发中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、复发性癌症、肾细胞(肾)癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌(头颈癌)、肉瘤、儿童横纹肌肉瘤、儿童血管肿瘤、尤因肉瘤(骨癌)、卡波西肉瘤、骨肉瘤(骨癌)、塞泽里综合征(淋巴瘤)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、皮肤鳞状细胞癌、转移性原发灶隐匿的鳞状颈癌(头颈癌)、胃(胃部)癌、T细胞淋巴瘤、喉癌(头颈癌)、口咽癌、下咽癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、气管支气管肿瘤(肺癌)、肾盂和输尿管的移行细胞癌(肾(肾细胞)癌)、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管肿瘤、外阴癌、和/或肾母细胞瘤和其他儿童肾脏肿瘤。在本文公开的任何实施方案中，所述癌症可以是(或所述肿瘤可以是如以下的癌症的肿瘤，以及所述赘生物可以是如以下的癌症的赘生物)：胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胆管癌、软组织肉瘤、血液或造血细胞癌、乳腺癌、肺癌、子宫或子宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、间皮瘤癌、皮肤癌、头颈癌、神经内分泌癌或瘤、食道癌、睾丸癌、前列腺癌或胸腺癌。在本文公开的任何实施方案中，所述癌症可以包括(或所述肿瘤可以是包括以下的癌症的肿瘤，以及所述赘生物可以是包括以下的癌症的赘生物)：腺癌、子宫癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、移行细胞癌、浆液性癌、透明细胞癌、粘液性腺癌、未分化癌、去分化癌、浆液性腺癌、或其任两种或更多种的组合。

在本文的任何实施方案中，所述施用可以包括将所述化合物局部施用至包括癌症(如肿瘤)的受试者的部位，或将所述组合物局部施用至包括癌症(如肿瘤)的受试者的部位。在本文的任何实施方案中，所述施用可以包括口服、直肠、经鼻、阴道、透皮、静脉内、肌内或吸入施用。在本文的任何实施方案中，所述施用可以包括将所述化合物注射至包括癌症(如肿瘤)的受试者的部位中或包括癌症(如肿瘤)的受试者的部位近侧。

本发明技术的化合物也可以连同其他常规治疗剂一起施用至患者，所述常规治疗剂可用于治疗肿瘤或用于疫苗接种。所述施用可以包括口服施用、肠胃外施用或经鼻施用。在这些实施方案中的任一个中，所述施用可以包括皮下注射、静脉内注射、腹膜内注射或肌内注射。在这些实施方案中的任一个中，所述施用可以包括口服施用。本发明技术的方法还可以包括依序或与本发明技术的一种或多种化合物组合施用常规治疗剂，所述常规治疗剂的量可潜在地或协同地有效用于治疗肿瘤或用于疫苗接种。在本文的任何实施方案中，所述施用可以进一步包括化学治疗剂的施用，所述化学治疗剂如烷基化剂；亚硝基脲；抗代谢药；蒽环类；拓扑异构酶II抑制剂；有丝分裂抑制剂；抗雌激素；孕激素；芳香酶抑制剂；抗雄激素；LHRH激动剂；皮质类固醇激素；DNA烷基化剂；紫杉烷；长春花生物碱；微管抑制剂，或其任两种或更多种的组合。在本文的任何实施方案中，所述施用可进一步包括施用如以下的化学治疗剂：白消安、顺铂、卡铂、奥沙利铂、八面体铂(IV)化合物、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、二氯甲二乙胺(氮芥)、美法仑、替莫唑胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷(ara-C)、氟达拉滨、培美曲塞、道诺霉素、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、泼尼松、地塞米松、L-天冬酰胺酶、放线菌素D、沙利度胺、维甲酸、伊马替尼(格列卫)、吉非替尼(易瑞沙)、厄洛替尼(特罗凯)、利妥昔单抗(瑞图宣)、贝伐单抗(安维汀)、伊匹单抗、纳武单抗(欧狄沃)、派姆单抗(齐内达)、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、醋酸甲地孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、或其任两种或更多种的组合。在本文的任何实施方案中，所述化学治疗剂的施用可以包括将所述化学治疗剂局部施用至包括癌症的受试者的部位。在本文的任何实施方案中，所述化学治疗剂的施用可以包括口服、直肠、经鼻、阴道、透皮、静脉内、肌内或吸入施用。在本文的任何实施方案中，所述化学治疗剂的施用可以包括将所述化学治疗剂注射到包括癌症的受试者的部位中或包括癌症的受试者的部位近侧。

提供了本文的实施例以说明本发明技术的优点，并且进一步帮助本领域普通技术人员制备或使用本发明技术的化合物和组合物。还提出了本文的实施例以便更全面地展示本发明技术的优选方面。实施例无论怎样也不应解释为限制如所附权利要求所定义的本发明技术的范围。实施例可以包括或并入上述本发明技术的任何变型、方面或实施方案。上述变型、方面或实施方案还可以各自进一步包括或并入本发明技术的任何或所有其他变型、方面或实施方案的变型。

实施例

统计分析和软件。使用GraphPad Prism 7.03，使用双尾未配对的t检验以95％置信区间来计算所有p值。使用通过Holm-Sidak校正的单向方差分析进行多重比较。在每个图中报告了N-重复和误差。贯穿全文，ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。使用GraphPad Prism 7.03生成增殖曲线；使用OriginPro 9.0分析了拟合到高斯函数的包括纳米报告物分布的所有其他数据。MATLAB R2014a用于生成彩色像素图、图像覆盖和原始报告物数据校正。ImageJ或Fiji(NIH)用于分析蛋白质印迹膜密度，并且产生印迹和免疫荧光图像、β-gal图像和宽视场/共聚焦图像(HDF5/Bio-格式插件)。用ChemBioDrawUltra 13.0设计化学结构和卡通图。用Adobe Illustrator CS6 v16.0.3设计图和方案布局。

细胞系。原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)衍生自MSKCC的Lowe实验室C57BL/6小鼠集落。将MEF通过SV40大T抗原永生化。^82,83将永生化的MEF通过用cDNA质粒转染的HEK293T系包装的逆转录病毒进行转导。使用修饰版本的逆转录病毒质粒载体pTRE-Tight(Clonetech)将cDNA插入物、空(乱序)载体、小鼠K-ras^G12V 4B、或人H-ras^G12V克隆到Tet-ON3G pTURN构建体⁸⁴的前面。⁸⁵使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)和氯喹/BSA补充(以增强病毒加载)将质粒用逆转录病毒包装质粒共转染到HEK293T细胞中；16h后添加新鲜培养基，并且转染后2天收集病毒上清液。通过将0.45μm过滤的HEK调节的培养基(加4μg/mL聚凝胺，Fisher TR1003G)暴露于6E5靶细胞发生逆转录病毒转导。将潮霉素(150μg/mL，ThermoFisher 10687-010)用于选择。用自我切除的逆转录病毒Cre-重组酶^19,84,86制备K-ras^G12D敲入系，然后用SV40LT感染。先前描述了具有针对Pten的组成型Akt1或组成型短指导RNA的SV40LT MEF。⁸⁶将SV40LT Atg5敲除系⁸²通过pTURN质粒转导。将所有细胞系针对支原体测试，然后进行扩增和储存。RAW 264.7小鼠巨噬细胞/单核细胞来自ATCC(TIB-71)，并且在如正文中所指示的但是添加10％的热灭活FBS的培养基中培养。恶性系是使用相同的培养基培养的，并且来自Memorial Sloan Kettering Cancer Center研究组的馈赠，并且包括以下：KP肺、小鼠的KrasG12D/p53R270H侵入性原发性肺腺癌；人PA-TU-8988T胰腺腺癌、人HCT-116结肠癌、人A549肺腺癌、人Panc-1胰腺导管上皮腺癌。

细胞培养。将细胞培养物在37℃下，用5％CO₂和环境氧气孵育。本工作中使用的完全培养基由补充丙酮酸盐的DMEM(ThermoFisher 10313021)和以下最终浓度的添加物组成：4.75％v/v热灭活的胎牛血清(FBS)(ThermoFisher 10082147)、88.5U/mL Pen Strep(ThermoFisher 15140122)、3.54mM GlutaMAX(ThermoFisher 35050061)、1.77mM L-谷氨酰胺(ThermoFisher 25030081)和35mM HEPES(ThermoFisher 15630080)。用TrypLE(ThermoFisher 12604013)进行常规传代。从液氮储存的七至八次传代后不使用细胞系；在从液氮储存的至少两次传代后开始实验。培养的细胞通常在80％-90％汇合之前分裂。为了补充亲脂性药物，将DMSO溶解的储备化合物与适当体积的37℃完全培养基一起预孵育，并且轻轻混合10分钟。对于脂蛋白缺乏实验，将FBS用相同的最终％LPDS(Sigma S5394)代替。将所有预制溶液进行无菌过滤(0.22μm)。除非另有指示，否则将多西环素(500ng/mL)与其他测试化合物同时添加到培养基中。为了补充脂肪酸，将制造在1mL中6mM储液所需的一定体积的脂肪酸油转移到用氮气吹扫的无菌Eppendorf中。向此管中添加1mL的1mM脱脂BSA(级分V无脂肪酸BSA，Sigma A7030，批次号5LBQ0873V)。将管置于在1000rpm、37℃下的自动混合器中30分钟(Eppendorf ThermoMixer C)。将所得的储备PUFA-BSA用0.22μm PES膜无菌过滤。将储液等分、氮气吹扫、并且在-20℃下储存直至使用。补充有PUFA混合物的培养基含有5μM二十二碳六烯酸(Sigma D2534)、5μM花生四烯酸(EMD 181198)和2.5μM的每种亚油酸(LA)(Sigma L1376)和亚麻酸(ALA)(Sigma L2376)。在对照条件下补充脱脂的BSA。

增殖测定。为了测定增殖，将6E4个细胞/孔用完全培养基铺板在6孔板(ThermoFisher 140675)中以产生从第0天直至第3/4天每个实验条件一式三份的孔。接种细胞后6-8h，将孔用新鲜培养基简单冲洗，并且然后用适当补充的测试培养基培养。在此时间将第0天板计数。将板以24-h间隔计数。贴壁和扩散MEF>95％有活力，⁸⁴如通过缺乏台盼蓝染色或针对切割的半胱天冬酶7或PARP的阳性蛋白质印迹来确认的(数据未显示)。为了计数贴壁细胞，将培养基从每个孔中吸出，然后在室温(RT)1x HBSS(不具有Ca/Mg++)中使用手动搅动冲洗两次。将贴壁细胞用1mL TrypLE进行胰蛋白酶消化。在成像细胞仪(ThermoT10796；出厂默认设置)上加载含有24μL的胰蛋白酶消化的细胞悬浮液的腔室载玻片(ThermoFisher T10794)。成像18个视场；将细胞计输出以细胞数/mL给出。将输出针对细胞/粒度进行门控，使得最终计数不包括7μm或低于7μm的颗粒，这被采用来反映来自培养物的背景碎片。将上门控阈值设置为34μm以包括测量的17μm平均值的两倍尺寸。

超光谱显微镜。对于脂质报告物成像实验，将细胞铺板在35mm玻璃底培养皿(MatTek Corp.P35G-1.5-10-C)上，以便在测定当天存在大约0.5-0.8E6个细胞。在测定前24h，将细胞用新鲜培养基简单冲洗并且如所述培养。在测定那天，将测试培养基移除到无菌Eppendorf中，在迷你型离心机中旋转以沉淀细胞碎片，并且在37℃下储存。将贴壁细胞用Pulse培养基(无血清完全培养基)简单冲洗，然后暴露于纳米报告物(在Pulse培养基中0.2μg/mL)30分钟。暴露后，将过量的纳米报告物通过在完全培养基中冲洗去除，并且将储存的测试培养基重新添加到培养皿中用于5-h孵育时间段。在活的贴壁细胞上进行近红外超光谱显微术⁸⁷以获得来自内膜囊泡的荧光发射图。⁸⁸简言之，将730nm连续波二极管激光器通过纤维泵送到100x油物镜中以激发贴壁细胞内的荧光报告物。将收集的发射作为在1100与1200nm之间纠正的编码波长的超光谱成像立方体储存。通过在MATLAB中拟合洛伦兹函数来获得在立方体中每个像素的中心波长。在OriginPro 9.0中将代表100x放大的成像视场的在每个立方体中整个像素群体的中心波长用高斯函数拟合。报告了所得的拟合中心波长值。在主要的图直方图中，(*)代表来自位于拟合分析中不包括的细胞周边处的固定传感器的发射值。

孔板光谱。用定制的近红外光谱仪进行集合光谱测量。⁸⁹将脂质储液预溶解在甲醇中并且在水性缓冲液中平衡3h，然后添加传感器(在150μL缓冲液中1μg/mL传感器)。将传感器-脂质混合物在37℃下孵育5h，然后移至96孔板。每一行均含有空白孔。使用1秒的曝光时间，从500nm至839nm以3nm梯度通过超连续激光激发样品孔。获得从930nm至1368nm的发射，并且将数据校正并且在MATLAB中拟合到洛伦兹函数中以产生峰强度和中心波长。

免疫细胞化学。将细胞铺板在腔室载玻片(Millipore PEZGS0416/PEZGS0816)上并且如所述处理。在测定时，将细胞通过3.7％多聚甲醛在室温下固定15分钟(使用逐滴添加到温热培养物中的4℃37％储液)。将固定剂通过与在1x PBS中的75mM氯化铵的10分钟孵育灭活。用1x PBS冲洗两次后，将腔室在4℃下储存或立即加工(所有试剂缓冲液使用1xPHEM缓冲液制备：60mM PIPES，25mM HEPES，10mM EGTA，2mM MgCl2，5mM NaCl，70mM KCl，pH6.9)：室温下用0.1％Tween-20(TW20)透化5分钟，室温下用5％BSA/0.3％TW20封闭3h，然后4℃在5％BSA/0.3％TW20中在温和摇动的情况下与一抗孵育过夜。在三次室温洗涤，每次持续5分钟后，在添加5％山羊血清(ThermoFisher 016201)后在室温下将细胞如上封闭1-h。将荧光二抗稀释到5％BSA/0.3％TW20/5％山羊血清中，并且室温下将腔室在黑暗中孵育1-h。在一些情况下，在三个10分钟室温洗涤后，应用稀释的细胞核复染(在PBS中的Hoechst，ThermoFisher 62249)持续2分钟，然后洗涤2分钟。将封片介质(Life TechnologiesP36961)和盖玻片(Fisher 1254418)应用到每个载玻片上。根据靶标修改ICC方案：细胞核-二次孵育增加到2h；非细胞核内膜-减少至2％的固定剂，在100％-20℃甲醇中透化10分钟，随后如上所述冲洗一次并且封闭。使用以下一抗：抗HP1γ(1:100，Cell Signaling2619S)、抗磷酸化H2A.X(1:300，Cell Signaling 9718)、抗PLA2g7(1:50，Proteintech15526-1-AP)、抗PAFAH2(1:50，Proteintech 10085-1-AP)；二抗选自以下：Alexa488/568山羊抗小鼠、Alexa568抗兔IgG(Life Technologies A11001/A11004和A11011)、山羊抗兔IgGSuper Clonal 555/647(Invitrogen A27040/A27039)、或山羊抗大鼠IgG 555/647(LifeTechnologies 21247/21434)。

免疫印迹。将补充有100μM胃蛋白酶抑制剂A(Sigma 11359053001)的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo 78446)1:100稀释至RIPA缓冲液(Pierce 89901)或不具有乙基马来酰亚胺的变性免疫沉淀(IP)缓冲液(20mM HEPES，50mM NaCl，0.5％NP-40，1mM EDTA，0.5％SDS，0.5％SDC)中以制造工作细胞裂解缓冲液用于可溶性靶标(RIPA)或不溶性/膜相关靶标(IP缓冲液)。将细胞用冷1x HBSS洗涤两次。添加冰冷的裂解缓冲液，并且将细胞用橡胶淀帚刮下。将裂解物汇集到在湿冰上的Eppendorf中，并且设置为在4℃下混合30分钟。将裂解物与5个全冲程通过26G针均匀化，并且然后在4℃离心机中在16,000rcf下旋转20分钟。将RT Bradford试剂(BioRad 5000205)与含BSA标准品或样品裂解物的去离子水稀释的样品1:1混合。在Tecan Infinite M1000 Pro板读取器中在595nm下测量吸光度。加载缓冲液由1x Laemmli缓冲液/2-巯基乙醇(BioRad 1610747/1610710)和去离子水(如有必要)组成。将最终加载样品等分并且在-80℃下储存直至使用。将冷冻样品立即在75℃下加热8分钟(磷酸化蛋白靶标)或在90℃下加热6分钟(所有其他靶标)。将TGX预制凝胶(BioRad4568094，4％-20％)加载到填充有冷却的1x Tris/甘氨酸/SDS缓冲液(BioRad 1610732)的Tetra Cell电泳装置(BioRad 1658004)中。将1.5μL运行梯状标志(LI-COR 92698000)、10-30μL样品或10-30μL空白样品缓冲液注入每个泳道。电泳在110伏、CV下运行80分钟或直至适当的梯状标志分离。印迹三明治包含在甲醇中预孵育的0.2μm PVDF膜(BioRad1620174)，然后是在缓冲液润湿的堆叠纸(BioRad)与凝胶之间保持的转移缓冲液(BioRad10026938)。在7分钟的Midi-Turbo设置上使用Trans-Blot Turbo转移系统(BioRad1704150)。将印迹膜剪下并且立即在1xTBS中冲洗，然后移至封闭溶液(在1x TBS-T中的3％w/v BSA)(BioRad 1706435；Sigma P1379)并且在室温下搅动1.5h。将一抗稀释至1mL的封闭缓冲液中，在密封前将其夹在两个石蜡膜片之间的膜中。将膜三明治在4℃下在旋转的情况下孵育过夜。将膜从石腊模中剥离至1x TBS-T中，并且在室温下在搅动的情况下洗涤三次持续10分钟。将HRP缀合的二抗稀释在足够的封闭溶液中以在室温下在搅动的情况下覆盖膜1h。在再三次10分钟洗涤后，将膜在室温1x TBS中冲洗，然后在HRP底物中孵育1分钟(Millipore WBLUR0500)。为了曝光薄膜，将湿膜放置在x射线盒中的塑料插入件内。抗体如下：抗Cox1(1:500，Cell Signaling 9896)、抗Cox2(1:1000，Cell Signaling 12282)、抗p38 MAPK(1:1300，Cell Signaling 8690)、抗磷酸化p38 MAPK T180/Y182(1:500，CellSignaling 4511)、抗ATF-2(1:1000，Cell Signaling 9226)、抗磷酸化ATF-2T69/T71(1:1000，Cell Signaling 5112)、抗TBP(1:1500，Cell Signaling 44059)、抗cPLA₂(1:1000，Cell Signaling 5249)、抗磷酸化cPLA₂ S505(1:750，Cell Signaling 53044)、抗磷酸化IκBαS32(1:500，Cell Signaling 2859)、抗IκBα(1:1000，Cell Signaling 4812)、抗NF-κBp65(1:1000，Selleckchem.com A5075)、抗磷酸化NF-κB p65 S468(1:1000，CellSignaling 3039)、抗磷酸化NF-κB p65 S536(1:1000，Cell Signaling 3033)、抗TNF-α(1:1000，Cell Signaling11948)、抗IL-6(1:500，Cell Signaling 12912)、抗前列腺素E合酶(1:1000，Abcam ab180589)、抗p44/42MAPK(1:1000，Cell Signaling 4695)、抗磷酸化p44/42MAPK(1:1000，Cell Signaling 9101)、抗p16(1μg，Abcam 189034)、抗p21^waf1/cip1(1.6μg，Abcam 109199)、抗SAPK/JNK(1:1000；Cell Signaling 9252)、抗磷酸化SAPK/JNK T183/Y185(1:500；Cell Signaling 4668)、抗p19ARF(1:1000，Abcam ab80)、抗PLA2g7(1:400，Proteintech 15526-1-AP)、抗PAFAH2(1:400，Proteintech 10085-1-AP)；二抗是HRP缀合的抗兔(1:2000-1:5000，Cell Signaling 7074)。

SA-β-半乳糖苷酶染色。使用接种到6孔板中的细胞按照制造商的说明书(CellSignaling 9860)进行染色。处理后，将浓缩的Hoechst染料溶液添加到每个孔中以复染细胞核，并且在高增益荧光成像时引起细胞溶质渗出。对于分析和报告，使用Fiji的颜色解卷积插件通过显微镜上的彩色照相机获得的RGB图像解卷积到三个H&E DAB组分中。仅将通过(R＝0.650，G＝0.704，B：0.286)表示的颜色1用于分析。将相同的阈值应用于所得的单色图像(8位)以获得二元掩模。这些二元图像是β-Gal阳性掩模。使用从相同视场中获得的DAPI图像上的分段程序单独产生总细胞掩模，放大后用于增加细胞溶质渗出的强度。手动检查显示分段准确。每个视场中的β-Gal阳性细胞的分数(和报告的％)计算为：β-Gal覆盖的分段区域数/总细胞核数。合并每个生物重复的技术重复试样(每种条件5-10个)，用于确定阳性平均值和标准偏差％。使用Fiji的Azan Mallory设置(突出显示β-Gal染色)，每个图中的代表性图像是颜色解卷积的发射光图像。

泛sPLA2/PAF-AH活性和总脂质氢过氧化物。对于生色测定，根据制造商的说明，使用用于sPLA2(Cayman 765001)、PAF-AH测定(Cayman 760901)或脂质氢过氧化物(LPO)(Cayman 705003)的基于酶活性的商业试剂盒。所需的水和溶剂是LC-MS级的。简言之，诱导细胞使得在测定那天，6孔板的孔是90％-100％汇合。对于sPLA2测定，使用冷10kDa截止膜装置(Sigma UFC501096)，针对冷PBS旋转过滤裂解物/培养基两次。

脂质组学和分析。接种100mm板，使其生长并且诱导，使得在收获的那天，培养皿是90％-100％汇合。培养基是无酚红的。为了收获条件培养基，将全体积移至在干冰/醇浆液上的玻璃小瓶中，并且将等于1/4的收集体积的新鲜冷PBS体积用于冲洗细胞；将此体积收集并且汇集。为了收获裂解物，将单独的细胞培养皿用冷HBSS洗涤三次；在最后一次洗涤中，将液体吸出，并且将培养皿放置在干冰/醇浆液上以冷冻30秒。将1mL的2:0.8份甲醇:水混合物(冷却至-80℃并且储存在干冰上)添加到板上。将培养皿立即移至湿冰上，并且用橡胶淀帚刮下。将裂解物汇集于培养皿的底部，并且然后转移至在干冰上的玻璃小瓶中，直至-80℃储存。将裂解提取物小瓶用氮气短暂地冲洗。修改的Bligh-Dyer提取在专用的代谢组学实验室中进行。LC-MS分析使用了与Agilent 1260Infinity UHPLC集成的Agilent6490三重四极杆MS(正相用于甘油磷脂/鞘脂；反相用于甾醇/甘油脂质)。在正和负电喷雾模式下使用MRM方法定量。原始数据报告为Mol％，或将ng/mL的脂质物质相对于通过质谱仪检测的绝对总脂质丰度(ng/mL)归一化。报告的数据Mol％除以来自平行处理的板的总贴壁细胞计数，计算为相对于对照((iKRas/载体)-1)的变化倍数。

共聚焦显微术。使用AiryScan模块(Carl Zeiss)、63x 1.4NA油物镜和适当的激光线和过滤器，用点扫描LSM 880仪器进行高分辨率共聚焦扫描。对于固定的细胞实验，将样品用#1.5盖玻片封片，所述盖玻片与物镜接触。在实验中，曝光时间和检测器增益保持恒定。

宽视场显微镜。用Olympus IX51倒置显微镜和Olympus DP73(彩色)或XM10(灰度)照相机获得透射光和免疫荧光图像。X-Cite系列120Q专有汞蒸汽短弧激发灯提供了照明。适当的Ex/Em过滤器立方体是可获得的。在实验中，曝光时间和检测器增益保持恒定。

siRNA敲低。通过铺板靶细胞以在测定那天达到80％-90％汇合实现MEF系的瞬时敲低。对于扩展实验，将细胞铺板以在处理那天达到40％-50％汇合。对于每种siRNA和靶标孔，将两个Eppendorf管各自填充150μL的无血清且无抗生素的DMEM。通过将siRNA转移到一个管中制造转染混合物，使得在靶标孔中的最终体积是45nM。将9μL的RNAiMAX(Thermofisher 13778)添加到另一个管中。将siRNA体积添加到RNAiMAX体积中并且通过移液混合。将混合物在室温下孵育10分钟，并且然后逐滴添加至含有2mL的新鲜完整培养基的靶标孔中。将板旋动以混合并且在37℃下孵育48h。在暴露于siRNA的第一个24h后添加多西环素和其他化合物：将孔内容物的1mL等分试样取出，与化合物混合并且返回。siRNA如下：通用阴性对照(Sigma SIC001/002WDAA)、pla2g7#1(Sigma NM_013737SASI_Mm01_00162678)、pla2g7#2(Sigma NM_013737 SASI_Mm01_00162677)、pafah2#1(Sigma NM_133880SASI_Mm01_00180435)、pafah2#2(Sigma NM_133880SASI_Mm01_00180436)。

乳酸脱氢酶(LDH)测定。使用商业试剂盒(ThermoFisher C20300)测定培养条件培养基中的乳酸脱氢酶活性。简言之，在细胞处理和孵育板结束时进行手动搅动以去除任何松散的细胞。将条件培养基转移至15mL管中。将在去离子水中的9％v/v Triton X-100(TX100)添加至每个管中并且涡旋。将新鲜的完整培养基用9％Triton X-100涡旋，以制造阴性对照。为了制造阳性对照(即，100％裂解)，将一个孔的贴壁细胞暴露于一定体积的新鲜阴性对照混合物中，刮下并且返回到管中。在涡旋并且在室温下孵育5分钟后，将所有管离心(在室温下7,000rcf)。在制造商的384孔形式测定中使用适当体积的所得上清液。在每个时间点计算结果(死亡％)；报告死亡％比率(最终/初始时间)。

达雷拉迪处理后的细胞活力。在开始处理前1天，将5,000个细胞/孔的经多西环素诱导的iKRas或靶标小鼠/人细胞接种在96孔板中。在实验那天，将渐增浓度的达雷拉迪一式三份添加到条件培养基中。孵育48h后，使用

发光测定(Promega G9681)评估细胞活力。使用前，将重构的试剂盒试剂平衡至室温。为了引发细胞裂解，将50μL的试剂添加到每个孔中。将板在室温下在定轨振荡器上轻轻混合的情况下孵育10分钟。使用TecanInfinite M1000 Pro板读取器(Tecan Group Ltd.)测量发光。测定结果计算为占未处理对照的百分比。报告的达雷拉迪的EC₅₀范围为10-1000nM，取决于所使用的细胞类型和下游标记物。酶IC₅₀范围为1-10nM。

霍乱毒素亚基B(CTxB)标记。将细胞铺板在腔室载玻片或玻璃底培养皿上。如前所述将细胞用单独的或与霍乱毒素亚基B(CTxB，0.5μg)(ThermoFisher C22843)组合的Alexa647-ssDNA包被的报告物脉冲。去除培养基，并且将细胞在室温(RT)1x HBSS中冲洗三次。在最终时间点，通过将显微术级别的多聚甲醛(EMS 15714-S)逐滴添加在培养基上来将细胞原位固定并且轻轻旋动以产生2％v/v的最终浓度。在一些情况下，将细胞核Hoechst复染液从储液中以1:10稀释度添加到固定剂中。如下文所指示进行成像。获得了共聚焦影片(数据未示出)，其示出了在内腔中用CTxB和Alexa647标记的囊泡的相关运动。

反面高尔基网38-GFP融合表达.对于每个35mm培养皿，将2μg的cDNA、Tgoln1(SinoBiological MG5A1193-ACG)添加到含2μL PLUS试剂的无血清且无抗生素的DMEM中。将8μLLipofectamine LTX(Thermofisher 15338030)添加到无血清培养基的另一个管中。将管通过移液混合并且在室温下放置孵育10分钟。在转染那天将细胞铺板以达到50％-60％汇合。参见Girotti M,Banting G.“TGN38-green fluorescent protein hybrid proteinsexpressed in stably transfected eukaryotic cells provide a tool for the real-time,in vivo study of membrane traffic pathways and suggest a possible rolefor ratTGN38.”Journal of cell science 109(Pt 12),2915-2926(1996)。将混合物逐滴添加到在完全培养基中生长的细胞中。将培养皿旋动，并且然后在37℃下孵育36小时。在此时间段后，将细胞洗涤并且允许静置2小时，然后进行处理和成像。

电子显微术。使具有诱导细胞系的6孔板生长至80％-90％汇合，用1x HBSS洗涤两次，并且用可接受的EM固定剂固定。将板送至威尔康奈尔医学院(Weill CornellMedicine)的CLC成像核心设施(CLC Imaging Core Facility)用于制备和成像。

RNA测序(RNAseq)。为了确保足够的起始材料，载体和K-ras^G12V的两种生物重复试样各自在6孔板中生长，使得每种重复试样专用三个孔。在提取那天，将培养基吸出，并且将500μL的三唑LS试剂(Thermo 10296010)移液至每个孔中。将板放置在湿冰上，并且将每个孔的内容物搅动并且用橡胶淀帚刮下，以确保所有材料是均匀的，然后转移至预冷的2mLEppendorf(Fisher 05-402-24C)中。将样品在异丙醇/干冰浆液中快速冷冻并且在-80℃下储存直至通过MSKCC Integrated Genomics Operation(IGO)加工：提取、聚A富集、质量控制、文库制备并且测序(30-40百万读段，HiSeq-PE50)。使用针对比对、聚类、Htseq计数和差异表达的标准递送途径，由MSKCC生物信息学核心(BIC)进行下游生物信息学分析。

PC-SUV囊泡和ANS测定。将500mg的大豆磷脂酰胆碱(Lipoid)溶解于200μL的乙醇中；将25μL的乙醇-脂质溶液注射到750μL的去离子水中。将所得的MLV分散体用手动挤出机通过200nm膜挤出四次。由此产生的小单层囊泡(SUV)尺寸是约160nm。参见Portnoy E,等人“Indocyanine Green Liposomes for Diagnosis and Therapeutic Monitoring ofCerebral Malaria.”Theranostics 6,167-176(2016)。对于ANS测定，将8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐(Sigma 10417-F)的100μM储液溶解于去离子水中。在去离子水中产生十二烷基硫酸钠即SDS(Fisher BP166-100)的储备溶液。通过首先将过量的工作浓度的2μM ANS与1μMSUV(基于总脂质计算)混合在1x PBS中制备测定。向此混合物中添加媒介物空白、SDS或报告物。作为对照，在不存在SUV的情况下，将ANS与SDS或报告物混合。在使用UV透明半孔96孔板(Corning 3679)进行台式孵育30分钟后，在Tecan Infinite M1000 Pro板读取器(TecanGroup Ltd.)上测量荧光。所述程序设置为350nm激发，和470nm发射(5nm带宽)。使用顶部模式，在模式1(400Hz)手动增益为120和50次闪光。稳定时间为0ms，并且z位置是22303。

亚甲基蓝染色。在细胞系诱导24小时后，通过将1％w/v储备溶液(Fisher S25431)用1x HBSS稀释至0.05％v/v来产生工作染色。将细胞洗涤并且用此工作溶液覆盖，然后在37℃下孵育5分钟。将细胞彻底冲洗并且维持在RT新鲜的1x HBSS中用于随后成像。将宽视场显微镜、彩色照相机和10x目镜用于图像采集。

shRNA针对第7组基因的逆转录病毒递送。将RT3GEPIR miR-E载体骨架用于克隆在针对Renilla萤光素酶(载体对照)、pla2g7或pafah2的shRNA靶向序列(每种基因靶标中两个)中。shRNA插入物长度是22个碱基。通过部分使用用于shRNA产生的算法，由MSKCC的基因编辑和筛选核心(Gene Editing and Screening Core)产生和供应质粒DNA。参见PelossofR,等人“Prediction of potent shRNAs with a sequential classificationalgorithm.”Nature Biotechnology 35,350-353(2017)。使用接种到100mm LB琼脂平板(Teknova L111002)上的Mach1感受态细菌进行质粒扩增。首先将细菌储液使用制造商说明书(Zymo Research T3002)扩增，然后在-80℃下储存。质粒转化到细菌中是在湿冰上发生：将20μL的感受态Mach1与250pg的DNA轻轻混合。将此体积逐滴移液至37℃预热的100mm LB琼脂加羧苄青霉素(200μg)板(Teknova L1046)上并且然后进行珠滚动。将板在干燥的37℃培养箱中孵育18小时或直至形成稳健的菌落。通过将单个转化体菌落接种到3mL Terrific肉汤加200μg羧苄青霉素(Teknova T7510；加100μg羧苄青霉素，Fisher AAJ67159AD)来扩增菌落。将具有宽松配合盖的培养管在37℃下在振荡(225rpm)的情况下孵育15小时。对于归档，从所得的浑浊肉汤中取出900μL，并且与50％无菌甘油1:1混合并且在-80℃下冷冻。将剩余的肉汤(或如果未进行归档，则是全体积)旋转离心(6800rcf，3分钟，15℃)用于小量制备(Qiagen 27106)。为了重新扩增存档在甘油中的质粒，将无菌环简单地刮取甘油储液并且连续划线两个加羧苄青霉素200μg的100mm LB琼脂平板。使用衍生自HEK293T的Phoenix-AMPHO细胞系(ATCC CRL3213)实现逆转录病毒包装。将Phoenix扩增并且在第3代时以等分试样冷冻在液氮中；对于使用，将2.5E6个Phoenix细胞解冻至如其他地方所述的基础生长培养基(补充有10％热灭活的FBS但是不含抗生素)中，在转染前24小时接种在60mm板上以达到约80％汇合。在接种后12小时时更换新鲜培养基。针对每个60mm培养皿制造的转染混合物是：将6μg质粒DNA稀释至1mL生长培养基(无FBS/抗生素)中，然后1:1比率DNA:PLUS试剂(ThermoFisher 15338100)并且轻轻混合。将混合物在室温下孵育10分钟，然后添加20μL Lipofectamine LTX(ThermoFisher 15338100)；将此混合物在室温下孵育25分钟。将准备用于转染的来自Phoenix培养皿的2mL条件培养基与2mL新鲜培养基(无抗生素)混合。将25μM氯喹添加到此4mL体积中。将此混合体积替换到Phoenix培养皿上进行转染，轻轻操作以免扰动单层。然后将转染混合物逐滴添加至Phoenix培养皿中，使其在37℃下孵育9-10小时。在此之后，将培养基吸出，并且将补充有抗生素和10mg/mL无菌过滤的BSA(Sigma A1470，溶解于1x PBS中)的5mL新鲜培养基轻轻添加至每个培养皿中。将培养皿替换至培养箱中，并且假定Phoenix细胞100％汇合，通过将代表每个基因构建体的Phoenix条件培养基汇集并且通过无菌0.45μm过滤器过滤至少24小时后开始收获病毒上清液。由于培养基酸化，将过滤的病毒上清液用10％v/v HEPES(ThermoFisher 15630106)和25％v/v新鲜完全生长培养基缓冲。将过滤的病毒上清液快速冷冻并且在-80℃下在密封的锥形管中储存。通过首先在具有5％FBS的完全培养基中，将5E5个靶细胞/100mm培养皿铺板过夜，使靶MEF系感染病毒。将冷冻的病毒上清液在37℃水浴中迅速但不完全解冻。通过将4mL的病毒上清液用1mL补充有5％FBS的新鲜培养基稀释来制造转导混合物。然后将聚凝胺添加至4μg/mL的最终浓度，并且将混合物轻轻混合并且在室温下孵育10分钟。将转导混合物添加到抽吸的靶细胞板中。将培养皿在37℃下孵育8小时，然后添加新鲜的补充5％FBS的培养基以使培养皿体积达到10mL。继续孵育另外的36小时或直至细胞达到90％汇合。将条件培养基使用HBSS和完全培养基完全洗掉，并且然后将靶细胞分至新的培养皿中以在两天后达到80％-90％汇合，以开始双抗生素选择。为了选择，将完全生长培养基补充用于维持原始pTURN载体(杀伤浓度约150μg/mL)的30μg/mL潮霉素，和用于选择含shRNA构建体的细胞的3μg/mL嘌呤霉素。使未感染和未处理的对照平行地生长。每两天对靶细胞替换具有抗生素的完全培养基，直至对照培养物死亡。将在选择下增殖的细胞集落扩增，暴露于全潮霉素选择剂量持续另外的两天以确保原始诱导型cDNA的存在，并且然后收获用于储存或免疫印迹分析。测定显示，适当的系(iKRas/mirG7或iKRas/mirAH2相比于海肾对照)过表达RasG12V，并且具有降低水平的第7组或pafah2蛋白；然而，对照系当通过纳米传感器测定时示出了升高的炎性脂质含量，并且当用试剂盒测定时示出了升高的PAFAH活性。具有敲低的iKRas系在纳米传感器的反应中没有显示明显变化并且PAFAH的测定报告了在细胞裂解物和条件培养基中的升高的活性(数据未示出)。由于这些原因，未报告稳定的诱导型shRNA，而是使用瞬时RNAi。

分化标记物的免疫细胞化学。以下一抗用于间接免疫荧光：0.1μg/mL抗波形蛋白小鼠单克隆(Vector Labs VPV684)、1μg/mL抗SMA小鼠单克隆(Sigma A5228)、2.5μg/mL抗E-钙粘蛋白小鼠单克隆(BD 610181)、1:300抗突触融合蛋白6(Cell Signaling 2869)、1:300抗LAMP1(Abcam 25245)。结果显示，当与载体中的背景染色或阳性对照细胞系(HK-2或E-cad)相比时，iKRas没有表达任何这些末端分化标记物(数据未示出)。

试剂与材料。如所述制备纳米报告物；⁸⁸简言之，将原始纳米管(SWCNT)用单链DNA(ssDNA)序列5’-CTTCCCTTC-3’(IDT Technologies)悬浮，并且经受双水相(ATP)分离以纯化(9,4)手性物。将储备溶液保持在4℃下。对于共聚焦成像，使用1微摩尔的Alexa647-ssDNA(5’-CTTCCCTTCTT/iSp18//3AlexF647N/-3’，IDT Technologies)来产生报告物。通过在-20℃冷块中将混合物超声(2mm阶式探针，Sonics and Materials Inc.，脉冲：1分钟开，15秒关)30分钟实现溶解于0.1M NaCl中的1mg原始SWCNT(NanoIntegris，HiPco)与1mgssDNA的扩散。将所得的悬浮液在30,000rcf下台式离心10分钟。将上清液在171,180rcf下超离心30分钟。将所得的上清液针对去离子水旋转过滤(Millipore Amicon，100kDa)三次，重悬浮，并且然后以30,000rcf离心10分钟。收集顶部90％的上清液并且通过UV-Vis-NIR分光光度法(Jasco V-670)测量。用于计算浓度的消光系数是：ε(910nm)＝0.02254L·mg^-1·cm^-1。通过Memorial Sloan Kettering Media Preparation Core Facility制备PBS和HBSS。DMSO(Fluka BP2311)用分子筛(Fluka 69839)储存。此工作中使用的药物和化合物如下：盐酸多西环素溶液(Sigma D3072)、伐瑞拉迪(Selleckchem S1110)、MJ-33(Cayman90001844)、BEL(Cayman 70700)、MAFP(Cayman 70660)、达雷拉迪(Selleckchem S7520)、利勒拉迪(MCE HY-102004/CS-0022446)、ML256(馈赠)、AA39-2(馈赠)、P11(Cayman 17507)、TSI-01(Cayman 17628)、甲基氨基甲酰基PAF C-16(Cayman 60908)、(±)-α-生育酚(SigmaT3251)、磷酰胆碱氯化钙盐四水合物(Sigma P0378)、亚油酸(Sigma L1376)、1-C16醚MG(Avanti 999971)、18:1BMP(S,R)(Avanti 857133)、C18 LPA(Avanti 857228)、18:1鞘氨醇-1-磷酸酯(Avanti 860492)、18:0PA(Avanti 830865)、8:0LPC(Avanti 855275)、14:0LPC(Avanti 855575)、16:0LPC(Avanti 855675)、C16 2:0PAF(Avanti 878110)、18:0LPC(Avanti 855775)、18:1LPC(Avanti 845875)、20:0LPC(Avanti 855777)、24:0LPC(Avanti855800)、14:0PC(Avanti 850345)、16:0PC(Avanti 850355)、18:0PC(Avanti 850365)、16:0LPS(Avanti 858142)、16:0PS(Avanti 840037)、18:0LPS(Avanti 858144)、14:0LPE(Avanti 856735)、18:0LPE(Avanti 856715)、14:0PE(Avanti 850745)、16:0LPG(Avanti858122)、16:0PG(Avanti 840455)、16:0LPI(Avanti 850102)、16:0PI(Avanti 850141)、NaCl(Fisher S2711)、NP-40(Sigma I8896)、十二烷基硫酸钠(SDS)(Sigma 436143)、脱氧胆酸钠(SDC)(Sigma D6750)、EDTA(Sigma EDS)；TAK-632(500nM；Selleckchem S7219)、GDC-0941(500nM；Selleckchem S1065)、Torin1(500nM；Selleckchem S2827)、曲美替尼(500nM；Selleckchem S2673)、洛玛莫德(500nM；Selleckchem S7215)、JNK-IN-8(20nM；Selleckchem S4901)、GDC-0994(500nM；Selleckchem S7544)、醋酸地塞米松(Cayman22286)、BQU57(Selleckchem S7607)、QNZ(EVP4593)(Selleckchem S4902)、亮抑蛋白酶肽(Selleckchem S7380)、胃蛋白酶抑制剂(Selleckchem S7381)、E-64(SelleckchemS7379)、16:0LPC(Avanti 855675)、达雷拉迪(Selleckchem S7520)、AA39-2(gift)、LPDS(Sigma S5394)、脱脂BSA(级分V无脂肪酸BSA，Sigma A7030，批次号5LBQ0873V)、二十二碳六烯酸(DHA)(Sigma D2534)、亚油酸(LA)(Sigma L1376)和亚麻酸(ALA)(Sigma L2376)。

体内存活研究。为了产生同基因KP移植肺癌模型，将衍生自KrasG12D/+；Trp53-/-(KP)GEMM肺肿瘤的细胞系用逆转录病毒萤光素酶(Luc)-GFP构建体感染，并且将重悬浮于400μL PBS中的5000个KP肿瘤细胞尾静脉注射到7周龄雌性C57BL/6小鼠中。⁹⁰将小鼠随机分为多个研究群组，然后用媒介物或达雷拉迪处理。周一至周五，通过口服灌饲每天一次施用处理。将异种移植后第73天未死于疾病相关的发病的小鼠通过在Xenogen IVIS Spectrum(Caliper Life Sciences)上的生物发光成像(BLI)监测肿瘤形成，并且评价它们的重量变化。在所述研究中保持生物发光阳性小鼠，而将生物发光阴性小鼠实施安乐死，并且收获它们的肺用于组织学分析。将组织冲洗并且固定在4℃缓冲的4％多聚甲醛中持续24-48小时，并且移至4℃70％乙醇中用于长期储存、包埋、切片和染色(H&E，抗GFP一抗，抗Ki-67一抗)。由于一些小鼠没有成功地接种来自注射体积的肿瘤细胞，收获来自第73天存活组的小鼠并且通过组织学评价。从最终的研究分析中排除了组织发育不良阴性的组织；在最终的研究分析中保留组织发育不良阳性的组织。调整每个群组的N值以在最终分析之前反映组织学结果。因为没有疾病相关的发病的非常早的死亡(第24天)，将对生物发光阴性的一个处理群组的小鼠标记为最终分析中的异常值，并且一旦在疾病相关的死亡(第91天)之前，对肺生物发光阳性的一个处理群组的小鼠的体重下降则对其实施安乐死，以保持合理的研究时间线。

人表达分析。来自TCGA泛癌图集研究(TCGA PanCancer Atlas Studies)⁹¹的人数据经由cBioPortal获得。⁹²进行了pla2g7、pafah2、kras和hras基因的查询。输出数据是RNAseq V2，通过中值表达(线性或log2放大的)排序。

结果

致癌基因RAS扩增诱导衰老相关的应激和损伤。

评估在通过Tet-诱导型K-或-H-ras^G12V cDNA(iK/HRas)稳定转导的SV40大T-永生化鼠胚胎成纤维细胞中RAS应激和损伤的程度。首先测量暴露于多西环素的iKRas、iHRas或载体(对照)MEF的增殖(图1)。为了比较，将从通过Cre重组酶预处理的胚胎产生的内源性致癌性K-ras(eKRas)细胞永生化并且连同配对的野生型MEF进行增殖测试。载体对照、可逆的Tet-ON系与内源性突变体之间的增殖方面有明显的差异。虽然KRAS扩增阻滞细胞，但是内源性KRAS促进过度增殖。

为了研究这两种模型中的信号传导变化，对细胞裂解物进行24h免疫印迹(图2)。免疫印迹示出了在iKRas细胞中致癌基因RAS过表达和下游ERK1/2磷酸化。值得注意的是，磷酸化p53示出了没有显著增加；然而，在整个多西环素处理过程中p21^waf1/cip1表达升高并且维持表达(图3)。与扩增的RAS细胞相比，在eKRas内源性RAS细胞中，ERK磷酸化不可检测，并且p21^waf1/cip1几乎不可检测。为了确定是否存在致癌基因RAS应激的其他关键属性，测试了DNA损伤反应。图4示出了来自急性双链断裂标记物γH2A.X的免疫荧光的定量。类似地，进行基因毒性应激标记物磷酸化JNK和磷酸化ATF-2的测定(图5)。在iKRas细胞(而不是eKRas或对照)中所有的应激标记物均升高。

为了确认致癌基因RAS剂量与预成熟衰老之间的关系，诸位发明人评估了RAS突变细胞是否展现出衰老标记物的差异。保持对应激诱导的衰老的两个标记物最小值，诸位发明人测定了衰老相关的β-半乳糖苷酶和异染色质聚集(HP1γ)。这些测定中的两种测定报告了在培养72h后仅在iKRas细胞中具有升高的衰老相关标记物表达(图6)。在eKRas细胞的情况下，β-Gal信号是随机的。鉴于由iKRas细胞表达的明显致癌基因应激表型，诸位发明人调查了它们是否会产生急性SIR/SASP炎症表达特征。24h诱导的细胞培养物的RNA测序，以及代表性SIR/SASP标记物的免疫印迹报告了先天性炎症反应的上调。基于来自长期细胞培养物的SIR和SASP表型的先前的发现，^{23,28,33,34,35,36,37}我们的特征分析表明iKRas(而不是eKRas细胞)模拟对扩增的致癌基因RAS的应激和损伤反应。

致癌基因RAS应激触发第7组sPLA2活性。

研究了在iKRas和eKRas细胞中的sPLA2亚型的活性。使用两种脂质底物运行生色酶测定：二庚酰基-磷脂酰胆碱(PC)(迄今为止已知最新的癌症相关的sPLA2亚型的底物)或血小板活化因子(PAF)(第7组和第8组sPLA2亚型的底物)(也称为血小板活化因子乙酰水解酶，PAF-AH)。制备来自扩增的iKRas模型、载体对照细胞或增生eKRas的细胞裂解物和条件培养基，并且与巯基化PC或PAF一起孵育，与DNTB(Ellman试剂)混合。将纯化的酶，蜂毒衍生的第3组sPLA2(其中PC是底物)或人PAF-AH(其中PAF是底物)插入样品中作为阳性测定对照。观察到iKRas细胞中没有PC特异性活性(图7)，但是观察到PAF-AH特异性活性升高；对照和eKRas裂解物中均不含高于检测限的活性(图8)。这些结果证明，通过扩增的RAS诱导的损伤诱导细胞内第7组和/或第8组sPLA2亚型。

为了评估细胞内蛋白表达是否与测量的第7组sPLA2活性一致，进行共聚焦显微术并且分析mRNA序列数据。使用抗PLA2第7A组抗体的免疫细胞化学显示，iKRas细胞含有7A亚型的内源性过表达和点状(囊泡)定位(图9)。发现sPLA2第7B组亚型(其在应激期间从细胞溶质重新定位至ER/golgi)³⁸在iKRas细胞中广泛染色并且具有低强度。这些结果表明，第7B组在iKRas细胞中不是细胞内PAF-AH活性的主要来源。此外，结果与pla2g7 RNA的32倍扩增一致。第7B组和第8组酶在iKRas细胞中并未类似地过表达。

iKRas内膜中的脂质调节异常是由于PLA2G7活性和氧化的磷脂。

因为第7A组sPLA2是动物血清脂蛋白的正常组分，所以诸位发明人总结了，iKRas细胞可能展现与此循环酶的内源性活性相关的调节异常的细胞内脂质代谢。使用先前验证的纳米传感器评估细胞内涵体细胞器中的脂质调节异常，所述纳米传感器通过在活细胞的内体腔中其近红外发射向较小(更蓝)值的移位来测量可溶性脂质。^39,40诸位发明人首先查询传感器是否将响应于sPLA2的底物/产物。³⁹证实报告物是pH不敏感的和膜双层不可渗透的。首先探询的是传感器在体外对单独脂质(代表广泛的内源性表面活性剂级(水溶性)物质)的反应，其中发现报告物的有色反应对溶血磷脂酰胆碱(lysoPC)、血小板活化因子(PAF)和溶血磷脂酰丝氨酸(lysoPS)最敏感。在远高于其内源性临界胶束浓度(pM-nM，高于此点的游离溶解度可忽略不计)的脂质浓度下观察到另外的敏感性(例如对极长链lysoPC和PC)。

为了评估活细胞中的脂质调节异常，将脂质纳米传感器引入RAS或载体转化的细胞系的培养基中。利用近红外高光谱显微术获得在平行的PI3K途径中空间上在iKRas、iHRas、eKRas、载体对照细胞和具有突变的MEF内的纳米传感器的荧光光谱。将数据拟合以确定纳米传感器发射带的中心波长，然后将其映射回细胞的明视场图像上并且绘制在直方图中。使用此方法，测量了致癌基因RAS诱导后24h和72h的平均传感器发射波长。还测量了在培养具有十八烷基化(组成型)Akt1(myrAkt1)或短指导RNA(以敲除Pten)的永生化MEF后24h平均传感器发射波长(图10)。发现如与载体或信号传导对照细胞相比，仅组成型RAS突变体展现出显著地蓝移反应。eKRas细胞展现出显著小于iKRas细胞中移位的较小蓝移。如与不影响传感器反应的mTOR/AKT途径效应子的药理学抑制剂相比，MAPK途径效应子如RAF、MEK和ERK的药理学抑制剂(分别为TAK-632、曲美替尼和GDC-0994)显著降低了iKRas中相对于载体的脂质纳米传感器反应(图11)。囊泡降解途径的抑制剂类似地没有消除纳米传感器反应(图12)。这些结果表明，来自致癌基因RAS扩增的损伤直接诱导不特异于任一个内膜运输途径的内体/内膜脂质调节异常。

接下来测量的是这种细胞内报告物反应对sPLA2介导的溶血磷脂和相关脂质物质生成是否敏感。在将细胞用一系列PLA2抑制剂处理后24h，使用纳米传感器测量脂质积累。纳米传感器反应显示，iKRas细胞中的脂质调节异常仅由第7组sPLA2(PLA2G7A/B)酶活性的抑制剂防止(图13)。抑制剂以以下顺序衰减报告物反应：达雷拉迪>利勒拉迪≈ML256>AA39-2。达雷拉迪和利勒拉迪是有效且可逆的PLA2G7A抑制剂，而ML256是PLA2G7A的共价抑制剂，而AA39-2是PLA2G7B的共价抑制剂。^41,42不能衰减iKRas细胞中的脂质报告物反应的其他PLA2抑制剂包括伐瑞拉迪(其抑制PLA2G2/5/10/12亚型)、MJ-33、花生四烯酸酯的过渡态模拟物⁴³(据报道使PRDX6和PLA2G15失活)、BEL(PLA2G6的抑制剂)、MAFP(细胞溶质PLA2G4的抑制剂)、P11(PLA2G8的抑制剂)和TSI-01(PAF生物合成的抑制剂)。与RAS损伤细胞中的第7组活性一致，PLA2G7A刺激物和抗炎药地塞米松⁴⁴增加了载体系中的报告物反应(图14)。这些结果表明，第7组sPLA2(PLA2G7A/B)活性(但不是广泛的sPLA2活性)诱导内膜脂质调节异常，并且来自致癌基因RAS扩增的损伤显著加剧了这种调节异常。

还检查了iKRas脂质调节异常是否可能由膜磷脂氧化引起。首先，为了评估iKRas细胞的氧化环境，将活细胞培养物用氧化还原染料亚甲基蓝染色，其显示出升高的细胞染色。此结果支持升高的细胞内氧化环境。然后将iKRas细胞与亲脂性α-生育酚(维生素E)(常见的膜抗氧化剂)一起孵育。⁴⁵在与维生素E一起预孵育的细胞中报告物反应消除(图15)，这表明脂质调节异常是由于对膜的氧化损伤导致可溶性溶血磷脂的释放造成的。

接下来研究了内体脂质调节异常是否需要血清脂蛋白的多不饱和脂肪酸(PUFA)组分，所述组分对于合成第7组基质PAF⁴⁶和氧化的磷脂(PAF-类似物)是必需的。将细胞在有或没有两种必需PUFA(花生四烯酸(AA)和二十二碳六烯酸(DHA))的脂蛋白缺陷血清中预孵育。观察到在PUFA耗尽后脂质报告物反应消除，但是在PUFA补充之后拯救了此反应(图16)，这表明此脂质调节异常也需要第7组sPLA2酶的多不饱和脂肪酸底物。

进行了致癌基因RAS扩增细胞的电子显微术，以进一步研究脂质调节异常表型。透射电子显微术(TEM)示出了iKRas和iHRas系中异常的层样结构存在(图17)。这些结构显现类似于板层小体。⁴⁷这些图像进一步支持内体腔和/或分泌内膜隔室内的脂质调节异常，并且这些图像也支持作为致癌基因RAS诱导的损伤的重要组分的PLA2G7的细胞内保留。

基于迄今为止提出的报告物数据，测试了一种工作模型，其中对内膜的直接损伤通过第7组sPLA2酶的作用增加了PAF-类似物底物和溶血磷脂的产生。

RAS扩增介导的脂质氧化通过PLA2G7增强了细胞溶血磷脂。

为了解决工作模型，研究了通过iKRas细胞产生的脂质物质是否与来自第7组sPLA2酶的活性一致。在iKRas上进行总膜脂质氢过氧化物生色测定以测试第7组sPLA2酶底物的存在。测定(图18)显示相对于对照iKRas细胞含有升高的脂质氢过氧化物水平，这支持第7组酶底物的产生增加。

为了确定iKRas代谢是否产生与第7组sPLA2活性一致的脂质特征，制备iKRas细胞裂解物和条件培养基用于甘油磷脂、甾醇、甘油脂质和鞘脂的LC-MS/MS。发现在突变体培养物(与载体对照相比)的条件培养基中富含lysoPAF和lysoPC物质。iKRas细胞裂解物含有较少的总饱和/不饱和磷脂、缩醛磷脂和醚磷脂，但是它们含有与载体对照相比更多的溶血磷脂。这些结果支持增加的脂质调节异常包括sPLA2产物的结论。

诸位发明人推断iKRas细胞中饱和/不饱和磷脂的损失和溶血磷脂的升高可能是由于直接氧化修饰、酶促作用或两种活性。为了了解第7组sPLA2活性是否确实促成磷脂调节异常，在将iKRas细胞用第7组酶抑制剂达雷拉迪处理后评估脂质代谢。脂质组学数据示出了溶血磷脂水平(尤其是lysoPC以及具有PUFA的其他类别像lysoPE、lysoPI和lysoPS)的显著衰减(图19)，这表明第7组酶活性至少部分地负责iKRas中的溶血膦脂产生。另外的脂质组学分析发现在iKRas细胞裂解物和培养基中的脂质物质的一般损失，这证明了iKRas表型是广泛分解代谢的和/或证明脂质的损伤和修饰并不是磷脂类别特有的。

第7组sPLA2底物和产物脂质差异性地影响细胞增殖。

由于sPLA2酶亚型已经被描述为肿瘤抑制剂和肿瘤促进剂二者，^{48,49,50,51,52,53}所以使用两种代表性脂质-第7组sPLA2和产物探询iKRas细胞。首先，将载体对照细胞与渐增浓度的16:0lysoPC(第7组sPLA2产物)和16:0甲基氨基甲酰基PAF(cPAF)(底物)一起孵育。发现lysoPC产物在近lysoPC临界胶束浓度(CMC，大约8-10μM)阻滞载体对照细胞增殖(图20)。此浓度下的阻滞表明直接的洗涤剂样效果。在另一方面，第7组sPLA2底物cPAF对在亚临界和临界胶束浓度(类似于lysoPC的CMC)二者下的对照细胞增殖展现出轻度刺激作用。因此，在载体对照细胞中，与酶底物相比，第7组sPLA2产物的细胞内积累更大程度地影响增殖。在用临界胶束浓度的相同脂质探询iKRas和eKRas细胞时，lysoPC促进了可忽略的阻滞作用或降低的阻滞作用，而cPAF促进了对iKRas和eKRas细胞二者的有效阻滞作用(图21)。因此，来自这些研究的数据支持，与产物脂质相比，第7组底物的细胞内积累是显著更抑制细胞的。此外，eKRas细胞对不存在底物脂质的显著RAS相关损伤或第7组活性更敏感。

为了研究第7组与RAS介导的细胞阻滞之间的分子联系，评估了第7组底物/产物的细胞膜加载是否会影响内源性p21^waf1/cip1。将载体和iKRas细胞与lysoPC或cPAF脂质一起孵育24h。免疫印迹显示，在暴露于cPAF(PLA2G7底物)(而不是lysoPC产物)后磷酸化ERK和p21^waf1/cip1表达增加(图22)，这支持此脂质基质的积累参与了致癌基因RAS诱导的阻滞。

为了评估通过致癌基因RAS扩增是否内源性地刺激了此脂质底物相关的阻滞，诸位发明人进行了PAF受体(PAF-R)(在PAF类似物存在下下调的细胞内靶标)的免疫印迹。发现PAF-R在暴露于cPAF的载体细胞中下调，而iKRas细胞中的PAF-R状态与脂质加载无关(图22)。因为第7组底物的细胞加载触发致癌基因RAS扩增后观察到的阻滞，数据支持RAS损伤本身产生这些细胞抑制性/细胞毒性脂质物质。

第7组sPLA2敲低杀伤具有致癌基因KRAS的细胞。

为了评估第7组sPLA2的功能是否是去除有害的PAF类似物脂质物质，诸位发明人评估了第7组的敲低是否调节p21^waf1/cip1表达。将靶向第7组sPLA2基因的商业化siRNA与iKRas细胞一起孵育。诸位发明人对裂解物进行免疫印迹以评估基因敲低对阻滞的影响，其中发现磷酸化ERK和p21^waf1/cip1表达消失，这支持致癌基因诱导的阻滞需要第7组表达。然而，第7组酶的去除应当允许诱导损伤的PAF类似物的更大的积累，这似乎是与以下发现不一致的期望：仅cPAF脂质底物促进磷酸化ERK和p21^waf1/cip1表达。

在此工作过程中作出的观察结果向诸位发明人表明，iKRas表型依赖于血清批次和细胞PUFA加载。为了确定磷酸化ERK和p21^waf1/cip1表达是否依赖于PUFA，诸位发明人在将siRNA对汇集在一起后重复上述实验，并且将培养基用15μM PUFA混合物(花生四烯酸、二十二碳六烯酸和亚油酸/亚麻酸各5μM)补充。所得的免疫印迹显示，在存在添加的PUFA的情况下敲低后磷酸化ERK/p21^waf1/cip1表达持续存在。类似地，在存在PUFA的情况下PLA2G7亚型的药理阻断增加了磷酸化ERK/p21^waf1/cip1表达，这与允许底物在细胞内积累的这些酶的敲低一致。从第7组sPLA2蛋白表达对PUFA的存在的依赖性推导出PUFA加载对此酶途径的重要性。因此，得出结论，PUFA衍生的底物的存在是酶诱导和损伤介导的阻滞二者的重要的上游介导者。

由于第7组sPLA2酶清除细胞抑制/细胞毒性磷脂，因此诸位发明人评估了第7组敲低是否影响细胞增殖和存活。如前所述，将细胞维持在补充有PUFA和siRNA的培养基中。在多西环素处理后72h，计数贴壁细胞数。发现第7组敲低刺激了载体对照细胞增殖，而不刺激iKRas细胞增殖(图23)。为了评估细胞死亡，在72h时去除培养基，并且测试细胞破裂相关的乳酸脱氢酶(LDH)活性(图24)。敲低导致iKRas细胞(而不是载体对照细胞)中LDH活性增加，这表示iKRas培养物中的细胞死亡增加。

为了评估具有致癌基因RAS的癌症细胞对第7组sPLA2的开发最多的药理抑制剂的反应，将多种肿瘤衍生的细胞系用达雷拉迪(最初开发用于治疗心血管疾病)探询。将iKRas细胞和衍生自肺、胰腺和结直肠肿瘤的细胞系与达雷拉迪一起孵育并且测定活力(图25)，其中所有具有RAS的系在低微摩尔浓度的达雷拉迪下死亡。天然表达高水平的第7组sPLA2的对照细胞系RAW 264.7鼠巨噬细胞在很大程度上不受处理的影响。因为RAW 264.7细胞表达第7组sPLA2酶，所以这些结果表明显著的膜损伤的存在是药物敏感性的起因。为了确定达雷拉迪是否可以选择性地杀伤RAS突变细胞，将eKRas(具有较小的致癌应激并且没有显著的7A亚型)或野生型SV40 MEF暴露于药物。活力数据显示，达雷拉迪杀伤eKRas的效力是相比于野生型细胞的两倍(图26)。

诸位发明人接下来评估了第7组抑制是否会影响具有RAS的鼠癌症模型的开发。使用了非小细胞肺癌的同基因KrasG12D/+；Trp53-/-(KP)移植物模型。^54,55将衍生自GEMM肺肿瘤的萤光素酶化细胞静脉内施用至WT C57BL/6小鼠。在初始异种移植物注射后的两个不同的时间点开始将小鼠通过口服灌饲用媒介物或达雷拉迪处理，以评估处理对癌症发展的影响。在用达雷拉迪处理的小鼠的肺癌相关死亡和发病的两种情况下观察到显著的延迟(图27)。此外，诸位发明人观察到在媒介物处理(而不是达雷拉迪)的群组的其他器官中的非原发性肿瘤。

最终，为了研究这种靶标跨癌症的组织和人相关性，诸位发明人探询了TCGA数据库关于两个第7组亚型的表达信息，并且分析了来自胰腺癌的两个研究的回顾性数据。诸位发明人发现，第7组转录物在多种人癌症(包括胰腺癌)中表达和扩增。几乎所有的这些癌症均显示出kras和hras转录物的过表达和扩增，包括经常具有点突变和组成型形式的RAS的组织。

讨论

在此实施例部分，研究了在RAS-突变肿瘤中促成细胞存活的炎症相关脂质调节异常。虽然在具有致癌基因ras的恶性细胞和组织中发现了多种sPLA2亚型，^{48,49,50,51,52} _, ⁵³但是在这些炎症介质与RAS之间的直接关系是非白细胞模型的新生研究领域。在胚胎细胞系模型中，诸位发明人在发育的小鼠中发现明显升高的p21^waf1/cip1、成熟前衰老标记物以及DNA损伤和应激的标记物(γH2A.X、磷酸化JNK和磷酸化ATF-2)，这些总起来支持在基因扩增与来自致癌基因RAS的体内致癌性之间的联系。^19,20,21,22与衰老标记物的上调一起，SIR/SASP基因和蛋白质上调表明iKRas细胞模拟炎症表型。^{23,28,35,56,57}值得注意地是，eKRas(单等位基因过度增殖突变细胞系)除p21^waf1/cip1表达轻微升高之外没有显示与iKRas细胞中相同的损伤迹象。

无偏生物化学特征分析允许诸位发明人鉴定广泛分泌的Pla2基因家族的独特生物活性酶亚型PLA2G7，作为损伤的介质。共聚焦成像示出了第7A组sPLA2的大量过表达，而RNAseq报告了Pla2g7基因表达(但不是其同源物Pafah2(第7B组))的32倍升高。使用检测在活细胞的内体腔中的脂质的纳米传感器，诸位发明人在此系统中探索了脂质调节异常。使用荧光纳米传感器衡量脂质积累，诸位发明人发现致癌基因RAS扩增诱导细胞内的内体隔室中大量脂质调节异常以及内膜运输缺陷。只有第7组sPLA2和RAS-ERK信号传导的特异性抑制剂消除了脂质调节异常。使用纳米传感器，诸位发明人发现eKRas(内源性突变体)中的部分细胞内脂质调节异常；然而，eKRas没有显示出显著的应激反应或第7A组表达。这些发现类似于此致癌基因的剂量依赖性性质，而且重要的是，因为组成型RAS信号传导可以直接产生氧化剂^14,18,58,59，所以这些发现支持在eKRas中p21^waf1/cip1的部分脂质表型和轻度上调反映了氧化磷脂底物的产生不足以触发第7A组。已经显示了p21^waf1/cip1表达、细胞衰老和氧化损伤反馈之间的联系。^60,61应激和炎症诱导型第7A组亚型可能需要RAS扩增的高度升高的应激以用于表达，即使这些亚型通过直接氧化攻击相互矛盾地失活。⁶²

诸位发明人进一步研究了在异常积累中涉及的脂质的来源和身份。发现培养基衍生的多不饱和脂肪酸(PUFA)对于细胞内脂质调节异常是必需的，这是所预期的，因为在Pla2家族中的膜活性酶在PUFA释放中发挥重要作用^46,63，而第7组酶用氧化的PUFA选择性地攻击膜脂质。^64,65,66,67细胞内脂质调节异常对PUFA加载和亲脂性抗氧化剂处理的敏感性与第7组酶的膜损伤反应性作用一致。

第7组sPLA2酶催化的主要产物是可溶性溶血磷脂和氧化的脂肪酸；当所述酶降解时，此催化活性应停止。然而，诸位发明人试图阻断内体降解，对脂质调节异常没有影响(图23)。不受理论束缚，这可以通过第7组酶是酸不稳定的并且在酸性pH下失活⁶⁸ _, ⁶⁹的这一事实解释，而在Ras转化的成纤维细胞中的内膜隔室是碱性的⁷⁰并且支持酶活性。

使用不可降解的PAF类似物底物脂质测试炎症第7A组活性与RAS介导的存活之间的联系。诸位发明人证明了致癌基因诱导的生长延迟的重要标记物(p21^waf1/cip1)与此细胞抑制性底物脂质类别的细胞内积累之间的联系。基于其中必须将细胞毒性底物脂质清除到膜外以存活的模型，本公开文本中讨论的数据确实支持这一点，因为第7组基因沉默未消除p21^waf1/cip1表达，而可用的第7组酶的化学抑制促进了p21^waf1/cip1表达。重要的是，诸位发明人示出了第7组基因沉默选择性地杀伤RAS损伤细胞，而不是对照细胞。

成纤维细胞(包括胚胎系)是一种经常使用的模型系统，以研究ras转化并且最近研究由衰老相关应激诱导的SIR/SASP现象。成纤维细胞可以在特定条件下合成典范PAF或在存在临界胶束浓度的外源PAF脂质的情况下产生IL-6。^71,72在这里，诸位发明人发现RAS过表达导致细胞裂解物中升高的IL-6水平，这支持了通过致癌基因RAS扩增的损伤刺激了保守的炎症反应。值得注意的是，在白细胞中的损伤相关分子模式⁷³和来自紫外线辐射的DNA损伤信号传导^74,75也对第7组/PAF/p21^waf1/cip1途径(其中氧化修饰是关键特性)有明显影响。虽然诸位发明人未探询在此细胞背景中第7组活化或转录的下游细节，但是最近来自RAS癌发生期间NRF2活化和抗氧化基因表达的研究证据表明，对抗氧化应激和损伤(包括维持低水平的氧化)是内源性RAS突变体细胞的存活和增殖的关键事件。⁷⁶严重损伤更可能使细胞生长停止；因此，修复这种损伤的机制将选择出侵袭性细胞。

PLA2G7A是主要衍生自白细胞的一种可溶脂蛋白相关丝氨酸水解酶，而PLA2G7B(pafah2)从细胞溶质转移至ER膜并且首先被描述为在肝脏、^65,77红细胞⁷⁸和粟酒裂殖酵母(S.pombe.)⁶⁴中的氧化剂解毒剂。这两种酶均被认为在大多数底物所在的膜-水界面的水性侧起作用，但有可能针对细胞溶质底物的活性是相关的。此活性的至少一部分是定位于内体隔室的内膜。

基于纳米传感器和脂质组学的发现，即可溶性溶血磷脂的表象与第7组活性相关，诸位发明人研究了第7组sPLA2酶的抑制剂。发现第7组抑制剂可以选择性地杀伤RAS过表达细胞。针对这些应激酶的开发最多的化合物是达雷拉迪(第7A组和第7B组抑制剂)，所述达雷拉迪在未能满足其预期的心血管临床终点之前达到3期试验。虽然达雷拉迪在体内安全且显然是无副作用的，但是大多数细胞具有针对其管家酶功能的第7B组酶。因此，全面抑制可选择性地影响膜损伤显著或周转缓慢的细胞类型。许多人赘生物过表达或扩增RAS，包括导致组成型信号传导的点突变。

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虽然已经说明和描述了某些实施方案，但是本领域普通技术人员，在阅读上述说明书之后，可以实现对如本文所述的本发明技术的化合物或盐、药物组合物、衍生物、前药、代谢物、互变异构体或其外消旋混合物的变化、等效取代或其他类型的改变。上述每个方面和实施方案还可以包括如关于任何或所有其他方面和实施方案所公开的此类变型或方面，或将所述变型或方面并入上述每个方面和实施方案中。

本发明技术也并不受限于本文描述的具体方面，所述具体方面旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。如本领域技术人员将清楚的是，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行许多修改和改变。本领域技术人员根据前述描述将清楚，除了本文列举的方法和设备外，在本发明技术范围内的功能上等效的方法。此类修改和改变旨在落入所附权利要求的范围内。应当理解，本发明技术并不限于具体方法、试剂、化合物、组合物、标记的化合物或生物系统，它们当然可以改变。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述具体方面的目的，而不意图限制。因此，预期被视为示例性的说明书仅具有仅由所附权利要求、其中的定义及其任何等效语指示的本发明的广度、范围和精神。

本文说明性描述的实施方案可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下进行合适的实践。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被扩展地且无限制地解读。另外，本文采用的术语和表述已经用作描述性术语而非限制性术语，并且没有意图使用这类术语和表述来排除所示或所述的特征的任何等同物或其部分，但是应认识到在所要求保护的技术的范围内的各种修改是可能的。另外，短语“基本上由……组成”将被理解为包括那些具体叙述的要素和那些实质上不影响所要求保护的技术的基本和新颖特征的另外要素。短语“由……组成”排除未指定的任何要素。

另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。落在总公开文本之内的更窄的种类和亚属的分类中的每个也形成了本发明的一部分。这包括本发明的总描述，具有从属中除去任何主题的条件或否定式限制，无论切除的材料是否在本文中被明确地引述。

如由本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述相同的范围并使相同的范围能够分解成至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围都可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包括所列举的数字，并且是指可以随后分解成如上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员可理解，范围包括每一个别成员。

将本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其他文件(例如，期刊、文章和/或教科书)均通过引用并入本文，如同具体且单独地指示将每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文件通过引用以其整体并入一样。在通过引用并入的文本中包含的定义与本公开文本中的定义相抵触的程度上，将其排除。

本发明技术可以包括但不限于以下带字母条款中所述的特征和特征的组合，可以理解，以下条款不应解释为限制所附权利要求的范围或授权所有此类特征必须包括在此类权利要求中：

A.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物以治疗癌症；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；并且其中所述癌症具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增；任选地其中与健康对照细胞相比，所述癌症展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

B.根据条款A所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胆管癌、软组织肉瘤、血液或造血细胞癌、乳腺癌、肺癌、子宫或子宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、间皮瘤癌、皮肤癌、头颈癌、神经内分泌癌或瘤、食道癌、睾丸癌、前列腺癌或胸腺癌。

C.根据条款A或条款B所述的方法，其中所述癌症包括：腺瘤、腺癌、子宫癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、移行细胞癌、浆液性癌、透明细胞癌、粘液性腺癌、未分化癌、去分化癌、浆液性腺癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、发育不良性病变、或其任两种或更多种的组合。

D.根据条款A-C中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

E.根据条款A-D中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.01mg/kg至约20mg/kg的所述化合物。

F.根据条款A-E中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.25mg/kg至约10mg/kg的所述化合物。

G.根据条款A-F中任一项所述的方法，其中所述化合物是达雷拉迪。

H.根据条款A-F中任一项所述的方法，其中所述化合物是利勒拉迪。

I.根据条款A-F中任一项所述的方法，其中所述化合物是AA39-2。

J.根据条款A-F中任一项所述的方法，其中所述化合物是ML256。

K.根据条款A-J中任一项所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：烷基化剂；亚硝基脲；抗代谢药；蒽环类；拓扑异构酶II抑制剂；有丝分裂抑制剂；抗雌激素；孕激素；芳香酶抑制剂；抗雄激素；LHRH激动剂；皮质类固醇激素；DNA烷基化剂；紫杉烷；长春花生物碱；微管抑制剂、及其任两种或更多种的组合。

L.根据条款A-K中任一项所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：白消安、顺铂、卡铂、奥沙利铂、八面体铂(IV)化合物、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、二氯甲二乙胺(氮芥)、美法仑、替莫唑胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷(ara-C)、氟达拉滨、培美曲塞、道诺霉素、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、泼尼松、地塞米松、L-天冬酰胺酶、放线菌素D、沙利度胺、维甲酸、伊马替尼(格列卫)、吉非替尼(易瑞沙)、厄洛替尼(特罗凯)、利妥昔单抗(瑞图宣)、贝伐单抗(安维汀)、伊匹单抗、纳武单抗(欧狄沃)、派姆单抗(齐内达)、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、醋酸甲地孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、及其任两种或更多种的组合。

M.根据条款A-L中任一项所述的方法，其中所述施用包括口服施用、静脉内施用或肌内施用。

N.根据条款A-M中任一项所述的方法，其中所述方法包括给所述受试者口服施用有效量的所述化合物以治疗所述癌症。

O.一种减慢或逆转受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；其中所述有效量是有效减慢或逆转所述肿瘤生长的量；并且其中所述肿瘤是具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体的癌症的肿瘤，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增；任选地其中与健康对照细胞相比，所述癌症展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

P.根据条款O所述的方法，其中所述肿瘤是选自以下的癌症的肿瘤：胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胆管癌、软组织肉瘤、血液或造血细胞癌、乳腺癌、肺癌、子宫或子宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、间皮瘤癌、皮肤癌、头颈癌、神经内分泌癌或瘤、食道癌、睾丸癌、前列腺癌或胸腺癌。

Q.根据条款O或条款P所述的方法，其中所述肿瘤是包括以下的癌症的肿瘤：腺瘤、腺癌、子宫癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、移行细胞癌、浆液性癌、透明细胞癌、粘液性腺癌、未分化癌、去分化癌、浆液性腺癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、发育不良性病变、或其任两种或更多种的组合。

R.根据条款O-Q中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

S.根据条款O-R中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.01mg/kg至约20mg/kg的所述化合物。

T.根据条款O-S中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.25mg/kg至约10mg/kg的所述化合物。

U.根据条款O-T中任一项所述的方法，其中所述化合物是达雷拉迪。

V.根据条款O-T中任一项所述的方法，其中所述化合物是利勒拉迪。

W.根据条款O-T中任一项所述的方法，其中所述化合物是AA39-2。

X.根据条款O-T中任一项所述的方法，其中所述化合物是ML256。

Y.根据条款O-X中任一项所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：烷基化剂；亚硝基脲；抗代谢药；蒽环类；拓扑异构酶II抑制剂；有丝分裂抑制剂；抗雌激素；孕激素；芳香酶抑制剂；抗雄激素；LHRH激动剂；皮质类固醇激素；DNA烷基化剂；紫杉烷；长春花生物碱；微管抑制剂、及其任两种或更多种的组合。

Z.根据条款O-Y中任一项所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：白消安、顺铂、卡铂、奥沙利铂、八面体铂(IV)化合物、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、二氯甲二乙胺(氮芥)、美法仑、替莫唑胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷(ara-C)、氟达拉滨、培美曲塞、道诺霉素、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、泼尼松、地塞米松、L-天冬酰胺酶、放线菌素D、沙利度胺、维甲酸、伊马替尼(格列卫)、吉非替尼(易瑞沙)、厄洛替尼(特罗凯)、利妥昔单抗(瑞图宣)、贝伐单抗(安维汀)、伊匹单抗、纳武单抗(欧狄沃)、派姆单抗(齐内达)、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、醋酸甲地孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、及其任两种或更多种的组合。

AA.根据条款O-Z中任一项所述的方法，其中所述施用包括口服施用、静脉内施用或肌内施用。

AB.根据条款O-AA中任一项所述的方法，其中所述方法包括给所述受试者口服施用有效量的所述化合物。

AC.根据条款O-AB中任一项所述的方法，其中所述施用包括将所述化合物注射到所述肿瘤中或所述肿瘤近侧。

AD.一种减慢或逆转受试者的赘生物生长和/或减慢或逆转所述受试者的赘生物的增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；其中所述有效量是有效减慢或逆转所述赘生物生长和/或减慢或逆转所述赘生物增殖的量；并且其中所述赘生物是具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体的癌症的赘生物，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增；任选地其中与健康对照细胞相比，所述癌症展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

AE.根据条款AD所述的方法，其中所述赘生物是选自以下的癌症的赘生物：胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胆管癌、软组织肉瘤、血液或造血细胞癌、乳腺癌、肺癌、子宫或子宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、间皮瘤癌、皮肤癌、头颈癌、神经内分泌癌或瘤、食道癌、睾丸癌、前列腺癌或胸腺癌。

AF.根据条款AD或条款AE所述的方法，其中所述赘生物是包括以下的癌症的赘生物：腺瘤、腺癌、子宫癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、移行细胞癌、浆液性癌、透明细胞癌、粘液性腺癌、未分化癌、去分化癌、浆液性腺癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、发育不良性病变、或其任两种或更多种的组合。

AG.根据条款AD-AF中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

AG.根据条款AD-AG中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.01mg/kg至约20mg/kg的所述化合物。

AI.根据条款AD-AH中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.25mg/kg至约10mg/kg的所述化合物。

AJ.根据条款AD-AI中任一项所述的方法，其中所述化合物是达雷拉迪。

AK.根据条款AD-AI中任一项所述的方法，其中所述化合物是利勒拉迪。

AL.根据条款AD-AI中任一项所述的方法，其中所述化合物是AA39-2。

AM.根据条款AD-AI中任一项所述的方法，其中所述化合物是ML256。

AN.根据条款AD-AM中任一项所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：烷基化剂；亚硝基脲；抗代谢药；蒽环类；拓扑异构酶II抑制剂；有丝分裂抑制剂；抗雌激素；孕激素；芳香酶抑制剂；抗雄激素；LHRH激动剂；皮质类固醇激素；DNA烷基化剂；紫杉烷；长春花生物碱；微管抑制剂、及其任两种或更多种的组合。

AO.根据条款AD-AN中任一项所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：白消安、顺铂、卡铂、奥沙利铂、八面体铂(IV)化合物、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、二氯甲二乙胺(氮芥)、美法仑、替莫唑胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷(ara-C)、氟达拉滨、培美曲塞、道诺霉素、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、泼尼松、地塞米松、L-天冬酰胺酶、放线菌素D、沙利度胺、维甲酸、伊马替尼(格列卫)、吉非替尼(易瑞沙)、厄洛替尼(特罗凯)、利妥昔单抗(瑞图宣)、贝伐单抗(安维汀)、伊匹单抗、纳武单抗(欧狄沃)、派姆单抗(齐内达)、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、醋酸甲地孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、及其任两种或更多种的组合。

AP.根据条款AD-AO中任一项所述的方法，其中所述施用包括口服施用、静脉内施用或肌内施用。

AQ.根据条款AD-AP中任一项所述的方法，其中所述方法包括给所述受试者口服施用有效量的所述化合物。

AR.根据条款AD-AQ中任一项所述的方法，其中所述施用包括将所述化合物注射到所述赘生物中或所述赘生物近侧。

其他实施方案连同这些权利要求有权享有的等同物的全部范围阐述于以下权利要求中。

Claims (44)

1.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物以治疗癌症；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；并且其中所述癌症具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增；任选地其中与健康对照细胞相比，所述癌症展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胆管癌、软组织肉瘤、血液或造血细胞癌、乳腺癌、肺癌、子宫或子宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、间皮瘤癌、皮肤癌、头颈癌、神经内分泌癌或瘤、食道癌、睾丸癌、前列腺癌或胸腺癌。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症包含腺瘤、腺癌、子宫癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、移行细胞癌、浆液性癌、透明细胞癌、粘液性腺癌、未分化癌、去分化癌、浆液性腺癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、发育不良性病变、或其任两种或更多种的组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.01mg/kg至约20mg/kg的所述化合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.25mg/kg至约10mg/kg的所述化合物。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述化合物是达雷拉迪。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述化合物是利勒拉迪。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述化合物是AA39-2。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述化合物是ML256。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：烷基化剂；亚硝基脲；抗代谢药；蒽环类；拓扑异构酶II抑制剂；有丝分裂抑制剂；抗雌激素；孕激素；芳香酶抑制剂；抗雄激素；LHRH激动剂；皮质类固醇激素；DNA烷基化剂；紫杉烷；长春花生物碱；微管抑制剂、及其任两种或更多种的组合。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：白消安、顺铂、卡铂、奥沙利铂、八面体铂(IV)化合物、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、二氯甲二乙胺(氮芥)、美法仑、替莫唑胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷(ara-C)、氟达拉滨、培美曲塞、道诺霉素、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、泼尼松、地塞米松、L-天冬酰胺酶、放线菌素D、沙利度胺、维甲酸、伊马替尼(格列卫)、吉非替尼(易瑞沙)、厄洛替尼(特罗凯)、利妥昔单抗(瑞图宣)、贝伐单抗(安维汀)、伊匹单抗、纳武单抗(欧狄沃)、派姆单抗(齐内达)、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、醋酸甲地孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、及其任两种或更多种的组合。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用包括口服施用、静脉内施用或肌内施用。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括给所述受试者口服施用有效量的化合物以治疗所述癌症。

15.一种减慢或逆转受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；其中所述有效量是有效减慢或逆转所述肿瘤生长的量；并且其中所述肿瘤是具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体的癌症的肿瘤，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增；任选地其中与健康对照细胞相比，所述癌症展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤是选自以下的癌症的肿瘤：胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胆管癌、软组织肉瘤、血液或造血细胞癌、乳腺癌、肺癌、子宫或子宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、间皮瘤癌、皮肤癌、头颈癌、神经内分泌癌或瘤、食道癌、睾丸癌、前列腺癌或胸腺癌。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤是包括以下的癌症的肿瘤：腺瘤、腺癌、子宫癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、移行细胞癌、浆液性癌、透明细胞癌、粘液性腺癌、未分化癌、去分化癌、浆液性腺癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、发育不良性病变、或其任两种或更多种的组合。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者是人。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.01mg/kg至约20mg/kg的所述化合物。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.25mg/kg至约10mg/kg的所述化合物。

21.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述化合物是达雷拉迪。

22.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述化合物是利勒拉迪。

23.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述化合物是AA39-2。

24.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述化合物是ML256。

25.根据权利要求15所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：烷基化剂；亚硝基脲；抗代谢药；蒽环类；拓扑异构酶II抑制剂；有丝分裂抑制剂；抗雌激素；孕激素；芳香酶抑制剂；抗雄激素；LHRH激动剂；皮质类固醇激素；DNA烷基化剂；紫杉烷；长春花生物碱；微管抑制剂、及其任两种或更多种的组合。

26.根据权利要求15所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：白消安、顺铂、卡铂、奥沙利铂、八面体铂(IV)化合物、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、二氯甲二乙胺(氮芥)、美法仑、替莫唑胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷(ara-C)、氟达拉滨、培美曲塞、道诺霉素、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、泼尼松、地塞米松、L-天冬酰胺酶、放线菌素D、沙利度胺、维甲酸、伊马替尼(格列卫)、吉非替尼(易瑞沙)、厄洛替尼(特罗凯)、利妥昔单抗(瑞图宣)、贝伐单抗(安维汀)、伊匹单抗、纳武单抗(欧狄沃)、派姆单抗(齐内达)、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、醋酸甲地孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、及其任两种或更多种的组合。

27.根据权利要求15所述的方法，其中所述施用包括口服施用、静脉内施用或肌内施用。

28.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括给所述受试者口服施用有效量的所述化合物。

29.根据权利要求15所述的方法，其中所述施用包括将所述化合物注射到所述肿瘤中或所述肿瘤近侧。

30.一种减慢或逆转受试者的赘生物生长和/或减慢或逆转所述受试者的赘生物的增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物；其中所述化合物是以下中的至少一种：达雷拉迪、利勒拉迪、AA39-2或ML256；其中所述有效量是有效减慢或逆转所述赘生物生长和/或减慢或逆转所述赘生物增殖的量；并且其中所述赘生物是具有KRAS或HRAS中的一种或两种的组成型活性变体的癌症的赘生物，其中所述组成型活性变体是功能获得性突变、重复或基因扩增；任选地其中与健康对照细胞相比，所述癌症展现出PLA2G7A和PAFAH2中的至少一种的表达和/或活性升高。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述赘生物是选自以下的癌症的赘生物：胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胆管癌、软组织肉瘤、血液或造血细胞癌、乳腺癌、肺癌、子宫或子宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、间皮瘤癌、皮肤癌、头颈癌、神经内分泌癌或瘤、食道癌、睾丸癌、前列腺癌或胸腺癌。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述赘生物是包括以下的癌症的赘生物：腺瘤、腺癌、子宫癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、移行细胞癌、浆液性癌、透明细胞癌、粘液性腺癌、未分化癌、去分化癌、浆液性腺癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、发育不良性病变、或其任两种或更多种的组合。

33.根据权利要求30所述的方法，其中所述受试者是人。

34.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.01mg/kg至约20mg/kg的所述化合物。

35.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者(按照化合物的质量/所述受试者的质量)施用约0.25mg/kg至约10mg/kg的所述化合物。

36.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述化合物是达雷拉迪。

37.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述化合物是利勒拉迪。

38.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述化合物是AA39-2。

39.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述化合物是ML256。

40.根据权利要求30所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：烷基化剂；亚硝基脲；抗代谢药；蒽环类；拓扑异构酶II抑制剂；有丝分裂抑制剂；抗雌激素；孕激素；芳香酶抑制剂；抗雄激素；LHRH激动剂；皮质类固醇激素；DNA烷基化剂；紫杉烷；长春花生物碱；微管抑制剂、及其任两种或更多种的组合。

41.根据权利要求30所述的方法，其中所述施用进一步包括施用选自以下的化学治疗剂：白消安、顺铂、卡铂、奥沙利铂、八面体铂(IV)化合物、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、二氯甲二乙胺(氮芥)、美法仑、替莫唑胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷(ara-C)、氟达拉滨、培美曲塞、道诺霉素、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、泼尼松、地塞米松、L-天冬酰胺酶、放线菌素D、沙利度胺、维甲酸、伊马替尼(格列卫)、吉非替尼(易瑞沙)、厄洛替尼(特罗凯)、利妥昔单抗(瑞图宣)、贝伐单抗(安维汀)、伊匹单抗、纳武单抗(欧狄沃)、派姆单抗(齐内达)、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、醋酸甲地孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、及其任两种或更多种的组合。

42.根据权利要求30所述的方法，其中所述施用包括口服施用、静脉内施用或肌内施用。

43.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法包括给所述受试者口服施用有效量的所述化合物。

44.根据权利要求30所述的方法，其中所述施用包括将所述化合物注射到所述赘生物中或所述赘生物近侧。

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