CN114272367A - 一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了口服狂犬病病毒样颗粒疫苗及其制备方法，以CVS株狂犬病病毒的糖蛋白RVGP和基质蛋白RVMP自组装成的RVLPs为抗原，利用
L100与PLGA为主要材料来制备口服耐酸缓微球。用黏膜免疫佐剂LTB提高口服RVLPs的抗原性，增强免疫效果。通过设计适于经口服递送一直到肠道给药的蛋白类药物载体，使其能够顺利克服胃肠道的各种生理障碍直接递送至肠道，在肠道pH条件下响应释放抗原，对其引发的免疫效果进行初步的免疫学评价。本发明的口服狂犬病病毒样颗粒疫苗可以提高蛋白类药物的实际利用效率，提高疫苗的治疗或预防效果，有望为我国扩大狂犬病疫苗接种范围、从动物源头上消灭狂犬病，提高疫苗安全性，为研发新型病毒样颗粒口服亚单位疫苗奠定重要基础。
Description
技术领域
本发明属于口服疫苗技术领域，具体涉及一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗及其制备方 法。
背景技术
狂犬病是由狂犬病病毒(RABV)引发的一种嗜神经性人畜共患病，99％的人类狂犬病 死亡案例是由狗介导的，疫苗接种是预防RABV传播的最有效手段(Zhang W J,Zheng XX, Cheng N,et al.Isatis Indigotica Root Polysaccharides as Adjuvants for anInactivated Rabies Virus Vaccine[J].International Journal of BiologicalMacromolecules,2016,87:7-15.)。控制流 浪狗的数量、对家养犬及野生动物进行大规模或强制性非肠道疫苗接种运动以及野生动物 口服疫苗的进步，已经在几个发达国家成功消灭了陆生食肉动物介导的人类狂犬病。然而， 发展中国家每年仍有数以千计的人死于狂犬病，原因是财政、后勤和其他方面的阻碍，无 法控制狗的数量和实施大规模疫苗接种计划。提供一种更容易管理和更具成本效益的疫苗 可能有助于实现消除狗介导的人类狂犬病(Arya J M,Dewitt K,Garrard M S,et al.Rabies Vaccination in Dogs Using aDissolving Microneedle Patch[J].Journal of Controlled Release, 2016,239:19-26.)。
ORV在全球消除狗介导的人类狂犬病中起着决定性作用，应紧急开展具体的实践活 动，以促进具有安全和成本效益的ORV的快速和大规模使用。虽然几种自我复制的生物制品，包括修饰的活病毒、减毒活病毒和重组病毒，都在犬种群中进行了口服评估，但由 于安全性问题，目前仍然没有开发出一种适合的ORV(Cliquet F,Guiot A L,Aubert M,etal. Oral Vaccination of Dogs:A Well-Studied and Undervalued Tool forAchieving Human and Dog Rabies Elimination[J].Veterinary Research,2018,49(1):61.)。
口服给药相对于注射给药具有方便、快捷、安全和患者依从性好等优势，且不需要专 业的接种人员。其次，口服疫苗能刺激系统和黏膜免疫反应，建立更广泛和持久的保护。然而，口服给药是具有挑战性的，尤其是对蛋白药物而言，需要克服恶劣的胃肠道环境， 避免诱导免疫耐受性，以实现有效的保护(Renu S,Han Y,Dhakal S,et al. Chitosan-Adjuvanted Salmonella Subunit Nanoparticle Vaccine for Poultry Deliveredthrough Drinking Water and Feed[J].Carbohydrate Polymers,2020,243:116434.)。
蛋白类药物与病毒相比具有绝对安全性，其中VLPs比多肽的稳定性和免疫原性都高， 因此是蛋白类药物研发的热点，而合适的递送载体是实现该类药物口服靶向与释放的最佳 手段(Chen X Y,Butt A M,Amin M C I M.Enhanced Paracellular Delivery ofVaccine by Hydrogel Microparticles-Mediated Reversible Tight Junction Openingfor Effective Oral Immunization[J].Journal of Controlled Release,2019,311-312:50-64.)。
PLGA和EL100是FDA批准的可用于人体的材料。以PLGA NPs为载体在注射疫苗 的递送方面有很多应用(Kole S,Qadiri S S N,Shin S M,et al.PLGA EncapsulatedInactivated-Viral Vaccine:Formulation and Evaluation of Its ProtectiveEfficacy against Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus(Vhsv)Infection in OliveFlounder(Paralichthys Olivaceus) Vaccinated by Mucosal Delivery Routes[J].Vaccine,2019,37(7):973-983.Umerska A, Gaucher C,Ampuero F O,et al.PolymericNanoparticles for Increasing Oral Bioavailability of Curcumin[J].Antioxidants(Basel),2018,7(4):46.)；Eudragit可以保护药物不被酸性条件破 坏，Rajasree(Rajasree P H,Paul W,Sharma C P,et al.Eudragit Encapsulated Cationic Poly(Lactic-Co-Glycolic Acid)Nanoparticles in Targeted Delivery of Capecitabinefor Augmented Colon Carcinoma Therapy[J].Journal of Drug Delivery Science andTechnology,2018,46: 302-311.)等用
S100涂覆在载药的PLGA NPs表面，作为一种新型靶向给药系统 治疗结肠癌，许(Xu B H,Zhang W J,Chen Y L,et al.
L100-Coated Mannosylated Chitosan Nanoparticles for Oral Protein VaccineDelivery[J].International Journal of Biological Macromolecules,2018,113:534-542.)等用BSA负载的
L100覆盖的甘露糖化壳聚 糖NPs进行口服免疫，发现可引起更佳的系统性IgG和黏膜IgA抗体反应。
目前抗狂犬病毒口服疫苗的相关研究较少见，更未见能够应对恶劣的胃肠道环境的相 关口服疫苗。
发明内容
本发明针对上述问题进行，致力于开发一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，递送蛋白质 类药物的口服提供了一种设计思路。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明首先制备口服狂犬病病毒样颗粒疫苗RVLPs/EPLGA MPs，对其进行体外表征 后，随后将冷冻干燥的RVLPs/EPLGA MPs灌胃小鼠进行免疫原性评价，对疫苗产生的细胞免疫反应作出初步评价。
本发明的第一方面，提供了一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，包括广谱性狂犬病病毒 样颗粒抗原以及药物载体。其中，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原包括CVS株狂犬病病毒 糖蛋白RVGP和基质蛋白RVMP，CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP的多核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述基质蛋白RVMP的多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，
药物载体为由PLGA与
L100组成的混合载体，
L100与PLGA的 质量比1:5～1:1；广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与PLGA的浓度比为1:5～1:10。
优选的，
L100与PLGA的质量比1:2，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与PLGA的浓度比为1:10。
优选的，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的浓度为5mg/mL，PLGA的浓度为 25～50mg/mL，更优选PLGA的浓度为50mg/mL。
优选的，口服狂犬病病毒样颗粒疫苗中还包括黏膜免疫佐剂LTB，该LTB含量为 20～100ug/mL。
本发明的第二方面，提供了上述口服狂犬病病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括如下步 骤：
1)将广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与LTB同时加入到溶解有PLGA的乙酸乙酯和溶解有
L100的乙醇的混合油相中，涡旋震荡后形成O/W1型初乳，所述广谱性狂 犬病病毒样颗粒抗原的体积与乙酸乙酯以及乙醇的体积比为2:10:5；
2)获得的初乳在磁力搅拌作用下滴加到10～12倍体积的1％PVA中，形成W2/O/W1型复乳；
3)在4℃下继续搅拌复乳至少4h，挥发有机溶剂，得到固化后的颗粒RVLPs/EPLGA MPs；
4)固化好的RVLPs/EPLGA MPs于4℃，300rpm离心收集，用超纯水清洗，洗净RVLPs/EPLGA MPs表面的PVA和未包裹的抗原，并收集所有离心的上清液；
5)用适量无菌PBS重悬RVLPs/EPLGA MPs，于4℃、-20℃和-80℃梯度冻结实， 真空冷冻干燥24h后，密封好置于-20℃保存备用。
优选的，步骤1)中，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的浓度为5mg/mL，PLGA的浓 度为50mg/mL，
L100的浓度为25mg/mL。
优选的，步骤2)中，磁力搅拌的转速为300～400rpm。
优选的，步骤4)中，采用超纯水清洗的次数为3次。
该制备条件通过正交实验得到，实验结果表明，当PLGA浓度为50mg/mL，搅拌转 速为300rpm，1％PVA体积为20mL，PLGA与EL100的质量比为2:1时获得最佳包封率(Encapsulation efficieny,EE)，包封率为97.14±1.37％。
依次对根据上述方法制备的口服狂犬病病毒样颗粒疫苗RVLPs/EPLGA MPs进行体外表征、稳定性分析、体外释放实验以及小鼠肠道滞留时间分析。
体外表征结果显示，刚制备好的RVLPs/EPLGA MPs呈规则的球形，且大小均一性良好(图2A)。SEM结果表明所制备的RVLPs/EPLGA MPs经真空冷冻干燥后，表面平整， 呈相对规则的球形，平均粒径在168.20±39.28μm的范围内(图2B)。
稳定性结果显示，LTB和RVLPs被成功包封在EPLGA MPs中，RVLPs粒径与形态 并没有发生改变，并且LTB和RVLPs的天然二级结构没有发生改变。在4℃条件下保存 3个月后，形态和包封率均没有明显变化。
模拟体内胃(pH1.2)和肠道(pH6.8)环境中的药物释放结果显示，与PLGA MPs相比， EPLGA MPs递送系统具有pH依赖性的药物控释模式，EPLGA MPs有效的实现了大部分目的蛋白在pH6.8的PBS中缓慢释放，很好的克服了胃的恶劣环境对蛋白的变性作用， 将目的蛋白顺利递送至肠道部位(图4)。
小鼠肠道滞留时间分析，给药5h时已累计释放出来约20％的mCherry，其中大约10％ 的mCherry在胃中释放而变性失活，而在肠道中释放出的mCherry也会因为肠道中的蛋 白酶的作用而部分失活；口服给药10h后，剩余没有被降解的微球直接离开小肠到达蛋白 酶含量低的大肠。本发明制备的EPLGA MPs可以克服胃的酸性环境，成功将蛋白递送至肠道。
对Balb/c小鼠进行口服免疫的结果表明，RVLPs能够诱导机体产生相应的抗原特异 性体液、细胞和黏膜免疫应答，且RVLPs和LTB负载在EPLGA MPs中联合给药能诱导 机体产生更强的免疫应答。免疫应答在第3次免疫达到最高水平。小鼠的体重和主要器官 的HE染色结果表明本实验的疫苗成分具有良好的安全性。
本发明的有益效果如下：
本发明以CVS株狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)的糖蛋白(Rabies virusglycoprotein, RVGP)和基质蛋白(Rabies virus matrix protein,RVMP)自组装成的RVLPs为抗原，利用 
L100与PLGA为主要材料来制备口服耐酸缓微球，可以在肠道缓慢释放出RVLPs， 具有纳米结构的RVLPs可以很快被肠道M细胞以及其他APC摄取。具有高密度抗原表位 的RVLPs与黏膜佐剂LTB连用，能够提高口服RVLPs的抗原性，增强免疫效果。
本发明通过设计适于经口服递送一直到肠道给药的蛋白类药物载体，使其能够顺利克 服胃肠道的各种生理障碍直接递送至肠道，在肠道pH条件下响应释放抗原。对其引发的 免疫效果进行初步的免疫学评价，结果显示，RVLPs能够诱导机体产生相应的抗原特异性 体液、细胞和黏膜免疫应答，且RVLPs和LTB负载在EPLGA MPs中联合给药能诱导机体 产生更强的免疫应答；免疫应答在第3次免疫达到最高水平；小鼠的体重和主要器官的HE 染色结果表明本实验的疫苗成分具有良好的安全性。
本研究制备的到的口服狂犬病病毒样颗粒(Rabies virus like particles,RVLPs)疫苗可以 提高蛋白类药物的实际利用效率，提高疫苗的治疗或预防效果，有望为我国扩大狂犬病疫 苗接种范围、从动物源头上消灭狂犬病，从而限制和防止RABV在陆地食肉动物种群之间 传播，并降低感染扩散到家畜和人类种群的风险，提高疫苗安全性，为研发新型病毒样颗 粒口服亚单位疫苗奠定重要基础。
附图说明
图1为口服狂犬病病毒样颗粒(RVLPs)疫苗RVLPs(LTB)/EPLGA MPs的制备及其诱导 的黏膜免疫反应机制。
图2为RVLPs/EPLGA MPs的形貌，倒置显微镜(A)和扫描电镜(B)观察RVLPs/EPLGA微球的形态。
图3为EPLGA MPs中RVLPs/LTB蛋白的完整性分析，其中：(A)FTIR光谱；(B)CD 光谱；(C)TEM。
图4为RVLPs/EPLGA MPs的存储稳定性分析，其中：不同储存条件下RVLPs/EPLGAMPs的包封率(A)和外观(B)。
图5为RVLPs/EPLGA MPs的体外释放结果。
图6为口服mCherry/EPLGA MPs后小鼠胃肠道离体成像图。
图7为血清中anti-RVLPs IgG抗体亚型的含量，其中：(A)IgG；(B)IgG1；(C)IgG2a；(D)IgG1/IgG2a比值。
图8为粪便及肠液中anti-RVLPs sIgA抗体的含量，其中：(A)粪便anti-RVLPssIgA 抗体；(B)第三次免疫后肠液中anti-RVLPs sIgA抗体。
图9为不同给药小鼠血清中INF-γ和IL-4的表达水平，其中：(A)INF-γ；(B)IL-4。
图10为小鼠体重的变化及主要器官的组织学检测结果。
具体实施方式
下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发 明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护 范围不限于下述的实施例。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分 比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除 非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会 根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的 有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
实施例1口服狂犬病病毒样颗粒疫苗RVLPs/EPLGA MPs制备
1、口服狂犬病病毒样颗粒疫苗RVLPs/EPLGA MPs
该口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，包括广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原以及药物载体。其 中，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原包括CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP和基质蛋白RVMP， CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP的多核苷酸序列如SEQ ID NO.1，基质蛋白RVMP的多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
药物载体为由PLGA与
L100组成的混合载体，
L100与PLGA的 质量比1:5～1:1，优选1:2。广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与PLGA的浓度比为1:5～1:10， 优选1:10；浓度方面，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的浓度为5mg/mL，PLGA的浓度为 25～50mg/mL。
优选的，口服狂犬病病毒样颗粒疫苗中还包括黏膜免疫佐剂LTB，RVLPs与黏膜佐剂LTB连用，能够提高口服RVLPs的抗原性，增强免疫效果。
2、疫苗制备
图1显示了口服狂犬病病毒样颗粒(RVLPs)疫苗RVLPs(LTB)/EPLGA MPs的制备及其诱导的黏膜免疫反应机制。上述口服狂犬病病毒样颗粒疫苗的制备流程包括如下步骤：
1)将广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原单独或与LTB共同加入到溶解有PLGA的乙酸乙酯和溶解有
L100的乙醇的混合油相中，涡旋震荡后形成O/W1型初乳；
2)获得的初乳在磁力搅拌作用下滴加到10～12倍体积的1％PVA中，形成W2/O/W1型复乳；
3)在4℃下继续搅拌复乳至少4h，挥发有机溶剂，得到固化后的颗粒RVLPs(LTB) /EPLGA MPs；
4)固化好的RVLPs(LTB)/EPLGA MPs于4℃，300rpm离心收集，用超纯水清洗， 洗净RVLPs/EPLGA MPs表面的PVA和未包裹的抗原，并收集所有离心的上清液；
5)用适量无菌PBS重悬RVLPs(LTB)/EPLGA MPs，于4℃、-20℃和-80℃梯度冻 结实，真空冷冻干燥24h后，密封好置于-20℃保存备用。
3、组分优化
以包封率(Encapsulation efficieny,EE)为标准，对PLGA的浓度、PLGA和EL100质量 比、1％PVA的体积以及磁力搅拌器的搅拌转速进行优化，设计4因素3水平的正交实验(表1)。利用BCA法检测上清中游离RVLPs的浓度，EE的计算公式如下：
EE(％)＝(投放RVLPs总量-上清中RVLPs量)/投放RVLPs总量×100％
表2表明最优实验组合为A3B3C2D2，即当PLGA浓度为50mg/mL，搅拌转速为300rpm，1％PVA体积为20mL，PLGA与EL100的质量比为2：1时获得最佳EE。优化 后RVLPs/EPLGA MPs包封率为97.14±1.37％。
当PLGA浓度为12.5mg/mL时，无论其他条件如何，EE都很低，可能是因为低浓度 的PLGA无法和蛋白水溶液相互饱和；当1％PVA的体积过大时，得到的EE也不理想， 可能是过多的外水相大大降低了PLGA的浓度；当PLGA与EL100的质量比为1时，EE 不高可能是因为过量EL100加入后，会与PLGA一起成膜析出，使得油相和水相不能相 互饱和。
表1正交设计的因素和水平
注：保持PLGA总量和搅拌时间不变。
表2正交实验L9(34)结果
实施例2 RVLPs/EPLGA MPs体外表征
RVLPs/EPLGA MPs制备完成后，利用倒置显微镜观察形貌。冻干后，利用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察形貌与大小。
刚制备好的RVLPs/EPLGA MPs呈规则的球形，且大小均一性良好(图2A)。SEM结 果表明所制备的RVLPs/EPLGA MPs经真空冷冻干燥后，表面平整，呈相对规则的球形， 平均粒径在168.20±39.28μm的范围内(图2B)。
实施例3 RVLPs LTB/EPLGA MPs稳定性
1、结构稳定性
利用傅立叶红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer,FITR)和圆二色光谱 (Circular dichroism,CD)分析RVLPs是否成功负载到EPLGA MPs中，且其二级结构是否 完整。为了评估EPLGA MPs的pH响应性，将EGFP/EPLGA MPs分别与pH1.2和pH6.8 的PBS孵育2、4和8h后，取样观察EGFP/EPLGA MPs的完整性。为了进一步确定冻干 EGFP/EPLGAMPs的储存稳定性，将真空冷冻干燥后的RVLPs/EPLGA MPs分别于4℃、 25℃和37℃进行保存，定期取出不同保存条件下的RVLPs/EPLGA MPs拍照，裂解RVLPs/EPLGA MPs计算EE，同时利用透射电子显微镜(Transmission electron microscope, TEM)检测RVLPs的完整性。
为了确定LTB和RVLPs成功包封在EPLGA MPs中，利用FTIR光谱分析蛋白质中 存在的酰胺键。如图3A所示，与EPLGA MPs相比，LTB/EPLGA MPs在1544.7cm-1和 1654.7cm-1处检测到的键证实EPLGA MPs内LTB蛋白的包封；RVLPs/EPLGA MPs在 1543.5cm-1和1654.5cm-1处检测到的键证实EPLGA MPs内RVLPs蛋白的包封。这两个 键分别由蛋白酰胺I键(C＝O)和II键(N-H)弯曲振动而产生(Roy K,Kanwar R K, Subramanian,etal.Competitive Inhibition of Survivin Using a Cell-Permeable RecombinantProtein Induces Cancer-Specific Apoptosis in Colon Cancer Model[J].International Journal of Nanomedicine,2015,10:1019-1043.)。FTIR光谱结果表明，LTB和RVLPs被成功包封在 EPLGA MPs中。
为了进一步证实EPLGA MPs内LTB和RVLPs的天然二级结构没有发生改变，利用 CD光谱测定LTB/EPLGA MPs和RVLPs/EPLGA MPs的二级结构。其中，α-螺旋(负峰： 222nm和208nm，正峰：190nm)、β-折叠(正峰：195-198nm，负峰：217-218nm)和无规则 卷曲(正峰：220nm，负峰：198nm)构成蛋白二级结构(Fan K L,Jiang B,Guan Z,et al. Fenobody:AFerritin-Displayed Nanobody with High Apparent Affinity and Half-LifeExtension[J].Analytical Chemistry,2018,90(9):5671-5677.)。如图3B所示，LTB的包括α 螺旋、β折叠和无规卷曲3种结构；RVLPs由RVMP和RVGP自组装形成，RVMP主要以 β折叠和无规卷曲为主，RVGP主要以α螺旋、β折叠和无规卷曲为主。LTB/EPLGA MPs 和RVLPs/EPLGAMPs与天然的LTB和RVLPs的CD光谱趋势一致，说明LTB和RVLPs 包裹到EPLGA MPs并不影响它们的天然的二级结构。
此外，利用TEM分析包封在EPLGA MPs中RVLPs的完整性。将RVLPs/EPLGA MPs 裂解后的上清浓缩后用TEM观察，结果表明，上清中的RVLPs粒径与形态并没有发生 改变，为180-200nm的圆形或椭圆形NPs(图3C)。因此，本研究中制备的EPLGA MPs 能成功包封LTB和RVLPs，并保持其结构的完整性。
2、存储稳定性
真空冷冻干燥后的RVLPs/EPLGA MPs于不同温度条件下存储，定期拍照。如图4B所示，RVLPs/EPLGA MPs在37℃存储1周后就出现明显的皱缩与聚集，说明37℃不适 合RVLPs/EPLGA MPs的存储，而在4℃和25℃下保存3个月后，其形态基本保持不变。 故取4℃和25℃不同储存时间段的RVLPs/EPLGA MPs各10mg，PBS裂解后，用BCA 试剂盒测定蛋白含量并计算EE。结果如图4A所示，RVLPs/EPLGA MPs在4℃存储3个 月后，EE仅有轻微下调，且与第0天没有统计学差异。但是，RVLPs/EPLGA MPs在25℃ 存储过程中，EE随时间的延长而逐渐降低，直至3个月，EE下降了约15％。因此，4℃ 更适合RVLPs/EPLGA MPs的保存。
实施例3 RVLPs/EPLGA MPs体外释放实验
取10mg RVLPs/EPLGA MPs加入1mL释放介质中，并在100rpm，37℃中孵育，按 照预定的时间间隔以12000rpm，10min收集上清，补充等体积的新鲜PBS，测定上清液 中RVLPs的量。
由于RVLPs/EPLGA MPs以灌胃的方式进行给药，因此有必要模拟体内胃(pH1.2)和肠道(pH6.8)环境中的药物释放。如图5所示，与PLGA MPs相比，EPLGA MPs递送系统 具有pH依赖性的药物控释模式，RVLPs/EPLGA MPs和LTB/EPLGA MPs在pH1.2时2h 内仅释放不到10％的目的蛋白，而RVLPs/PLGA MPs在pH1.2时2h内突释了接近70％的 目的蛋白。虽然在模拟肠液中两种MPs在24h内累积释放了约95％的目的蛋白，但EPLGA MPs有效的实现了大部分目的蛋白在pH6.8的PBS中缓慢释放，很好的克服了胃的恶劣 环境对蛋白的变性作用，将目的蛋白顺利递送至肠道部位。
实施例4 RVLPs/EPLGA MPs小鼠肠道滞留时间
制备负载樱桃红荧光蛋白(mCherry)(激发/发射波长为580nm/610nm)的EPLGAMPs ——mCherry/EPLGA MPs。灌胃前将Balb/c小鼠禁食12h但正常供水，然后用PBS重悬mCherry/EPLGA MPs(100μL)进行灌胃，并在灌胃后第0.5、1.5、3、5、10h分别解剖小鼠， 剥离胃肠道器官，利用KODAK活体动物成像系统进行拍照观察。
将mCherry/EPLGA MPs灌胃小鼠后，在特定的时间点解剖小鼠取出胃肠道拍照。如图6所示，当给药0.5h后，mCherry/EPLGA MPs都集中在胃部，1.5h后，mCherry/EPLGA MPs开始由胃缓慢向十二指肠流动，直至3h，微球全部离开胃，到达小肠，并逐渐从十 二指肠向回肠流动。由于肠道的偏中性环境，会使得mCherry/EPLGA MPs被降解，释放 mCherry并被M细胞摄取，所以在5h时，位于空肠和回肠的荧光强度会稍有减弱。5h 时已累计释放出来约20％的mCherry，其中大约10％的mCherry在胃中释放而变性失活， 而在肠道中释放出的mCherry也会因为肠道中的蛋白酶的作用而部分失活，口服给药10h 后，剩余没有被降解的微球直接离开小肠到达蛋白酶含量低的大肠。本研究所制备的 EPLGA MPs可以克服胃的酸性环境，成功将蛋白递送至肠道。
实施例5 RVLPs(LTB)/EPLGA MPs疫苗免疫效果
1、实验方法
(1)将RVLPs/EPLGA MPs灌胃接种6-8周龄的SPF级雌性Balb/c小鼠。将小鼠按照表3进行随机分组，做好标记。小鼠适应一周后，免疫前12h禁食但自由饮水，于第7、 第21和第35天进行灌胃免疫，并对其产生的免疫应答进行评价。
(2)小鼠体重的测定：免疫前称量1次体重，之后每7天在固定时间称量1次，直至第3次免疫结束共记录6次，分析小鼠体重变化情况。
(3)小鼠粪便的收集以及抗原特异性sIgA的检测。
(4)小鼠血清的收集以及抗原特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体、细胞因子IFN-γ和IL-4 以及小鼠外周血中CD4+T和CD8+T细胞的检测。
(5)小鼠肠液的收集以及抗原特异性sIgA抗体的检测。
(6)小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾和小肠)的病理组织学检测。
表3动物实验分组及给药剂量
取样操作方面：
步骤(3)中小鼠粪便中的收集包括如下步骤：
①收集：免疫前和每次免疫后1周，使用洁净的镊子随机采集15粒小鼠粪便，放入灭菌的EP管中，做好标记，置于-80℃保存备用，一式三份；
②处理：从-80℃取出小鼠粪便，用注射器芯碾碎粪便后，加入500μL灭菌PBS不断吹打至充分溶解，在4℃，12000rpm离心5min，收上清，做好标记，-80℃保存，用于 RVLPs特异性sIgA分析。
步骤(4)中，小鼠血液的收集包括如下步骤：
①收集：免疫前和前两次免疫后1周，用毛细玻璃管刺入小鼠眼眶内收集血液；第3次免疫后1周，使用灭菌的镊子快速摘取眼球收集血液；
②处理：将血液样品于4℃静置12h，随后在4℃，1000rpm离心30min，吸取血清 到灭菌的EP管中，做好标记，于-80℃保存，用于RVLPs特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a 的分析，第3次免疫后1周的血清还要用于IL-4和IFN-γ分析，以及第3次免疫后1周 的小鼠外周血中CD4+T和CD8+T细胞的检测。
步骤(5)中，小鼠肠液的收集包括如下步骤：
①收集：第3次免疫后1周，用75％的酒精对颈椎脱臼法处死的小鼠进行消毒，无菌截取小肠肠段，手术刀划开使肠内壁暴露，置于无菌EP管中；
②处理：向装有小肠的EP中加入1mL无菌PBS溶液，涡旋振荡15min，并在4℃，12000rpm离心10min，收集上清，于-80℃保存，用于RVLPs特异性sIgA分析。
检测方面：
RVLPs特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a和sIgA的检测，方法如下：
①包被：用PBS将RVLPs稀释到5μg/mL，向96孔板中加入稀释后的RVLPs(100μL/孔)，4℃包被过夜；
②封闭：向反应孔中加入200μL 1％BSA，37℃孵育2h；
③加样：分别加入100μL粪便提取液和肠液和用1％BSA稀释(1：100)的血清，37℃孵育2h；
④加酶标二抗：向反应孔中加入100μL用1％BSA稀释(1：10000)的偶联HRP的山 羊抗小鼠多克隆抗体，37℃孵育1h；
⑤加底物液显色：加入100μL显色液，37℃避光孵育20min；
⑥终止反应：加入100μL 1M H2SO4混匀后检测OD值(490nm)。
⑦①-④步每次结束后都用PBST洗涤6次。
细胞因子IFN-γ或IL-4的检测，根据IL-4和IFN-γ试剂盒的说明书，方法如下：
①使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫；
②根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样本(含标准品)和空白都 应做复孔；
③加样：100μL/well加入稀释后的Cytokine standard至标准品孔，100μL/well加入 样本至样本孔，100μL/well加入Dilution buffer R(1×)至空白对照孔；
④加检测抗体：50μL/well加入Biotinylated antibody工作液。混匀后，盖上封板膜， 37℃温育90min；
⑤洗板：扣去孔内液体，300μL/well加入1×Washing buffer工作液；停留1min后弃去孔内液体。重复4次，每一次在滤纸上扣干；
⑥加酶：100μL/well加入Streptavidin-HRP工作液。盖上封板膜，37℃温育30min；
⑦洗板：重复步骤5；
⑧显色：100μL/well加入TMB，37℃避光温育5-30min，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应；
⑨终止反应：100μL/well迅速加入Stop solution终止反应。
2、结果分析
2.1血清特异性IgG抗体亚型
不同特异性抗体亚型可在一定程度上反应机体所响应的免疫应答水平。结果如图7 所示，与Saline组相比，EPLGA MPs和LTB/EPLGA MPs在免疫后均不会产生抗原特异 性抗体。
第1次免疫后，所有组的血清中均没有检测到特异性IgG抗体(图7A)。加强免疫后，除了Rabisin(i.g.)组检测不到特异性IgG抗体外，其他组均诱导显著增强的特异性IgG抗体反应。其中，RVLPs组IgG抗体含量是Saline组的2.27倍(P<0.001)；RVLPs+LTB、 RVLPs/EPLGA MPs和RVLPs+LTB/EPLGA MPs 3组之间的IgG抗体含量没有统计学差异， 但分别是RVLPs组的1.43、1.56和1.66倍(P<0.001)；RVLPs+LTB/EPLGA MPs和 (RVLPs+LTB/EPLGAMPs)×2组的IgG抗体含量也没有统计学差异，但(RVLPs+LTB /EPLGA MPs)×2组是RVLPs/EPLGA MPs组的1.21倍(P<0.01)；Rabisin(i.m.)组的IgG抗 体含量最高，是(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的1.67倍(P<0.001)。第3次免疫后， RVLPs+LTB/EPLGA MPs和(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组特异性IgG抗体含量最高，但 是这两组没有统计学差异。(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的IgG抗体含量分别是 Rabisin(i.m.)和Rabisin(i.g.)组的1.35和4.07倍(P<0.001)。以上结果表明口服RVLPs能够 激发机体产生特异性体液免疫应答，佐剂LTB能够增强免疫应答的水平，当RVLPs和LTB 负载在EPLGA MPs中联合给药时，产生的特异性体液免疫应答水平高出Rabisin(i.m.)和Rabisin(i.g.)组(P<0.001)，但没有剂量依赖性。
RVLPs特异性IgG1抗体分析结果如图7B所示。初次免疫后，只有Rabisin(i.m.)组诱 导显著增强的IgG1抗体反应(P<0.001)。两次加强免疫后，Rabisin(i.g.)组都没有诱导机体 产生IgG1抗体反应，而其他各组均诱导显著增强的IgG1反应。第2次免疫后，抗原特异性IgG1抗体含量分析结果表明，RVLPs+LTB/EPLGA MPs组是RVLPs/EPLGA MPs组 的1.37倍(P<0.001)，而(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组是RVLPs+LTB/EPLGA MPs组的 1.37倍(P<0.001)。第3次免疫后，(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的特异性IgG1抗体含 量分别是RVLPs+LTB/EPLGA MPs和Rabisin(i.g.)组的1.17(P<0.01)和1.59倍(P<0.001)。 然而，在两次加强免疫后，Rabisin(i.m.)组的IgG1抗体含量都是最高的，分别是 (RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的1.39和1.59倍(P<0.001)。
RVLPs特异性IgG2a抗体检测中(图7C)，初次免疫后，仅RVLPs+LTB/EPLGA MPs、(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2、Rabisin(i.g.)和Rabisin(i.m.)4组的特异性IgG2a抗体水平显著增加，且RVLPs+LTB/EPLGA MPs与(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组、Rabisin(i.g.) 与Rabisin(i.m.)组之间的IgG2a含量没有显著差异。所有实验组的IgG2a抗体含量在第3 次免疫后达到最高水平。其中，(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组是RVLPs+LTB/EPLGA MPs 组的1.13倍(P<0.01)、是Rabisin(i.g.)组的1.73倍(P<0.001)，而Rabisin(i.m.)组则是(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的2.01倍(P<0.001)。
图7B和C表明，相比于其他实验组，(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组能刺激机体产生最显著的IgG1和IgG2a抗体反应。IgG1与IgG2a的水平反映了Th2和Th1型细胞免 疫应答，说明本实验制备的RVLPs/EPLGA MPs和LTB/EPLGA MPs以两倍剂量联合给药 时能够诱导机体产生显著增强的细胞免疫应答，虽然效果不如市售灭活狂犬疫苗 Rabisin(i.m.)组，但是显著高于Rabisin(i.g.)组。
计算第3次免疫后IgG1与IgG2a的比值(图7D)。IgG1与IgG2a的比值反映了Th2 与Th1型细胞免疫应答反应的倾向性，若比值接近1，则说明诱导更平衡的Th1和Th2 型免疫应答，RVLPs和Rabisin(i.m.)组属于这一类；若比值大于1，则说明IgG1抗体亚型 占主导，倾向于Th2型免疫应答，即RVLPs+LTB、RVLPs/EPLGAMPs、RVLPs+LTB/EPLGA MPs和(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组；若比值小于1，则说明IgG2a抗体亚型占主导， 倾向于Th1型免疫应答，即Rabisin(i.g.)组。
2.2粪便及肠液中特异性sIgA抗体
通过对小鼠粪便和肠液中RVLPs特异性sIgA抗体含量的分析可以判断口服疫苗产生 的黏膜免疫应答水平。由图8可知，EPLGA MPs、LTB/EPLGA MPs和Rabisin(i.m.)组与Saline组一样，不能刺激机体产生黏膜特异性sIgA抗体。
所有实验组及Rabisin(i.g.)组粪便中RVLPs特异性sIgA抗体含量均随着免疫次数的 增加而显著升高(图8A)。初次免疫后，RVLPs组的sIgA含量是Saline组的1.26倍(P<0.01)； RVLPs+LTB和RVLPs/EPLGA MPs组的sIgA含量没有统计学差异，分别是RVLPs组的1.26和1.23倍(P<0.01)；RVLPs+LTB/EPLGA MPs组的sIgA含量是RVLPs/EPLGA MPs 组的1.22倍(P<0.01)；(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的sIgA含量则分别是 RVLPs+LTB/EPLGAMPs和Rabisin(i.g.)组的1.33和1.54倍(P<0.001)。第2次免疫后， RVLPs、RVLPs+LTB和RVLPs/EPLGA MPs组的sIgA含量没有差异，但是Saline组的1.8、 2.03和2.39倍(P<0.001)；RVLPs/EPLGA MPs和RVLPs+LTB/EPLGA MPs组没有差异， RVLPs+LTB/EPLGA MPs组是RVLPs+LTB组的1.46倍(P<0.01)；RVLPs+LTB/EPLGA MPs 组和(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组也没有差异，(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组是 RVLPs/EPLGA MPs和Rabisin(i.g.)组的1.32和1.35倍(P<0.01)。第3次免疫后，RVLPs 和RVLPs+LTB组的sIgA含量没有统计学差异，但分别是Saline组的2.1和2.16倍 (P<0.001)；而RVLPs/EPLGA MPs组是RVLPs+LTB组的1.44倍(P<0.001)， RVLPs+LTB/EPLGA MPs组是RVLPs/EPLGA MPs组的1.73倍(P<0.001)， (RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组是RVLPs+LTB/EPLGA MPs和Rabisin(i.g.)组的1.87和 4.07倍(P<0.001)。
第3次免疫后，所有实验组肠液中的特异性sIgA抗体水平都显著增强(P<0.001)，其 中(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组诱导的特异性黏膜免疫应答最显著，是 RVLPs+LTB/EPLGA MPs和Rabisin(i.g.)组的1.16(P<0.01)和1.70倍(P<0.001)(图8B)。
以上实验结果表明口服RVLPs可以激起机体产生黏膜特异性sIgA抗体，LTB佐剂可以增强抗原诱导的黏膜免疫应答水平，经EPLGA MPs包裹后产生的免疫效果更好。当RVLPs/EPLGA MPa和LTB/EPLGA MPs以2倍剂量共同口服递送时，可以产生最佳的免 疫效果，分析是由于EPLGA MPs的缓释作用，可以实现抗原的持续刺激，从而产生更持 久的免疫应答，所以其产生的黏膜免疫应答要显著高于Rabisin(i.g.)组。
2.3血清中INF-γ和IL-4检测
第3次免疫后，小鼠血清中的INF-γ和IL-4趋势基本一致(图9)。EPLGA MPs与LTB/EPLGA MPs相比于Saline组也能诱导显著增强的IFN-γ和IL-4水平(P<0.001)。其中Rabisin(i.m.)与Rabisin(i.g.)组的IFN-γ水平没有差异，但Rabisin(i.m.)组IL-4水平是Rabisin(i.g.)组的1.78倍(P<0.001)。虽然RVLPs和RVLPs+LTB诱导机体产生的IFN-γ是LTB/EPLGA MPs组的1.44和1.46倍(P<0.001)，但是它们诱导机体产生的IL-4水平与 LTB/EPLGA MPs组没有统计学差异。RVLPs/EPLGA MPs组的IFN-γ和IL-4水平分别是 RVLPs+LTB组的1.15(P<0.01)和1.17倍(P<0.001)。RVLPs+LTB/EPLGA MPs和 (RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组诱导机体产生最高水平的IFN-γ和IL-4，但是这两组之间 没有显著差异。(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的INF-γ水平分别是RVLPs/EPLGA MPs、 Rabisin(i.m.)和Rabisin(i.g.)组的1.14(P<0.01)、1.18(P<0.001)和1.14倍(P<0.001)； (RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的IL-4水平则是RVLPs/EPLGA MPs组的1.43倍(P<0.001)， 而与Rabisin(i.m.)组没有差异，是Rabisin(i.g.)组的1.78倍(P<0.001)。
以上结果表明，RVLPs可以增强血清细胞因子的表达水平，当RVLPs/EPLGA MPa 和LTB/EPLGA MPs联合给药时，其刺激机体产生的细胞因子水平没有剂量依赖性，但 IFN-γ和IL-4水平比Rabisin(i.g.)组高(P<0.001)，虽然其产生IL-4水平与Rabisin(i.m.)组没有统计学差异，但IFN-γ水平显著高于Rabisin(i.m.)组(P<0.001)。
2.4外周血CD4+和CD8+T细胞含量的变化
第3次免疫后，对小鼠外周血中CD4+和CD8+T细胞含量进行分析(表4)，当CD4+和CD8+T的比值升高，说明记性T淋巴细胞免疫应答被激活(Wahlin B,Sander B, ChristenssonB,
B,et al.Entourage:The Immune Microenvironment Following FollicularLymphoma[J].Blood Cancer Journal,2012,2(1):e52.)。
本发明中，Saline、EPLGA MPs、LTB/EPLGA MPs、RVLPs与Rabisin(i.g.)组的外 周血中CD4+T与CD8+T比值不具有统计学差异，说明口服RVLPs和Rabisin不能刺激 机体产生显著的细胞免疫应答。虽然RVLPs+LTB组的CD4+和CD8+T比值与RVLPs组没 有差异，但比Saline组高1.06倍(P<0.01)。RVLPs+LTB组和RVLPs/EPLGA MPs组的CD4+和CD8+T比值也不具有统计学差异，但是RVLPs组的1.02和1.08倍(P<0.01)。 RVLPs/EPLGA MPs与RVLPs+LTB/EPLGAMPs组也没有统计学差异，但CD4+和CD8+T 比值是RVLPs+LTB组的1.06和1.11倍(P<0.01)，说明RVLPs经EPLGA MPs包裹后能够 刺激机体产生显著的细胞免疫应答，且佐剂LTB具有增强细胞免疫应答的能力。 (RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的CD4+和CD8+T比值增加最显著，是RVLPs+LTB/EPLGA MPs组的1.09倍(P<0.01)，表明两倍剂量的抗原和佐剂以EPLGA MPs包裹共同给药能诱导更强的细胞免疫应答。然而，Rabisin(i.m.)组诱导的细胞免疫应 答最显著，是(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的1.14倍(P<0.001)。
表4免疫后CD4+T与CD8+T细胞含量的平均值及比率
3、小鼠生物安全性评价
为了评价疫苗成分是否会对小鼠的正常生命活动产生影响，我们在免疫前以及免疫后 对小鼠的体重进行了测量与记录。如图10A所示，各组小鼠体重均保持正常增长，部分小鼠体重出现下降可能是因为灌胃对小鼠食道造成了一定的损伤，使小鼠减少了食物的摄入，但是体重很快就恢复正常增长，说明所制备的疫苗不会对小鼠的正常生长产生显著影响。免疫结束后，无菌取出各组小鼠的主要器官，通过HE染色观察主要器官的形态。相 比于Saline组，各给药组小鼠的主要器官没有明显的组织形态学变化(图10B)，充分说明 疫苗成分不会对小鼠的正常生命活动产生不良影响。
综上，在研究中，我们利用EPLGA MPs分别负载RVLPs和LTB，对它们联合给药 后产生的黏膜和系统免疫效果进行评价。制备得到的RVLPs/EPLGA MPs为表面光滑、大 小均一(168.20±39.28μm)的球形或椭圆形。mCherry/EPLGA MPs经灌胃后，在不同时间点 取出小鼠肠道进行成像，荧光分布表明所制备的EPLGA MPs能够顺利离开胃到达肠道并 释放抗原。体外释放实验表明，EPLGA MPs具有pH响应性，在pH1.2条件下2h内基本 完整，仅释放不到10％的抗原，而在pH6.8条件下缓慢裂解并释放出RVLPs，24h内累积 释放率约为95％。最重要的是，FTIR和CD光谱结果表明，EPLGA MPs负载的RVLPs 和LTB的天然结构不会改变，而且至少能在4℃条件下稳定保存3个月。
对Balb/c小鼠进行口服免疫的结果表明，RVLPs能够诱导机体产生相应的抗原特异 性体液、细胞和黏膜免疫应答，且RVLPs和LTB负载在EPLGA MPs中联合给药能诱导 机体产生更强的免疫应答。免疫应答在第3次免疫达到最高水平。首先， RVLPs+LTB/EPLGA MPs和(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组诱导的抗原特异性IgG含量 没有统计学差异，但是显著高于其他实验组，且是Rabisin(i.m.)组的1.36和1.35倍(P<0.001)。 其次，(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的抗原特异性IgG1和IgG2a抗体含量显著高于其 他实验组和Rabisin(i.g.)组(P<0.001)，且IgG1与IgG2a比值大于1，说明倾向Th2型免疫 应答；而Rabisin(i.m.)组的IgG1和IgG2a抗体含量是(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的 1.59和2.01倍(P<0.001)。此外，(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的CD4+与CD8+T比值 比其他实验组和Rabisin(i.g.)组显著增加(P<0.001)，但是Rabisin(i.m.)组免疫后的CD4+与 CD8+T比值是(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的1.14倍(P<0.001)。说明 (RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2在所有实验组中能诱导最强的细胞免疫应答，虽然低于 Rabisin(i.m.)组，但是显著高于Rabisin(i.g.)组。
第3次免疫后，除了Rabisin(i.m.)组，所有实验组和Rabisin(i.g.)组的sIgA含量都显 著增高，其中(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的粪便和肠液中抗原特异性sIgA效价最高。 (RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组粪便中sIgA含量是RVLPs+LTB/EPLGA MPs和 Rabisin(i.g.)组的1.87和4.07倍(P<0.001)，而肠液中sIgA抗体含量是RVLPs+LTB/EPLGA MPs和Rabisin(i.g.)组的1.16(P<0.01)和1.70倍(P<0.001)。以上结果表明口服RVLPs可以 刺激机体产生黏膜特异性sIgA抗体，当RVLPs/EPLGA MPa和LTB/EPLGA MPs以两倍 剂量共同口服递送时，可以产生最佳的免疫效果。其次，相比于其他实验组， RVLPs+LTB/EPLGA MPs和(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组诱导机体产生最高水平的 IFN-γ和IL-4(P<0.001)。RVLPs+LTB/EPLGA MPs和(RVLPs+LTB/EPLGA MPs)×2组的 INF-γ水平分别是RVLPs/EPLGA MPs和Rabisin(i.m.)组的1.11倍(P<0.01)和1.14倍 (P<0.001)，IL-4水平分别是RVLPs/EPLGAMPs和Rabisin(i.g.)的1.40倍(P<0.001)和1.43 倍(P<0.001)，而与Rabisin(i.m.)组没有差异。以上结果表明，口服RVLPs+LTB/EPLGA MPs 能强机体细胞因子的表达水平，其效果要高于市售疫苗，但是不具有剂量依赖性。最后， 小鼠的体重和主要器官的HE染色结果表明本实验的疫苗成分的良好安全性。
本发明中，RVGP的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)
MVPQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFS YMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYN WKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGK CPGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYK SLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVR TWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVI PLVHPLADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTA LMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGQTRL
RVMP的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)
MNFLRKIVKNCRDEDTQKPSPVSAPLDDDDLWLPPPEYVPLKELTSKKNMRNFCIDGG VKVCSPNGYSFRILRHILKSFDEIYSGNHRMIGLVKVVIGLALSGSPVPEGMNWVYKLR RTFIFQWADSRGPLEGEELEYSQEITWDDDTEFVGLQIRVIAKQCHIQGRIWCINMNPRA CQLWSDMSLQTQRSEEDKDSSLLLE
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施 例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型 或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗及其制备方法
<130> 权利要求书、说明书
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 524
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1 5 10 15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro
20 25 30
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
35 40 45
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu
50 55 60
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys
65 70 75 80
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
85 90 95
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala
100 105 110
Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu
115 120 125
Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val
130 135 140
Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp
145 150 155 160
Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly
165 170 175
Lys Cys Pro Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His
180 185 190
Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys
195 200 205
Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu
210 215 220
Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly
225 230 235 240
Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp
245 250 255
Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro
260 265 270
Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu
275 280 285
His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp
290 295 300
Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu
305 310 315 320
Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile
325 330 335
Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg
340 345 350
Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly
355 360 365
Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu
370 375 380
Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu
385 390 395 400
Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His
405 410 415
Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu
420 425 430
Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly
435 440 445
Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala
450 455 460
Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys
465 470 475 480
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
485 490 495
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
500 505 510
Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Gln Thr Arg Leu
515 520
<210> 2
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
Met Asn Phe Leu Arg Lys Ile Val Lys Asn Cys Arg Asp Glu Asp Thr
1 5 10 15
Gln Lys Pro Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu Asp Asp Asp Asp Leu Trp
20 25 30
Leu Pro Pro Pro Glu Tyr Val Pro Leu Lys Glu Leu Thr Ser Lys Lys
35 40 45
Asn Met Arg Asn Phe Cys Ile Asp Gly Gly Val Lys Val Cys Ser Pro
50 55 60
Asn Gly Tyr Ser Phe Arg Ile Leu Arg His Ile Leu Lys Ser Phe Asp
65 70 75 80
Glu Ile Tyr Ser Gly Asn His Arg Met Ile Gly Leu Val Lys Val Val
85 90 95
Ile Gly Leu Ala Leu Ser Gly Ser Pro Val Pro Glu Gly Met Asn Trp
100 105 110
Val Tyr Lys Leu Arg Arg Thr Phe Ile Phe Gln Trp Ala Asp Ser Arg
115 120 125
Gly Pro Leu Glu Gly Glu Glu Leu Glu Tyr Ser Gln Glu Ile Thr Trp
130 135 140
Asp Asp Asp Thr Glu Phe Val Gly Leu Gln Ile Arg Val Ile Ala Lys
145 150 155 160
Gln Cys His Ile Gln Gly Arg Ile Trp Cys Ile Asn Met Asn Pro Arg
165 170 175
Ala Cys Gln Leu Trp Ser Asp Met Ser Leu Gln Thr Gln Arg Ser Glu
180 185 190
Glu Asp Lys Asp Ser Ser Leu Leu Leu Glu
195 200
Claims (9)
1.一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，其特征在于，包括广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原以及药物载体，
其中，所述广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原包括CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP和基质蛋白RVMP，所述CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP的多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基质蛋白RVMP的多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，
所述药物载体为由PLGA与
L100组成的混合载体，
L100与PLGA的质量比1:5～1:1，
所述广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与PLGA的浓度比为1:5～1:10。
2.根据权利要求1所述的口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，其特征在于：
其中，
L100与PLGA的质量比1:2，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与PLGA的浓度比为1:10。
3.根据权利要求1所述的口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，其特征在于：
其中，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的浓度为5mg/mL，PLGA的浓度为25～50mg/mL。
4.根据权利要求1所述的口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，其特征在于：
其中，PLGA的浓度为50mg/mL 。
5.根据权利要求1所述的口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，其特征在于：
其中，所述口服狂犬病病毒样颗粒疫苗中还包括黏膜免疫佐剂LTB，该LTB含量20～100ug/mL。
6.权利要求1所述的口服狂犬病病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与LTB同时加入到溶解有PLGA的乙酸乙酯和溶解有
L100的乙醇的混合油相中，涡旋震荡后形成O/W1型初乳，所述广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的体积与乙酸乙酯以及乙醇的体积比为2:10:5；
2)获得的初乳在磁力搅拌作用下滴加到10～12倍体积的1％PVA中，形成W2/O/W1型复乳；
3)在4℃下继续搅拌复乳至少4h，挥发有机溶剂，得到固化后的颗粒RVLPs/EPLGA MPs；
4)固化好的RVLPs/EPLGA MPs于4℃，300rpm离心收集，用超纯水清洗，洗净RVLPs/EPLGAMPs表面的PVA和未包裹的抗原，并收集所有离心的上清液；
5)用适量无菌PBS重悬RVLPs/EPLGAMPs，于4℃、-20℃和-80℃梯度冻结实，真空冷冻干燥24h后，密封好置于-20℃保存备用。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
其中，步骤1)中，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的浓度为5mg/mL，PLGA的浓度为50mg/mL，
L100的浓度为25mg/mL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
其中，步骤2)中，磁力搅拌的转速为300～400rpm。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
其中，步骤4)中，采用超纯水清洗的次数为3次。
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|---|---|---|---|
| CN202111469820.1A CN114272367B (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗及其制备方法 |
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| CN105517569A (zh) * | 2013-08-21 | 2016-04-20 | 库瑞瓦格股份公司 | 狂犬病疫苗 |
| CN107779458A (zh) * | 2016-08-29 | 2018-03-09 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 一种酵母细胞表达的狂犬病毒的病毒样颗粒及其制备方法 |
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2021
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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