CN114190368B

CN114190368B - 无血清免疫细胞冻存液、配制方法、及免疫细胞冻存方法

Info

Publication number: CN114190368B
Application number: CN202210007695.0A
Authority: CN
Inventors: 周斌; 余茂倩; 黄欣
Original assignee: Shanghai Heyousheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Heyousheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-06
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2042-01-06
Also published as: CN114190368A

Abstract

本发明提供了无血清免疫细胞冻存液，包括：抗冻剂和保存液，所述抗冻剂包括甲基甘油、葡聚糖和聚乙二醇，所述保存液包括葡萄糖氯化钠溶液、人血白蛋白溶液、复方电解质溶液和EDTA‑Na2，所述抗冻剂和保存液中各溶液的体积占比为甲基甘油5％、葡聚糖10％、聚乙二醇5％、葡萄糖氯化钠溶液30％、人血白蛋白溶液20％、复方电解质溶液30％，EDTA‑Na2的终浓度为2mM。本发明采用了无动物源性蛋白的人血白蛋白作为营养物质保护剂，解决了动物源性物质激活免疫细胞产生免疫应答的问题。并弃用传统冻存液常使用的二甲基亚砜(DMSO)，减少冻存液的细胞毒性，提高了细胞活力。

Description

无血清免疫细胞冻存液、配制方法、及免疫细胞冻存方法

技术领域

本发明涉及细胞冻存技术领域，具体为无血清免疫细胞冻存液、配制方法、及免疫细胞冻存方法。

背景技术

细胞冻存是指将细胞放在低温环境，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。将加入冻存液的细胞分装至冻存安瓿瓶，并以一定的降温速率降到-100℃以下，投入液氮冻存，使得细胞处于极低的代谢状态，停止生长，达到长期储存的目的。

最常用的冻存液通常为纯的胎牛血清中添加一定比例的二甲基亚砜(DMSO)或其他无机盐类培养液中添加胎牛血清和一定比例的二甲基亚砜(DMSO)。二甲基亚砜(DMSO)，可以减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，可以在细胞冻存过程中保护细胞。

在冻存液中加入血清，可以为细胞提供营养。同时，血清中富含的蛋白等大分子物质可以对细胞有较好的保护作用。

常用的细胞冻存方法通常通常采用采用程序冻存，传统方法一般是﹣4℃放置30分钟，20℃放置30分钟，﹣80℃过夜，最后进行液氮保存。或者使用程序降温盒，直接放置于-80℃冰箱过夜后液氮保存。

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，是一类较为复杂和脆弱的细胞。由于DMSO在低温下可以保护细胞，在常温条件下却对细胞有害，若DMSO未清洗干净，对复苏后细胞状态影响较大。使用普通含DMSO的冻存液冻存细胞，复苏后细胞活力显著下降，部分细胞表面抗原会随之丢失。胎牛血清属于动物源性蛋白，属于异种免疫原，可能会激活初始状态的免疫细胞产生免疫应答。

细胞在冻存的过程中，不同类型的细胞的最佳冷却速率相差极大，这取决于水分渗透过程是否能跟得上降温速率，取决于细胞表面积于体积之比。免疫细胞中细胞种类多，大小差异较大，传统的程序降温法在冻存免疫细胞时，由于程序未经优化，冻存过程中冷却不恰当对细胞存活率有较大影响。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供无血清免疫细胞冻存液、配制方法、及免疫细胞冻存方法，以解决上述背景技术中的问题。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现无血清免疫细胞冻存液，包括：抗冻剂和保存液，所述抗冻剂包括甲基甘油、葡聚糖和聚乙二醇，所述保存液包括葡萄糖氯化钠溶液、人血白蛋白溶液、复方电解质溶液和EDTA-Na2，所述抗冻剂和保存液中各溶液的体积占比为甲基甘油5％、葡聚糖10％、聚乙二醇5％、葡萄糖氯化钠溶液30％、人血白蛋白溶液20％、复方电解质溶液30％，EDTA-Na2的终浓度为2mM。

优选地，所述人血白蛋白溶液为20％的人血白蛋白溶液。

无血清免疫细胞冻存液配制方法，具体包括以下步骤：

步骤1、按照无血清免疫细胞冻存液的配方的体积占比，取定量的葡萄糖氯化钠溶液、复方电解质溶液装于储液瓶中，称取定量的EDTA-Na2置于储液瓶中，使用涡旋混匀仪充分混匀使EDTA-Na2充分溶解；

步骤2、在储液瓶中加入定量的甲基甘油、葡聚糖、聚乙二醇，充分混匀后使用过滤器过滤除菌；

步骤3、过滤除菌后，在冻存液中加入定量的人血白蛋白溶液，充分混匀后放入4℃条件下保存。

优选地，所述步骤2中的过滤器为0.22um过滤器。

免疫细胞冻存方法，具体包括以下内容：

1)对免疫细胞进行计数，离心后去除细胞上清；

2)将免疫细胞以低于2*10⁷/mL的密度以配置好的冻存液重悬，充分混匀后，加入冻存管中；

3)放入程序降温仪使用程序降温仪冻存。

优选地，所述(3)中的程序降温仪设置为：当温度不低于4℃时，1℃/min；当温度到达4℃时，20℃/min降温；当温度达到-15℃时，2℃/min降温；当温度达到-35℃时，10℃/min降温；当温度达到-80℃时，转入液氮罐保存。

与已公开技术相比，本发明存在以下优点：本发明采用了无动物源性蛋白的人血白蛋白作为营养物质保护剂，解决了动物源性物质激活免疫细胞产生免疫应答的问题。并弃用传统冻存液常使用的二甲基亚砜，减少冻存液的细胞毒性，提高了细胞活力。

本发明采用高分子冻存保护剂葡聚糖降低冻存液中低分子溶质的浓度，减轻盐害，和渗透性抗冻剂丙二醇和甲基甘油，渗透进细胞，改变胞内过冷状态，使胞内胞外压力接近，降低细胞脱水皱缩浓度和速度。综合添加多种不同的冻存细胞保护剂，更大程度上的保护细胞。并通过调整冻存液中其他高渗和低渗保存液的比例和配方，使得细胞处于持续稳定的状态。

本发明在冻存液中额外添加了EDTA-Na2，作为钙离子结合剂，可有效降低免疫细胞复苏后的粘连情况，增加了复苏后细胞的回收率。

本发明专利通过实验优化免疫细胞冻存过程中的冷却速率，调整程序降温过程中的降温速度和时间，减少冷却过程中的冰晶形成，同时降低细胞在高浓度溶液中暴露的时间，减少冻存过程中的胞内冰损伤和溶液损伤，使存活率达到较高水平。

附图说明

图1为实施例中T细胞激活比例示意图；

图2为实施例中T细胞激活数量示意图；

图3为实施例中未冻存PBMC细胞表面marker比例；

图4为实施例中使用本发明冻存方法后PBMC细胞表面marker比例；

图5为实施例中对照组冻存后PBMC细胞表面marker比例。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1、配制无血清免疫细胞冻存液：量取30mL葡萄糖氯化钠溶液和30mL复方电解质溶液装于储液瓶中，称取67.2412mg EDTA-Na2置于储液瓶中，使用涡旋混匀仪充分混匀使EDTA-Na2充分溶解；在储液瓶中加入5mL甲基甘油，10mL葡聚糖，5mL聚乙二醇，充分混匀后使用0.22um过滤器过滤除菌；过滤除菌后，在冻存液中加入20mL20％的人血白蛋白溶液，充分混匀后放入4℃条件下保存。

在显微镜下观察未冻存的免疫细胞，对免疫细胞进行计数，使用细胞计数仪检测细胞数量活性；将免疫细胞均分成两份，其中一份离心后去除细胞上清，以低于2*10⁷/mL的密度以配置好的冻存液重悬，充分混匀后，加入冻存管中。放入程序降温仪使用程序降温仪冻存，并将程序降温仪设置为：当温度不低于4℃时，1℃/min降温；当温度到达4℃时，20℃/min降温；当温度达到-15℃时，2℃/min降温；当温度达到-35℃时，10℃/min降温；当温度达到-80℃时，转入液氮罐保存，作为实验组。另一份使用DMSO冻存液使用传统方法冻存，作为对照组。冻存相同时间后，将实验组和对照组的免疫细胞进行冻存复苏，并对复苏后细胞数量活性进行对比，对比结果如表一所示，其中免疫细胞包括PBMC细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。

表一

由表一的对比结果可知，实验组的冻存后免疫细胞的的活性普遍高于对照组冻存后免疫细胞的的活性。

2、对比使用无血清免疫细胞冻存液和免疫细胞冻存方法冻存的免疫细胞复苏后的T细胞和未冻存的T细胞增殖效率，使用含DMSO冻存液和传统程序降温方法冻存的T细胞作为对照组：

细胞复苏后，使用RPMI-1640完全培养基调整浓度至1*10⁶cells/mL，并使用CFDA-SE染色液染色细胞；加入CD3/CD28抗体和IL-2，在37℃培养箱中培养14天，每隔3天更换培养基并补加细胞因子；第五天使用流式细胞仪检测T细胞激活比例，检测结果如图1所示；每隔三天进行细胞计数，检测T细胞激活数量情况，检测结果如图2所示。

3、将PBMC细胞重悬至1*10⁷cells/mL，使用荧光标记的CD3，CD4，CD8，CD14，CD19，CD56抗体进行染色，染色后洗去抗体使用流式细胞仪进行检测。对比使用本发明专利申请提出的无血清免疫细胞冻存液和免疫细胞冻存方法的免疫细胞复苏后的PBMC细胞和未冻存的PBMC细胞表面标记物的比例，使用含DMSO冻存液和传统程序降温方法冻存的PBMC细胞作为对照组，对比结果如表二、图3、图4和图5所示。

表二

由表二的对比结果可知，无血清免疫细胞冻存液和免疫细胞冻存方法的免疫细胞复苏后的PBMC细胞表面标记物的比例高于对照组PBMC细胞表面标记物的比例。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.无血清免疫细胞冻存液，其特征在于：包括：抗冻剂和保存液，所述抗冻剂包括甲基甘油、葡聚糖和聚乙二醇，所述保存液包括葡萄糖氯化钠溶液、人血白蛋白溶液、复方电解质溶液和EDTA-Na2，所述抗冻剂和保存液中各溶液的体积占比为甲基甘油5％、葡聚糖10％、聚乙二醇5％、葡萄糖氯化钠溶液30％、人血白蛋白溶液20％、复方电解质溶液30％，EDTA-Na2的终浓度为2mM。

2.根据权利要求1所述的无血清免疫细胞冻存液，其特征在于：所述人血白蛋白溶液为20％的人血白蛋白溶液。

3.根据权利要求1所述的无血清免疫细胞冻存液的配制方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的无血清免疫细胞冻存液配制方法，其特征在于：所述步骤2中的过滤器为0.22um过滤器。

5.根据权利要求1所述的无血清免疫细胞冻存液进行免疫细胞冻存的方法，其特征在于，具体包括以下内容：

1)对免疫细胞进行计数，离心后去除细胞上清；

3)放入程序降温仪使用程序降温仪冻存，所述程序降温仪设置为：当温度不低于4℃时，1℃/min；当温度到达4℃时，20℃/min降温；当温度达到-15℃时，2℃/min降温；当温度达到-35℃时，10℃/min降温；当温度达到-80℃时，转入液氮罐保存。