CN114206903A

CN114206903A - 糖巨肽的制造方法

Info

Publication number: CN114206903A
Application number: CN202080055702.3A
Authority: CN
Inventors: 远藤裕太; 岸野光广; 金子雅哉
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2022-03-18
Also published as: US20220153795A1; AU2020324023A1; CA3149377A1; EP4008190A1; EP4008190A4; WO2021024622A1

Abstract

提供一种能够以工业规模简便地制造苯丙氨酸含量低的高纯度的糖巨肽的方法。详细地说，提供一种糖巨肽的制造方法，其包含：(A)使包含糖巨肽的乳清蛋白混合物与活性碳接触的工序、以及(B)将糖巨肽从活性碳中分离的工序。

Description

糖巨肽的制造方法

技术领域

本发明涉及糖巨肽的制造方法，详细地说，涉及以工业规模简便地制造苯丙氨酸含量低的高纯度的糖巨肽的方法。

背景技术

苯酮尿症是参与苯丙氨酸代谢的苯丙氨酸羟化酶的功能先天缺陷的疾病，苯酮尿症患者需要限制苯丙氨酸的摄取。因此，需要开发苯酮尿症患者易于摄取的蛋白质源。

糖巨肽是分子量为约8000(无糖链修饰的情况)、分子量为25000～30000(包含糖链修饰的情况)的、氨基酸序列中不包含苯丙氨酸残基的蛋白质。糖巨肽存在于作为制造奶酪等乳制品时的副产品的乳清中。糖巨肽由于在氨基酸序列中不含有苯丙氨酸残基，可以作为苯酮尿症患者易于摄取的蛋白质源而利用。乳清在乳制品的制造中大量地作为副产物而产生，因此可以认为可以从乳清中获得的糖巨肽适合工业生产。

但是，工业性地从乳清中得到的糖巨肽包含苯丙氨酸成分(例如，游离苯丙氨酸、以及包含苯丙氨酸残基的肽和蛋白质)作为杂质，难以将苯丙氨酸成分完全除去。因此，需要开发一种能够从乳清中制造将苯丙氨酸成分尽可能除去了的糖巨肽的方法。

作为这样的方法，已经报道了几种使用离子交换树脂(离子交换色谱)的方法，其是基于亲水性相互作用的方法的一种。

非专利文献1中记载了，通过数个循环的基于阳离子交换树脂等的分离，而制造除去了苯丙氨酸成分的糖巨肽的方法。

非专利文献2中记载了，通过基于酸沉淀和阴离子交换树脂等的分离，而制造除去了苯丙氨酸成分的糖巨肽的方法。

非专利文献3中记载了，通过基于阴离子交换树脂等的分离，而制造除去了苯丙氨酸成分的糖巨肽的方法。

但是，在这些方法中，需要使用离子交换树脂，由于使用盐溶液(经常包含高浓度的盐类)进行溶出操作，因此溶出的糖巨肽溶液中会混入盐类。盐类会影响食品的风味，因此盐类的混入是不优选的，但是在混入盐类后进行透析这样的盐类的交换操作是繁杂的，成本面上较为不利，因此需要开发不需要使用了盐溶液的溶出操作的方法。此外，使用离子交换树脂的方法在成本面上较为不利，并且，由于处理能力不一定高，并不适合工业上的大量生产。

此外，作为苯丙氨酸含量低的肽混合物的制造方法，已经报道了：作为基于疏水性相互作用的方法的一种的使用活性碳的方法、和作为基于分子量的分离法的一种的使用凝胶过滤剂(凝胶过滤色谱)的方法。

例如，专利文献1中记载了一种苯丙氨酸含量低的肽混合物的制造方法(实施例1、2)，其包含：用1种或2种蛋白酶(内肽酶和外肽酶)水解乳白蛋白而得到肽混合物的工序、使肽混合物与活性碳接触而使芳香族氨基酸(苯丙氨酸)吸附到活性碳上的工序、以及除去吸附了芳香族氨基酸的活性碳的工序。

此外，专利文献2中记载了通过包含以下一系列的操作(实施例2)而制造苯丙氨酸含量低的肽混合物的方法：1)用多种蛋白酶(内肽酶和外肽酶)水解乳清蛋白浓缩物，将得到的水解肽混合物以凝胶过滤剂(凝胶过滤色谱)进行回收的工序(实施例1、3)；以及2)用多种蛋白酶水解牛奶酪蛋白，使得到的水解肽混合物与活性碳粉末接触，使苯丙氨酸吸附到活性碳上的工序；以及除去吸附了苯丙氨酸的活性碳的工序。

然而，一般而言，糖巨肽等可溶性蛋白质(也称为分泌蛋白)具有分子内部包含疏水性氨基酸残基(例如，苯丙氨酸)、分子表面包含亲水性氨基酸残基的蛋白质折叠结构。这是因为，可溶性蛋白质要在乳清等的水溶液中可溶化，需要在作为与水溶液接触的区域的分子表面上露出亲水性氨基酸残基。因此，即使在可溶性蛋白质包含疏水性氨基酸残基(例如，苯丙氨酸)的情况下，疏水性氨基酸残基也难以在作为与水溶液接触的区域的分子表面上露出，难以与疏水性载体相互作用，因此通常在可溶性蛋白质的分离中不利用基于疏水性相互作用的方法。不如说，基于疏水性相互作用的方法一般都用于类固醇激素等高疏水性低分子化合物的分离，而非可溶性蛋白质的分离。例如，与活性碳同样为碳质的木炭用于制备木炭条血清。在木炭条血清的制备中，为了在尽量使生长因子等可溶性蛋白质残留在血清中的同时，将高疏水性低分子化合物从血清中除去，而使血清与木炭接触，接下来，通过将吸附了血清中的高疏水性低分子化合物的木炭从血清中分离，而能够制备残留有可溶性蛋白质、并且高疏水性低分子化合物被除去了的血清。即，就作为碳质的木炭而言，其在木炭条血清的制备中，是以高疏水性低分子化合物的吸附·分离为主要目的而使用的，而非以可溶性蛋白质的吸附·分离为目的。如上所述，就现状而言，在可溶性蛋白质的分离中通常不利用基于疏水性相互作用的方法。

因此，在所述专利文献1、2中记载的使用活性碳的方法中，通过水解的工序，而人为地使包含疏水性氨基酸残基的肽混合物处于易于吸附到活性碳上的状态。即，可以考虑通过使由于在分子内部包含疏水性氨基酸残基(例如，苯丙氨酸)而难以与活性碳通过疏水性相互作用进行吸附的可溶性蛋白质水解而低分子化，将其变换为无法采取如上所述的蛋白质折叠结构的肽混合物，而使疏水性氨基酸残基在作为与水溶液接触的区域的分子表面上露出。但是，根据专利文献1、2中记载的使用活性碳的方法，则在苯丙氨酸含量低的肽混合物的制造方法中，水解的工序是必须的，会变的繁杂，通过水解使蛋白质等分解也可能对风味等的要素造成影响。此外，就专利文献2中记载的使用凝胶过滤剂的方法而言，存在难以分离分子量类似的物质的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特公平2-54070号公报

专利文献2：日本专利第3682994号公报

非专利文献

非专利文献1：J Food Sci.2009；74(4)：E199-E206

非专利文献2：Nakano and Ozimek，J Food Process Technol 2015，7：1

非专利文献3：Journal of Dairy Research(2018)85 110-113

发明内容

本发明所要解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种能够以工业规模简便地制造苯丙氨酸含量低的高纯度的糖巨肽的方法。

解决技术问题的技术手段

本发明者们经过深入研究的结果，发现：通过在选择包含糖巨肽的乳清蛋白混合物、和糖巨肽的组合作为原料和纯化对象物的组合的基础上，使用活性碳，能够以工业规模简便地制造苯丙氨酸含量极少的高纯度的糖巨肽。

本发明的方法能够使用可以容易且大量获得的便宜的活性碳，对样品进行大量处理，因此与使用离子交换树脂的非专利文献1～3的方法相比，更适合工业性的大量生产。此外，本发明的方法与以在使用离子交换树脂的方法中采用的使用了盐溶液的溶出操作为必要步骤的非专利文献1～3的方法不同，就不需要这样的溶出操作的点而言，具有能够防止盐类混入的优点。并且，根据本发明的方法，与专利文献1、2的方法不同，不需要水解工序，因此更为简便。此外，本发明的方法与专利文献1、2的方法不同，能够制造糖巨肽(非水解蛋白质)而非水解肽，能够回避水解对风味等要素造成的影响。并且，本发明的方法还具有：即使是仅仅1次的基于活性碳的简便处理，也能够使糖巨肽高纯度化等的优点。

就本发明者们所了解到的，以活性碳纯化而制造作为可溶性蛋白质的一种的糖巨肽的方法尚未被报道。此外，这样的方法与关于可溶性蛋白质的分离的上述技术常识相反，因此对于本领域技术人员而言绝非可以容易想到的。即，本发明者们打破技术常识，并且，预料不到地发现：活性碳相对于包含糖巨肽的乳清蛋白混合物(原料)和糖巨肽(纯化对象物)的组合的相性极好，进而完成了本发明。

即，本发明如下：

[1]

一种糖巨肽的制造方法，其包含：

(A)使包含糖巨肽的乳清蛋白混合物与活性碳接触的工序、以及

(B)将糖巨肽从活性碳中分离的工序。

[2]

根据项[1]的方法，其中，乳清蛋白混合物为来源于乳清的粗糖巨肽。

[3]

根据项[1]或[2]的方法，其中，活性碳的细孔容积为0.50mL/g以上。

[4]

根据项[1]～[3]中任一项的方法，其中，活性碳来源于植物类的碳前体。

[5]

根据项[1]～[4]中任一项的方法，其中，活性碳的平均细孔径为2nm以上。

[6]

根据项[1]～[5]中任一项的方法，其中，活性碳的比表面积为1000m²/g以上。

[7]

根据项[1]～[6]中任一项的方法，其中，乳清蛋白混合物含有包含苯丙氨酸残基的蛋白质。

[8]

根据项[1]～[7]中任一项的方法，其中，在工序(B)中，分离苯丙氨酸浓度为1000质量ppm以下(以固体成分计)的糖巨肽。

发明的效果

根据本发明的方法，能够以工业规模简便地制造苯丙氨酸含量低的高纯度的糖巨肽。

附图说明

[图1]图1是通过本发明的一种实施方式所涉及的方法制造糖巨肽时的、苯丙氨酸残留率(纵轴)和活性碳的细孔容积(横轴)的标点图。

[图2]图2是通过本发明的一种实施方式所涉及的方法制造糖巨肽时的、苯丙氨酸残留率(纵轴)和活性碳的平均细孔径(横轴)的标点图。

[图3]图3是通过本发明的一种实施方式所涉及的方法制造糖巨肽时的、苯丙氨酸残留率(纵轴)和活性碳添加量(横轴)的标点图。

[图4]图4是通过本发明的一种实施方式所涉及的方法制造糖巨肽时的、苯丙氨酸残留率(纵轴)和乳清蛋白混合物的pH(横轴)的标点图。

本发明的具体实施方式

本发明的糖巨肽的制造方法包含以下工序：

(A)使包含糖巨肽的乳清蛋白混合物与活性碳接触的工序；以及

(B)将糖巨肽从活性碳中分离的工序。

-工序(A)-

工序(A)中，使包含糖巨肽的乳清蛋白混合物与活性碳接触。由此，在乳清蛋白混合物中作为杂质而包含的苯丙氨酸成分吸附到活性碳上。

就工序(A)中使用的乳清蛋白混合物而言，只要包含糖巨肽就无特别限定。此处的“糖巨肽”(GMP)，如上所述，是分子量为约8000的、如果包含糖链修饰则分子量为25000～30000的、在它的纯物质中，其氨基酸序列中不含苯丙氨酸残基的乳清蛋白。

作为工序(A)中使用的乳清蛋白混合物，例如，可以举出制造奶酪等乳加工品时得到的乳清、其浓缩物或其水稀释物。或者，作为乳清蛋白混合物，也可以使用来源于乳清的粗糖巨肽。本发明中“来源于乳清的粗糖巨肽”是指，从乳清中通过工业分离·纯化而得到的、含有苯丙氨酸成分作为杂质的粗纯化糖巨肽。需要说明的是，商业上有时也将这样的粗纯化糖巨肽称为“纯化糖巨肽”。从乳清中工业分离·纯化糖巨肽而得到粗糖巨肽的方法是公知的，例如，已知有使用离子交换色谱或超滤而从乳清中得到粗糖巨肽的方法(美国专利第5968586号等)。糖巨肽的等电点为3.8左右，比其他主要的乳清蛋白的等电点(通常比4.3大)低。这样的等电点的差别在从乳清中工业分离·纯化糖巨肽而得到粗糖巨肽时经常利用，但是其在将糖巨肽与包含苯丙氨酸残基的蛋白质分离中的运用存在极限。在本发明中，在使用来源于乳清的粗糖巨肽作为乳清蛋白混合物的情况下，可以使用在从乳清中工业分离·纯化糖巨肽的过程中的任意阶段中得到的粗糖巨肽。如果粗糖巨肽中的固体成分量低，也可以使用其浓缩物，如果固体成分量高，也可以使用其水稀释物。

虽然工序(A)中使用的乳清蛋白混合物的固体成分浓度也要考虑与活性碳的接触处理的具体方式(分批式、连续式等)，但优选为10质量％以下，8质量％以下，6质量％以下或5质量％以下。该固体成分浓度的下限无特别限定，但从处理效率的观点出发，优选为0.1质量％以上，0.2质量％以上，0.3质量％以上或0.5质量％以上。

工序(A)中使用的乳清蛋白混合物含有苯丙氨酸成分(例如，游离苯丙氨酸、以及包含苯丙氨酸残基的肽和蛋白质)作为杂质。乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸浓度(以固体成分计)无特别限制，但从得到苯丙氨酸含量低的糖巨肽的观点出发，优选为10000质量ppm以下，8000质量ppm以下，6000质量ppm以下，5000质量ppm以下，4000质量ppm以下或3000质量ppm以下。该苯丙氨酸浓度(以固体成分计)的下限通常可以超过1000质量ppm，可以为1100质量ppm以上，1200质量ppm以上，1300质量ppm以上或1400质量ppm以上。此处，对于乳清蛋白混合物而言的苯丙氨酸浓度(以固体成分计)是指，相对于乳清蛋白混合物中的总固体成分量的、游离苯丙氨酸以及苯丙氨酸残基(换算为游离苯丙氨酸)的合计量的比例[质量ppm]。苯丙氨酸浓度的测定例如可以通过以下方法进行：(1)在高温下对乳清蛋白混合物进行酸处理(例如，6规定(N)盐酸下110℃下22小时)使肽成分水解为游离氨基酸，对游离氨基酸中的游离苯丙氨酸进行定量(例如，高效液相色谱、质量分析计、氨基酸分析机)的方法；或(2)在乳清蛋白混合物中，测定苯丙氨酸残基特有的吸收波长(260nm)处的吸光度，以该吸光度为指标测定苯丙氨酸含量的方法。这些测定可以使用苯丙氨酸标准品进行。详细地说，乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸浓度的测定可以依照后述的[苯丙氨酸浓度的测定]一节中所述的方法进行。

工序(A)中使用的乳清蛋白混合物除了糖巨肽以及苯丙氨酸成分之外，也可以包含乳清中通常含有的成分。在不损害本发明的效果的范围内，乳清蛋白混合物还可以包含pH调整剂、消泡剂等添加剂。

一种实施方式中，工序(A)中使用的乳清蛋白混合物是乳清或其水稀释物。在其他的实施方式中，工序(A)中使用的乳清蛋白混合物是来源于乳清的粗糖巨肽。苯丙氨酸浓度等的乳清蛋白混合物的特性如上所示。

一种实施方式中，乳清蛋白混合物含有包含苯丙氨酸残基的蛋白质(以下也称为“含Phe的蛋白质”)作为杂质苯丙氨酸成分。本发明能够从乳清蛋白混合物中，选择性地且简便地除去以含Phe的蛋白质为首的苯丙氨酸杂质，显著地有助于以工业规模简便地制造苯丙氨酸含量低的高纯度的糖巨肽。

以下对工序(A)中使用的活性碳进行说明。

活性碳的形状无特别限定，例如，可以是粒子状、纤维状(丝状，十字状、毡状)等中的任一种形状，可以根据具体的使用方式而适宜选择。其中，由于每单位体积的苯丙氨酸成分吸附能力高，因此优选粒子状。如果是粒子状的碳材料，则其尺寸无特别限定，根据具体的使用方式适宜地进行粒度调整即可。

活性碳的原料(碳前体)无特别限定，例如可以举出植物类的碳前体(例如，木材、木屑(如锯末和刨花)、木炭、果壳(如椰子壳和核桃壳)、水果种子、纸浆生产副产品、木质素、废糖蜜等来源于植物的材料)、矿物类的碳前体(例如，泥炭、次炭、褐炭、烟煤、无烟煤、焦炭、煤焦油、煤沥青、石油蒸馏残渣、石油沥青等来源于矿物的材料)、合成树脂类的碳前体(例如，酚醛树脂、聚偏二氯乙烯、丙烯酸树脂等来源于合成树脂的材料)、天然纤维类的碳前体(例如，纤维素等天然纤维、人造丝等再生纤维等来源于天然纤维的材料)等。其中，由于较可能为能够选择性吸附乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸成分(特别是含Phe的蛋白质)的活性碳，优选植物类的碳前体。因此在适宜的一种实施方式中，活性碳为来源于植物类的碳前体。从能够实现可进一步高效地吸附除去乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸成分的活性碳的观点出发，优选以木材、木材屑或果实壳为原料，更优选以木材或木材屑为原料。因此在特别适宜的一种实施方式中，使用木材或木材屑作为植物类的碳前体。

就活性碳的细孔容积而言，从能够选择性吸附乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸成分的观点出发，优选为0.40mL/g以上，0.45mL/g以上，0.50mL/g以上，0.55mL/g以上，0.60mL/g以上，0.65mL/g以上或0.70mL/g以上。本发明者们发现，活性碳的细孔容积与苯丙氨酸成分的选择吸附能力密切相关。本发明者们还确认到，特别是，细孔容积为0.6mL/g以上的活性碳(其中，来源于植物类的碳前体的活性碳)在选择性吸附乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸成分的能力这点上特别优异。活性碳的细孔容积的上限无特别限制，从机械强度的观点出发，通常可以为1.7mL/g以下，1.5mL/g以下，1.3mL/g以下等。活性碳的细孔容积(总细孔容积)可以根据氮吸附等温线中的相对压P/P0＝0.99时的氮吸附量，通过Gurvish法而算出。

就活性碳的平均细孔径而言，从能够选择性吸附乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸成分的观点出发，优选为1.9nm以上，2nm以上，2.1nm以上，2.2nm以上，2.3nm以上，2.4nm以上或2.5nm以上。本发明者们发现，活性碳的平均细孔径与苯丙氨酸成分的选择吸附能力密切相关。本发明者们还确认了，特别是，平均细孔径为2nm以上的活性碳(其中，来源于植物类的碳前体的活性碳)在选择性吸附乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸成分的能力这点上特别优异。活性碳的平均细孔径的上限无特别限制，从机械强度的观点出发，通常可以为5nm以下，4.5nm以下，4nm以下，3.5nm以下，3nm以下等。活性碳的平均细孔径可以根据氮吸附等温线算出，详细地说，可以通过4000×[上述的细孔容积(mL/g)/后述的比表面积(m²/g)]的计算式求出。

就活性碳的比表面积而言，从能够选择性吸附乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸成分的观点出发，优选为900m²/g以上，950m²/g以上，1000m²/g以上，1050m²/g以上或1100m²/g以上。活性碳的比表面积的上限无特别限制，通常可以为2000m²/g以下，1800m²/g以下，1600m²/g以下等。活性碳的比表面积可以根据氮吸附等温线通过BET法而算出。

在适宜的一种实施方式中，工序(A)中使用的活性碳满足以下的条件(i)，并且，满足以下的条件(ii)以及条件(iii)中的至少一方。

(i)来源于植物类的碳前体

(ii)细孔容积为0.5mL/g以上

(iii)平均细孔径为2nm以上

在更适宜的一种实施方式中，工序(A)中使用的活性碳满足所述的全部条件(i)、(ii)以及(iii)。需要说明的是，在这些适宜的实施方式中，碳前体的适宜的种类、细孔容积或平均细孔径等适宜的范围如上所示。

工序(A)中使用的活性碳可以通过对上述的碳前体进行活化而制造。需要说明的是，如果在活化前，需要碳化，则通常隔断氧或空气，例如，在400～800℃(优选为500～800℃，进一步优选为550～750℃)下碳化即可。此时，对通过碳前体的碳化而得到的原料碳进行活化，制造碳材料即可。

就活化的方法而言，只要能够对碳前体进行活化就无特别限定，可以是使用了氯化锌、磷酸等活化剂的化学品活化；使用了含有水蒸气、二氧化碳的气体、空气等活化气体的气体活化中的任一种，也可以将它们组合，可以根据碳前体的种类等适宜选择。这些活化的条件在活性碳的制造领域中是公知的。在适宜的方式中，使用植物类的碳前体，对其进行气体活化，得到活性碳。作为活化气体，从适度地包含水蒸气或二氧化碳这一点出发，优选使用烃(例如，甲烷、丙烷、丁烷等轻质气体，轻油、煤油、重油等液体燃料)的燃烧气体，活化气体中的水蒸气浓度优选为10～40容量％。此外，气体活化时的温度可以为700～1000℃(优选为800℃～1000℃，850℃～950℃)，活化的时间可以是能够达成细孔容积、平均细孔径、比表面积等所期望的特性的任意的时间。可以根据碳前体的种类(适宜的种类如上所述)，通过对活化的进行程度进行调整，而得到细孔容积、平均细孔径、比表面积在所述适宜范围内的活性碳。

工序(A)中，活性碳可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。在使用2种以上的活性碳的情况下，优选该混合物作为整体而具有所述的细孔容积、平均细孔径、比表面积等所期望的特性。

在工序(A)中，就乳清蛋白混合物与活性碳的接触处理而言，只要乳清蛋白混合物可以与活性碳接触就无特别限定，可以是分批式的接触处理，也可以是连续式的接触处理。例如，在分批式的接触处理中，将乳清蛋白混合物和活性碳装入吸附塔，使它们相互接触即可。此时，可以是使活性碳以悬浮浮游在乳清蛋白混合物中的状态进行接触的流动床式处理，也可以是以活性碳固定在载体上的状态使乳清蛋白混合物与该活性碳接触的固定床式处理。此外，在连续式的接触处理中，将乳清蛋白混合物通液至充填有活性碳的过滤器中，连续地使乳清蛋白混合物与活性碳接触即可。各种使吸附剂与被处理液体接触的技术都是公知的，本发明的工序(A)可以采用这些公知的接触技术中的任意技术而实施。

工序(A)中，就与活性碳接触时的乳清蛋白混合物的温度而言，从可以使乳清蛋白混合物与活性碳顺利地接触的观点出发，优选为10℃以上，15℃以上或20℃以上。从能够制造苯丙氨酸成分少的高纯度的糖巨肽的观点出发，该温度越高越适宜，优选可以提高至25℃以上，30℃以上，35℃以上，40℃以上或45℃以上。该温度的上限无特别限定，从实用性出发，可以为85℃以下，80℃以下等。从能够收率高地制造苯丙氨酸含量少的高纯度的糖巨肽的观点出发，在适宜的一种实施方式中，工序(A)中，与活性碳接触时的乳清蛋白混合物的温度为20℃～80℃(更优选为25℃～70℃，25℃～60℃或25℃～50℃)。

工序(A)中，与活性碳接触时的乳清蛋白混合物的pH(25℃)可以在3～9的范围(优选为4～8的范围)内。根据本发明的方法，即使不对乳清蛋白混合物的pH进行特别的调整，也能够选择性地除去乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸成分。

工序(A)中，使乳清蛋白混合物与活性碳接触的时间可以根据乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸浓度、活性碳的特性、温度、线速度(连续式的情况)等各种接触条件而适宜决定。在采用的接触条件中，优选预先测定击穿时间，将该击穿时间设为接触时间的上限。此处，“击穿时间”是指，活性碳到达吸附饱和的时间。

就工序(A)中的活性碳的量而言，只要能够达成本发明的目的就无特别限定。从得到苯丙氨酸含量低的糖巨肽的观点出发，在将乳清蛋白混合物中的总固体成分量设为100质量％时，基于干燥重量(干燥质量)，工序(A)中的活性碳的量优选为10质量％以上，15质量％以上，20质量％以上，25质量％以上或30质量％以上。活性碳的量的上限，例如，可以设为500质量％以下，400质量％以下，300质量％以下等，优选为200质量％以下，100质量％以下，80质量％以下或60质量％以下。此外，在以连续式的接触处理实施工序(A)的情况下，通液条件无特别限定，但从在压力损失不变得过大的范围内得到苯丙氨酸含量低的高纯度的糖巨肽的观点出发，优选在200～10000/hr，更优选在500～8000/hr的空间速度(SV)下实施工序(A)即可。

-工序(B)-

在工序(B)中，将糖巨肽从活性碳中分离。通过将吸附到活性碳上的苯丙氨酸成分与活性碳一同分离除去，可以得到苯丙氨酸含量低的糖巨肽。

就从活性碳中分离糖巨肽而言，在工序(A)中采用流动床式处理的情况下，可以通过(1)使接触处理后的悬浮液静置，使活性碳沉淀后，回收上清(含有糖巨肽)；(2)对接触处理后的悬浮液进行过滤、离心分离等分离处理，使活性碳和液相(含有糖巨肽)分离；或将所述(1)和(2)的处理组合进行而实施。此外，在工序(A)中采用固定床式处理的情况下，回收接触处理后的液相(含有糖巨肽)即可。为了使苯丙氨酸含量低的糖巨肽的收率提高，可以进一步包含用水清洗附着在活性碳上的糖巨肽(取得苯丙氨酸含量低的糖巨肽)的处理。以下，也将通过工序(B)而从活性碳中分离的、含有糖巨肽的液相称为“糖巨肽分离相”。

将供至工序(A)中的乳清蛋白混合物中的苯丙氨酸浓度设为C₀，工序(B)中得到的糖巨肽分离相中的苯丙氨酸浓度设为C₁时，C₀和C₁优选满足C₁/C₀≤0.7的关系，更优选满足C₁/C₀≤0.6或C₁/C₀≤0.5的关系。需要说明的是，在实施后述的工序(C)时，将“工序(B)中得到的糖巨肽分离相中的苯丙氨酸浓度”替换为“工序(C)中分离的糖巨肽中的苯丙氨酸浓度”进行适用即可。

工序(B)中得到的糖巨肽分离相中的苯丙氨酸浓度(以固体成分计)优选为1200质量ppm以下，1100质量ppm以下或1000质量ppm以下。通过使用之前所示的适宜的活性碳，能够进一步使该苯丙氨酸浓度(以固体成分计)降低，例如，可以实现低至900质量ppm以下，800质量ppm以下，700质量ppm以下，600质量ppm以下，500质量ppm以下，400质量ppm以下，300质量ppm以下或200质量ppm以下的苯丙氨酸浓度。该苯丙氨酸浓度(以固体成分计)的下限无特别限定，越低越好，通常，可以为10质量ppm以上，50质量ppm以上，100质量ppm以上等。需要说明的是，在实施后述的工序(C)时，将“工序(B)中得到的糖巨肽分离相中的苯丙氨酸浓度(以固体成分计)”替换为“工序(C)中分离的糖巨肽中的苯丙氨酸浓度(以固体成分计)”进行适用即可。

-其它工序-

就本发明的糖巨肽的制造方法而言，只要包含工序(A)以及工序(B)，就可以进一步包含对于从乳清蛋白混合物中制造苯丙氨酸含量低的高纯度糖巨肽而言有益的其他工序。例如，在工序(A)中，作为乳清蛋白混合物，使用乳清、其浓缩物或其水稀释物；在从乳清中工业分离·纯化糖巨肽的过程中的任意的阶段中得到的粗糖巨肽时，该乳清蛋白混合物中除了糖巨肽或苯丙氨酸成分之外，也可能存在其他的乳清蛋白或乳清肽、游离氨基酸等杂质(以下，也简称为“其他杂质”)。因此，在工序(A)中使用的乳清蛋白混合物中含有其他杂质的情况下，可以进一步实施适于将糖巨肽从其他杂质中分离的公知处理。作为所述处理，可以举出用于从乳清中工业分离·纯化糖巨肽的、传统进行的公知处理，例如，离子交换色谱、超滤等分离处理。需要说明的是，就附随所述处理的操作(例如，基于酶的乳清蛋白的水解、pH调整等操作)而言，只要不损害本发明的效果，就可以和该处理一同实施。因此，一种实施方式中，本发明的糖巨肽的制造方法可以进一步包含(C)从工序(B)中得到的糖巨肽分离相中分离糖巨肽的工序。

本发明的糖巨肽的制造方法也可以进一步包含对最终得到的糖巨肽制品中的固体成分浓度进行调整的工序。例如，可以将糖巨肽制品浓缩或用水稀释而制备具有所期望的糖巨肽浓度的样品，也可以从糖巨肽制品中除去水分而制备固体样品(例如，干燥或半干燥粉末)。

实施例

以下，将举出实施例对本发明进行进一步详细的说明，但本发明不受以下实施例的限定。除非有其他明示的记载，下文中的“％”以及“ppm”是指“质量％”以及“质量ppm”。

<评价方法>

实施例中的各物理性质值是通过以下所示的方法测定的。

[苯丙氨酸浓度的测定]

将乳清蛋白混合物约100mg(基于干燥重量)放入耐压玻璃管中，加入6规定(N)盐酸约20mL后，进行密封在110℃下加热22小时。加热结束后，在减压下蒸馏去除盐酸，用0.02规定(N)盐酸将残渣稀释至100mL后，使用高效液相色谱对苯丙氨酸进行了定量。详细地说，以HITACHI制L-8900Amino Acid Analyzer(生物体液分析法模式)，使用富士胶片和光纯药公司制氨基酸混合标准液H型作为标准品进行了定量。

分别对于与活性碳接触前的乳清蛋白混合物、与活性碳接触后的乳清蛋白混合物实施了测定。

[pH的测定]

以HORIBA制LAQUA pH/ION METER F-73，用东亚DKK公司制pH 4.01(25℃)苯二甲酸盐pH标准液和pH 6.86(25℃)中性磷酸盐pH标准液进行构成，对乳清蛋白混合物的pH(25℃)进行了测定。

<活性碳>

实施例中使用的活性碳A～I的规格如表1所示。活性碳A～I是使用表1所述的碳前体，通过表1所述的活化方法，进行活化直至细孔容积、平均细孔径、比表面积为表1的值而制造的。

[表1]

[实施例1]

1-1.糖巨肽的制造

<制造例1>

作为乳清蛋白混合物，准备了将纯化糖巨肽(GMP)粉末(Agropur公司制，GMP97.1％of protein，水分6.9％，苯丙氨酸1454ppm/总固体成分)1.1g溶解在超纯水49mL中所得的水性组合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳A 400mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到澄清的GMP处理液约48g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到苯丙氨酸含量低的GMP粉末约0.91g(苯丙氨酸883ppm/总固体成分)。

<制造例2>

与制造例1同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳B 400mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到澄清的GMP处理液约47g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约0.93g(苯丙氨酸1222ppm/总固体成分)。

<制造例3>

与制造例1同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳C 400mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到澄清的GMP处理液约48g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约0.95g(苯丙氨酸1217ppm/总固体成分)。

<制造例4>

与制造例1同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳D 400mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到澄清的GMP处理液约48g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约0.93g(苯丙氨酸1049ppm/总固体成分)。

<制造例5>

与制造例1同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳E 400mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到澄清的GMP处理液约47g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约0.84g(苯丙氨酸619ppm/总固体成分)。

<制造例6>

与制造例1同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳F 400mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到澄清的GMP处理液约48g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约0.95g(苯丙氨酸1189ppm/总固体成分)。

<制造例7(对照组)>

与制造例1同样地准备了乳清蛋白混合物。接下来，除了不投入活性碳之外，与制造例1同样地，得到了GMP粉末约1.0g(苯丙氨酸1454ppm/总固体成分)。

<制造例8>

作为乳清蛋白混合物，准备了将纯化糖巨肽(GMP)粉末(Agropur公司制，GMP97.1％of protein，水分6.9％，苯丙氨酸1454ppm/总固体成分)1.3g溶解在超纯水59mL中所得的水性组合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳G 480mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到了澄清的GMP处理液约58g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约1.08g(苯丙氨酸581ppm/总固体成分)。

<制造例9>

与制造例8同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳H 480mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到了澄清的GMP处理液约58g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约1.10g(苯丙氨酸1077ppm/总固体成分)。

<制造例10>

与制造例8同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳I 480mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到了澄清的GMP处理液约58g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约1.10g(苯丙氨酸779ppm/总固体成分)。

<制造例11>

与制造例8同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳I 240mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到了澄清的GMP处理液约58g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约1.15g(苯丙氨酸1071ppm/总固体成分)。

<制造例12>

与制造例8同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳I 720mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到了澄清的GMP处理液约58g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约1.08g(苯丙氨酸594ppm/总固体成分)。

<制造例13>

作为乳清蛋白混合物，准备了将纯化糖巨肽(GMP)粉末(Agropur公司制，GMP97.1％of protein，水分6.9％，苯丙氨酸1454ppm/总固体成分)1.8g溶解在超纯水78mL中所得的水性组合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳I 1440mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到澄清的GMP处理液约77g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约1.29g(苯丙氨酸396ppm/总固体成分)。

<制造例14>

与制造例13同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳I 2880mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到澄清的GMP处理液约74g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约1.05g(苯丙氨酸216ppm/总固体成分)。

<制造例15>

与制造例13同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳I 5440mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到澄清的GMP处理液约69g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约0.67g(苯丙氨酸116ppm/总固体成分)。

1-2.活性碳的特性和苯丙氨酸(Phe)残留率的相关性

关于制造例1～10，活性碳的特性和Phe残留率如表2所示。Phe残留率越低，越表示乳清蛋白混合物中的Phe成分被选择性地除去。就Phe残留率(％)而言，是在将活性碳处理前的乳清蛋白混合物中的Phe浓度设为C₀[ppm]，活性碳处理后的乳清蛋白混合物中的Phe浓度设为C₁[ppm]，对照组的乳清蛋白混合物中的Phe浓度设为C₂[ppm]时，通过公式：[(C₁/C₀)/(C₂/C₀)]×100，即公式：[C₁/C₂]×100算出的。

[表2]

^*1活性碳处理后的样品中的Phe浓度

^*2对照组样品中的Phe浓度

确认到了细孔容积的值越大Phe残留率越低的倾向。此外，确认到了平均细孔径越大Phe残留率越低的倾向。图1表示对细孔容积(横轴)和Phe残留率(纵轴)进行了绘制的图，此外，图2表示对平均细孔径(横轴)和Phe残留率(纵轴)进行了绘制的图。图1和图2中一并表示了基于最小二乘法的近似直线和其方程、决定系数R²。特别是就细孔容积而言，决定系数R²超过了0.91，确认到了其与Phe残留率极为密切地相关。

1-3.活性碳量和Phe残留率的相关性

关于使用了活性碳I的制造例10～15，活性碳添加量和Phe残留率如表3所示。需要说明的是，Phe残留率是以与所述1-2同样的方式算出的。

[表3]

^*将乳清蛋白混合物中的总固体成分量设为100质量％时的值(质量％)

^*1活性碳处理后的样品中的Phe浓度

^*2对照组样品中的Phe浓度

确认到了活性碳添加量的值越大样品中的Phe残留率越低的倾向。图3中表示了对活性碳添加量(横轴)和Phe残留率(纵轴)进行了绘制的图。

[实施例2]

2-1.糖巨肽的制造

作为乳清蛋白混合物，准备了将纯化糖巨肽(GMP)粉末(Agropur公司制，GMP97.1％of protein，水分6.9％，苯丙氨酸1454ppm/总固体成分)1.1g溶解在超纯水98mL中后，使用1M的硫酸水溶液对pH(25℃)进行了调整的水性组合物。通过使1M的硫酸水溶液的添加量变化，得到了pH(25℃)为4.2、5.0、6.0以及6.5的4种水性组合物(乳清蛋白混合物)。向各乳清蛋白混合物中，投入活性碳A 400mg(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到了澄清的GMP处理液。将得到的各处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末。其结果，在使用pH(25℃)为4.2的样品的情况下，得到的GMP粉末中的Phe浓度(以固体成分计)为635质量ppm。此外，在使用pH(25℃)为5.0、6.0以及6.5的样品的情况下，得到的GMP粉末中的Phe浓度(以固体成分计)分别为805质量ppm、1027质量ppm以及1044质量ppm。由此，确认到了在所有pH(25℃)中，都得到了Phe浓度降低了的GMP粉末。

此外，除了不投入活性碳之外，以与所述同样的方式得到的对照组GMP粉末中的Phe浓度(以固体成分计)为1454质量ppm。

2-2.乳清蛋白混合物的pH和Phe残留率的相关性

图4中表示对乳清蛋白混合物的pH(横轴)和Phe残留率(纵轴)进行了绘制的图。需要说明的是，Phe残留率是以与所述1-2同样的方式算出的。

GMP的等电点为约3.8，存在pH越接近3.8，疏水度越增加，越易于吸附到活性碳上的倾向。就这一点而言，从随着pH的降低，Phe残留率也降低的现象中，也可以看出通过活性碳而吸附除去的Phe成分是与GMP类似的化合物。

[实施例3]

3-1.通过清洗活性碳确认有无Phe溶出

可以考虑，以活性碳处理样品后，用水清洗附着在活性碳上的糖巨肽(取得Phe含量低的糖巨肽)，来使Phe含量低的糖巨肽的收率提高。就该点而言，如果吸附到活性碳上的含Phe的成分溶出，则对于制造Phe含量低的糖巨肽这一目的的达成而言是不利的。因此，以活性碳处理样品后，用水清洗活性碳，确认得到的样品的Phe残留率，对于水清洗对Phe残留率的影响进行了确认。

<制造例16(无清洗)>

作为乳清蛋白混合物，准备了将纯化糖巨肽(GMP)粉末(Agropur公司制，GMP97.1％of protein，水分6.9％，苯丙氨酸1454ppm/总固体成分)27.3g溶解在超纯水473mL中所得的水性组合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳I10.0g(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤，得到澄清的GMP处理液约469g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约21.60g(苯丙氨酸713ppm/总固体成分)。

<制造例17>

与制造例16同样地准备了乳清蛋白混合物。向所述乳清蛋白混合物中，投入活性碳I 10.0g(基于干燥重量)，在室温25℃下搅拌1小时。然后，将活性碳悬浮液进行过滤器过滤。并且，对于过滤器上形成的活性碳饼，投入了10.5g的超纯水。通过该操作，得到了包含清洗了活性碳饼的超纯水的澄清的GMP处理液约480g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约22.22g(苯丙氨酸704ppm/总固体成分)。

<制造例18>

对于过滤器上形成的活性碳饼，除了投入了30.1g的超纯水之外，以与制造例17同样的方式，得到了包含清洗了活性碳饼的超纯水的澄清的GMP处理液约502g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约22.43g(苯丙氨酸723ppm/总固体成分)。

<制造例19>

对于过滤器上形成的活性碳饼，除了投入了70.5g的超纯水之外，以与制造例17同样的方式，得到了包含清洗了活性碳饼的超纯水的澄清的GMP处理液约539g。将得到的处理液在105℃下加热干燥，得到了苯丙氨酸含量低的GMP粉末约23.25g(苯丙氨酸708ppm/总固体成分)。

3-2.活性碳的清洗水比率和Phe残留率的相关性

关于制造例16～19，活性碳的清洗中使用的超纯水的比率(清洗水比率)和Phe残留率如表4所示。清洗水比率是指，以添加的活性碳的干燥重量(干燥质量)为100质量％时，清洗中使用的超纯水的量(质量％)。

[表4]

^**将添加的活性碳的干燥质量设为100质量％时的值(质量％)

^*1活性碳处理后的样品中的Phe浓度

^*2对照组样品中的Phe浓度

如表4所示，对清洗水比率0～705％的条件下得到的GMP处理液的Phe残留率进行了测定的结果，即使清洗水比率增加，样品中的Phe残留率也没有变化。即，即使在以活性碳处理样品后，以水清洗活性碳，吸附到活性碳上的含Phe的成分也不会溶出。由此，确认了以活性碳处理样品后，通过用水清洗附着在活性碳上的糖巨肽，可以使Phe含量低的糖巨肽的收率提高。

Claims

1.一种糖巨肽的制造方法，其包含：

(B)将糖巨肽从活性碳中分离的工序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

乳清蛋白混合物为来源于乳清的粗糖巨肽。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，

活性碳的细孔容积为0.50mL/g以上。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，

活性碳来源于植物类的碳前体。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，

活性碳的平均细孔径为2nm以上。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，

活性碳的比表面积为1000m²/g以上。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，

乳清蛋白混合物含有包含苯丙氨酸残基的蛋白质。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

在工序(B)中，分离苯丙氨酸浓度以固体成分计为1000质量ppm以下的糖巨肽。