CN114246879A

CN114246879A - 木蝴蝶苷b在制备用于预防、控制和/或治疗眼部疾病药物中的用途

Info

Publication number: CN114246879A
Application number: CN202111680307.7A
Authority: CN
Inventors: 刘继东; 杨强; 赵欣; 王小桐; 祖嶶; 沈旭
Original assignee: Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114246879B

Abstract

本发明涉及木蝴蝶苷B在制备用于预防、控制和/或治疗眼部疾病药物中的用途，其特征在于，所述眼部疾病是与新生血管有关的眼部疾病，其中木蝴蝶苷B通过抑制眼组织血管的病理性增生，治疗由所述眼组织血管的病理性增生导致的血管渗漏和/或瘢痕形成所引起的眼部疾病。并且木蝴蝶苷B通过抑制血管内表皮生长因子VEGF的表达，同时抑制炎症因子白细胞介素IL‑1、IL‑6，细胞间黏附分子ICAM‑1以及基质金属蛋白酶MMP9、MMP2的表达以抑制眼组织新生血管的形成和发展，从而达治疗所述眼部疾病的效果。

Description

木蝴蝶苷B在制备用于预防、控制和/或治疗眼部疾病药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及木蝴蝶苷B在制备用于预防、控制和/或治疗眼部疾病药物中的用途。

背景技术

血管新生(Angiogenesis，也可以称作新生血管形成)是指在原有血管的基础上，内皮细胞以发芽的模式形成新血管的过程，具体表现为在促血管生成因子的作用下，血管内皮细胞从静止状态开始迁移，同时激活间质金属蛋白酶(如MMP2、MMP9)降解血管外基质，进而内皮细胞可以向周围扩增和迁移形成血管腔，最后周细胞和平滑肌细胞等环绕在内皮细胞周围形成完整的血管新生。血管新生在胚胎发育和创伤修复等生理活动发挥重要作用，健康成年人血管新生处于相对静止状态。维持正常血管系统的动态平衡包括促血管生成因子和抑制血管生成因子，正常情况下两者处于相对平衡。当机体受到某些刺激时平衡被打破，血管新生就会被激活。快速不受控制增长的眼部血管新生形成脆弱和渗漏的脉管，造成眼内出血和液体及蛋白质渗出物在眼腔内的积累，角膜透明度降低，视网膜神经元的结构和功能受损，导致视力下降。这些血管可能诱发纤维瘢痕的形成，对角膜、视网膜功能造成不可逆的损害，如果不加以治疗，最终会导致失明。

血管新生是一个极为复杂的过程，主要由缺氧和炎症诱导，包括细胞的增殖、迁移、管腔形成、血管重构等一系列过程，涉及多种因子多条信号通路参与。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是在所有已经发现和鉴定的血管生成促进因子中最重要且研究最多的一个，是血管新生的始动蛋白。缺氧和炎症反应等病理状态的持续存在能诱导角膜上皮和内皮细胞分泌的VEGF增加，VEGF受体属于酪氨酸蛋白激酶受体(tyrosine kinases receptor)，VEGF通过与血管内皮细胞上的特异性受体结合，诱导的内皮细胞开始增殖、分化、迁移和形成毛细血管来促进血管生成。

许多研究表明VEGF还可以作为免疫细胞的趋化因子，组织损伤时VEGF会招募免疫细胞尤其是巨噬细胞到组织损伤部位发挥免疫作用，这时巨噬细胞增多会释放更多的VEGF促进血管生成。此外，促血管生成因子还包括：碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、白细胞介素、基质金属蛋白酶、肿瘤坏死因子、血管生成素、细胞间粘附因子ICAM-1和环氧化酶-2等。如白细胞介素1(IL-1)是一种多能细胞因子，不仅参与急性炎症反应，激活炎症细胞，还可以上调细胞间黏附分子ICAM-1，导致血管的生成，还有白细胞介素6(IL-6)等其他炎症细胞因子促进炎症环境，导致巨噬细胞、角膜上皮和结膜上皮分泌VEGF。基质金属蛋白酶是一类分解细胞外基质组分的锌蛋白酶，它们可以降解新出芽血管细胞外基质，同时还能释放细胞因子、生长因子、趋化因子和激活潜在的信号分子，如角膜血管血管新生出现MMP2和MMP9高表达。

健康的角膜是透明、无血管的，位于虹膜和瞳孔的前方，对保护眼球免受感染、外伤以及维持最佳视力等起到至关重要的作用。角膜维持无血管状态是由于促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡。但感染、角膜移植、自身免疫、化学损伤、创伤和隐形眼镜诱导等有害条件引起的缺氧和炎症刺激，会打破促血管生成和抗血管生成因子平衡，导致异常血管新生从角巩膜缘侵入角膜基质，引起角膜血管新生。角膜血管新生是一种威胁视力的疾病，也是日益严重的公共卫生问题。一项研究报告估计每年有140万人发病，其中12％的人随后出现视力丧失，同时角膜血管血管新生也是角膜移植术后主要的并发症之一。因此，抗炎和抗血管化可能是治疗角膜血管新生的有效方法。

木蝴蝶，学名Oroxylum indicum，又名千张纸、玉蝴蝶等，是紫葳科木蝴蝶属植物木蝴蝶的干燥成熟种子。作为一味传统常用中药，自1963年版中国药典就开始收载，其味苦、甘、凉，归肺、肝、胃经；《本草纲目拾遗》著：“治心气，肝气痛，凡痈毒不收口，一贴之，即敛”；《中国药典》记载：“清肺利咽、疏肝和胃，用于肺热咳嗽，喉痹，肝胃气痛等”。木蝴蝶富含多种黄酮类物质，主要包括木蝴蝶苷A(Oroxin A)、木蝴蝶苷B(Oroxin B)、黄芩素(Baicalein)、白杨素(Chrysin)等。木蝴蝶苷B是木蝴蝶的专属性成分，其分子式为C₂₇H₃₀O₁₅，分子量为594.52，具有式Ⅰ所示的结构：

木蝴蝶苷B在中国药典作为木蝴蝶药材质量控制的重要指标；最近一些研究表明，木蝴蝶苷B具有很强的抗肝癌作用和抑制淋巴肿瘤作用；重要的是，与另外三种黄酮相比，木蝴蝶苷B在中性和微酸性条件下具有最佳的水溶性，所以可能更适合开发成眼部给药的化合物。

关于木蝴蝶苷B在眼部抗血管新生和炎症等疾病方面的应用，目前尚未见报道。

发明内容

发明要解决的问题

本发明是基于治疗与眼部新生血管相关的疾病问题而提出的，其目的在于，提供采用木蝴蝶苷B在制备用于预防、控制和/或治疗眼部疾病药物中的用途。

用于解决问题的方案

本发明提供一种木蝴蝶苷B在制备用于预防、控制和/或治疗眼部疾病药物中的用途，其特征在于，所述眼部疾病是与新生血管有关的眼疾。

进一步，优选的，所述新生血管有关的眼部疾病是由眼组织血管的病理性增生导致的血管渗漏和/或瘢痕形成所引起的。

进一步，优选的，所述与新生血管有关的眼部疾病包括以下眼部疾病中的一种或多种：

炎症，优选眼表炎症；

角膜新生血管形成；

视网膜新生血管形成；

血管渗漏性增加；

年龄相关性黄斑水肿；

年龄相关性黄斑变性；

糖尿病性黄斑水肿；

糖尿病性视网膜水肿；

新生血管性虹膜症；

新生血管性青光眼；

脉络膜新生血管形成；和

眼周组织病变。

进一步，优选的，木蝴蝶苷B通过抑制眼组织血管内皮细胞的增殖、迁移和/或成管趋势预防、控制和/或治疗眼部疾病。

进一步，优选的，木蝴蝶苷B通过抑制血管内表皮生长因子VEGF的表达，抑制眼组织新生血管。

进一步，优选的，木蝴蝶苷B同时抑制炎症因子、细胞粘附分子和基质金属蛋白酶的表达。

进一步，优选的，所述炎症因子为白细胞介素1和白细胞介素6。

进一步，优选的，所述基质金属蛋白酶为MMP9、MMP2。

进一步，优选的，所述细胞粘附分子为ICAM-1。

进一步，优选的，所述预防、控制和/或治疗眼部疾病的药物是外用涂覆施用的剂型，例如滴眼剂、眼部洗剂或眼药膏；或者是适用于向前房、玻璃体、结膜下或球外筋膜囊注射施用的剂型；或者是适用于植入玻璃体内的眼球植入剂施用的剂型。

发明效果

(1)木蝴蝶苷B，能够显著抑制血管新生的形成及血管的渗漏，并且其是通过抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管趋势，对正常组织没有毒副作用；

(2)木蝴蝶苷B，对于预防、控制、和/或治疗眼血管新生增生、血管渗漏性增加引起的不适症、疾病具有良好的治疗效果，如炎症，优选眼表炎症、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、血管渗漏性增加、年龄相关性黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜水肿、新生血管性虹膜症、新生血管性青光眼、脉络膜新生血管形成和眼周组织病变一系列疾病，更具备针对性的治疗效果；

(3)从商业角度上考虑，有效成分木蝴蝶苷B来源中药材木蝴蝶，价格低廉，是一种安全有效的制剂，因此很好的商业性合成可行性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是木蝴蝶苷B抑制人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)的增殖的图。

图2是木蝴蝶苷B抑制HRMEC细胞的迁移的图。

图3是木蝴蝶苷B抑制HRMEC细胞的微管形成作用的图。

图4是HPLC法测定溶液中木蝴蝶苷B的色谱图。

图5是使用木蝴蝶苷B溶液对兔眼的刺激性的图。

图6是使用木蝴蝶苷B溶液对兔眼的毒性的苏木素-伊红(HE)染色图。

图7是UPLC-MS/MS法测定木蝴蝶苷B(A)及内标乙氧苯柳胺(B)对照品的二级质谱图。

图8是UPLC-MS/MS法测定兔眼组织中木蝴蝶苷B的浓度的图。

图9是低、中、高三种浓度木蝴蝶苷B溶液在单次给药后，木蝴蝶苷B在兔眼组织中随时间的浓度分布。

图10是大鼠碱烧伤后各组角膜透明度分数图(A)、血管新生面积图(B)。

图11是大鼠碱烧伤后各组角膜裂隙灯显微镜检查图。

图12是大鼠角膜的炎症因子等各基因表达水平图。

图13是大鼠角膜在碱烧伤后14天的HE染色图。

具体实施方式

现在将参照附图来详细描述本公开的各种示例性实施例。对示例性实施例的描述仅仅是说明性的，决不作为对本公开及其应用或使用的任何限制。本公开可以以许多不同的形式实现，不限于这里所述的实施例。提供这些实施例是为了使本公开透彻且完整，并且向本领域技术人员充分表达本公开的范围。应注意到：除非另有说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、材料的组分、数字表达式和数值等应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。

本公开中使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其它要素的可能。“上”、“下”、“左”、“右”、“横向”、“纵向”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。

本公开使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。

对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明的实施例公开了木蝴蝶苷B在制备用于预防、控制和/或治疗眼部疾病药物中的用途，主要通过以下设计的五个实验来进行说明。其中，所有统计分析均使用SPSS16.0软件进行t检验或单因素方差分析，P<0.05时，被视为存在统计学差异。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器若未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实验1：木蝴蝶苷B具有抑制人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)的增殖、迁移和微管形成的作用

一.材料和试剂

人视网膜微血管内皮细胞(Human Retina Microvascular Endothelia Cell,HRMEC)(购自上海细胞库，中国)；

木蝴蝶苷B(含量≥99.5％)(美国sigma公司)；

内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium)培养基(美国Sciencell公司)；

0.25％Trypsin-EDTA(1×)(美国Gibco公司)；

胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)；

二甲基亚砜(DMSO)(德国PanReac Applichem公司)；

Cell Counting Kit-8solution(美国Abcam公司)；

基质胶Matrigel Matrix(美国BD公司)

二.实验仪器

CCL-050B-8型CO₂细胞培养箱(新加坡艺思高科技有限公司)；

DMi8倒置荧光显微镜(德国Lecia公司)；

DMi1倒置显微镜(德国Lecia公司)；

AC2-4S1生物安全柜(新加坡艺思高科技有限公司)；

Multiskan Sky全波长酶标仪(美国Thermo公司)；

XS105电子分析天平(瑞士METTER TOLEDO公司)

三.实验步骤及结果

1.增殖实验：收集处于生长对数期人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)细胞，用含胎牛血清的ECM培养基调整细胞悬液浓度，按照细胞密度为5×10³个/孔、每孔100μL接种至96孔板中，5％CO₂ 37℃CO2细胞培养箱孵育24h，待细胞单层贴牢孔底后更换无胎牛血清ECM培养基继续饥饿培养24h，分别加入含不同浓度的木蝴蝶苷B(25、50、80、100、120、150、200μM)的培养基100μL，每个浓度设置5个复孔(实验孔)。其中对照孔加入相同体积的含0.1％DMSO的无胎牛血清ECM培养基，同时设置只含无胎牛血清ECM培养基的空白孔，混合均匀后放入细胞培养箱分别培养24h和48h，每孔加入10μL CCK8试剂，继续培养2h，采用酶标仪测定460nm处的吸光度。

计算公式：细胞活力＝[(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)]*100％。

图1展示了木蝴蝶苷B抑制HRMEC细胞的增殖呈剂量和时间的依赖性，即随着木蝴蝶苷B浓度的增加，细胞相当增殖活性逐渐降低，并且随着培养时间的增长，细胞相当增殖活性逐渐降低，24h CCK-8实验表明，与对照组比较，木蝴蝶苷B对hRMEC增殖活性的抑制呈剂量依懒性，即随着木蝴蝶苷B浓度的增加，细胞增殖活性逐渐降低，其中50μM木蝴蝶苷B增殖活性为99％；100μM木蝴蝶苷B增殖活性为95％；120μM木蝴蝶苷B增殖活性为87％(p<0.05)；150μM木蝴蝶苷B增殖活性为85％(p<0.05)；200μM木蝴蝶苷B增殖活性为76％(p<0.01)；另外木蝴蝶苷B对hRMEC增殖活性的抑制同时呈时间依懒性，即随着木蝴蝶苷B作用时间的增加，对hRMEC的抗增殖作用进一步增加，120μM木蝴蝶苷B增殖活性降为79％(p<0.01)；150μM木蝴蝶苷B增殖活性降为69％(p<0.01)；200μM木蝴蝶苷B增殖活性降为60％(p<0.01)。

2.迁移实验：将HRMEC细胞按密度为1×10⁵个/孔接种于24孔板中，加含胎牛血清完全培养基5％CO₂ 37℃孵育，待细胞到达90％左右融合时，更换无胎牛血清ECM培养基继续饥饿培养24h。采用无菌200μL枪头垂直预孔板底画线，并用PBS轻轻冲洗脱落细胞碎片3次，分别加入完全培养基(对照组)或150μM木蝴蝶苷B继续培养24h(n＝3)。细胞迁移评估通过显微镜下划痕宽度测定，并采用Image J对照片进行处理分析，该实验重复三次。

图2展示了木蝴蝶苷B抑制HRMEC细胞的迁移，24h对照组划痕处几乎全部愈合，而150μM木蝴蝶苷B组仍为34％左右空白，细胞迁移率明显下降(p<0.05)，提示木蝴蝶苷B能显著抑制HRMEC的迁移。(*p≤0.05)

3.成管实验：基质胶隔夜4℃融化，并提前将96孔板和200μL枪头放于4℃预冷。每孔加入70μL基质胶均匀铺在96孔板底部同时避免气泡产生，37℃孵育1h。将HRMEC细胞利用0.25％胰酶消化观察2min左右，停止消化，吹打成单细胞悬液后计数。调节单细胞悬液约为1×10⁴个/孔HRMEC细胞接种于铺有基质胶的96孔板内,分别加入完全培养基或150μM木蝴蝶苷B，37℃，0.5％CO2培养箱放置6h后显微镜下拍照，每孔随机选取4个视野观察形成的管腔，计算形成的小管数，各取平均值。

图3展示了木蝴蝶苷B抑制HRMEC细胞的成管作用，每个视野，对照组HRMEC形成16±2个闭合管腔，而150μM木蝴蝶苷B组只有7±2个闭合管腔，细胞成管数量明显下降(p<0.05)，提示木蝴蝶苷B能显著抑制HRMEC的成管能力。(*p≤0.05)

实验1展示了木蝴蝶苷B具有抑制HRMEC的增殖、迁移和微管形成的作用，因此具有抑制血管新生的作用，可从这一方面考虑其制备用于治疗眼部疾病药物中的用途。

实验2：HPLC法测定溶液中木蝴蝶苷B含量，同时考察连续使用木蝴蝶苷B溶液后眼刺激性和眼局部毒性

一.材料和试剂

木蝴蝶苷B(含量≥99.5％)(成都格林普生物科技有限公司)；

甘露醇(含量≥99.3％)(辽宁医药物资有限公司)；

磷酸二氢钾(含量≥99％)(Fisher Scientific)；

甲醇(色谱纯)(美国Sigma-Aldrich公司)；

乙腈(色谱纯)(美国Sigma-Aldrich公司)；

超纯水(自制，德国默克密理博公司)；

环保组织固定液(雷根生物)；

透明液(雷根生物)；

苏木素(德国莱卡公司)；

伊红(德国莱卡公司)；

二.实验仪器

H-class Waters Acquity UPLC高效液相色谱仪(美国Waters公司)；

XS105电子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)；

WH260-H红外磁力搅拌器(德国Wiggens公司)；

LGJ-25C冷冻干燥机(北京四环福瑞科仪科技发展有限公司)；

DSC 250差示量热分析仪(美国TA Instruments公司)，

RM2255全自动轮转切片机(德国Lecia公司)；

DM3000正置荧光显微(德国Lecia公司)；

包埋机(市售)，

HI1210摊片机(德国Lecia公司)；

HI1220烤片机(德国Lecia公司)；

SL-17手持裂隙灯(日本Kowa公司)

三.实验步骤及结果

1.木蝴蝶苷B的HPLC色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(5μm，100mm×4.6mm)；以磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾1.36g，加水1000ml使溶解)-乙腈(75：25)为流动相；流速为1.0ml/min；检测波长为276nm；柱温30℃；进样量10μl。在此条件下木蝴蝶苷B保留时间分别为2.363min。

图4展示HPLC法测定木蝴蝶苷B的色谱图，空白溶媒(A)此处为木蝴蝶苷B溶液中除了木蝴蝶苷B以外的其他辅料、20ug/mL木蝴蝶苷B对照品溶液(B)色谱图、木蝴蝶苷B样品图(C)；由图可知，空白溶媒对主峰无干扰。

2.木蝴蝶苷B溶液眼刺激性评价：采用0.5％荧光素钠及裂隙灯显微镜进行双眼检查的方法，挑选眼部无眼刺激性、角膜缺陷和结膜损伤的12例健康新西兰兔，设受试物组和空白对照组，每组6只，雌雄各半，采用同体左右侧眼自身对比法，左侧给予1％木蝴蝶苷B溶液或空白溶媒为50μL/侧/次；右侧给予等体积的0.9％氯化钠注射液作对照，每天给药4次，连续给药21天。于第7天、第14天和第21天给药前及给药21天最后一次给药后1、2、4、24小时观察全部动物眼睛的局部反应情况并详细记录异常情况和眼部反应的分值，并对动物双眼进行荧光素染色检查。

图5展示木蝴蝶苷B溶液使用对眼部的刺激性，裂隙灯检查结果为兔双眼均未见明显异常变化，木蝴蝶苷B溶液和空白溶媒连续3周多次滴眼给药，均未见兔眼引起刺激性反应

3.木蝴蝶苷B溶液眼表毒性评价：眼刺激性观察后动物空气栓塞处死，取各组眼球进行脱水、包埋及苏木素-伊红染色(HE)染色。具体做法为：眼球放入4％多聚甲醛溶液中固定24小时后，分取各组角膜和结膜组织冲水过夜，依次进行梯度酒精脱水：50％乙醇Ⅰ脱水30min、50％乙醇Ⅱ脱水30min、75％乙醇Ⅰ脱水30min、75％乙醇Ⅱ脱水30min、95％乙醇Ⅰ脱水20min、95％乙醇Ⅱ脱水20min、无水乙醇Ⅰ脱水20min、无水乙醇Ⅱ脱水20min；之后50％乙醇-50％透明液透明20min、透明液Ⅰ透明40min、透明液Ⅱ透明40min；50％蜡-50％透明液透蜡20min、蜡Ⅰ透蜡20min、蜡Ⅱ透蜡20min(60℃)；石蜡包埋之后4μm连续切片，放入65℃烘箱中4-5h，苏木素-伊红染色：苏木素染色2min，自来水冲洗20min(避免水直接洒到切片上)，1％盐水酒精分化液10s，自来水冲洗，伊红复染5s，自来水冲洗30s；乙醇脱水：85％、95％、无水乙醇分别浸泡2分钟；透明：二甲苯Ⅰ浸泡5min、透明液Ⅱ浸泡5min；中性树胶封片。

图6展示木蝴蝶苷B溶液眼表毒性，木蝴蝶苷B溶液和空白溶媒连续3周多次滴眼给药各组角膜、结膜HE染色，均未见兔眼引起毒性反应。其中，生理盐水(A)、空白溶媒(B)、1％木蝴蝶苷B溶液(C)兔角膜HE染色图；生理盐水(D)、空白溶媒(E)、1％木蝴蝶苷B溶液(F)兔结膜HE染色图。

实验2展示了使用对于兔眼使用木蝴蝶苷B溶液，眼表无刺激性也无毒性，说明木蝴蝶苷B作为制备用于治疗眼部疾病药物是安全的。

实验3.采用UPLC-MS/MS法测定木蝴蝶苷B在眼组织分布

一.材料和试剂

色谱纯乙腈(美国Sigma-Aldrich公司)；

色谱纯甲醇(美国Sigma-Aldrich公司)；

木蝴蝶苷B对照品(国家标准物质中心)；

木蝴蝶苷B(含量≥99.5％，成都格林普生物科技有限公司)；

乙氧苯柳胺对照品(国家标准物质中心)；

色谱级甲酸(中国迪马科技有限公司)；

超纯水(Milli-Q超纯水过滤系统，德国密理博公司)；

二.实验仪器

色谱柱(菲罗门

XB_C18 100A 50mm×2.1mm,i.d.,1.7μm)

塑料离心EP管(沈阳色谱仪器科学有限公司)；

微量移液枪(Eppendorf公司)；

AB Sciex Qtrap 5500型质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst1.6.1数据处理软件(美国Applied Biosystems公司)；

AllegraTM X-22R低温高速离心机(美国Backman公司)；

Precellys Evolvtion匀浆机(法国Bertin technologies公司)；

XS105电子分析天平(瑞士METTER TOLEDO公司)；

Vortex Genius旋涡混合器(德国IKA公司)；

KQ-250DB型数控超声波清洗器(市售)；

DW-86L388(J)超低温保存箱(中国青岛海尔特种电器有限公司)；

Turbo Vap LV氮气吹干仪(瑞典Biotage公司)

三.实验步骤及结果

1.UPLC-MS/MS法测定眼组织中木蝴蝶苷B：色谱柱采用菲罗门

XB_C18100A(50mm×2.1mm,i.d.,1.7μm,)；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈梯度洗脱方式；流速为0.3mL/min；进样量为7μL；柱温为35℃。质谱采用负离子电喷雾离子源和多重选择反应监测MRM方式。

图7展示UPLC-MS/MS法测定木蝴蝶苷B(A)及内标乙氧苯柳胺(B)对照品的二级质谱图。二者具有完全不同的吸收峰。

2.方法专属性：分别取6个不同来源的空白兔角膜匀浆上清液50μL，加入175μL甲醇沉淀，涡旋1min，4℃14500rpm离心10min；取上清液50μL置于1.5mL的EP管中，加入200μL甲醇，涡旋1min，取上清液置于内衬管中，4℃14500rpm离心5min，项下操作，进行UPLC-MS/MS分析，以角膜样品为例，获得空白生物样品的色谱图(A)；以“标准曲线样品的制备”项下操作，配制的定量下限(LLOQ)样品进行分析的代表性色谱图，获得模拟生物样品的色谱图(B)；取兔眼给予0.5％木蝴蝶苷B溶液后2h的角膜组织样品，得到的代表性色谱图，获得实际生物样品的色谱图(C)。

图8展示UPLC-MS/MS法测定兔眼组织中木蝴蝶苷B的浓度，木蝴蝶苷B的保留时间为1.51min，内标乙氧苯柳胺的时间为1.78min。内源性物质不干扰眼组织和血浆中木蝴蝶苷B和内标的测定。空白角膜样品的色谱图(A)，模拟角膜组织样品色谱图(B)，给药后角膜样品色谱图(C)。

3.药代动力学研究：72只健康新西兰兔，随机分为24组，每组3只(雌雄兼顾)，第S1、S4、S7、S10、S13、S16、S19、S22组兔双眼给予0.2％木蝴蝶苷B溶液，50μl；第S2、S5、S8、S11、S14、S17、S20、S23组兔双眼给予0.5％木蝴蝶苷B溶液50μl；第S3、S6、S9、S12、S15、S21、S24组兔双眼给予1.0％木蝴蝶苷B溶液，50μl，第S1-S3组兔于给药0.5h后取血后空气栓塞处死；第S4-S6组兔于给药1h后取血后空气栓塞处死；第S7-S9组兔于给药2h后取血后空气栓塞处死；第S10-S12组兔于给药4h后取血后空气栓塞处死；第S13-S15组兔于给药6h后取血后空气栓塞处死；第S16-S18组兔于给药8h后取血后空气栓塞处死；第S19-S21组兔于给药12h后取血后空气栓塞处死；第S22-S24组兔于给药24h后取血后空气栓塞处死。空气栓塞处死后采集兔双眼房水、角膜、虹膜-睫状体、巩膜、结膜、晶体。除房水和血浆外，其余组织经蒸馏水清洗三遍后，用滤纸吸干并称重，按1:10(g/mL)的比例进行匀浆，晶体除外(1:3)，匀浆液为蒸馏水，制成组织匀浆液。所有生物样本于-80℃冻存。

图9是低、中、高三种浓度木蝴蝶苷B溶液在单次给药后，木蝴蝶苷B在兔眼组织中随时间的浓度分布。三剂量木蝴蝶苷B溶液(T1、T2、T3)单次点眼后木蝴蝶苷B在眼组织的分布如下：角膜>巩膜>结膜>虹膜-睫状体，房水>晶体角膜组织分布最大，在血浆中未见其分布。

实验4：采用碱烧伤法建立大鼠角膜血管新生和炎症模型，木蝴蝶苷B溶液能够有效抑制角膜炎症和血管新生形成，同时具有增加上皮愈合的作用。

一、材料和试剂

木蝴蝶苷B(含量≥99.5％)(成都格林普生物科技有限公司)；

0.5％丙美卡因滴眼液(美国Alcon公司)；

加替沙星眼用凝胶(沈阳兴齐眼药股份有限公司)；

水合氯醛(上海阿拉丁生化科技制药公司)；

氢氧化钠(沈阳化学试剂厂)

二、实验仪器

裂隙灯显微镜(市售)；

体视显微镜EZ4W(市售)

三、实验步骤及结果

1.大鼠角膜血管新生模型建立：所有大鼠实验前一天经裂隙灯显微镜检查排除眼部疾病，且给予加替沙星眼膏避免感染。采用3.5ml/kg剂量的10％水合氯醛腹腔注射全身麻醉，0.5％丙美卡因滴眼液表麻后，将4μL 1mol/L的NaOH滴入直径为3mm的圆形滤纸片上后，立即放于大鼠左眼角膜中央30s，左眼不予任何处理，随即采用40mL 0.9％NaCl彻底冲洗眼睛1min，术后再次滴入加替沙星眼膏预防感染。整个实验过程剔除角膜穿孔和角膜感染大鼠

2.给药及分组：烧伤后第一天，将75只大鼠随机分成5组，空白组不予任何处理，模型组：空白溶媒组，低剂量组：0.2％木蝴蝶苷溶液，中剂量组：0.5％木蝴蝶苷B溶液，高剂量组：1％木蝴蝶苷B溶液，除空白组外，其他各组动物均是右眼给予10μL空白溶媒或木蝴蝶苷B溶液，共21天，每天点眼4次，每3小时一次

3.角膜透明度及血管新生评价：于碱烧伤后第1d、4d、7d、14d、21d采用裂隙灯显微镜和体视显微镜观察并拍照，角膜水肿及浑浊度是炎症的重要表现，按如下4种分级标准对角膜浑浊程度进行评价。0级，角膜完全透明；1级，角膜混浊极少，但虹膜清晰可见；2级，角膜轻度混浊，但虹膜血管仍然可见；3级，角膜中度混浊，瞳孔边缘无虹膜；4级角膜重度浑浊，瞳孔不可见；血管新生评价是记录从角巩膜缘长入角膜血管新生的长度和数量，每个象限以弯曲度最小朝向角膜中心生长的最长垂直长度为准计算，按照公式S＝C/12*3.14*[r²-(r-l)²]计算血管新生面积，其中C—累计角膜的圆周钟点，r—角膜半径，l—血管新生的长度。

图10和11基于实验例4，其中，大鼠碱烧伤后各组角膜透明度分数图(图10A，)、血管新生面积图(图10B)、裂隙灯显微镜检查角膜图(图11)，碱烧伤第一天，兔角膜烧伤区水肿、浑浊、但虹膜血管仍然可见，各组角膜透明度评分均为2。碱烧伤第四天，模型组出现部分眼内出血，角膜透明度降低，角膜缘处有血管新生芽呈刷状向角膜中央生长，管径粗大，生长迅速，面积为14.5±5.5mm²；低剂量组眼内出现较少量出血，少数动物角膜透明度下降，评分为2.6±1.0，与模型组比有显著水平差异(p<0.05),结膜充血明显，角膜缘处血管新生长度长约1.1±0.2mm，面积为8.3±4.0mm²，血管新生面积与模型组比有显示水平差异(p<0.01)；中、高剂量组炎症反应略有减轻，角膜透明度和血管新生面积与模型组比均有显著水平差异(p<0.01)；碱烧伤第七天，模型组眼内出血面积进一步增大，眼球肿胀明显，炎症反应加剧，角膜呈现水肿重度浑浊，血管新生长度已达烧伤区，生长迅速，长约2.0±0.6mm，面积为26.7±20.8mm²；各给药组角膜透明度和血管新生面积与模型组比均有显著水平差异(p<0.01)。碱烧伤第十四天，模型组角膜重度浑浊，瞳孔不可见，血管新生管径减少，蔓延面积增加，达到角膜中央区长约2.6±1.0mm，面积为23.2±11.8mm²，各给药组角膜透明度和血管新生面积与模型组比均有显著水平差异(p<0.01)；碱烧伤第二十一天，模型组血管新生覆盖全角膜，血管长约2.8±1.3mm，面积为24.2±13.5mm²，高剂量组角膜透明度和血管新生面积与模型组比有显著水平差异(*p≤0.05，**p≤0.01)

实验4展示木蝴蝶苷B溶液能够有效抑制角膜炎症和血管新生形成，因此说明木蝴蝶苷B具有可用于制备预防、控制和/或治疗与血管新生有关的眼部疾病的用途。

实验5：木蝴蝶苷B通过抑制抗炎因子IL-6、IL-1的表达，降低基质金属蛋白酶 MMP2、MMP9的表达、减少细胞间黏附分子ICAM-1以及血管生成因子VEGF的表达，从而抑制血管新生和炎症。

一、材料和试剂

Total RNA Minipre Kit(美国Axygen公司)；

FastKing cDNA第一链合成试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；

荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)；

RT-PCR相关引物(上海生工公司)；

焦碳酸二乙酯(DEPC)(美国Sigma公司)；

异丙醇(沈阳化学试剂厂)；

无水乙醇(沈阳化学试剂厂)；

环保组织固定液(雷根生物)；

透明液(雷根生物)；

苏木素(德国莱卡公司)；

伊红(德国莱卡公司)；

二、实验仪器

Precellys Evolvtion匀浆机(法国Bertin technologies公司)；

Multiskan Sky全波长酶标仪(美国Thermo公司)；

CFX-96荧光定量PCR仪(市售)；

RM2255全自动轮转切片机(德国Lecia公司)；

DM3000正置荧光显微镜(德国Lecia公司)；

HistoCore-Arcadia包埋机(市售)；

HI1210摊片机(德国Lecia公司)；

HI1220烤片机(德国Lecia公司)

三、实验步骤及结果

1.角膜组织取材：分别于碱烧伤(实验4)后第4d、7d、14d、21d每组随机挑选3只大鼠，腹腔注射过量10％水合氯醛处死后，在眼科手术显微镜下，采用DEPC水处理并灭菌眼科显微剪沿角膜膜缘迅速剪下角膜组织，放入经DEPC水处理并灭菌的带盖研磨管中，液氮短时浸泡后于-80℃待测。

角膜组织总RNA提取：采用总RNA提取试剂盒(Total RNA Minipre Kit，Axygen)用于角膜组织总RNA提取。向每支大鼠角膜组织样本加入200μL细胞裂解液Buffer R-Ι，加入1.4mm灭菌钢珠，放入Precellys Evolvtion匀浆机，在4℃条件下6000rpm研磨3min，然后按照试剂盒操作说明书的提取步骤进行总RNA提取(美国Axygen公司)。将提取得到的总RNA采用Multiskan Sky全波长酶标仪进行纯度测定和质量评价，260/280分光光度比值为1.9～2.1为质量合格，存放置-80℃冰箱，可用于后续实验。

反转录实验：采用反转录试剂盒(Fastking cDNA第一链合成试剂盒，天根)，将提取得到的约500ng的质量合格的总RNA先进行gDNA去除反应，反应体系为10μL。在RNasefree的PCR管中配置下列溶液：

彻底混匀后，简短离心，并置于42℃，孵育3min，然后置于冰上放置。配置反转录反应体系配置混合液：

将反转录反应中的混合液，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃孵育15min，95℃孵育3min之后放于冰上分装标记，置于-20℃保存，用于后续研究。

实时定量PCR(RT-q PCR):采用Takara试剂盒(

Premix Ex Taq^TMII Kit)测定mRNA水平，反应在Bio-Rad CFX-96荧光定量PCR仪进行。RT-q PCR的扩增反应体系为12.5μL。

反应条件：预变性温度95℃，30秒；变性温度95℃，5秒；退火温度55℃，30秒；延伸72℃，60秒，采用39个循环的三步法进行反应，绘制溶解曲线。以GAPDH为内参，每个样品重复3次，采用平均CT值数据进行后续分析，2-△△CT法进行结果统计。本研究引物序列表如下

图11展示角膜的炎症因子等基因表达水平。碱烧伤第4天，MMP2和MMP9的mRNA表达量开始增加；第7天，在各组的表达量达到峰值，随后14天和21天逐渐降低，但显著性仍然存在(p<0.01)。与模型组相比，各给药组在连续给药第7天及以后时间点均呈现显著水平降低，除低剂量组在第7天MMP2表达水平外(p>0.05)。说明木蝴蝶苷B降低基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达。碱烧伤后大鼠角膜促炎性细胞因子IL-6和IL-1的mRNA表达水平模型组与空白组相比被显著上调，与模型组相比各组IL-6mRNA表达水平均有显著水平降低；与模型组相比，各组IL-1mRNA表达水平均显著降低，说明木蝴蝶苷B具有降低IL-6、IL-1表达水平的作用。ICAM-1mRNA表达水平与空白组相比，在碱烧伤后第4天出现显著水平增高(p<0.05)，7天、14天继续增高(p<0.01)，其中在第14天表达量达到峰值，21天开始下降(p>0.05)；与模型组相比，各给药组在第7天和第14天ICAM-1mRNA表达水平显著水平降低，第21天只有高剂量组呈现显著水平差异(p<0.05)，说明木蝴蝶苷B降低ICAM-1的表达。VEGFmRNA表达水平模型组与空白组相比，在碱烧伤后第4天开始增高(p>0.05)，7天、14天继续增高(p<0.01)，其中在第14天表达量达到峰值，21天开始下降(p<0.05)；与模型组相比，各给药组均有显著水平降低，除低剂量组第4天和第21天(p>0.05)说明木蝴蝶苷B降低VEGF的表达。(*与空白组相比，#与模型组相比p≤0.05，**与空白组相比，##与模型组相p≤0.01)

2.角膜组织HE染色：分别于碱烧伤后第7d、14d每组随机挑选3只大鼠，腹腔注射过量10％水合氯醛处死后，在眼科手术显微镜下，采用眼科显微剪摘除给药眼整个眼球。将眼球放入4％多聚甲醛溶液中固定24小时后，分取各组角膜组织(沿角巩膜缘后1mm)冲水过夜，依次进行梯度酒精脱水：50％乙醇Ⅰ脱水30min、50％乙醇Ⅱ脱水30min、75％乙醇Ⅰ脱水30min、75％乙醇Ⅱ脱水30min、95％乙醇Ⅰ脱水20min、95％乙醇Ⅱ脱水20min、无水乙醇Ⅰ脱水20min、无水乙醇Ⅱ脱水20min；之后50％乙醇-50％透明液透明20min、透明液Ⅰ透明40min、透明液Ⅱ透明40min；50％蜡-50％透明液透蜡20min、蜡Ⅰ透蜡20min、蜡Ⅱ透蜡20min(60℃)；石蜡包埋之后4μm连续切片，放入65℃烘箱中4-5h。脱蜡：透明液Ⅰ脱蜡5min、透明液Ⅱ脱蜡5min；至水：无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇，75％乙醇分别浸泡3min后，蒸馏水浸泡30s；染色：苏木素染色2min，自来水冲洗20min(避免水直接洒到切片上)，1％盐水酒精分化液10s，自来水冲洗，伊红复染5s，自来水冲洗30s；乙醇脱水：85％、95％、无水乙醇分别浸泡2分钟；透明：二甲苯Ⅰ浸泡5min、透明液Ⅱ浸泡5min；中性树胶封片。

图12展示各组角膜在碱烧伤后14天的HE染色。空白对照组(A)：角膜上皮、角膜基质、后界层和角膜内皮结构完整、细胞形态清晰，间质未见明显病理改变；模型组(B)：角膜上皮变性且变薄，角膜基质结构紊乱，可见炎细胞浸润和较多血管新生，内界层和角膜内皮层增宽，可见较多红染无定形物质；低剂量组(C)：角膜基质内偶见血管新生、少量炎症细胞浸润，角膜上皮、内界层、角膜内皮未见明显病理改变；中剂量组(D)：角膜上皮变薄，其余各层未见明显病理改变；高剂量组(E)：未见明显病理改变。

实验5展示了木蝴蝶苷B可以抑制VEGF、ICAM-1、IL-6、IL-1、MMP2、MMP9的表达，并且说明在碱烧伤后使用木蝴蝶苷B溶液可以抑制血管新生，减少炎症，并且抑制内皮细胞的增殖，再次验证木蝴蝶苷B具有可用于制备预防、控制和/或治疗与血管新生有关的眼部疾病的用途。

应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.木蝴蝶苷B在制备用于预防、控制和/或治疗眼部疾病药物中的用途，其特征在于，

所述眼部疾病是与新生血管有关的眼部眼疾。

2.根据权利要求1所述用途，其特征在于，

所述新生血管有关的眼部疾病是由眼组织血管的病理性增生导致的血管渗漏和/或瘢痕形成所引起的。

3.根据权利要求1所述用途，其特征在于，

所述与新生血管有关的眼部疾病包括以下眼部疾病中的一种或多种：

炎症，优选眼表炎症；

角膜新生血管；

视网膜新生血管；

血管渗漏性增加；

年龄相关性黄斑水肿；

年龄相关性黄斑变性；

糖尿病性黄斑水肿；

糖尿病性视网膜水肿；

新生血管性虹膜症；

新生血管性青光眼；

脉络膜新生血管；和

眼周组织病变。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，

木蝴蝶苷B通过抑制眼组织血管内皮细胞的增殖、迁移和/或成管趋势预防、控制和/或治疗眼部疾病。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，

木蝴蝶苷B通过抑制血管内表皮生长因子VEGF的表达抑制眼组织新生血管的形成和发展。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，

木蝴蝶苷B同时抑制炎症因子、细胞间黏附分子和基质金属蛋白酶的表达。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，

所述炎症因子为白细胞介素1和白细胞介素6。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，

所述基质金属蛋白酶为MMP9、MMP2。

9.根据权利要求6中所述的用途，其特征在于，

所述细胞粘附分子为ICAM-1。

10.根据权利要求1-3所述的用途，其特征在于，

所述预防、控制和/或治疗眼部疾病的药物是外用涂覆施用的剂型，例如滴眼剂、眼部洗剂或眼药膏；或者是适用于向前房、玻璃体、结膜下或球外筋膜囊注射施用的剂型；或者是适用于植入玻璃体内的眼球植入剂施用的剂型。