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CN111789101B - 一种基于pva的冻存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用 - Google Patents

一种基于pva的冻存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用 Download PDF

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CN111789101B
CN111789101B CN201910281983.3A CN201910281983A CN111789101B CN 111789101 B CN111789101 B CN 111789101B CN 201910281983 A CN201910281983 A CN 201910281983A CN 111789101 B CN111789101 B CN 111789101B
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Abstract

本发明公开了一种基于PVA的冷冻保存液在卵母细胞或胚胎冷冻保存中的应用，所述冷冻保存液含有PVA，多元醇和水溶性糖。所述冷冻保存液以PVA为主要低温保护剂成分，DMSO含量低，毒性小，用于卵母细胞的冷冻保存时，能达到与商业化冷冻保存液(含有DMSO 15％)同等甚至更高的细胞存活率和功能表达稳定性，具有较高的保存效率。本发明的冷冻保存液组成简单，且原料来源方便，成本低廉。

Description

一种基于PVA的冻存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种基于PVA的冻存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用。
背景技术
冷冻保存(冻存)是指将细胞、组织或器官保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。该技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。近年来，随着生活压力的增加，人类生育力呈逐年下降的趋势，生育力保存越来越受到人们的重视，人类生殖细胞(精子、卵母细胞)、性腺组织等的冷冻保存就成为保存生育力的重要手段。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性细胞、组织或器官的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源以备不时之需成为亟待解决的科学技术问题。
目前最常用的冷冻保存方法为玻璃化冷冻。玻璃化冷冻技术虽然在快速冷冻过程中可使细胞内外的液体直接成为玻璃态而避免了冷冻过程中因冰晶形成而导致的损伤。但是，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。目前玻璃化冷冻方法所使用的高浓度(≥15％)的有机溶剂，导致冷冻保存试剂对细胞的毒副作用，严重影响保存对象(子代)安全性以及功能表达。综上，目前采用的冷冻保存试剂存在不具备复温过程中有效控制冰晶生长的能力，同时存在试剂毒性大的问题。
发明内容
为改善现有技术的上述缺陷，本发明提供一种基于PVA的冻存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用。本发明提供如下技术方案:
一种冷冻保存液，以每100mL体积计，含有PVA 0.01-6.0g，多元醇5.0-45mL，水溶性糖0.1-1.0mol L-1，DMSO 0-15mL，血清0-30mL，和缓冲液余量。
根据本发明，所述PVA选自无规PVA，例如所述PVA的间同规整度为45％-65％、50％-55％。
根据本发明，所述PVA可选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA，例如分子量为10-30kDa、30-50kDa、80-90kDa、200-500kDa。
根据本发明，所述PVA可选自水解度为大于80％的PVA，例如水解度为80％-99％、82-87％、87％-89％、89％-99％、98％-99％。
根据本发明，所述多元醇可以为碳原子数2-5的多元醇，优选碳原子数2-3的二元醇、三元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种。
根据本发明，所述水溶性糖可以为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、海藻糖。所述水溶性糖可以起到保护细胞膜和避免细胞沉降的作用。
根据本发明，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或其替代物SDS，针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白。
根据本发明，所述缓冲液可以为DPBS、hepes-buffered HTF缓冲液中的至少一种。
根据本发明的冷冻保存液，所述PVA含量为0.1-5.5g、0.5-5.0g，例如1.0g、2.0g、3.0g、4.0g。
根据本发明的冷冻保存液，所述多元醇含量为6.0-40mL，例如7.0-20mL，10-15mL。
根据本发明的冷冻保存液，所述DMSO含量为0.1-15mL，例如1.0-10mL，优选1.5-7.5mL；作为本发明的另一实施方案，所述DMSO含量为0。
根据本发明的冷冻保存液，所述血清含量为0.1-30mL，例如5.0-20mL，10-15mL；作为本发明的另一实施方案，所述血清含量为0。
根据本发明的冷冻保存液，所述水溶性糖含量为0.1-1.0mol L-1，例如0.1-0.8molL-1，0.2-0.6mol L-1；具体地，例如0.25mol L-1，0.5mol L-1，1.0mol L-1。
根据本发明的冷冻保存液，其pH为6.5-7.6，例如为6.9-7.2。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：
PVA 0.01-6.0g
多元醇 5.0-45mL
血清 0.1-30mL
水溶性糖 0.1-1.0mol L-1
缓冲液 余量。
优选，所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：PVA 0.01-6.0g
乙二醇 5.0-30mL
血清 10-20mL
蔗糖 0.1-0.6mol L-1
DPBS 余量。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：
PVA 1.0-5.0g
多元醇 5.0-20mL
DMSO 0.1-10mL
血清 0.1-20mL
水溶性糖 0.2-0.8mol L-1
缓冲液 余量。
优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：
PVA 1.0-4.0g
乙二醇 5.0-15mL
DMSO 4-10mL
血清 10-20mL
蔗糖 0.2-0.6mol L-1
DPBS 余量。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
PVA 0.1-6.0g
多元醇 10-45mL
水溶性糖 0.2-1.0mol L-1
缓冲液 余量。
优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
PVA 1.0-5.0g
乙二醇 5.0-20mL
蔗糖 0.2-0.6mol L-1
DPBS 余量。
根据本发明，所述冷冻保存液以每100mL体积计，还可以包括0-9.0g的聚氨基酸(聚合度≥2,如聚合度为6、8、15、20等)，例如包括1.0-6.0g、2.0-5.0g、3.0g、或4.0g聚氨基酸。优选所述聚氨基酸的聚合度为6～25。
根据本发明，所述聚氨基酸可选自赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸等中至少一种或两种以上氨基酸的聚合物。
根据本发明，所述冷冻保存液以每100mL体积计，还可以包括0-50g的氨基酸，例如包括1.0-25g、4.0-20g、或8.0-10g的赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸组氨酸、谷酰胺酸、天冬氨酸、甘氨酸等中的至少一种或两种以上氨基酸的组合。
本发明还提供所述冷冻保存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将PVA溶解于一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，得到溶液1；
(2)任选地，将聚氨基酸或氨基酸溶解于一部分缓冲液，冷却到室温后调节pH形成溶液2；
(3)将水溶性糖溶解于另一部分缓冲液中，待水溶性糖全部溶解后加入其他组分，制得溶液3；
(4)待溶液1、任选地溶液2、和溶液3冷却至室温后混合，再次确认或调节pH并补齐余量缓冲液至预定体积，得到所述冷冻保存液。
根据本发明的制备方法，当所述冷冻保存液含有血清时，所述血清在所述冷冻保存液使用时添加。
根据本发明的制备方法，所述步骤(1)中，PVA在水浴加热中溶解；例如水浴温度为60-95℃，优选80℃。所述步骤(1)中，所述溶解包括搅拌步骤。
根据本发明的制备方法，所述步骤(2)中，所述溶解为超声辅助溶解。
一种冷冻平衡液，以每100mL体积计，含有PVA 0-5.0g，多元醇5.0-45mL，缓冲液余量。
根据本发明的冷冻平衡液，还任选地包括DMSO 0-15mL，血清0-30mL.
根据本发明的冷冻平衡液，所述PVA含量为0.1-5.0g，例如0.1g、0.5g、1.0g、2.0g。
根据本发明的冷冻平衡液，所述多元醇含量为6.0-28mL，例如7.0-20mL，10-15mL。
根据本发明的冷冻平衡液，所述DMSO含量为0.1-15mL，例如1-10mL，1.5-7.5mL；作为本发明的一个实施方案，所述DMSO的含量为0。
根据本发明的冷冻平衡液，所述血清含量为0.1-30mL，例如5.0-20mL，10-15mL；作为本发明的一个实施方案，所述血清的含量为0。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有多元醇5.0-7.5mL，DMSO 5.0-7.5mL，血清10-20mL，缓冲液余量.
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有多元醇7.5-15mL，血清10-20mL，缓冲液余量。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有PVA1.0-5.0g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量。
本发明还提供上述冷冻平衡液的制备方法，包括将各组分溶解于缓冲液中，血清单独存放，在使用时添加。
一种基于PVA的冷冻保存用试剂，包括上述冷冻平衡液和上述冷冻保存液，所述冷冻平衡液和冷冻保存液彼此独立存在。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存用试剂中，所述冷冻保存液的DMSO含量为0，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，PVA 0-5.0g，多元醇7.5-15mL，血清10-20mL，缓冲液余量。当所述冷冻保存液的DMSO和血清含量均为0时，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有PVA 1.0-5.0g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量。
根据本发明的冷冻保存用试剂，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，包括如下组分：
PVA 0-5.0g
多元醇 5.0-30mL
DMSO 0-15mL
血清 0-25mL
缓冲液 余量。
所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分:
PVA 0.01-6.0g
聚氨基酸 0-9.0g
多元醇 5.0-45mL
DMSO 0-15mL
血清 0-30mL
水溶性糖 0.1-1.0mol L-1
缓冲液 余量。
本发明还提供上述冷冻保存液或平衡液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用。
根据本发明的应用，包括将要保存的卵母细胞或胚胎先置于所述冷冻平衡液中平衡2-5分钟；然后置于所述冷冻保存液中平衡1-3分钟，将已在冷冻保存液中平衡后的卵母细胞或胚胎放入液氮中进行冷冻。
本发明还提供上述冷冻保存液在制备卵母细胞或胚胎冻存中使用的冷冻试剂中的用途。
本发明还提供上述冷冻平衡液在制备卵母细胞或胚胎冻存中使用的冷冻试剂中的用途。
有益效果
(1)本发明提供的冷冻保存液以PVA为主要成分，DMSO含量低，毒性小，安全性好。
(2)本发明选用特定结构的无规PVA作为主要控冰材料，用于冷冻保存液时在冰水界面具有更加优异的铺展性能，能有效抑制冰晶生长，减小冰晶对细胞的损害，较少用量的PVA即可实现良好的冷冻保存效果。
(3)本发明的冷冻保存液以特殊的PVA和其他特定比例的渗透性保护剂、非渗透保护剂共同作用，用于卵母细胞和胚胎的冷冻保存时，能达到与商业化冷冻保存液(含有DMSO15％)同等甚至更高的细胞存活率和功能表达稳定性，具有较高的保存效率。
(4)本发明的冷冻保存液组成简单，且原料来源方便，成本低廉。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中采用的PVA为间同规整度为50％-55％，分子量为13-23kDa，水解度98％。
本发明实施例中冷冻保存液中采用聚-L-脯氨酸聚合度为15，分子量为1475。解冻液中聚-L-脯氨酸聚合度为8，分子量为795。
本发明实施例中存活率为3-12次重复实验的存活率平均值。
实施例
1.制备冷冻保存液：按以下配方配制冷冻保存液
冷冻保存液A:
每100mL中含有如下组分：
物质 含量
PVA(g) 2.0
乙二醇(mL) 10
DMSO(mL) 10
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
胎牛血清(mL) 20
DPBS(mL) 余量
将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，待PVA全部溶解并冷却到室温后调节pH为7.0，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇、10mL的DMSO，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积的80％，20mL血清单独存放待保存液使用时添加。
冷冻保存液B：
每100ml中含有如下组分：
物质 含量
L-Arg(g) 8.0
L-Thr(g) 4.0
PVA(g) 2.0
乙二醇(mL) 10
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
胎牛血清(mL) 20
DPBS(mL) 余量
冷冻保存液配液步骤：将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于20mL的DPBS中，调节pH为7.1，为溶液1；将8.0g的L-Arg和4.0g的L-Thr溶于20mL的DPBS中，调节pH为7.1，为溶液2；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于20mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇，为溶液3；待溶液1、溶液2及溶液3恢复至室温，再将三种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积的80％，使用时加入20mL的血清。
冷冻保存液C:
每100ml中含有以下组分：
Figure BDA0002021981840000091
Figure BDA0002021981840000101
将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，调节pH为6.9，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积的80％，20mL血清单独存放待保存液使用时添加。
冷冻保存液D：
每100ml中含有以下组分：
物质 用量
PVA(g) 2.0
乙二醇(mL) 10
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
DPBS(mL) 余量
将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于30mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积100mL，备用。
冷冻保存液E:
每100ml中含有以下组分：
Figure BDA0002021981840000102
Figure BDA0002021981840000111
配液步骤：将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1；将1.5g的聚-L-脯氨酸超声溶于另外20mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液2；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL乙二醇，为溶液3，待溶液1、溶液2及溶液3恢复至室温，再将3种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积100mL，备用。
2.制备冷冻平衡液：按以下配方配制冷冻平衡液
冷冻平衡液a：将7.5mL的乙二醇、7.5mL的DMSO加入65mL的DPBS中，混匀，使用时加入20mL的血清。
冷冻平衡液b：将7.5mL的乙二醇溶于72.5mL的DPBS中，混匀，使用时加20mL的血清。
冷冻平衡液c:将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于50mL的DPBS中，待PVA全部溶解，调节pH为7.0，加入7.5mL乙二醇，混匀，调节pH值并定容补齐余量至100mL，备用。
对比例：
冷冻平衡液a：每1mL中含有7.5％(v/v)的DMSO,7.5％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS；
冷冻保存液1#：每1mL中含有15％(v/v)的DMSO,15％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，0.5M蔗糖，余量为DPBS。
冷冻平衡液2#：每1mL中含有7.5％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS；
冷冻保存液2#：每1mL中含有10％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，0.5M蔗糖，余量为DPBS。
本发明实施例和对比例采用的解冻液配方有如下三种：
解冻液1#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅱ(含有0.5mol L-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅲ(含有0.25mol L-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅳ(20％的血清，余量为DPBS)
解冻液2#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L-1的蔗糖，20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅱ(含有0.5mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅲ(含有0.25mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅳ(20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)。
解冻液3#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L-1的蔗糖，20mg mL-1的PVA，10mg mL-1的聚脯氨酸，余量为DPBS)；解冻液Ⅱ(含有0.5mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，5.0mg mL-1的聚脯氨酸，余量为DPBS)；解冻液Ⅲ(含有0.25mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，2.5mg mL-1的聚脯氨酸，余量为DPBS)；解冻液Ⅳ(20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)。
应用例：
采用上述实施例及对比例的冷冻平衡液以及冷冻保存液按表1和表2中的方案分别进行卵母细胞和胚胎冷冻保存。
1.卵母细胞冷冻保存
小鼠卵母细胞先置于冷冻平衡液中平衡5分钟；然后置于所制备冷冻保存液中1分钟，将已在冷冻保存液中平衡后的卵母细胞放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮中(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存；将冻存的卵母细胞置于37℃的解冻液Ⅰ中平衡5分钟，再依次在解冻液Ⅱ-Ⅳ中各平衡3分钟；将解冻完毕的卵母细胞培养2小时后观察存活细胞数量，计算存活率(参见表1)。
2.胚胎冷冻保存
小鼠胚胎先置于冷冻平衡液平衡5分钟，然后置于所制备冷冻保存液50秒，将已在冷冻保存液中平衡的胚胎放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存；将冻存的胚胎置于37℃的解冻液Ⅰ中平衡3分钟，再依次在解冻液Ⅱ-Ⅳ中各平衡3分钟；将解冻完毕胚胎培养2小时，观察存活胚胎数量，计算存活率(参见表2)。
表1小鼠卵母细胞冷冻保存存活率
编号 平衡液 冷冻保存液 解冻液 冻卵总数 2小时后存活率
应用实例1 a A 解冻液1# 67 100.0％
应用实例2 b B 解冻液1# 109 94.8％
应用实例3 b C 解冻液1# 90 97.7％
应用实例4 c D 解冻液1# 50 93.4％
应用实例5 c D 解冻液2# 53 96.5％
应用实例6 c E 解冻液1# 39 89.7％
应用实例7 c E 解冻液3# 60 98.6％
对比实例1 a 冷冻液1# 解冻液1# 146 95.0％
对比实例2 平衡液2# 冷冻液2# 解冻液1# 96 81.9％
对比实例3 平衡液2# 冷冻液2# 解冻液2# 44 94.7％
表2小鼠胚胎冷冻保存存活率
Figure BDA0002021981840000131
Figure BDA0002021981840000141
以上数据表明该冷冻保存液可以达到90％以上甚至100％的存活率，能达到或远远超过目前临床普遍使用的含有15％DMSO的商业化冷冻保存液的冷冻保存复苏率。应用实例1和对比实例1对比可以看出，PVA的加入显著提高了卵母细胞的存活率；应用实例2-8也表明，本发明添加PVA的冷冻保存液，受解冻液影响因素小，即便采用现有技术通用的商业化解冻液，或者仅加入少量DMSO或不加入DMOSO也能达到较高的卵母细胞或胚胎存活率，解决了目前临床普遍使用的商业化冷冻保存液DMSO浓度高，对细胞损害大的问题。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (27)

1.一种冷冻保存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用，其特征在于，所述冷冻保存液以每100mL体积计，含有PVA 0.01-6.0g，多元醇5.0-45 mL，水溶性糖 0.1-1.0 mol L-1，DMSO0-15 mL，血清 0-30mL，缓冲液余量；
所述PVA为无规PVA，所述PVA的间同规整度为45%-65%；
所述冷冻保存液pH为6.5-7.6;
所述PVA选自分子量为10-500kDa的PVA;
所述PVA选自水解度大于80%的PVA。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DMSO含量为0.5-10mL。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血清含量为10-20mL。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DMSO和/或血清含量为0。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多元醇为C2-5的多元醇。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多元醇为乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水溶性糖为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水溶性糖选自蔗糖、海藻糖。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为DPBS、hepes-buffered HTF缓冲液中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PVA含量为0.1-5.5g。
11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
PVA 0.01-6.0g
多元醇 5.0-45mL
血清 0.1-30mL
水溶性糖 0.1-1.0 mol L-1
缓冲液余量。
12.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
PVA 1.0-5.0g
多元醇 5.0-20mL
DMSO 0.1-10mL
血清 0.1-20mL
水溶性糖 0.2-0.8 mol L-1
缓冲液 余量。
13.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
PVA 0.1-6.0g
多元醇 10-45 mL
水溶性糖 0.2-1.0 mol L-1
缓冲液 余量。
14.根据权利要求1-13任一项所述的应用，其特征在于，所述冷冻保存液以每100mL体积计，还包括0-9.0g的聚合度为2~40的聚氨基酸。
15.根据权利要求1-13任一项所述的应用，其特征在于，所述冷冻保存液以每100mL体积计，还包括0-30g的氨基酸。
16.根据权利要求14所述的应用，所述冷冻保存液由如下步骤制备：
（1）将PVA溶解于一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，得到溶液1；
（2）任选地，将聚氨基酸溶解于一部分缓冲液，冷却到室温后调节pH形成溶液2；
（3）将水溶性糖溶解于剩余一部分缓冲液中，待全部溶解后加入其他组分，制得溶液3；
（4）待溶液1、任选地溶液2、和溶液3冷却至室温后混合，得到所述冷冻保存液。
17.根据权利要求15所述的应用，所述冷冻保存液由如下步骤制备：
（1）将PVA溶解于一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，得到溶液1；
（2）任选地，将氨基酸溶解于一部分缓冲液，冷却到室温后调节pH形成溶液2；
（3）将水溶性糖溶解于剩余一部分缓冲液中，待全部溶解后加入其他组分，制得溶液3；
（4）待溶液1、任选地溶液2、和溶液3冷却至室温后混合，得到所述冷冻保存液。
18.根据权利要求17所述的应用，当所述冷冻保存液含有血清时，所述血清在所述冷冻保存液使用时添加。
19.根据权利要求16所述的应用，当所述冷冻保存液含有血清时，所述血清在所述冷冻保存液使用时添加。
20.一种冷冻平衡液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用，其特征在于，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有PVA 0.1-5.0g，多元醇5.0-45mL，缓冲液余量，DMSO 0-15mL，血清0-30mL；
所述PVA为无规PVA，所述PVA的间同规整度为45%-65%;
所述PVA选自分子量为10-500kDa的PVA;
所述PVA选自水解度大于80%的PVA。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述多元醇为C2-5的多元醇。
22.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述多元醇为C2-C3的二元醇、三元醇。
23.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述多元醇为乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种。
24.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为DPBS、hepes-bufferedHTFD缓冲液中的至少一种。
25.一种冷冻保存方法，其特征在于，将要保存的卵母细胞或胚胎先置于权利要求20-24任一项所述冷冻平衡液中平衡2-5分钟；然后置于权利要求1-19任一项所述冷冻保存液中平衡1-3分钟，将已在冷冻保存液中平衡后的卵母细胞或胚胎放入液氮中进行冷冻。
26.根据权利要求25所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述冷冻保存液中，DMSO含量为0时，所述冷冻平衡液为每100mL体积计，含有PVA 0.5 -2g，多元醇7.5-15mL，血清0-20mL，缓冲液余量。
27.根据权利要求25所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述冷冻保存液中，DMSO和血清含量均为0，所述冷冻平衡液以每100 mL计，含有PVA 0.5-3g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量。
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