CN114350818A - 与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记及其应用，属于生物技术领域，该分子标记包括：SNP5、SNP6和/或SNP7；其中，所述SNP5位于如SEQ ID No.1所示序列的Chr2:48996109位点，等位基因为C＞A；所述SNP6位于如SEQ ID No.1所示序列的Chr2:48996350位点，等位基因为T＞C；所述SNP7位于如SEQ ID No.1所示序列的Chr2:48996351位点，等位基因为插入/缺失；本发明可以准确鉴定不同周龄的番鸭产蛋性状，为分子标记辅助选择育种提供新的分子标记。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记及其应用。
背景技术
番鸭(Cairina moschata)是一种特殊的水鸟，和家鸭来自不同属，其具有耐热性强和产肉量高的优点，但是产蛋性能低下。番鸭的产蛋高峰期在35～53周之间，覆盖了大部分产蛋期。番鸭虽在国内已经大规模养殖，但是产蛋性能差，缺乏系统化养殖，导致番鸭产蛋性状参差不齐，影响企业的生产率和经济效益。
产蛋性状属于低遗传力性状，基于性状选择的育种方式，具有周期长的特点，育种进展缓慢，难以取得明显效果，导致提高番鸭的产蛋性能是十分具有挑战性的工作。利用与数量性状相关的分子标记，以标记信息为辅助信息，可以从分子水平准确快速地分析个体的遗传组成，从而实现基因型的选择。而且，充分利用遗传标记、系谱和表型信息，与常规育种方法相比，信息量更丰富，选择准确性更高。单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism,SNP)是指基因组DNA序列由于插入、缺失、颠换和转换等单个碱基变化而引起的基因组DNA多态性，具有稳定遗传，易于检测等特性。SNP可作为分子标记信息用于分子标记辅助选择(Molecular Mark-assist Selection,MAS)，提高选种准确性和选育效果。
催乳素(Prolaction，PRL)是一种由脑垂体前叶分泌的多肽激素，已被证明在所有脊椎动物中具有多种多样的生物活性和功能。家禽孵化行为的发生是由催乳素的分泌增加所引起的，这通常导致卵巢退化，因此，禽类的催乳素在产蛋量中起着至关重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明发现番鸭催乳素基因上游非翻译区存在多个SNP位点，并将其与番鸭的产蛋性状关联分析，为MAS提供新的SNP分子标记。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记，包括：SNP5、SNP6和/或SNP7；其中，所述SNP5位于如SEQ ID No.1所示序列的Chr2:48996109位点，等位基因为C＞A；所述SNP6位于如SEQ ID No.1所示序列的Chr2:48996350位点，等位基因为T＞C；所述SNP7位于如SEQ ID No.1所示序列的Chr2:48996351位点，等位基因为插入/缺失。
本发明还提供一种上述的与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记的检测试剂在检测番鸭产蛋性状中的应用。
本发明还提供一种扩增上述的与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记的引物，包括如SEQ ID No.2-5所示序列的引物。
本发明还提供一种上述的引物在鉴别番鸭的产蛋性状或制备鉴别番鸭的产蛋性状的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种用于鉴别番鸭产蛋性状的试剂盒，包括上述的引物。
本发明还提供一种鉴别番鸭产蛋性状的方法，鉴别待测样本番鸭中如上述的分子标记的基因型。
进一步地，该方法包括以下步骤：
(1)提取待测样本番鸭的基因组DNA；
(2)利用上述的引物进行PCR扩增，获取扩增引物；
(3)将所述扩增产物经测序后，获取分子标记的基因型；
(4)根据基因分型结果，判断所述待测样本番鸭的产蛋性状。
进一步地，在步骤(2)中，所述PCR扩增的扩增体系包括：2xTaq MasterMix 15μL、混合引物各1.2μL、超纯水10.6μL和DNA2μL；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃ 2min，94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s，30cycles，72℃ 2min。
本发明还提供一种上述的与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记、上述的引物、上述的试剂盒在番鸭育种中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过分析催乳素基因，发现该基因存在多个与番鸭产蛋性状显著相关的SNP位点，为MAS提供新的SNP分子标记，并且通过试验验证，SNP5(C48996109A)与白番鸭41-58周龄产蛋量、300日龄产蛋量、合格产蛋量以及总产蛋量显著相关，SNP6(T48996350C)与白番鸭42-45周龄产蛋量和300日龄产蛋量显著相关，SNP7(I48996351D)与白番鸭43-53周龄产蛋量显著相关。其他SNP位点与产蛋性状关联性未达到显著水平(P＞0.05)。可见，本发明提供的分子标记可以准确的鉴定番鸭不同周龄的产蛋性能，以为番鸭的选育提供科学数据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为PCR产物凝胶电泳图和SNP峰图；其中，A-B.PCR产物凝胶电泳图，图中M表示2000的Marker，最亮的条带为750bp；C-I.SNP1-SNP7不同基因型测序峰图；SNP1和SNP2在群体中只发现TT型和TG(TA)型个体；
图2为白番鸭产蛋曲线。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例
1材料与方法
1.1动物样品
选取387只60周龄的雌性白番鸭(广东温氏南方家禽育种有限公司仁马种鸭场)。采集皮下静脉血液2mL，-80℃保存，用作DNA提取样本。记录选择群体的家系信息和开产日龄、每日产蛋量、总产蛋数以及产蛋合格数等繁殖性状。
1.2主要仪器
BIO-RAD T100 PCR仪(品牌：BIO-RAD；货号：1861096；美国伯乐)、北京六一DYCP-31DN核酸电泳仪(品牌：北京六一；货号：413-1402；北京六一生物科技有限公司)。
1.3主要试剂
快速血液基因组DNA提取试剂盒(品牌：诺唯赞；货号：DC111-01；江苏诺唯赞生物科技股份有限公司)、2xTaq MasterMix(含染料)(品牌：康为世纪；货号：CW0682；江苏康为世纪生物科技股份有限公司)、DNA marker(品牌：诺维赞；货号：MD101；江苏诺维赞生物科技股份有限公司)、高纯度低电渗琼脂糖(品牌：擎科；货号：TSJ001；北京擎科生物科技有限公司)。
2实验方法
2.1引物设计
根据Ensembl公布的番鸭(家养型)基因组(GCA_009194515.1)催乳素基因(ENSCMMG00000003520)，使用NCBI(National Center for Biotechnology InformationSearch database)的Primer-BLAST工具设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司提供引物合成服务。引物序列相关信息如表1所示。
表1 PCR扩增引物序列
2.2血液基因组DNA提取
参照快速血液基因组DNA提取试剂盒操作手册提取血液基因组DNA。
2.3催乳素基因外显子序列的PCR扩增
以上述378只白番鸭半同胞个体的血液基因组DNA为模板配制PCR扩增反应体系(表2)。反应程序如表3所示。反应完成后，由广州天一辉远基因科技有限公司提供Sanger测序服务。
表2反应体系
表2反应程序
2.4SNPs确定与基因分型
利用SnapGene 4.3.6软件对PCR扩增产物的Sanger测序结果进行比对处理，通过碱基峰图进行基因分型。
2.5基因型与产蛋性状的关联分析
利用SAS 9.4软件的GLM程序进行关联分析。模型为：
Yijk＝μ+Gi+Mj+Sk+eijk
Yijk表示表型值，μ表示均值，Gi表示基因型效应，Mj表示母性效应，Sk表示基因型与母性的互作效应，eijk表示残差。
使用Haploview 4.2软件进行哈迪温伯格平衡(HWE)计算和单倍型分析。
3结果
3.1催乳素基因上游非翻译区的PCR扩增以及SNP筛选
通过表1所示2对PCR引物扩增得到催乳素基因上游非翻译区(5’UTR)以及内含子1共1323bp(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)。其中使用PRL-SNP-F1/R1引物扩增的PCR产物802bp(图1A)，使用PRL-SNP-F2/R2引物扩增的PCR产物834bp(图1B)。通过将Sanger测序得到的“.ab1”文件进行比对，共得到7个SNP位点，都位于催乳素基因上游非翻译区(图1C-I，表4)，分别为：SNP1(T48995528G)、SNP2(T48995550A)、SNP3(A48995598T)、SNP4(T48995958C)、SNP5(C48996109A)、SNP6(T48996350C)、SNP7(I48996351D)。哈迪温伯格平衡计算结果显示，SNP3、SNP4、SNP6和SNP7符合哈迪温伯格平衡(表5)。
表3催乳素上游非翻译区的SNPs
表4 SNPs基因型分布
HWE＝哈迪温伯格平衡检测P值；I＝插入，D＝缺失。
SEQ ID No.1(催乳素PCR序列)：
AGGCTAGTTTGTGGATTACCACAGACACATCAGATGTGGAAACAAATCCCCCTGATTACGACAGCATGTGTTTTGAGTATGGTAGACAATGTACATCTTTTACGCAAAG
GTTTTCATGTATAGAAAATAATCTTATCATTTCTGATTTGTTT
TGTTCTTTAAATAATGCTGAT
TAATCATTAAACTTTATGATTAAATAGTAAACATGCAACTTCATCTT
GTTGTTATACATTATTACTTTTTTAATATAAGAACTGTCCCTGTTTCTCTAAACATACCTCATCCTGAGGACCAGTTATATCATGACAATGTAATCTCTTTCTTAACTGTATGAAGCTATATACTCACGATGTCATATCTATAATATTACATATAATGACCTGTCTTTCCACAAGCTGCCATTATCCTTCTCTAGACAATTTATGCTATTTCTTTTCCTGTGGATATTATATTGTTCCCCTTTCCCAAATAATCAGAATTTTAACATTGGAAGGCTGAACATTGGAAAGCTGAAGAGATGAGGATGGATGAAAAGACAGCTGTGGGAAGGGGGAACAATAGGCTATAAACATTGAGGA
ATCTGTCTCAGAATTGACAACTAGAGCTTTCTAGGAACAGTGGCATTTTCAGAGCAAAATTTTGGCATTCTCTTCATCAAACTATACTCAGGATCCCACAACTGAAATTCTAATGAAATTCCCTCTCACAGTTACAAATAATAAAAAAAAA
TGAATATGAATGTGGAAGAAAGGCAGTTTGATGTTTGTAATTATCGAGGTAAACTCCACGACCTGTTGAATGTATGCAAAATGGACCCCGGATGGTGTATATAAACCTGGTATGTGCAGAAAATAAAAGCAAGTATTGAGACTTCTTTCTGGTAGAGCAAGTCATCCTACAGGGTCTCTACCATGAGCACCAAGGGGGATTCGTTGAAAGGTAAGACTTTAGCCATTCACTTGTCGATAA
TTTATGTTTGTTTTTTGTTTGTTTGTTAGTTGTTGTTTTTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTTGTTTTTTGTTTTACTTTAGATTGAATTTGGAAGTAACTGACAGGTAACAACTCCAGAAACTGAGGTCTTCCAAGACATCCAGTTTTCGAGTAATGGTGAAACTTGTCTCTGCTTCAAATGTTTAGTGTTCAAAATTTGGAATTAGCAGGCAGTTTGATCTCTTTTTTACTCAGTTTTTGATCTCTCAAGACTACCTTTGCACTGAGCAGTGTCACTGAAATTTGGCTTTCAGGTTATGACACCTGCACAAAAAAAGACTGGATCCAGACTGCTTTGCTACTCATGA
PRL-SNP-F1:AGGCTAGTTTGTGGATT
PRL-SNP-R1:TAAACTCCACGACCTGTT
PRL-SNP-F2:ATTGGAAGGCTGAACAT
PRL-SNP-R2:TGCTTTGCTACTCATGA
SNP位点：
上游非编码区：GATTAAATAGTAAACA
内含子区：ACTCCAGAAAC
3.2SNP位点与繁殖性状的关联分析
如表6所示，通过分析，SNP5与白番鸭41-58周龄产蛋量、300日龄产蛋量、合格产蛋量以及总产蛋量显著相关(P<0.05)；SNP6与白番鸭42-45周龄产蛋量和300日龄产蛋量显著相关(P<0.05)；SNP7与白番鸭43-53周龄产蛋量显著相关(P<0.05)。
表6 SNPs与繁殖性状关联性
不同基因型的表型数据如表7-9所示。
表5 SNP5不同基因型表型数据
表8 SNP6不同基因型表型数据
表9 SNP7不同基因型表型数据
N为实际用于GLM分析的个体数；所有数据均以“均值±标准误“形式展示。
4讨论
白番鸭开产后产蛋量快速上升至32周龄达到最高水平，之后在最高水平维持5周左右开始缓慢下降，直至300日龄(42周龄)一直维持较高水平(图2)。催乳素上游非翻译区所得SNPs中SNP5和SNP6与白番鸭的300日龄产蛋量显著相关。在51周龄之前，SNP5的CC型产蛋量小于AA型，AA型产蛋量小于CA型；而52-58，AA型周龄优势更大，CA型最小，因此，AA型具有高产的优势。在42周龄之后，SNP6基因型TT和SNP7基因型II相较于CC(TC)和DD(ID)更具有优势。SNP6和SNP7具有完全连锁，可通过检测单个位点填充。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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ataataaaaa aaaactgaat atgaatgtgg aagaaaggca gtttgatgtt tgtaattatc 780
gaggtaaact ccacgacctg ttgaatgtat gcaaaatgga ccccggatgg tgtatataaa 840
cctggtatgt gcagaaaata aaagcaagta ttgagacttc tttctggtag agcaagtcat 900
cctacagggt ctctaccatg agcaccaagg gggattcgtt gaaaggtaag actttagcca 960
ttcacttgtc gataattttt atgtttgttt tttgtttgtt tgttagttgt tgttttttgt 1020
tgttgttgtt gttgtttgtt ttttgtttta ctttagattg aatttggaag taactgacag 1080
gtaacaactc cagaaactga ggtcttccaa gacatccagt tttcgagtaa tggtgaaact 1140
tgtctctgct tcaaatgttt agtgttcaaa atttggaatt agcaggcagt ttgatctctt 1200
ttttactcag tttttgatct ctcaagacta cctttgcact gagcagtgtc actgaaattt 1260
ggctttcagg ttatgacacc tgcacaaaaa aagactggat ccagactgct ttgctactca 1320
tga 1323
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggctagttt gtggatt 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacaggtcgt ggagttta 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attggaaggc tgaacat 17
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcatgagtag caaagca 17
Claims (9)
1.一种与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记，其特征在于，包括：SNP5、SNP6和/或SNP7；其中，所述SNP5位于如SEQ ID No.1所示序列的Chr2:48996109位点，等位基因为C＞A；所述SNP6位于如SEQ ID No.1所示序列的Chr2:48996350位点，等位基因为T＞C；所述SNP7位于如SEQ ID No.1所示序列的Chr2:48996351位点，等位基因为插入/缺失。
2.一种权利要求1所述的与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记的检测试剂在检测番鸭产蛋性状中的应用。
3.一种扩增权利要求1所述的与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记的引物，其特征在于，包括如SEQ ID No.2-5所示序列的引物。
4.一种权利要求3所述的引物在鉴别番鸭的产蛋性状或制备鉴别番鸭的产蛋性状的试剂盒中的应用。
5.一种用于鉴别番鸭产蛋性状的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物。
6.一种鉴别番鸭产蛋性状的方法，其特征在于，鉴别待测样本番鸭中如权利要求1所述的分子标记的基因型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样本番鸭的基因组DNA；
(2)利用权利要求3所述的引物进行PCR扩增，获取扩增引物；
(3)将所述扩增产物经测序后，获取分子标记的基因型；
(4)根据基因分型结果，判断所述待测样本番鸭的产蛋性状。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述PCR扩增的扩增体系包括：2xTaq MasterMix 15μL、混合引物各1.2μL、超纯水10.6μL和DNA2μL；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃2min，94℃30s、53℃30s、72℃30s，30cycles，72℃2min。
9.一种权利要求1所述的与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因SNP分子标记、权利要求3所述的引物、权利要求5所述的试剂盒在番鸭育种中的应用。
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