TWI756948B - 胜肽奈米管之製備方法、用途及其免疫組成物 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種胜肽奈米管做為增加黏膜免疫反應之DNA疫苗佐劑之製備方法、用途及其免疫組成物，其中該胜肽奈米管為長胜肽奈米管及/或短胜肽奈米管，該胜肽奈米管之製備方法包含：混合環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與水或酒精形成溶液；震盪溶液至混合均勻；以及移除溶液中之液體以形成該胜肽奈米管。

Description

胜肽奈米管之製備方法、用途及其免疫組成物

本發明係關於一種胜肽奈米管之製備方法、用途及其免疫組成物，特別是關於促進黏膜免疫之胜肽奈米管之製備方法、用途及其免疫組成物。

黏膜免疫反應是人體或動物的第一道免疫防線，以新冠病毒為例(COVID-19)，其感染途徑跟一般的呼吸道疾病很相似，主要經由飛沫傳染、接觸傳染，而病毒會透過黏膜入侵身體，包含眼結膜、鼻黏膜、口腔黏膜等。許多動物傳染病病毒經常經口腔由腸胃道感染，例如豬流行下痢病毒，若能促進黏膜(例如，口腔黏膜、腸黏膜)免疫反應，則可以在第一時間擋下大部分病毒的攻擊，提高疫苗的有效性。因此，疫苗學家亦致力於提高疫苗的黏膜免疫反應效果。

在各種疫苗當中， DNA疫苗因為純化技術簡便，品質易於控制和評價，能免除污染，而且成本較低，容易進行大規模的生產，也方便運送與儲存，成為傳染病疫苗研究的新寵。特別是DNA疫苗較能克服腸胃道嚴酷的環境，避免抗原蛋白降解、免疫耐受性誘導並延長滯留時間，其安全性也漸被信任，非常適合用來開發口服疫苗。口服疫苗在使用上相較於肌肉注射疫苗更為簡單方便，用於動物及小孩時可以減少採用較為費力和耗時的肌肉注射方式進行免疫，避免注射過程中因壓迫而受傷或是造成注射部位組織損傷等不良影響。

然而，縱使有上述諸多好處，DNA疫苗的免疫原性較差，若想要開發各種DNA疫苗，亟需研發一些佐劑來改善、促進、誘發免疫反應，特別是能安全使用於人體及動物中，且能幫助提高黏膜免疫反應的佐劑。

於一方面，本發明涉及一種胜肽奈米管做為增加黏膜免疫反應之DNA疫苗佐劑之用途，其中該胜肽奈米管為長胜肽奈米管及/或短胜肽奈米管，該胜肽奈米管之製備方法包含：混合一環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一水或酒精形成一溶液；震盪該溶液至混合均勻；以及移除該溶液中之液體以形成該胜肽奈米管。

於另一方面，本發明涉及一種免疫組成物，包含：一質體，以及一胜肽奈米管，其中該質體上含有一編碼一抗原蛋白質片段的DNA序列，其中該胜肽奈米管為長胜肽奈米管及/或短胜肽奈米管，該胜肽奈米管之製備方法包含：混合一環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一水或酒精形成一溶液；震盪該溶液至混合均勻；以及移除該溶液中之液體以形成該胜肽奈米管。

於另一方面，本發明涉及一種胜肽奈米管之製備方法，包含：混合一環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一水或酒精形成一溶液；震盪該溶液至混合均勻；以及移除該溶液中之液體以形成該胜肽奈米管。

本發明製備方法所提供的胜肽奈米管可以做為增加黏膜免疫反應之DNA疫苗佐劑，以其所製成的口服DNA疫苗證實能有效誘發動物的IgA特異性抗體，可以提供一種安全、高局部有效濃度及高體內穿透力之疫苗應用，有利於使用來控制野生動物的人畜共通疾病。使用在動物產業，可以減少抗生素的使用，改善動物福利並提高經濟動物之產量。

本發明於第一方面提供了一種胜肽奈米管做為增加黏膜免疫反應之DNA疫苗佐劑之用途，其中該胜肽奈米管為長胜肽奈米管及/或短胜肽奈米管，該胜肽奈米管之製備方法包含：混合一環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一水或酒精形成一溶液；震盪該溶液至混合均勻；以及移除該溶液中之液體以形成該胜肽奈米管。於某些具體實施例中，其係用於動物口服免疫，包含但不限於實驗動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠，家畜動物，例如豬、牛、山羊、綿羊、兔、馬、驢，家禽動物，例如雞、鴨、鵝、火雞，伴侶動物，例如，狗、貓，動物園動物，例如，長頸鹿、大象、獅、豹、猴。

於某些具體實施例中，使用的胜肽奈米管包含分別為約0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%、27.5%、30%、32.5%、35%、37.5%、40%、42.5%、45%、47.5%、50%、52.5%、55%、57.5%、60%、62.5%、65%、 67.5%、70%、72.5%、75%、77.5%、80%、82.5%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%或100%重量的長胜肽奈米管，以及約100%、97.5%、95%、92.5%、90%、87.5%、85%、82.5%、 80%、77.5%、75%、72.5%、70%、67.5%、65%、62.5%、60%、57.5%、55%、52.5%、50%、47.5%、45%、42.5%、40%、37.5%、35%、32.5%、30%、27.5%、25%、22.5%、20%、17.5%、15%、12.5%、10%、7.5%、5%、2.5%或0%重量的短胜肽奈米管。

本發明於第二方面還提供一種免疫組成物，包含：一質體，以及一胜肽奈米管，其中該質體上含有一編碼一抗原蛋白質片段的DNA序列，其中該胜肽奈米管為長胜肽奈米管及/或短胜肽奈米管，該胜肽奈米管之製備方法包含：混合一環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一水或酒精形成一溶液；震盪該溶液至混合均勻；以及移除該溶液中之液體以形成該胜肽奈米管。

於某些具體實施例中，本發明之免疫組成物包含分別為約2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%、27.5%、30%、32.5%、35%、37.5%、40%、42.5%、45%、47.5%、50%、52.5%、55%、57.5%、60%、62.5%、65%、 67.5%、70%、72.5%、75%、77.5%、80%、82.5%、85%、87.5%或90%重量的質體，以及約97.5%、95%、92.5%、90%、87.5%、85%、82.5%、 80%、77.5%、75%、72.5%、70%、67.5%、65%、62.5%、60%、57.5%、55%、52.5%、50%、47.5%、45%、42.5%、40%、37.5%、35%、32.5%、30%、27.5%、25%、22.5%、20%、17.5%、15%、12.5%或10%重量的胜肽奈米管。

於某些具體實施例中，本發明之免疫組成物進一步包含一黏性劑，該黏性劑可以包含生物可代謝油，包含但不限於，大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、茶籽油、橄欖油、甜杏仁油、堅果油、亞麻仁油、介花油、棕櫚油、紫蘇油、玄米油、芝麻油、椰子油、豬油或其混合油。生物可代謝油之濃度可以為10~30%體積之黏性劑，更佳為15~25%體積之黏性劑。生物可代謝油可以與乳化劑混合成該黏性劑，乳化劑包含但不限於天然乳化劑、化學乳化劑或其組合。該黏性劑的濃度可以為75~95%體積之免疫組成物，更佳為80~90%體積之免疫組成物。

本發明於第三方面更提供了一種胜肽奈米管之製備方法，包含：混合一環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一水或酒精形成一溶液；震盪該溶液至混合均勻；以及移除該溶液中之液體以形成該胜肽奈米管。

於某些具體實施例中，若混合該環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與該水時，移除該溶液中之上清液以形成短胜肽奈米管。該環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與水的重量比例可以為3：2000。

於某些具體實施例中，若混合該環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與該酒精時，使該溶液中之酒精揮發以形成長胜肽奈米管。其中，使用5毫克之該環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與15毫升50重量%酒精混合。

於某些具體實施例中，本發明之製備方法進一步包含保存於冰箱。溫度可以為0℃~10℃，更佳為3℃~6℃，最佳為4℃。

除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域中的技術人員所通常理解相同的含義。

如本文所用，冠詞「一」、「一個」以及「任何」是指一個或多於一個(即至少一個)的物品的文法物品。例如，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。

本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於20%以內，較佳為於10%以內，以及更佳者為於5%以內。於本文所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。

如本文所用，術語「免疫組成物(immunogenic composition)」是指一種當投予一宿主時能夠觸發該宿主之免疫系統而誘導任何免疫反應的組成物。免疫組成物可以包括它們的任何藥學上可接受的稀釋劑、佐劑、緩衝劑、賦形劑、載體或組合。在一般情況下，免疫組成物的組成分係基於給藥的方式和途徑，以及標準藥學實行而被選擇的。

如本文所用，術語「室溫」或「常溫」，若無特別說明，係指18至28℃之間之任意溫度區間。

如本文所用，術語「疫苗」是指適合施用於動物(包括人類)之成分，其包含一免疫有效量(即，能刺激目標動物之免疫系統)之一或多種抗原(諸如減毒或已被滅殺之微生物及/或其次單位，或任何其他物質，諸如有機體之代謝產物)，此一或多種抗原通常與藥學上可接受之載體(例如：含水之液體)組合，且可選擇地包含免疫刺激劑(佐劑)，當將該疫苗投予一動物時其可誘導足 以治療該動物之疾病或障礙失調(即，至少協助預防、改善或治癒疾病或障礙失調)之免疫反應。

如本文所用，術語「抗體效價」是指一抗體的物理狀態及其在體內的滯留時間，以其與抗原反應的多少來表示其免疫效果，稱為抗體效價。

如本文所用，術語「佐劑」是指任何可增加對一抗原之黏膜、體液或細胞免疫反應的物質，通常係用於達成二種目的：減緩抗原釋出及刺激免疫反應。

如本文所用，術語「抗原」或「免疫原」是指任何刺激免疫反應之物質。此名詞包括被殺死的、去活化的、減毒的或經改質的活細菌、病毒或寄生蟲。抗原一詞亦包括個別之多核苷酸、多胜肽、重組蛋白質、合成之胜肽、蛋白質萃取物、細胞(包括腫瘤細胞)、組織、多醣、或脂質、或其片段或彼等之任何組合。抗原一詞亦包括抗體，諸如抗個體遺傳型抗體或其片段，以及可模擬抗原或抗原決定簇(抗原決定部位)之合成胜肽模擬抗原決定部位(mimotopes)。

如本文所用，術語「乳劑」係指二種不相溶混之液體的組成物，其中一種液體之小滴懸浮於另一種液體之連續相中。

如本文所用，術語「黏膜免疫反應」是指外來物質入侵動物(包括人類)黏膜免疫系統時，黏膜免疫系統被觸發時所產生的反應，主要是透過分泌型免疫球蛋白A(IgA)來反應，其主要存在於唾液、乳液、胃腸液、呼吸道分泌液等，是黏膜部位抵抗病原微生物和有害物質的第一道防線。

如本文所用，術語「胜肽奈米管」是指使用本文揭露之方法而製成的胜肽奈米管，在本文有兩大態樣，使用酒精作為溶劑而生成的為長胜肽 奈米管，使用水為溶劑而生成的為短胜肽奈米管。命名係為方便理解而定，「長」、「短」是相對於另一態樣而言，平均有此特徵，並非絕對特徵。

本發明通過下列的實施例進一步說明，其提供了用於示範而非限制的目的。根據本發明公開內容，本領域中的技術人員應當理解，許多變化可以在所公開的特定具體實施例中產生，且仍然獲得相同或類似的結果而不脫離本發明的精神和範圍。

實施例一 胜肽奈米管的製備方法

秤取5毫克環-(D-色胺酸-酪胺酸)胜肽粉末於500毫升燒杯中，加入15毫升50重量%酒精，以鋁箔紙將燒杯蓋住，再放置於超音波震盪器，常溫震盪5分鐘，使藥品溶於50重量%酒精中並呈現透明清澈。接著放到37℃培養箱中隔夜使酒精揮發或烘乾後，燒杯底部會呈現雪花狀，再使用秤藥紙邊緣將雪花狀奈米載體刮起，放到1.5毫升離心管中於4℃冰箱保存，即為長胜肽奈米管(Long Peptide Nano Tube,LPNT或是L-PNT)。

秤取1.5毫克環-(D-色胺酸-酪胺酸)胜肽粉末於褐色玻璃瓶(2毫升小玻璃瓶)中，加入1毫升滅菌後二次蒸餾水(double distilled water,DDW)，放置於超音波震盪器，常溫震盪10分鐘，使藥品完全震散，震盪分散後，溶液會轉為乳白色。接著靜置後抽掉上清液再保存於4℃冰箱，即為短胜肽奈米管(Short Peptide Nano Tube,SPNT或是S-PNT)。短胜肽奈米管的製備非常簡單快速，震盪完1-2小時即可抽掉上清液使用，若不馬上使用可置入冰箱保存。

如圖1A-1H所示，為了了解二種胜肽奈米管於細胞培養環境中的特性，在六孔培養皿中分別將200微克與400微克的兩種不同胜肽奈米管加入非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)進行培養，並於初始日及次日以兩百放大倍率在倒立 式顯微鏡進行觀察，可清楚辨識二種胜肽奈米管的形態及其對細胞的影響。第1A-1D圖可以看到，LPNT呈現長晶體狀，長度可達100~200微米。第1E-1G圖可以看到，SPNT則小於1微米而呈短簇狀叢聚的型態。

圖1A-1B為200微克長胜肽奈米管在起始日與次日的培養狀況。圖1C-1D為400微克長胜肽奈米管在起始日與次日的培養狀況。圖1E-1F為200微克短胜肽奈米管在起始日與次日的培養狀況。圖1G-1H為400微克短胜肽奈米管在起始日與次日的培養狀況。無論SPNT或LPNT添加的量多寡，在細胞培養基環境中1天後，細胞形態並無明顯改變，可以得知Vero細胞對於兩種胜肽奈米管的添加皆不會產生任何急毒性的現象，細胞皆可正常生長。因此，兩種胜肽奈米管做為藥劑的奈米載體或佐劑對於細胞來說是安全的。

不同大小、種類、長寬比的奈米載體會有不同乘載體積，也會有不同的內化細胞速率與體內藥物動力學停留時間，因此有不同的功效。例如管狀的載體比球形載體有較快與較多內化細胞速率，也有較長血液停留時間，較大的奈米載體承載量較高，較小的奈米載體較容易進入細胞。為了更佳了解兩種胜肽奈米管的形態及性質，在此使用穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron microscopy,TEM)及光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)技術分別確認上述兩種胜肽奈米管，並將尺寸資料與介面電位(ζ-potential,zeta potential)結果記錄於表1，經t檢定顯示長胜肽奈米管的尺寸、長寬比相較短胜肽奈米管的尺寸有顯著差異。

*：代表長胜肽奈米管與短胜肽奈米管間有差異，p<0.05

如圖2所示，使用x光粉末繞射分析長胜肽奈米管、短胜肽奈米管與原始材料：環-(D-色胺酸-酪胺酸)胜肽粉末。分析顯示長、短胜肽奈米管的晶型形成在x光粉末繞射結果上極為類似，惟有長胜肽奈米管在第1波峰峰長的強度大於短胜肽奈米管。長、短胜肽奈米管的x光粉末繞射結果則與非晶型的原始材料粉末有明顯差異。可見經由本實施例一之製備方法，長、短胜肽奈米管已成為與原始材料不同晶型的奈米材料。

實施例二 質體去氧核醣核酸(DNA)製備

使用pTCY載體攜帶不同抗原基因之大腸桿菌表現系統，培養放大於1公升LB(Lysogeny broth)培養基，再抽取質體。上述pTCY載體係衍生自pEGFP-N1載體(Clontech公司，Mount View，加州，美國)，其中pEGFP-N1載體上的CMV立即早期啟動子(CMV immediate-early promoter)以一大鼠beta-肌動蛋白啟動子替換，且去除該增強的綠螢光蛋白的編碼區域，使其他目標基因能被插入並在beta-肌動蛋白啟動子的控制下表現。pTCY載體詳細的構築方式請參閱H.-C.Wu等人(2019)A DNA priming and protein boosting immunization scheme to augment immune responses against parvovirus in ducks.J.Appl.Microbiol.126(1)：49-57.。

在本實施例中，用到兩種病毒抗原基因進行製備。一種是豬流行性下痢病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)的棘蛋白(spike protein)S1區域，其胺基酸序列為SEQ ID NO：1，編碼該S1區域的胺基酸序列之示例性DNA序列為SEQ ID NO：2，但不限於此序列，可使用任何可以編碼SEQ ID NO：1之DNA序列。一種是鵝源水禽小病毒(Goose Parvo Virus,GPV)之第2病毒蛋白 (VP2)，其胺基酸序列為SEQ ID NO：3，編碼該VP2蛋白之示例性DNA序列為SEQ ID NO：4，但不限於此序列，可使用任何可以編碼SEQ ID NO：3之DNA序列。最後分別獲得pTCY攜帶PEDV-S1序列的質體(在此稱做「PED質體」)及pTCY攜帶VP2序列的質體(在此稱做「GPV質體」)。

實施例三 口服DNA疫苗製備

使用實施例一所獲得的胜肽奈米管與實施例二所獲得的質體DNA製備口服DNA疫苗。製備流程僅需將質體DNA與胜肽奈米管結晶於褐色玻璃管中均勻混合，最後固定於震盪器，使其混合到隔天，即可以將製成之口服DNA疫苗進行後續試驗。例如要製造PED口服DNA疫苗，可以依不同佐劑需求，選擇先秤取1.5毫克之LPNT或SPNT結晶放置褐色玻璃管中，再與1毫升之260微克/毫升PED質體均勻混合。或者，選擇秤取共1.5毫克之SPNT和LPNT結晶，示例性的比例可以為1：1，但不限於該比例，放入褐色玻璃管中，並加入1毫升之260微克/毫升PED質體均勻混合。如果需要製造GPV口服DNA疫苗，將上述PED質體替換為GPV質體即可。

為了初步確認兩種胜肽奈米管與質體結合後的狀態，採用代表性質體pCMV-bcl-xL-eGFP，其以巨細胞病毒啟動子做為DNA疫苗啟動，帶有編碼抗凋亡基因(bcl-xL)與增強綠色螢光蛋白基因(eGFP)，以大腸桿菌DH5a菌株放大。以市售Cy5螢光標劑分別在兩種胜肽奈米管進行標記，以TM-rhodamine螢光標劑在代表性質體DNA進行標記，分別於37℃下再與緩衝劑混和4個小時後，離心去除上清液，並利用酒精沉澱純化。將已標記長胜肽奈米管與短胜肽奈米管分別與代表性質體結合後，在雷射螢光共軛焦顯微鏡下，以光學顯微鏡以白光觀察(BF)胜肽奈米管與質體結合的狀況，以螢光顯微鏡在 Cy5通道之激發波長633奈米，發射波長645-740奈米觀察胜肽奈米管(紅色)，且在Rhodamine通道以激發波長為514奈米，發射波長570-620奈米觀察質體(綠色)，最後合併圖像為Cy5及Rhodamine通道疊圖的影像(黃色)，以觀察胜肽奈米管與代表性質體是否共定位。質體建構方式及螢光標記方式請參閱Feichin Hsiao等人之論文：In vitro and in vivo assessment of delivery of hydrophobic molecules and plasmid DNAs with PEO-PPO-PEO polymeric micelles on cornea.Journal of food and drug analysis 26(2018)869-878.

如圖3A-3D所示，顯示長胜肽奈米管與代表性質體結合時用螢光共軛焦顯微鏡進行觀察的照片，圖3A顯示長胜肽奈米管與代表性質體結合之光學顯微觀察圖，圖3B顯示出被標記Cy5螢光的長胜肽奈米管的螢光顯微圖。圖3C顯示出被標記TM-rhodamine螢光的代表性質體的螢光顯微圖。在圖3D則是圖3B與圖3C的疊圖，在同一個位置顯示結合在一起的代表性質體與長胜肽奈米管共定位。圖3E-3H為短胜肽奈米管與代表性質體結合時用螢光共軛焦顯微鏡進行觀察的照片，圖3E顯示短胜肽奈米管與代表性質體結合之光學顯微觀察圖，圖3F顯示出被標記Cy5螢光的短胜肽奈米管的螢光顯微圖。圖3G顯示出被標記TM-rhodamine螢光的代表性質體的螢光顯微圖。在圖3H則是圖3F與圖3G的疊圖，在同一個位置顯示結合在一起的代表性質體與短胜肽奈米管共定位。由上述結果可知，本發明之兩種胜肽奈米管皆能與質體DNA形成共定位。

另外，使用穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron microscopy,TEM)及光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)技術分別確認兩種胜肽奈米管與代表性質體DNA結合後的形態與性質，包括長、寬及預測長寬比(expected ratio)、尺寸和介面電位，並將結果記綠於下表2。

使用螢光測量，藉由不同DNA濃度的存在下，胜肽奈米管的螢光發射光譜強度變化推估胜肽奈米管與質體DNA的結合常數(Binding constant)。使用小鼠的十二指腸進行體外十二指腸穿透係數分析。將腸組織置於體外垂直擴散裝置，將口服DNA疫苗置於供體室，測量受體室內取出的樣品，以qPCR定量其濃度。腸胃道穿透隙數測試(apparent permeability coefficient,P)=V(dC/dt)/A x C₀，其中V(dC/dt)為在初始延遲時間後DNA出現於受體室的穩態速率，C₀為在供體室的初始質體濃度，A為十二指腸暴露的面積。

表2還使用t檢定檢驗兩種胜肽奈米管分別與代表性質體DNA之結合摩爾數(Mole fraction,n)、結合常數(M^-1)與腸胃道穿透隙數測試P是否有顯著差異。可以理解的是，短胜肽奈米管做為佐劑時體積較小，可以有較佳的腸胃道穿透能力，因此P顯著較大，而長胜肽奈米管做為佐劑時體積較大，可以與質體DNA有較佳的結合能力，攜帶更多的質體DNA，因此結合常數顯著較大。

為了進一步瞭解質體DNA與胜肽奈米管之結合率，採用下列方法進行實驗。胜肽奈米管以吸附的方式結合質體DNA，使用實施例二製備之GPV質體為例，先抽取GPV質體並測其濃度後，調整成260微克/毫升，在連續 十倍稀釋成26微克/毫升、2.6微克/毫升、0.26微克/毫升、0.026微克/毫升、0.0026微克/毫升、0.00026微克/毫升及0.000026微克/毫升，建立即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)定量之標準曲線。

在GPV質體與胜肽奈米管結合過程中，每2、4、8、12及24小時抽取10微升上清液，使用進行pTCY卡納黴素引子(kanamycin primer)進行即時聚合酶連鎖反應，以前述建立之標準曲線定量殘留於上層水溶液中的DNA含量，用以評估時間的長短是否可能影響DNA的吸附效率。從表3、表4的結果中可以發現長胜肽奈米管及短胜肽奈米管皆可快速吸附質體DNA，並於2小時內達99%以上吸附效率，於室溫(25~28℃)24小時仍不會釋放回水層。

上述的口服DNA疫苗於管餵時，可以確保餵食的疫苗劑量，適用於體積較小的動物，例如小鼠、鴨隻等。不過，較大的動物不容易進行管餵，若希望能提供嗜口性佳的乳劑型口服DNA疫苗，便於讓動物自行食用，本實施例中的口服DNA疫苗可進一步包含黏性劑，黏性劑可以包含生物可代謝 油。配置方式為：分別事先配置含20體積%生物可代謝油之黏性劑，添加之乳化劑可以為吐溫80(Tween80)、聚山梨醇酯二十(Tween20)等體積比例混合，接著與前項試驗中描述之口服DNA疫苗(質體DNA+胜肽奈米管)混合。以黏性劑：口服DNA疫苗為4：1~9：1的體積比例進行混合後使用，即可成為嗜口性佳的乳劑型口服DNA疫苗

實施例四 PED口服疫苗小鼠免疫試驗

實驗動物為4週大ICR公鼠(來源：樂斯科生物科技股份有限公司)，體重約15~18克左右。採用實施例三之方式以1.5毫克的胜肽奈米管混合260微克/毫升的PED質體製備兩種不同的PED口服疫苗。一種是使用長胜肽奈米管為佐劑的PED口服疫苗(LPNT/PED)，一種則使用短胜肽奈米管為佐劑的PED口服疫苗(SPNT/PED)，以試驗不同佐劑的免疫效果。動物實驗分為四組，每組四隻小鼠，控制組讓小鼠口服生理食鹽水進行免疫試驗，陽性對照組則對小鼠肌肉注射(IM)去活化PEDV蛋白(濃度為10^5.8TCID₅₀/毫升)進行免疫試驗，第一組試驗組則是對小鼠管餵PED口服疫苗(LPNT/PED)，第二組試驗組則是對小鼠管餵PED口服疫苗(SPNT/PED)進行免疫試驗。

如圖4所示，第一次實驗僅比較血清中的免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)抗體效價。在0週時，各個組別分別以0.2毫升劑量進行免疫試驗，0及4週時對小鼠採血收集血清，保存於-20℃。使用酵素免疫分析(Enzyme-linked Immunoorbent Assay,ELISA)測試小鼠血清中抗PEDV之IgG抗體效價，使用25微克/毫升的去活化PEDV為ELISA底層抗原，樣品為稀釋16倍樣品血清，加入山羊抗小鼠IgG HRP二級抗體(Goat anti mouse IgG HRP(1：5000))，並測定吸光值，各個組別進行多因子變異數分析(multi-ANOVA)檢 定後相對控制組進行比較(*表示p值<0.05，**表示p值<0.01)。結果顯示，到第四週時可以看出LPNT/PED口服DNA疫苗及SPNT/PED口服DNA疫苗之單次免疫相對於控制組皆有顯著效果。

第二次實驗為了瞭解二次免疫的效果，在0週時，各個組別分別以0.2毫升劑量進行免疫試驗，第二週再施以0.2毫升劑量進行二次免疫。同時，為了更進一步了解黏膜免疫反應，於第3週全數進行犧牲，犧牲後收集小鼠小腸全段(包含十二指腸，約20公分長)，以5毫升生理食鹽水沖洗小腸，收集之腸液以1,500rpm，離心5分鐘收集上清液，保存於-20℃，用免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)ELISA測驗，使用25微克/毫升的去活化PEDV為ELISA底層抗原，樣品為稀釋16倍樣品小腸沖洗液，加入山羊抗小鼠IgA HRP二級抗體(Goat anti mouse IgA HRP(1：5000))來測試小鼠腸液中抗PEDV之IgA抗體效價。

如圖5所示，使用multi-ANOVA檢定後相對控制組進行比較(**表示p值<0.01)。IgA抗體測試結果，在小鼠有補強免疫的情況下，L-PNT/PED口服DNA疫苗組別和S-PNT/PED口服DNA疫苗組別之腸沖洗液測得之IgA抗體效價相較於控制組有顯著的差異，代表PED口服DNA疫苗(L-PNT/PED和S-PNT/PED)可明顯誘發黏膜免疫反應，可顯著增加小鼠小腸中抗PEDV-IgA抗體效價，而肌肉注射去活化疫苗組則無法測得上升的IgA免疫效果，代表傳統肌肉注射去活化疫苗無明顯誘發黏膜免疫反應。

第三次實驗，同樣使用1.5毫克的胜肽奈米管混合260微克/毫升的PED質體，分別製備成兩種不同的PED口服疫苗(LPNT/PED、SPNT/PED)。另外再以總量為1.5毫克的短胜肽奈米管搭配長胜肽奈米管(短胜肽：長胜肽 =3：1)，製備成3SPNT+1LPNT/PED口服疫苗，以試驗長胜肽奈米管是否可輔助短胜肽奈米管免疫效能。

動物實驗分為四組，每組六隻小鼠。控制組讓小鼠口服生理食鹽水進行免疫試驗，第一組試驗組則是對小鼠管餵PED口服疫苗(SPNT/PED)，第二組試驗組則是對小鼠管餵PED口服疫苗(LPNT/PED)進行免疫試驗，第三組試驗組則是對小鼠管餵PED口服疫苗(3SPNT+1LPNT/PED)進行免疫試驗。

於第0週，各個組別初始免疫試驗給予0.2毫升劑量，第2週再以0.2毫升劑量進行二次免疫。於第4週全數動物犧牲，收集小鼠小腸全段(包含十二指腸，約20公分長)，以5毫升生理食鹽水沖洗小腸，收集之腸液以1,500rpm，離心5分鐘收集上清液，保存於-20℃，用免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)ELISA測驗，使用25微克/毫升的去活化PEDV為ELISA底層抗原，樣品為稀釋16倍樣品小腸沖洗液，加入山羊抗小鼠IgA HRP二級抗體(Goat anti mouse IgA HRP(1：5000))來測試小鼠腸液中抗PEDV之IgA抗體效價。

如圖6所示，IgA抗體測試結果，免疫SPNT/PED組可顯著誘發黏膜免疫反應，而LPNT/PED組別則不顯著，而結合二種載體的3SPNT+1LPNT組別亦可顯著增加黏膜免疫反應(p值<0.05)。

實施例五 GPV口服疫苗鴨隻免疫試驗

第一次實驗之實驗動物為9日齡正番鴨(來源：行政院農業委員會畜產試驗所宜蘭分所)，分成五組進行實驗，每組五隻。採用實施例三之方式以1.5毫克的胜肽奈米管混合50或100微克/毫升的PED質體分別製備兩種不同的GPV口服疫苗。一種是使用長胜肽奈米管為佐劑的GPV口服疫苗(L-PNT/GPV)，一種則使用短胜肽奈米管為佐劑的GPV口服疫苗(S-PNT/GPV)，以 試驗不同佐劑的免疫效果。控制組讓鴨隻口服生理食鹽水進行免疫試驗，第一組及第二組試驗組則是讓鴨隻口服GPV口服疫苗(S-PNT/GPV)，其GPV質體濃度分別為50及100微克/毫升，第三組及第四組試驗組則是讓鴨隻口服GPV口服疫苗(L-PNT/GPV)，其GPV質體濃度分別為50及100微克/毫升。

如圖7所示，第一次實驗進行口服DNA疫苗劑量測試以及長期抗體效力試驗。於第0週時，給予各組鴨隻1毫升的口服劑量，並於第2週以相同劑量進行第二次免疫。每2週採血收集血清，保存於-20℃，以ELISA檢測鴨隻血清中的抗GPV之IgG抗體，使用10微克/毫升的去活化GPV為ELISA底層抗原，樣品為血清樣本(1：50)，加入山羊抗鴨隻IgG HRP二級抗體(Goat anti dock IgG HRP(1：1000))，測定吸光值，並計算S/P比=(樣本吸光值-陰性對照組吸光值)/(陽性對照組吸光值-陰性對照組吸光值)，陽性對照組為GPV攻毒試驗存活的鴨隻血清，陰性對照組為無一級抗體之空白對照。結果顯示，L-PNT/GPV口服DNA疫苗與S-PNT/GPV口服DNA疫苗皆能引起IgG免疫反應，且能延續長達12週，另外可以看到在ANOVA檢定下(*代表p<0.05，**代表p<0.025)，GPV質體濃度100微克/毫升組別的免疫效果相較於控制組有顯著提升。因此，在鴨隻的動物實驗中，長胜肽奈米管與短胜肽奈米管做為佐劑能促進的IgG免疫效果相近。

第二次實驗之實驗動物為9日齡正番鴨(來源：行政院農業委員會畜產試驗所宜蘭分所)，這次使用長胜肽奈米管與短胜肽奈米管混合(重量比1：1)做為佐劑，測試混合不同胜肽奈米管的佐劑能否提升免疫效果。採用實施例三之方式以共1.5毫克的長/短胜肽奈米管混合260微克/毫升的GPV質體製備GPV口服疫苗。第0週時，給予試驗組的鴨隻1毫升GPV口服疫苗，給予控制組的鴨隻1毫升生理食鹽水。

如圖8及圖9所示，由於水禽類與哺乳動物不同，水禽類的血清、腸都會產生IgA反應，因此將前述取得的0、2、3周鴨隻血清以及第3週犧牲收集的十二指腸檢體來檢測IgA抗體效價。犧牲後收集鴨隻十二指腸(胃下十二指腸，約10公分長)，以5毫升生理食鹽水沖洗小腸，收集之腸液以4,000rpm，離心30分鐘收集上清液，保存於-20℃。以ELISA檢測血清或腸上清液中IgA抗體效價，使用10微克/毫升的去活化GPV為ELISA底層抗原，樣品為血清或腸上清液樣本(1：200)、加入小鼠抗鴨IgA二級抗體(mouse anti duck IgA(1：2000))，山羊抗小鼠IgG HRP三級抗體(Goat anti mouse IgG HRP(1：2000))，最後測定吸光值。使用ANOVA檢定發現，相較於控制組，不論是接種疫苗後第二週或第三週，試驗組血清中IgA抗體效價都顯著較高(*代表p<0.05，**表示p<0.025)(如圖8所示)；同樣地，相較於控制組，試驗組血清中及腸液中IgA抗體效價都顯著較高(**表示p<0.025)(如圖9所示)，代表混合長/短胜肽奈米管的佐劑可以顯著增加口服疫苗的黏膜免疫反應。

圖1A-1H所示為實施例一中胜肽奈米管產物與非洲綠猴腎細胞培養時之倒立式顯微鏡放大圖。圖1A-1B為200微克長胜肽奈米管在起始日與次日的培養狀況。圖1C-1D為400微克長胜肽奈米管在起始日與次日的培養狀況。圖1E-1F為200微克短胜肽奈米管在起始日與次日的培養狀況。圖1G-1H為400微克短胜肽奈米管在起始日與次日的培養狀況。圖中之比例尺標示為200微米。

圖2所示為實施例一中，長胜肽奈米管、短胜肽奈米管及原始材料之x光粉末繞射譜圖。

圖3A-3H所示為實施例三中長胜肽奈米管與短胜肽奈米管分別與質體DNA結合之光學顯微鏡與螢光顯微鏡觀察圖。圖3A為長胜肽奈米管與質體DNA結合之光學顯微鏡觀察圖。圖3B-圖3C分別為長胜肽奈米管與Cy5螢光標記、質體DNA與TM-rhodamine螢光標記所拍攝的螢光顯微鏡觀察圖。圖3D為圖3B與圖3C之結合圖。圖3E為短胜肽奈米管與質體DNA結合之光學顯微鏡觀察圖。圖3F-圖3G分別為短胜肽奈米管與Cy5螢光標記、質體DNA與TM-rhodamine螢光標記所拍攝的螢光顯微鏡觀察圖。圖3H為圖3F與圖3G之結合圖。圖中之比例尺標示為50微米。

圖4所示為實施例四中，第一次實驗各組於免疫後4週測得的小鼠血清抗PEDV-IgG抗體效價長條圖。

圖5所示為實施例四中，第二次實驗各組於免疫後第3週測得的小鼠腸液抗PEDV-IgA抗體效價盒鬚圖。

圖6所示為實施例四中，第三次實驗各組於免疫後第4週測得的小鼠腸液抗PEDV-IgA抗體效價盒鬚圖。

圖7所示為實施例五中，第一次實驗各組於免疫後不同週數測得的鴨隻血清抗GPV-IgG抗體S/P值長條圖。

圖8所示為實施例五中，第二次實驗各組於免疫後不同週數測得的鴨隻血清抗GPV-IgA抗體效價長條圖。

圖9所示為實施例五中，第二次實驗控制組與試驗組之鴨隻血清與腸液中於免疫後第3週測得的抗GPV-IgA抗體效價長條圖。

                         序列表
          <![CDATA[<110>  國立屏東科技大學]]>
          <![CDATA[<120>  胜肽奈米管之製備方法、用途及其免疫組成物]]>
          <![CDATA[<130>  P20-0222]]>
          <![CDATA[<160>  4     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  763]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  豬流行性下痢病毒]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Pro Thr Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Gln Ser Thr Thr 
          1               5                   10                  15      
          Asn Phe Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val 
                      20                  25                  30          
          Val Val Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ser Met Asn Ser Ser Ser Trp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Cys Gly Thr Gly Ile Glu Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Leu 
              50                  55                  60                  
          Ser Tyr Ile Asp Ser Gly Gln Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn 
                          85                  90                  95      
          Gly Asn Thr Asn Ala Ile Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Asp 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys Thr Leu Gly Pro Thr Val Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn 
                  115                 120                 125             
          Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala Tyr Met Arg Asp Gly Lys Asp 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Lys Ile Tyr His Phe Tyr Leu Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala 
                          165                 170                 175     
          Thr Arg Cys Tyr Asn Arg Arg Ser Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Thr 
                      180                 185                 190         
          Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile 
                  195                 200                 205             
          Tyr Tyr Glu Pro Cys Thr Ala Asn Cys Thr Gly Tyr Ala Ala Asn Val 
              210                 215                 220                 
          Phe Ala Thr Asp Ser Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Leu His Gly Lys Val 
                          245                 250                 255     
          Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys 
                      260                 265                 270         
          Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn His Thr Met Asp Gly 
                  275                 280                 285             
          Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Asp Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe 
              290                 295                 300                 
          Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu 
          305                 310                 315                 320 
          His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Leu Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser 
                          325                 330                 335     
          Asp Pro His Leu Ala Ile Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Glu Val 
                      340                 345                 350         
          Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr 
                  355                 360                 365             
          Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr 
              370                 375                 380                 
          Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp 
                          405                 410                 415     
          Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ser Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp 
                  435                 440                 445             
          Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp 
              450                 455                 460                 
          Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val 
                          485                 490                 495     
          Asn Ile Thr Val Ser Ala Ala Phe Gly Gly Leu Ser Ser Ala Asn Leu 
                      500                 505                 510         
          Val Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp 
                  515                 520                 525             
          Thr Arg Gln Phe Thr Ile Thr Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr 
              530                 535                 540                 
          Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser 
                          565                 570                 575     
          Leu Leu Ala Gly Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Ala Phe 
                      580                 585                 590         
          Gly Ser Gly Val Lys Leu Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly 
                  595                 600                 605             
          Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Ile Thr Asp Val 
              610                 615                 620                 
          Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Ile Leu Ala Gly 
                          645                 650                 655     
          Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val 
                      660                 665                 670         
          Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln 
                  675                 680                 685             
          Ala Ala Tyr Val Asn Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser 
              690                 695                 700                 
          Asn Ser Thr Phe Asn Asn Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His 
          705                 710                 715                 720 
          Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn 
                          725                 730                 735     
          Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln Tyr 
                      740                 745                 750         
          Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly 
                  755                 760             
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  2289]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  豬流行性下痢病毒]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          ccaacactca gcctaccaca agatgtcact aggtgccagt ctactactaa ctttaggcgg       60
          ttcttttcaa aatttaatgt tcaggcacct gccgtcgtcg ttttgggtgg ttacctacct      120
          agtatgaact cttctagctg gtactgtggc acaggcattg aaactgctag tggcgttcat      180
          ggtatttttc tcagctacat cgattctggt cagggctttg agattggcat ttcgcaagag      240
          ccgtttgatc ctagtggtta ccagctttat ttacataagg ccactaatgg taacactaat      300
          gctattgcac gactgcgcat ttgccagttt cccgataata aaacattggg ccctactgtt      360
          aatgatgtta caacaggtcg taactgccta ttcaacaaag ccattccagc ttatatgcgt      420
          gatggaaaag atattgttgt cggcataaca tgggataatg atcgtgtcac tgtttttgct      480
          gacaagatct atcattttta tcttaaaaat gattggtccc gcgttgcgac aagatgttac      540
          aatcgcagaa gttgtgctat gcaatatgtt tatacaccta cctactacat gcttaatgtt      600
          actagtgcag gtgaggatgg catttattat gaaccctgta cagctaattg cactggttac      660
          gctgccaatg tatttgccac tgattccaat ggccatatac cagaaggttt tagttttaat      720
          aattggtttc ttttatccaa tgactccact ttgttgcatg gtaaagtggt ttccaaccaa      780
          cccttgttgg tcaattgtct tttggccatt cctaagattt atggactagg ccaatttttc      840
          tcattcaatc acacgatgga tggcgtttgt aatggagctg ctgtggatcg tgccccagag      900
          gctctgaggt ttaatattaa tgacacctcc gtcattcttg ctgaaggctc aattgtactt      960
          catactgctt taggaacaaa tctttctttt gtttgcagta attcctcaga tcctcattta     1020
          gccatctttg ccatacctct gggtgctact gaagtaccct actattgctt tcttaaagtg     1080
          gatacttaca actccactgt ttataaattc ttggctgttt tacctcctac tgtcagggaa     1140
          attgtcatca ccaagtatgg tgatgtttat gtcaatgggt ttggctattt gcatctcggt     1200
          ttgttggatg ctgtcacaat taatttcact ggtcatggca ctgacgatga cgtttcaggt     1260
          ttctggacca tagcatcgac taattttgtt gatgcactca tcgaggttca aggaacttcc     1320
          attcagcgta ttctttattg tgatgatcct gttagccaac tcaagtgttc tcaggttgct     1380
          tttgaccttg acgatggttt ttaccccatc tcttctagaa accttctgag tcacgaacag     1440
          ccaatttctt ttgttacttt gccatcattt aatgatcatt cttttgttaa tattactgtc     1500
          tctgcggctt ttggtggtct tagtagtgcc aatctcgttg catctgacac tactatcaat     1560
          gggtttagtt ctttctgtgt tgacactaga caatttacca ttacactgtt ttataatgtt     1620
          acaaacagtt atggttatgt gtctaaatca caggatagta attgtccttt caccttgcaa     1680
          tctgttaatg attacctgtc ttttagcaaa ttttgtgttt caaccagcct tttggctggt     1740
          gcttgtacca tagatctttt tggttaccct gcgttcggta gtggtgttaa gttgacgtcc     1800
          ctttattttc aattcacaaa aggtgagttg attactggca cgcctaaacc acttgaaggt     1860
          atcacagacg tttcttttat gactctggat gtgtgtacca agtatactat ctatggcttt     1920
          aaaggtgagg gtattattac ccttacaaat tctagcattt tggcaggtgt ttattataca     1980
          tctgattctg gacagttgtt agcctttaag aatgtcacta gtggtgctgt ttattctgtc     2040
          acgccatgtt ctttttcaga gcaggctgca tatgttaatg atgatatagt gggtgttatt     2100
          tctagtttgt ctaactccac ttttaacaat actagggagt tgcctggttt cttctaccat     2160
          tctaatgacg gctccaattg tacagagcct gtgttggtgt atagtaacat aggtgtttgt     2220
          aaatctggca gtattggcta tgttccatct cagtatggcc aagtcaagat tgcacccacg     2280
          gttactggg                                                             2289
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  587]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  鵝源水禽小病毒]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Thr Ala Pro Ala Lys Lys Asn Thr Gly Lys Leu Thr Asp His Tyr Pro 
          1               5                   10                  15      
          Val Val Lys Lys Pro Lys Leu Thr Glu Glu Val Ser Ala Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser Ser Ala Val Gln Asp Gly Gly Ala Thr Ala Glu Gly Thr Glu Pro 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Ala Ser Glu Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Ala Met Gly Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Ser Gly Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asn Trp His 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Asp Ser Gln Trp Met Gly Asn Thr Val Ile Thr Lys Thr Thr Arg 
                          85                  90                  95      
          Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Ile Tyr Lys Ala Ile Thr 
                      100                 105                 110         
          Ser Gly Thr Ser Gln Asp Ala Asn Val Gln Tyr Ala Gly Tyr Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn His Trp Gly Ile Arg Pro Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Lys Phe Lys Ile Phe Asn Val Gln Val Lys Glu Val Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Gln Asp Gln Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln 
                      180                 185                 190         
          Val Phe Thr Asp Asp Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala 
                  195                 200                 205             
          Thr Glu Gly Thr Met Pro Pro Phe Pro Ser Asp Val Tyr Ala Leu Pro 
              210                 215                 220                 
          Gln Tyr Gly Tyr Cys Thr Met His Thr Asn Gln Asn Gly Ala Arg Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Asp Arg Ser Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met 
                          245                 250                 255     
          Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Thr Phe Asp Phe Glu Glu Val 
                      260                 265                 270         
          Pro Phe His Ser Met Phe Ala His Ser Gln Asp Leu Asp Arg Leu Met 
                  275                 280                 285             
          Asn Pro Leu Val Asp Gln Tyr Leu Trp Asn Phe Asn Glu Val Asp Ser 
              290                 295                 300                 
          Ser Arg Asn Ala Gln Phe Lys Lys Ala Val Lys Gly Ala Tyr Gly Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Gly Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Lys Phe Leu Asp Gln Arg Val 
                          325                 330                 335     
          Arg Ala Tyr Thr Gly Gly Thr Asp Asn Tyr Ala Asn Trp Asn Ile Trp 
                      340                 345                 350         
          Ser Asn Gly Asn Lys Val Asn Leu Lys Asp Arg Gln Tyr Leu Leu Gln 
                  355                 360                 365             
          Pro Gly Pro Val Ser Ala Thr Tyr Thr Glu Gly Glu Ala Ser Ser Leu 
              370                 375                 380                 
          Pro Ala Gln Asn Ile Leu Gly Ile Ala Lys Asp Pro Tyr Arg Ser Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Thr Thr Ala Gly Ile Ser Asp Ile Met Val Thr Glu Glu Gln Glu 
                          405                 410                 415     
          Val Ala Pro Thr Asn Gly Val Gly Trp Lys Pro Tyr Gly Arg Thr Val 
                      420                 425                 430         
          Thr Asn Glu Gln Asn Thr Thr Thr Ala Pro Thr Ser Ser Asp Leu Asp 
                  435                 440                 445             
          Val Leu Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr 
              450                 455                 460                 
          Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Lys Ile Pro Lys Thr Asp Gly Lys Phe 
          465                 470                 475                 480 
          His Pro Ser Pro Asn Leu Gly Gly Phe Gly Leu His Asn Pro Pro Pro 
                          485                 490                 495     
          Gln Val Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Val Glu 
                      500                 505                 510         
          Tyr Val His Gln Lys Trp Asn Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly 
                  515                 520                 525             
          Gln Cys Thr Val Glu Met Val Trp Glu Leu Arg Lys Glu Asn Ser Lys 
              530                 535                 540                 
          Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Ser Asn Arg Thr 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Ile Met Phe Ala Pro Asn Glu Thr Gly Gly Tyr Val Glu Asp Arg 
                          565                 570                 575     
          Leu Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Gln Asn Leu 
                      580                 585         
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  1764]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  鵝源水禽小病毒]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          acggcacctg caaaaaaaaa tacagggaag cttactgacc attacccggt agttaagaag       60
          cctaaactta ccgaggaagt cagtgcggga ggtggtagca gtgccgtaca agacggagga      120
          gccaccgcgg agggcaccga acctgtggca gcatctgaaa tggcagaggg aggaggcgga      180
          gctatgggcg actcttcagg gggtgccgat ggagtgggta atgcctcggg aaattggcat      240
          tgcgattccc aatggatggg aaacacagtc atcacaaaga ccaccagaac ctgggtcctg      300
          ccaagctaca acaaccacat ctacaaagca attaccagcg gaacctctca agatgcaaat      360
          gtccagtatg caggatacag taccccctgg gggtactttg atttcaaccg cttccactgc      420
          cacttctccc ctagagactg gcagagactt atcaacaacc attggggaat cagacccaag      480
          tctcttaaat tcaagatctt caatgtccaa gtcaaagaag tcacaacgca ggatcagaca      540
          aagaccattg caaacaatct cacctcaaca attcaagtct ttacggatga tgagcatcaa      600
          ctcccgtatg tcctgggctc ggctacggaa ggcaccatgc cgccgttccc gtcggatgtc      660
          tatgccctgc cgcagtacgg gtactgcaca atgcacacca accagaatgg agcacggttc      720
          aatgaccgta gtgcattcta ctgcttagag tacttcccta gtcagatgct aagaacaggc      780
          aacaactttg agttcacatt tgactttgaa gaagttcctt tccatagcat gttcgctcat      840
          tcacaggact tagacaggct gatgaacccc ctagtggatc aatacctctg gaatttcaat      900
          gaggtagaca gcagcagaaa tgctcaattt aaaaaggctg tgaaaggggc ttatggcacc      960
          atgggccgca attggctgcc aggacctaaa ttcctggatc aaagagttag ggcctacaca     1020
          ggaggaacag acaactatgc aaactggaac atctggagta atgggaacaa ggtgaatttg     1080
          aaagacagac agtatctcct acaacccgga cctgtgtcag ctacttacac agaaggggag     1140
          gcttccagcc ttccagctca aaatatttta gggatagcta aagatccata cagatcaggc     1200
          agcactacag caggaataag tgacattatg gtcacggaag aacaagaagt agcacctaca     1260
          aatggagtag ggtggaaacc atatggtagg actgtaacga atgaacaaaa cactactaca     1320
          gctcctacaa gttcagatct ggatgttctt ggagctttac caggaatggt ttggcagaac     1380
          agggatatat atctgcaggg acctattggg gcaaaaatac cgaagactga tggtaaattc     1440
          catccttctc cgaatctcgg aggatttggc ctgcacaatc caccaccgca ggtgttcatc     1500
          aagaatacac cagtgcctgc agaccctcca gtagaatacg tgcaccagaa gtggaattcc     1560
          tacataaccc agtactctac gggccagtgt acagtagaga tggtgtggga gctgagaaaa     1620
          gagaattcaa agagatggaa cccagaaatc cagttcacca gtaatttcag taacagaaca     1680
          agcataatgt ttgcacctaa tgaaactggt ggatatgtag aagatagatt gattggaacc     1740
          agatatctaa ctcaaaatct gtaa                                            1764
          

Claims (10)

1. 一種胜肽奈米管做為增加黏膜免疫反應之DNA疫苗佐劑之用途，該胜肽奈米管之製備方法包含：混合一環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一水形成一溶液；震盪該溶液至混合均勻；以及移除該溶液中之上清液以形成該胜肽奈米管。
2. 如請求項1之用途，其進一步搭配另一胜肽奈米管做為增加黏膜免疫反應之DNA疫苗佐劑，該另一胜肽奈米管之製備方法包含：混合該環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一酒精形成另一溶液；震盪該另一溶液至混合均勻；以及揮發該另一溶液中之酒精以形成該另一胜肽奈米管，其中該另一胜肽奈米管與該胜肽奈米管之重量比之範圍係從5：95至95：5。
3. 如請求項1之用途，其中該環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與該水之重量比例為3：2000。
4. 如請求項1之用途，其係用於動物口服免疫。
5. 一種免疫組成物，包含：一質體，以及一胜肽奈米管，其中該質體上含有一編碼一抗原蛋白質片段的DNA序列，該胜肽奈米管之製備方法包含：混合一環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一水形成一溶液；震盪該溶液至混合均勻；以及移除該溶液中之上清液以形成該胜肽奈米管。
6. 如請求項5之免疫組成物，其進一步包含另一胜肽奈米管，該另一胜肽奈米管之製備方法包含：混合該環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一酒精形成另一溶液；震盪該另一溶液至混合均勻；以及揮發該另一溶液中之酒精以形成該另一胜肽奈米管，其中該另一胜肽奈米管與該胜肽奈米管之重量比之範圍係從5：95至95：5。
7. 如請求項5之免疫組成物，其進一步包含一黏性劑，其佔該免疫組成物75至95體積百分比，該黏劑性包含一生物可代謝油。
8. 如請求項5之免疫組成物，其中該環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與該水之重量比例為3：2000。
9. 一種胜肽奈米管之製備方法，包含：混合一環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與一水形成一溶液；震盪該溶液至混合均勻；以及移除該溶液中之上清液以形成該胜肽奈米管。
10. 如請求項9之製備方法，其中該環-(D-色胺酸-酪胺酸)粉末與該水之重量比例為3：2000。

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