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CN114126646A - 基于序列的高通量方法产生骆驼抗体以高分辨率覆盖广泛表位 - Google Patents

基于序列的高通量方法产生骆驼抗体以高分辨率覆盖广泛表位 Download PDF

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CN114126646A CN202080031628.1A CN202080031628A CN114126646A CN 114126646 A CN114126646 A CN 114126646A CN 202080031628 A CN202080031628 A CN 202080031628A CN 114126646 A CN114126646 A CN 114126646A
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Abstract

一种产生多种不同骆驼抗体以高分辨率覆盖靶标功能表位的方法。还提供了一种产生骆驼抗体的方法。更具体地，提供一种产生用于识别抗原，特别是用于治疗应用的骆驼仅重链抗体或其结合部分的方法。

Description

基于序列的高通量方法产生骆驼抗体以高分辨率覆盖广泛 表位
发明背景
针对疾病靶点的功能表位进行治疗是当前抗体技术的一大挑战，因为每个靶点都有成百上千个表位，其中只有非常有限的表位参与生物功能，但目前的技术是采取措施随机零星地生成结合物，因此，表位覆盖不充分、选择冗余和成功率低是现存瓶颈。
单峰驼、双峰驼属于旧世界骆驼科，美洲驼、羊驼属于新世界骆驼科。只有驼科(俗称骆驼科)具有常规抗体和同源二聚体抗体(HcAb)的二分适应性体液免疫系统(dichotomous adaptive humoral immune system)。此外，HcAb已经进化出全面的抗体互补位结构，可作为识别非常广泛的抗原表位的驱动因素之一，而且IgG1抗体补充了HcAb结合结构以获得更多样化的识别。
骆驼科具有独特的体液免疫系统，由两种类型的HcAb、IgG2和IgG3组成，它们铰链区的长度有长有短。系统发育分析证实，HcAb自常规抗体IgG1分叉，是IgG1的最近的适应性变化。据报道，IgG1和IgG3可以中和西尼罗河病毒，而IgG2在受感染或接种过疫苗的动物中似乎效果较差(Daley LP，Clin.Vaccine Immunol.17:239–46,2010)。此外，HcAb和IgG1的表位范围可以重叠，但HcAb可以接触到IgG1无法到达的位点。对各种不同的骆驼IgG亚型的确切作用和功能的了解仍处于起步阶段。然而，HcAb(IgG2和IgG3)的多种抗体互补位结构，例如长形、凸面、凹面、突出和平坦表面，为开发针对具有挑战性靶标的抗体提供了绝佳机会，特别是在诊断以及应用治疗方面。HcAb没有轻链配对的简单结构也使基因克隆和抗体工程变得更加容易。此外，由于免疫单峰骆驼或美洲驼的HcAb库表现出与常规IgG1不同的识别模式(McCoy LE,J.Exp.Med.2012)，并且IgG1对于某些独特的表位或药物靶标热点具有高亲和力以及所需的功能(Cristina Basilico,The Journal of ClinicalInvestigation,Volume 124Number 7July,2014；Basvan der Woninga,MABS,VOL.8,NO.6,1126–1135,2016)，占骆驼类总IgG 25-50％的常规IgG1在扩大抗原结合库方面发挥重要作用。骆驼科动物有两种类型的轻链(Vκ或Vλ)与VH1配对形成常规IgG1，并且最近它们的种系组织也已被揭示(Laura M.Griffin,Journal of Immunological Methods Volume 405,Pages 35-46,March 2014；Alex Klarenbeek,mAbs 7:4,693--706；2015)。
在初级VHH B细胞库中，VHH中大量的体细胞超突变和基因转换明显高于VHs(30％vs 1.5％)，这使得HcAb库更加多样化以补偿轻链的缺乏。同样重要的是，HcAb的VHH结构域扩大了整体抗原结合库，例如通过创建具有凸形抗体互补位表面的扁平(橄榄球状)结构，使其非常适合在抗原表面插入空腔或裂缝(例如活性位点和变构位点)。相比之下，常规IgG的VH-VL结构域包含更多平坦或凹形的抗体互补位表面。B细胞库多样化的以下机制在很大程度上有助于VHH独特的结合特征：(i)与常规抗体骨架区2(FR2)相比，大多数VHH含有亲水性氨基酸取代的FR2(Val37→Phe/Tyr，Gly44→Glu、Leu45→Arg和Trp47→Gly)，其参与轻链结合；(ii)根据Kabat编号，延长的CDR1区域在残基27-30中具有免疫B细胞的广泛体细胞超突变；(iii)大部分VHH中，CDR1-CDR3(骆驼)或FR2-CDR3(羊驼和美洲驼)之间具有额外的二硫键；(iv)VHH的某些部分中，CDR1和CDR3内具有额外的二硫键；(v)由于某些VHH中额外非模板化核苷酸插入，还鉴定到较长CDR3环(Adhdi Arbabi-Ghahroudi,Frontiers inImmunology,Vol 8,2017；Viet Khong Nguyen,The EMBO Journal Vol.19No.5 2000；Mehdi Arbabi-Ghahroudi et al,Front.Immunol.,20November 2017；Nguyen VK,Immunogenetics 54:39–47,2002；Conrath KE,Dev Comp Immunol 27:87–103,2003)。还发现多组非经典VHH(不含FR2亲水性氨基酸)，它们来源于与常规IgG1相同的基因座IGHV3或IGHV4、D和J，这些重链抗体可能识别与IgG1相同或相似的表位，因为这两种类别的抗体共用相同或相似的负责表位识别的CDR3(Conrath KE Dev Comp Immunol 27:87–103,2003；Nick Deschacht,The Journal of Immunology.184(10)5696-5704,2010)。HcAb种系组织和VHH结构如图1A和B所示。
高亲和力、特异性、基因克隆简单、表达产量高、易于纯化、高度可溶和单域折叠稳定等功能和理化优势，为HcAb技术的发展奠定了基础。此外，由常规IgG1扩展的抗原结合库可以获得更广泛的表位覆盖。再者，VHH、VH、Vκ和Vλ与人类对应物的密切同源性为人源化和疗法开发提供了巨大优势。通过利用骆驼独特的抗体构造和NGS技术的优势来捕获整个B细胞抗体库，本发明公开了一种新方法来生成成百上千种不同的抗体，以高分辨率覆盖靶标的广泛表位，从而以系统和理想的方式靶向这些重要的功能性表位。
发明内容
本发明公开了一种生产针对抗原的骆驼抗体的高通量方法，包括：a)从免疫的骆驼富集和增殖对所述抗原特异的B细胞，b)由所述抗原特异性B细胞产生包括VHH2、VHH3和VHH1链序列的抗体下一代测序(NGS)库，c)在NGS库中按谱系对VHH2、VHH3和VH1的序列进行分组，d)通过一个或多个谱系优先因素对包含VHH重链(VHH2、VHH3)的谱系进行排序，e)从在NGS数据库中排名靠前的VHH重链谱系(VHH2、VHH3)中选择代表性序列，f)测试包含所选VHH重链序列的抗体以确定该抗体是否与抗原或其部分结合。在一个实施方案中，所述抗原包括多个表位。
在一个实施方案中，谱系的CDR3组中，特定CDR3的最小CDR3距离≤1，其中特定CDR3的最小CDR3距离是该CDR3相较其他相同长度的CDR3的最小汉明距离。
方案中，谱系优先因素选自：序列丰度从高到低的谱系、体外B细胞富集和增殖后扩增系数从高到低的谱系、免疫过程中谱系序列丰度变化、在消耗某些不需要的B细胞之前和之后的谱系序列丰度变化、在VHH和VH之间共享幼稚B细胞来源的谱系、避免可开发性不佳序列，和它们的组合。
在一些实施方案中，VHH2和/或VHH3谱系选自e)中的前100个谱系。
在一些实施方案中，该方法进一步包括重复e)-f)步骤以获得骆驼抗体，其中代表性序列选自前101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、601-700、701-800、801-900、901-1000、1001-1100、1101-1200、1201-1300、1301-1400、1401-1500、1501-1600、1601-1700、1701-1800、1801-1900或1901-2000个排序谱系。在一些实施方案中，该方法进一步包括重复e)-f)步骤以获得骆驼抗体，其中代表性序列选自前2,000至10,000个排序谱系。
在一些实施方案中，测试抗体由原核或真核细胞表达。
在一个优选的实施方案中，该方法进一步包括监测lgG2、3(HcAb)和lgG1(常规lgG)的免疫反应。
在一些实施方案中，可以通过重复该方法的e)-f)步骤选择所选IgG2或IgG3仅重链抗体的相同谱系组内的序列以优化抗体。
在一些实施方案中，抗原或免疫原可以是细胞、组织或生物流体。
在一些实施方案中，抗原可以是复合免疫原，该方法还包括：使用在步骤(f)中确定的抗体与复合免疫原结合，通过蛋白质阵列、细胞/组织抗原cDNA库或基于质谱的免疫沉淀来识别复合免疫原中所包含的个体抗原。
在本发明的一个方面，该方法进一步包括根据某些VHH特征细分为谱系亚组，所述VHH特征选自：i)FR2亲水区；ii)延长的CDR1；iii)CDR1-CDR3或FR2-CDR3之间的额外二硫键；iv)CDR3内的额外二硫键；v)长CDR3(>15aa)；vi)CDR1内的额外二硫键；vii)具有与常规IgG1相同的V和J种系的非经典VHH；viii)具有某些预定序列特征的非经典VHH；ix)某些预定的经典结合环结构(canonical binding loop structure)；x)来自相同免疫组的个体动物之间的收敛基序(convergent motif)或序列特征；xi)CDR2长度；xii)CDR3长度；xiii)CDR3长度和特性；xiv)在CDR3区域中存在3个或以上正电荷；xv)氨基酸序列中半胱氨酸的数量；以及xvi)CDR区域中的2-4氨基酸基序。所述基序鉴定自配体/受体复合物的3D结构。
在本发明的另一方面，提供了一种高通量产生针对抗原的骆驼抗体的方法，该方法包括：a)从免疫的骆驼中富集和增殖抗原特异性B细胞；b)由所述抗原特异性B细胞产生包含VHH2、VHH3、VH1和VL1链序列的抗体NGS库；c)按谱系对VHH2、VHH3、VH1和VL1 NGS序列进行分组；d)根据单B细胞分选和异源杂交瘤方法产生的锚定结合物进行VH1/VL1谱系配对；e)按谱系优先因素对步骤c)和步骤d)中的谱系和谱系对进行排序；f)从NGS库中排名靠前的VHH2、VHH3谱系和VH1/VL1谱系对中选择代表性序列或序列对；g)测试包含所选重链/轻链序列对或重链VHH2、VHH3序列的抗体以确定该抗体是否与抗原或其部分结合。在一个实施方案中，抗原包含多个表位。
在一个实施方案中，谱系的CDR3组中，特定CDR3的最小CDR3距离≤1，其中特定CDR3的最小CDR3距离是该CDR3相比其他相同长度的CDR3的最小汉明距离。
在一个实施方案中，步骤e)中谱系对的排序基于所述谱系对的VH1谱系的谱系优先因素。
在一些实施方案中，谱系优先因素选自：序列丰度从高到低的谱系、体外B细胞富集和增殖后扩增系数从高到低的谱系、免疫过程中谱系序列丰度变化、在消耗某些不需要的B细胞之前和之后的谱系序列丰度变化、在VHH和VH之间共享幼稚B细胞来源的谱系、避免可开发性不佳序列，和它们的组合。
在一些实施方案中，IgG1库的锚点(anchors for IgG1 repertoire)是用单B细胞分选和异源杂交瘤方法产生的。
在一些实施方案中，测试抗体由原核或真核细胞表达。
在一些实施方案中，在每前100个谱系或谱系对中选择一个代表性的VHH序列或一个代表性VH1/VL1对。在一些实施方案中，100个谱系/谱系对分别包括95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15或10个VHH谱系和5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95个VH1/VL1谱系对，其中VL1包括Vκ和Vλ。
在一些实施方案中，该方法进一步包括重复e)-f)步骤以获得骆驼抗体，其中代表性序列选自前101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、601-700、701-800、801-900、901-1000、1001-1100、1101-1200、1201-1300、1301-1400、1401-1500、1501-1600、1601-1700、1701-1800、1801-1900或1901-2000个排序谱系。在一些实施方案中，该方法进一步包括重复e)-f)步骤以获得骆驼抗体，其中代表性序列选自前2,000至10,000个排序谱系。
在一些实施方案中，用于谱系排序/选择的标准选自：序列丰度从高到低的谱系、扩增系数从高到低的谱系、免疫过程中谱系序列丰度变化、在消耗某些不需要的B细胞前后谱系序列丰度的变化、在VHH和VH之间共享幼稚B细胞来源的谱系、避免可开发性不佳序列，和它们的组合。
在一些实施方案中，抗原或免疫原可以是细胞或组织，产生的VHH用于通过蛋白质阵列或细胞/组织抗原cDNA库或基于免疫沉淀的质谱法鉴定个体相应抗原。
在本发明的另一方面，用于高通量产生针对特定抗原的多个表位的骆驼抗体的方法进一步包括将具有选自以下特征的VHH谱系细分为亚组：i)FR2亲水区；ii)延长的CDR1；iii)CDR1-CDR3或FR2-CDR3之间的额外二硫键；iv)长CDR3(≥15aa)；v)在VHH2、VHH3和VH1之间共享相同幼稚B细胞来源的序列；vi)基于序列的抗原结合环结构预测；x)来自相同免疫组的个体动物之间的收敛基序或序列特征；xi)CDR2长度；xii)CDR3长度；xiii)CDR3长度和特性；xiv)在CDR3区域中存在3个或以上正电荷；xv)氨基酸序列中半胱氨酸的数量；和xvi)CDR区域具有2-4氨基酸基序。该基序是从配体/受体复合物的3D结构中鉴定出来的。
在一些实施方案中，可以通过在第二轮中重复f)-g)步骤来选择第一轮中测试的抗体的相同谱系组内的序列用于优化抗体。
在一些实施方案中，用于高通量获得针对抗原的骆驼抗体的方法进一步包括应用所选VHH序列来指导针对具有相同幼稚B细胞来源的克隆进行VH1-VL1对选择，其中选择标准包括1)CDR1和CDR2差异；2)FR1、2、3和4的差异。
提供产生人源化VHH抗体的方法，包括a)从免疫的骆驼科动物中富集和增殖抗原特异性B细胞；b)从抗原特异性B细胞生成包含VHH2、VHH3和VH1链序列的抗体NGS库；c)按谱系对VHH2、VHH3和VH1 NGS序列进行分组；d)通过将氨基酸序列与多种相关抗体的氨基酸序列进行比较，鉴定共享相同幼稚B细胞来源的亲本VHH2、VHH3抗体或VH1中的可取代位置，其中相关抗体各自与相同谱系中的亲本抗体结合相同的表位；e)将亲本VHH2或VHH3抗体的一个或多个可替换位置的氨基酸替换为人抗体中相应位置的氨基酸；f)测试在所选序列内包含取代残基的抗体以确定该抗体是否与抗原或其部分结合。
在一个实施方案中，人源化VHH抗体的取代位置在FR区。在一个实施方案中，人源化VHH抗体的取代位置在CDR区。
在一个实施方案中，亲本抗体是骆驼抗体。在一个实施方案中，亲本抗体是人源化骆驼抗体。
在本发明的另一方面，提供分离的骆驼抗体或抗原结合部分，其包含由本发明产生的抗体序列。
在本发明的另一方面，提供药物组合物，其包含本发明的骆驼抗体和药学上可接受的载体。
附图简要说明
实施例示例性实施方案在参考图中显示。本文公开的实施方案和附图是说明性的而不是限制性的。
图1A显示了编码VHH、VH和CH免疫球蛋白的骆驼基因座的组织结构。图1B显示了骆驼VHH结构。
图2显示了骆驼科动物免疫和抗原特异性B细胞的富集/增殖。
图3显示了用于扩增VHH2、VHH3、VH1、Vk和Vλ的IgG同种型特异性引物组。
图4显示了生成VHH2、VHH3、VH1、Vk和VλNGS库和谱系分组。
图5显示了根据序列特征对VHH2和VHH3谱系进一步分组。
图6显示了VH-Vk或VH-Vλ谱系与用单B细胞分选和异源杂交瘤开发的锚点配对。
图7显示了从每个谱系中选择用于结合剂和生物活性筛选的序列。
图8显示了在相同谱系内对所选引导(the selected lead)的优化。来自第一轮筛选得到的引导标有@和+。
图9显示了通过谱系分析对VHH和VH-VL进行人源化的工作流程。
图10显示了来自与EGFR结合的所选抗体的荧光信号。
图11显示了从抗KLH抗体分泌B细胞和羊驼饲养细胞的所选共培养物中分泌的抗体的ELISA分析。没有饲养细胞的仅B细胞不会生长或扩增。它被用作阴性对照。免疫动物血清用对照培养基按1:1000稀释，作为ELISA的阳性对照。
图12显示了从饲养细胞和分泌抗体的B细胞的共培养物获得的B细胞的扩增对比没有饲养细胞的仅B细胞的扩增。
图13显示了来自KLH NGS数据所选克隆的上清液的ELISA测定结果。
图14显示了基于从配体/受体复合物的3-d结构鉴定的CDR区2-4氨基酸基序鉴定封闭抗体的工作流程。
图15显示了在PD-1和PD-L1之间形成的复合物的两个视图，突出显示了复合物界面处的PD-1的两种肽。
图16显示了PD-1:PD-L1复合物中界面肽相互作用的分析。
图17是系谱树，展示所选抗PD-1VHH抗体的谱系分组。系谱树的根用作定义谱系组的锚点，该谱系组包括亚组1、2和3。
图18是维恩图，展示来自免疫羊驼A1和A2的克隆库中CDR3结构域氨基酸序列的重叠。
图19A显示了一种选择方案，用于鉴定来自羊驼A1和A2具有共同CDR3结构域和铰链区序列的重叠克隆。图19B的维恩图显示来自免疫羊驼A1和A2的克隆库中铰链区氨基酸序列的重叠。
图20A显示了一种选择方案，用于鉴定来自羊驼A1和A2具有共同CDR3结构域和铰链区序列的重叠克隆。图20B的维恩图显示来自免疫羊驼A1和A2的克隆库中铰链区氨基酸序列的重叠。
图21A展示了来自单羊驼的文库中具有共同CDR3结构域序列的VH、VHH2和VHH3抗体的重叠克隆的维恩图。图21B显示了共同的CDR3序列。
图22是显示羊驼A1和A2、VH、VHH2和VHH3抗体之间共同的CDR3结构域序列数的维恩图。
图23显示了由FACS测得的抗原结合亲和力，利用RPMI8226细胞表达非经典VHH类型和经典VHH类型的所选抗体克隆的BCMA。
图24显示了结合三种不同抗原的三个抗体库的各自的独特FR2结构域序列的比例。
图25显示了结合三种不同抗原的三个抗体库的各自的抗体FR2结构域中某些氨基酸取代的频率。
图26显示了结合三种不同抗原的三个抗体库的各自的具有11至15个氨基酸的CDR1结构域长度的克隆比例。
图27显示了通过ELISA测定，靶向三种不同抗原的三个库的抗体中具有“长CDR2”结构域的抗体的结合亲和力分布。
图28显示了来自靶向三种不同抗原的三个库的抗体中在CDR3结构域内具有额外二硫键的克隆比例。
图29和图30显示了来自三种靶向三种不同抗原的抗体中在CDR1和CDR2结构域之间具有额外二硫键的克隆比例。
图31显示了来自靶向三种不同抗原的三个库的抗体中V区氨基酸序列中的半胱氨酸残基数目的分析。
图32显示了来自靶向三种不同抗原的三个库的抗体中在CDR1和CDR3结构域之间具有额外二硫键的克隆比例。
图33显示了来自靶向三种不同抗原的三个库的抗体中在FR2和CDR2结构域之间或在FR2和CDR3结构域之间具有额外二硫键的克隆比例
图34显示了VHH抗体序列中半胱氨酸氨基酸数目与上清液OD值之间的相关性。
图35显示了结合三种不同抗原的三个抗体库各自的具有“长CDR3”结构域的克隆比例。
图36、图37和图38显示了CDR3结构域的长度与通过FACS或ELISA测定的VHH抗BCMA抗体的抗体亲和力之间的相关性。
图39显示VHH抗体群的CDR3长度范围，所述VHH抗体群结合几乎相同表位或特定抗原的相同表位。
图40显示了评估所选抗PD1克隆与KEYTRUDA和OPDIVO竞争结合PD1的实验结果。
图41显示了结合三种不同抗原的三个抗体库各自的在VHH抗体中Trp118被Arg取代的克隆比例。
图42显示了CDR3的长度与抗KLH VHH抗体的ELISA结合活性之间的正相关性。
具体实施方式
下面的实施方案及其它方面结合系统、组合物和方法来描述和说明，这些系统、组合物和方法意在示例和说明，而不是限制范围。
术语
本文中，术语“包括”或“包含”用于指对实施方案有用的组合物、方法及其各自的组分，并开放式包含未指定要素(无论是否有用)。一般而言，本领域技术人员理解，本文使用的术语通常意为“开放”术语(例如，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”等)。
除非另有说明，否则在描述本申请的特定实施方案中(尤其是在权利要求中)使用的术语“一”和“一个”和“所述”以及类似标记可以被解释为涵盖单数和复数。此处对值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非在本文中另有说明，否则每个单独的值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独引用一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。关于本文中的某些实施方案提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本申请并且不对另外要求保护的本申请的范围构成限制。缩写，“例如”(“e.g.”)源自拉丁语exempli gratia，在此用于表示非限制性示例。因此，缩写“例如”(“e.g.”)与“例如”(“for example.”)一词同义。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对应用实践至关重要的任何未要求保护的元素。
术语“多个”是指超过1个，例如超过2个，超过约5个，超过约10，超过约20，超过约50，超过约100，超过约200，超过约500，超过约1000，超过约2000，超过约5000，超过约10,000，超过约20,000，超过约50,000，超过约100,000，通常不超过约200,000。“群”表示包含多个项目。
如本文所用，术语“约”是指诸如数量、持续时间等的可测量值，包括与指定值的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或±0.1％的变化。
如本文所用，术语“表位”可包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的分子表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。当平衡解离常数≤1μM，优选≤100nM，最优选≤10nM时，抗体被称为特异性结合抗原。
术语“KD”可以指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
如本文所用，术语“免疫反应”可以指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用导致对入侵病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫或病理性炎症的情况下正常生物细胞或组织的生物体的选择性杀伤、破坏或消除。
如本文所用，“抗原特异性T细胞反应”可指由T细胞特异性抗原刺激T细胞引起T细胞的反应。T细胞对抗原特异性刺激的反应的非限制性实例包括增殖和细胞因子的产生(例如IL-2的产生)。
如本文所用，术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或单克隆或多克隆抗原结合片段，其具有Fc(可结晶片段)区或Fc区的FcRn结合片段，本文称为“Fc片段”或“Fc区”。抗原结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解产生。抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单区抗体、嵌合抗体、双抗体以及含有免疫球蛋白的至少一部分的多肽，所述部分足以赋予多肽特异性抗原结合能力。Fc区包括构成两类或三类抗体的两条重链的部分。Fc区可以通过重组DNA技术或酶促(例如木瓜蛋白酶裂解)或完整抗体的化学切割产生。
如本文所用，术语“抗体片段”是指仅包含完整抗体的一部分的蛋白质片段，通常包括完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。本定义涵盖的抗体片段的例子包括：(i)Fab片段，具有VL、CL、VH和CH1区；(ii)Fab'片段，其是在CH1区的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1区的Fd片段；(iv)在CH1区的C端具有VH和CH1区和一个或多个半胱氨酸残基的Fd'片段；(v)具有抗体单臂VL和VH区的Fv片段；(vi)由VH区组成的dAb片段(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段，其是包括由铰链区二硫键连接的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)(Bird et al.,Science 242:423-426(1988)；and Hustonet al.,PNAS(USA)85:5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，包含连接到同一多肽链中的轻链可变区(VL)的重链可变区(VH)(参见例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；(xi)包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata et al.Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)；和U.S.Pat.No.5,641,870)。
如本文所用，“单链可变片段”、“单链抗体可变片段”或“scFv”抗体是指包含由接头肽连接的仅重链(VH)和轻链(VL)的可变区的抗体形式。scFv能够表达为单链多肽。scFv保留了其来源的完整抗体的特异性。轻链和重链可以是任何顺序，例如，VH-接头-VL或VL-接头-VH，只要保持scFv对靶抗原的特异性即可。
如本文所用，“分离抗体”可指基本上不含有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合TRAIL蛋白的分离抗体可基本上不含特异性结合除TRAIL蛋白质之外抗原的抗体)。然而，特异性结合人TRAIL蛋白的分离抗体可能与其他抗原(例如来自其他物种的TRAIL蛋白)具有交叉反应性。此外，分离抗体基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”可以指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对特定表位表现出单一的结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“重组人抗体”可指通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有的人抗体，例如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)分离的抗体或由其制备的杂交瘤(如下所述)，(b)从经转化以表达人抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组、组合人抗体库中分离的抗体，以及(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中框架和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体可以进行体外诱变(或者当使用人Ig序列转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，从而使重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列(虽然源自人种系VH和VL序列并与之相关)不是天然体内存在于人抗体种系库中的序列。
术语“同种型”可以指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。抗体可以是免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或源自它们。
术语“VHH2”、“VHH3”和“VH1”分别代表三个骆驼科动物IgG同种型IgG2、IgG3和IgG1的重链。VL1代表骆驼IgG1的轻链。骆驼VL1包括但不限于Vκ和Vλ。
术语“相应定位的氨基酸”和“相应氨基酸”在本文中可互换使用，指当两个或多个氨基酸序列比对时位于相同位置(即，彼此正对)的氨基酸残基。用于比对和编号抗体序列的方法在Chothia(同上),Kabat(同上)等中详细阐述。如本领域已知的(参见，如Kabat1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,DHHS,Washington,DC)，为了完成比对，抗体氨基酸之一或二者有时需要多达一个、两个、三个或四个残基，或最多约15个残基(特别是在轻链和重链CDR3中)的一个、两个或三个缺口和/或插入。
术语“天然”抗体是指其中抗体的重链和轻链已由多细胞生物的免疫系统制成并配对的抗体。脾脏、淋巴结、骨髓、血液和其他淋巴组织中包含产生天然抗体的细胞。例如，从免疫有抗原的第一动物中分离的B细胞产生的抗体是天然抗体。天然抗体包含天然配对的重链和轻链。
术语“天然配对”是指由多细胞生物的免疫系统配对的重链和轻链序列。
如本文所用，术语“混合物”是指分散且没有任何特定顺序的要素(例如细胞)的组合。混合物是均质的，不会在空间上分成不同的成分。要素混合物的例子包括许多不同的细胞，这些细胞以空间上未修饰(undressed)的方式存在于同一水溶液中。
术语“评估”包括任何形式的测量，并且包括确定要素是否存在。术语“确定”、“测量”、“评估”、“评定”和“测定”可互换使用，可能包括定量和/或定性测定。评估可以是相对的或绝对的。“评估存在”包括确定某物的存在量，和/或确定它是否存在。
术语“富集的”指组合物的组分(例如具体类型的细胞)相对于样品中的其他成分(例如，其他细胞)比富集之前更浓缩(例如，至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍，至少1,000倍)。在某些情况下，富集的物质可能占其所在样品中的很大一部分(比如，大于2％、大于5％、大于10％、大于20％、大于50％或更多，通常高达约90％-100％)。
术语“富集”是指可以从较大的B细胞群中获得抗原特异性细胞的任何方式。如下文更详细所述，可以通过淘选、使用磁珠或细胞分选来进行富集。
在获得要素(如细胞或序列)的上下文中，术语“获得”旨在包括接收要素以及物理产生要素。
术语“外周血单核细胞”或“PBMC”是指具有单个近似圆形的核(与叶状核相反)的血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)、单核细胞和巨噬细胞。可以通过Ficoll梯度从全血中富集外周血单核细胞。
术语“抗原特异性B细胞”是指在表面具有与抗原特异性结合的抗体的记忆B细胞及其祖细胞。
如果细胞或其后代是从宿主获得的，则该细胞“源自”宿主。祖细胞的后代源自祖细胞。
术语“包含抗原的支持物”包括任何类型的支持物(例如，固体或半固体支持物，包括平板和磁珠)，其包含固定在其上的抗原或其部分。抗原可以直接或间接固定在支持物上，比如通过连接物、生物素-链霉亲和素相互作用或细胞。通过淘选或使用磁珠富集抗原特异性B细胞的方法利用了这种支持物。
术语“淘选”用于指将B细胞施加到具有涂有抗原或其部分的一个或多个表面的容器(例如，板)的方法。未结合的细胞可以通过在细胞施加到表面后清洗表面来去除。
术语“基于珠子的富集”用于指将B细胞与连接了抗原或其部分的珠子(例如磁珠)混合的方法。
术语“细胞分选”用于指将B细胞与溶液中的可检测抗原(例如，荧光可检测抗原)混合的方法。在细胞分选方法中，与抗原结合的细胞从未结合的细胞中分选出来。荧光激活细胞分选(FACS)是细胞分选方法的一个例子。
术语“复合免疫原”旨在指包含多种抗原的免疫原。复合免疫原可以由多种不同的抗原组成，这些抗原分别制备然后混合在一起，或者它们可以在免疫中自然复合(例如，当使用整个细胞和组织或其部分时)。
术语“活化”是指刺激B细胞a)增殖和b)分化为浆母细胞和/或浆细胞和c)分泌抗体。B细胞的活化可以通过将B细胞与抗原、表达CD40L的T细胞和细胞因子接触来完成，其他方法也是已知的(例如，Wykes,Imm.Cell.Biol.2003 81:328-331)。
术语“活化的B细胞”是指包含活化的B细胞的后代的细胞群。如上所述，活化导致B细胞增殖，并且这种细胞的后代在本文中被称为活化的B细胞。
术语“收集”是指将培养基中的细胞与基质分离的行为。例如，可以通过移液或倾析进行收集。
术语“由抗原免疫”及其语法上的相似说法(例如“免疫动物”)指对抗原产生免疫反应的任何动物(人、兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、鸡、骆驼)。例如，动物可以通过接触传染物质、接种疫苗或通过施用抗原和佐剂(例如，通过注射)而暴露于外来抗原。术语“由抗原免疫”还意在包括对“自身”抗原产生免疫反应的动物，即患有自身免疫疾病的动物。
术语“排序”和“丰度排序”是指序列按丰度排列时的顺序，即丰度最高的序列在前，接着是丰度第二的序列，接着是丰度第三的序列等等。在某些情况下，可以通过进行频率分布按其频率对序列进行排序。
术语“对应等级”或“对应排序”是指两个序列在两个等级中具有相同的位置。例如，第一排序的第一、第二和第三位置分别对应第二排序的第一、第二和第三位置。
“谱系等级”一词是指谱系按优先因素排列时的顺序。优先因素包括但不限于谱系序列的丰度、扩增系数、去除某些不需要的B细胞前后谱系序列的动态变化、免疫过程中谱系序列丰度的动态变化、VHH和VH之间具有相同幼稚B细胞来源的谱系，避免可开发性不佳序列，和它们的组合。
术语“汉明距离”是指两个等长序列之间对应符号不同的位置数。
如本文所用，术语“按谱系分组的抗体”、“谱系相关抗体”和“与谱系相关的抗体”及其语法上的等效变体是由具有共同B细胞祖先的细胞产生的抗体。谱系相关的抗体与抗原的相同表位结合，并且它们通常在序列上非常相似，特别是在轻链和重链CDR3中。谱系相关抗体的重链和轻链CDR3可以具有相同的长度和几乎完全相同的序列(即最多相差5个，即0、1、2、3、4或5个残基)。在来自谱系的CDR3组中，特定CDR3的最小CDR3距离是该CDR3相较所有其他相同长度的CDR3的最小汉明距离。在一些实施方案中，最小CDR3距离等于或小于1。在某些情况下，B细胞祖先包含具有重排轻链VIC区和重排重链VDJ区的基因组，并产生尚未经历亲和力成熟的抗体。脾组织中存在的“幼稚”或“原始状态”B细胞是示例的共同B细胞祖先。
相关抗体通过共同的原始抗体而具有相关性，例如在幼稚B细胞祖先中产生的抗体。术语“谱系相关抗体”旨在描述由来自相同B细胞祖先的细胞产生的抗体组。“谱系组”包含通过谱系相互关联的抗体组。
如本文所用，术语“至少CDR3”或“至少CDR3序列”仅指CDR3序列、与CDR3序列连同CDR1和/或CDR2序列、或可变域的至少50个连续氨基酸直至可变域整个长度的包含CDR3的序列。
如本文所用，术语“谱系树”是指由遗传分类学分析产生的图，其描绘了感兴趣个体物种的假设分支序列。谱系树内的分支点称为节点。
如本文所用，术语“构建系统发育树”是指从序列制作系统发育树的计算行为。
如本文所用，术语“谱系”是指理论血统。“谱系”与“组”可互换使用，有时与谱系相关的抗体组被称为“谱系组”。术语“组”或“谱系”是排他的，因为一个序列只能属于一个组或谱系。
如本文所用，术语“细分亚组”是指基于独特特征或特点对谱系中的序列进行的进一步分组。“亚组”不是排他性的，这意味着一个序列可以在不同的亚组中。例如，一个序列可以同时具有两个、三个、四个、五个或六个独特特征。“细分亚组”仅适用于VHH。应用VHH序列特征可以助于更好地选择/缩小测试谱系(代表性序列)，这可能会获得更好的生物功能/生物活性结果。
如本文所用，术语“谱系分析”是指对抗体的理论血统谱系的分析，其通常通过分析谱系树来完成。
如本文所用，术语“序列读数”是指由测序仪确定的核苷酸序列，例如通过与该技术相关的碱基检出软件进行确定。
如本文所用，术语“获得氨基酸序列”是指获得包含氨基酸序列的文件。众所周知，可以在计算机上将核酸序列翻译成氨基酸序列。
如本文所用，术语“表达最丰富”是指样品中最丰富的蛋白质序列。蛋白质的丰度可以通过对编码该蛋白质的序列读数进行计数来确定。由最多序列读取编码的蛋白质是最丰富的蛋白质。
如本文可互换使用的术语“锚点”和“锚结合剂”是指通过单B细胞分选或具有天然H和L配对的异源杂交瘤产生的常规抗体，由此，可以“定位/配对”重链谱系和轻链谱系，这些谱系由序列组组成，所述序列组是在遇到抗原表位后克隆扩增幼稚B细胞H和L序列而得到的序列组。由于本领域已知重链和轻链的氨基酸序列是彼此配对的，因此可以谱系是可以“锚定”的。在这些实施方式中，分支围绕它们的节点旋转，直到在锚定序列之间存在最小数量的交叉(例如，没有交叉)。通过缠结图分析“对齐”树木后，已知配对的叶子可以通过边缘连接。如果已知配对的叶子通过边缘连接，则中间的叶子理论上可以相互配对，只要它们不与一条边缘或另一个边缘发生交叉。
短语“识别抗原表位的单克隆抗体”、“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
术语“特异性结合”是指抗体优先结合存在于不同分子的均质混合物中的特定抗原的能力。在某些实施方案中，特异性结合相互作用能区分样品中所需的和不需要的分子，在一些实施方案中超过约10至100倍，比如超过约1000-或10,000倍。
如本文所用，术语“基本上不结合”蛋白质或细胞可表示它不能结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即以2x10-6M或更大，更优选1x10-5M或更大，更优选1x10-4M或更大，更优选1x10-3M或更大，甚至更优选1x10-2M或更大的KD与蛋白质或细胞结合。
对IgG抗体的“高亲和力”可指对靶抗原具有1x10-6M或更小，优选1x10-7M或更小，更优选1x10-8M或更小，甚至更优选1x10-9M或更小，甚至更优选1x10-10M或更小的KD的抗体。然而，“高亲和力”结合可能因其他抗体同种型而异。
术语“药物制剂”是指一种形式上允许包含在其中的活性成分的生物是有效的，且不包含对施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的附加成分的制剂。
药剂(例如药物制剂或细胞)的“治疗有效量”是指在剂量和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(例如用于治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动力学或药效学效应的量。治疗有效量可根据受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及施用的细胞群等因素而变化。在一些实施方案中，所提供的方法包括以有效量(例如治疗有效量)给予细胞和/或组合物。
“CDR移植抗体”是包含源自特定物种或同种型的一个或多个CDR以及相同或不同物种或同种型的另一种抗体框架的抗体。
与源自非人物种的抗体序列有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加的差异，因此，与非人抗体相比，人源化抗体在给予受试者时诱导免疫反应的可能性较小，和/或诱导的免疫反应较轻。在一个实施方案中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定区中的某些氨基酸经突变以产生人源化抗体。在另一实施方案中，来自人抗体的恒定区与非人物种的可变区融合。在另一实施方案中，人源化抗体是CDR移植抗体，其包含源自特定物种或同种型的一个或多个的CDR和人抗体框架。在另一个实施方案中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基以降低非人抗体施用于人受试者时可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键的，或者对氨基酸序列所做的改变是保守改变，使得人源化抗体与抗原的结合并不比非人抗体与抗原的结合差。如何制造人源化抗体的例子可以参考U.S.Pat.Nos.6054297、5886152和5877293。
术语“嵌合抗体”是指包含来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体。在一个实施方案中，一个或多个CDR源自人抗体。在另一实施方案中，所有CDR都源自人抗体。在另一实施方案中，来自一种以上人抗体的CDR在嵌合抗体中混合和匹配。例如，嵌合抗体可包含来自第一人抗体轻链的CDR1、来自第二人抗体轻链的CDR2和CDR3以及来自第三抗体重链的CDR。也可以是其他组合。
术语“双互补位抗体”是指与抗原的两个非重叠表位结合的抗体。在一些实施方案中，双互补位抗体包括仅含重链的而没有轻链的VHH。在一些实施方案中，双互补位抗体包含仅重链的VHH和常规的VH1/VL1对。在一些实施方案中，双互补位抗体包含两个常规的VH1/VL1对。在一些实施方案中，双互补位抗体具有来自靶向一个表位的单克隆抗体的第一重链和第一轻链，以及靶向另一个表位的其他抗体的重链和轻链。在一些实施例中，所述其他轻链或重链可以不同于第一轻链或重链。
公开本发明的抗体与抗原的结合可以使用本领域中常用的一种或多种技术来评估。例如，在一个优选的实施方案中，可以通过ELISA分析来测试抗体，例如使用重组抗原蛋白。其他合适的结合测定包括但不限于流式细胞术测定，其中抗体与表达人抗原的细胞系(如HEK293细胞)反应。或者或此外，抗体的结合，包括结合动力学(如KD值)等可以在BIAcore结合测定、Octet Red96(Pall)等中测试。
术语“单B细胞分选”是指基于抗原特异性对独立和分离的单个B细胞进行分选。用于单细胞分离、分选的技术包括但不限于：FACS(荧光激活细胞分选，例如使用荧光标记抗原来分离结合抗原的细胞)、ISAAC(芯片免疫斑点阵列分析)、LCM(激光捕获显微切割)、微雕刻和液滴微流体。
本文提供一种产生用于识别抗原，特别是用于治疗应用的骆驼仅重链抗体或其结合部分的方法，该方法包括：
a)富集和扩增来自免疫骆驼科动物的抗原特异性B细胞；b)由抗原特异性B细胞生成包含VHH2、VHH3和VH1和VL1链序列的抗体NGS库；c)基于CDR3将将VHH2、VHH3和VH1序列数据分为系统发育谱系克隆型——例如，将相差0或1个氨基酸并具有相同长度的CDR3氨基酸序列分组在一起；d)按谱系优先因素对包含VHH重链(VHH2、VHH3)的谱系进行排序；e)根据谱系优先因素，从抗体序列库中排名靠前的VHH2、VHH3谱系中选择具有代表性的序列；f)测试包含所选代表性序列的抗体以确定该抗体是否与抗原或其部分结合。在一个实施方案中，抗原包含多个表位。
在一个实施方案中，可以通过重复步骤f)和g)以选择和测试来自多个谱系的序列。在一个实施方案中，f)可以包括1)合成所选代表性序列的DNA，2)构建包含DNA序列的载体，3)在细胞中表达载体，4)对特定抗原进行亲和力和生物活性测试。在一个实施方案中，b)可以包括1)从富集的抗原特异性B细胞中制备cDNA；2)对cDNA进行测序，得到多个VHH2、VHH3、VH1重链序列和多个VL1(Vκ和Vλ)轻链序列，生成骆驼lgG2(HcAb)、IgG3(HcAb)和IgG1(常规Ab)库。在一个实施方案中，产生的骆驼抗体包含IgG2。在一个实施方案中，产生的骆驼抗体包含IgG3。
本发明的另一方面是得到一种用于识别抗原，特别是用于治疗应用的骆驼抗体或其结合部分的方法，该方法包括：a)从免疫的骆驼科动物富集和扩增抗原特异性B细胞；b)由所述抗原特异性B细胞产生包含VHH2、VHH3、VH1和VL1链序列的抗体NGS库；c)基于CDR3将VHH2、VHH3、VH1和VL1序列数据分组为系统发育谱系克隆型；d)根据单B细胞分选和异源杂交瘤方法产生的锚定结合物进行IgG1 VH1/VL1谱系配对；e)按谱系优先因素对步骤c)和步骤d)中的谱系和谱系对进行排序；f)从NGS库中排名靠前的VHH2、VHH3谱系和VH1/VL1谱系对中选择代表性序列；g)测试包含所选VH1/VL1对序列或VHH2、VHH3序列的抗体，以确定该抗体是否与抗原或其部分结合。在一个实施方案中，VL1链包含Vκ和Vλ。在一个实施方案中，抗原包含多个表位。
在一个实施方案中，可以通过重复步骤f)和g)来选择和测试来自多个谱系的序列。在一个实施方案中，g)可以包括1)合成编码所选代表性氨基酸序列的DNA，2)构建包含该DNA序列的载体，3)在细胞中表达该载体，4)对特定抗原进行亲和力和生物活性测试。在一个实施方案中，b)可以包括1)从富集的抗原特异性B细胞中制备cDNA；2)对cDNA进行测序，得到多个VHH2、VHH3、VH1重链序列和多个VL1(Vκ和Vλ)轻链序列，生成骆驼lgG2(HcAb)、IgG3(HcAb)和IgG1(常规Ab)库。在一个实施方案中，产生的骆驼抗体包含IgG2。在一个实施方案中，产生的骆驼抗体包含IgG3。在一个实施方案中，产生的骆驼抗体包含常规的IgG1。在一个实施方案中，步骤e)中谱系对的排序基于所述谱系对的VH1谱系的谱系优先因素。在一个实施方案中，步骤e)中谱系对的排序基于所述谱系对的VL1谱系的谱系优先因素。该方法还包括测试以确定与抗原结合的抗体是否抑制抗原与另一蛋白质的结合。例如抗体结合是否抑制配体与其同源受体特异性结合。
产生靶向抗原的人源化骆驼抗体的方法包括a)从免疫的骆驼中富集和增殖抗原特异性B细胞；b)由所述抗原特异性B细胞的产生包含VHH2、VHH3、VH1和VL1链序列的抗体NGS库；c)按谱系对NGS库中的VHH2、VHH3和VH1的序列进行分组，d)通过将氨基酸序列与多种相关抗体的氨基酸序列进行比较，鉴定共享相同幼稚B细胞来源的亲本VHH抗体或VH1的可取代位置，其中相关抗体各自与相同谱系中的亲本抗体结合相同的表位；e)将亲本VHH抗体或VH1抗体的一个或多个可替换位置的氨基酸替换为人抗体中相应位置的氨基酸；f)测试在所选序列内包含取代残基的抗体以确定该抗体是否与抗原或其部分结合。在一个实施方案中，抗原包含多个表位。在一个实施方案中，可取代位置在CDRs区域中。在一个实施方案中，可取代位置在FRs区域中。
本发明产生的骆驼常规IgG1抗体可以通过将亲本IgG1抗体的一个或多个可取代位置的氨基酸替换为人抗体中相应位置的氨基酸来进行人源化。
图2展示了骆驼科动物免疫和抗原特异性B细胞分离/增殖方法的一个实施方案；这样的实施方案包括：
1)用DNA或含载体蛋白的小分子或含载体蛋白的肽或蛋白或抗原复合物如细胞或组织免疫骆驼科动物；2)分别监测IgG2、IgG3和IgG1的免疫反应；3)从PBMC、脾脏、淋巴结、淋巴组织获得包含B细胞的细胞样品。B细胞是指记忆细胞、浆母细胞和具有细胞膜IgG2(HcAb)、IG3(HcAb)和IgG1(常规IgG)的不同阶段B细胞；4)通过物理表面抗原淘选、磁珠分离或流式分选，用细胞表面抗体富集抗原特异性B细胞；5)在抗原、骆驼CD40-L表达细胞和生长因子存在的情况下激活富集的B细胞用于细胞增殖。激活步骤允许选择性地刺激记忆B细胞分化并成为浆细胞，浆细胞迅速分裂并表达大量抗体。在一些实施方案中，抗血清中IgG2、IgG3和IgG1的免疫应答通过以下方法监测：a)在不同pH洗脱条件下用Protein-A和Protein-G柱纯化IgG2、IgG3和IgG1；b)分析IgG2、IgG 3和IgG1的免疫反应滴度；或c)使用所需的免疫分析测试IgG2、IgG 3和IgG1的生物活性。
该方法的激活步骤仅增殖具有与抗原实际结合的表面束缚抗体的B细胞，所述激活步骤具有三个效果：(1)激活步骤仅导致那些与抗原特异性结合的B细胞增殖，从而增加这些细胞相对于非特异性结合到支持物的细胞的相对浓度，(2)该方法的激活步骤导致HcAb或常规IgG重链和轻链mRNA仅在特异性结合抗原的B细胞中被诱导，(3)这些表达具有高亲和力或特异性的抗体或识别“稀有”表位的“稀有”抗原特异性B细胞被放大从而显著提高信噪比。
在一些实施方案中，用于富集的抗原包括但不限于：
a)免疫原；
b)免疫原的所需结构域/表位；
c)复合免疫原：动物可以用多种抗原或细胞或组织，或生物流体进行免疫，并且针对多种抗原中每一种的抗原特异性B细胞可以彼此或作为一个整体进行富集。抗原特异性B细胞被激活后可以彼此分别富集或作为整体富集。VHH的简单性为高通量VHH克隆和表达提供了优势，并且通过解旋(deconvoluting)复杂的免疫原来鉴定VHH的各相应抗原相对更容易。复合免疫原可以通过多种方法解旋，这些方法包括但不限于蛋白质阵列或基于免疫沉淀的质谱法或细胞、组织抗原-cDNA库筛选法。
有时也可能需要在抗原特异性淘选之前通过淘选来消耗不需要的B细胞，以提高B细胞的纯度。
VHH2、VHH3、VH1、Vκ和VλNGS库可以分别从表达IgG2(HcAb)、IgG3(HcAb)和IgG1(常规Ab)的B细胞中制备。
骆驼的IgG1(常规Ab)、IgG2(HcAb)和IG3(HcAb)，每个都有一个独特的基因组织结构，可以设计特定的引物组来分别扩增它们的cDNA(如图3所示)。cDNA扩增可以通过以下步骤完成：
a)总RNA提取(TRIOL)和纯化(RNeasy试剂盒)；
b)RNA定量和任选的-20℃储存；
c)使用同种型特异性引物组进行mRNA捕获/RT-PCR(VHH2、VHH3、VH1、Vκ和Vλ)；
VHH2、VHH3、VH1、Vκ和Vλ的NGS库可以在Nextera库中通过PCR叠加NGS接头和库索引来制备。
NGS库中的cDNA可以通过库的高通量测序技术进行测序，例如使用IlluminaMiSeq300x2仪器。
序列可以通过生物信息学过程进行构建：-使用NGSQCTookit进行质量评估、组装R1/R2读取、翻译，然后识别CDR 1、2、3。
VHH2、VHH3、VH1、Vκ和Vλ抗体可以使用比如CDR3氨基酸序列的NGS数据进行分组，以构建系统发育谱系克隆型。
谱系由来自相同幼稚B细胞(相同的V和J分配)的序列组定义，谱系可以定义为其CDR3区域的氨基酸序列相差不超过1个氨基酸的组(汉明距离为1或更小，或总氨基酸差异在5aa以内但CDR3序列相同)。据推测，谱系的数量反映了库中幼稚B细胞的量，也反映了这些抗体识别的表位数量。(图4)。
一般而言，谱系大小与抗体成熟和克隆扩增相关。生物信息学方法允许对数据进行结构化和可视化，以合理的方式选择候选抗体。对于每个NGS库，可以通过生物信息学过程构建序列来识别多达10,000个谱系，包括：使用NGSQCTookit的QC、组装R1/R2读数、翻译、鉴定CDR1、2、3，然后基于CDR3相似性进行谱系分组。
VHH(VHH2,VHH3)序列可以通过它们独特的序列特征进一步分组(细分亚组)。
骆驼已经进化出多种机制来进一步增加VHH B细胞库的多样化并扩大抗原结合能力。由这些机制产生的序列“特征”允许进一步对谱系进行分组。这种用于进一步分组谱系的附加标准可以反映抗体的细微不同识别特征，并有助于识别具有独特VHH识别模式的表位。(图5)VHH的特征包括但不限于：
i)FR2亲水区：对于大多数VHH抗体，FR2对常规IgG具有独特的氨基酸取代：37Phe/Tyr、44Glu、45Arg和47Gly；
ii)延长的CDR1：许多VHH在CDR1旁边具有额外高变区(残基27-30，根据Kabat的编号)。VHH使用该区域和长CDR3来增加与抗原相互作用的表面积；
iii)CDR1-CDR3或FR2-CDR3之间的额外二硫键：在骆驼和单峰骆驼中，82％的VHH在CDR1-CDR3之间具有二硫键，在美洲驼和羊驼中，74％的VHH在FR2-CDR3之间具有二硫键；
iv)长CDR3：对于这些具有长CDR3(≥15aa)的VHH，在许多情况下具有额外二硫键；
v)CDR3内的额外二硫键：大约5-10％VHH在CDR3内有一个额外的二硫键，这可能表明具有更多的构象识别模式；
vi)CDR1内的额外二硫键；
vii)具有与常规IgG相同的V和J种系的非经典VHH：与常规IgG1共享相同幼稚B细胞来源(相同V和J分配)的VHH谱系组，表明VHH和IgG1能识别相同或相似的表位；
viii)具有独特序列特征的非经典VHH：例如，保守的Trp118被Arg118取代和或FR3中较低的疏水性；
ix)新的经典结合环结构(novel canonical binding loop structure)：位于关键位点的超突变热点用于确定经典环结构，使VHH结构库更具多样化。晶体学研究强调骆驼VHH的CDR1和CDR2环经常偏离常规VH1的已知经典结构。基于序列的新型Ag结合环构象预测也支持进一步谱系分组；
x)CDR2长度
xi)CDR3长度
xii)在CDR3区域中存在3个或更多个正电荷
xiii)氨基酸序列中半胱氨酸的数目
xiv)CDR区中的2-4氨基酸基序。该基序是从配体/受体复合物的3-d结构中鉴定的xv)CDR3长度和特性
以及
xvi)相同免疫组中骆驼科动物之间的收敛基序(convergent motif)或序列特征。
VHH(VHH2、VHH3)、VH1-Vκ和VH1-Vλ的人源化可以通过谱系分析来指导。
本发明提供了一种鉴定抗体位置的方法，该位置可以被修饰而不会显著降低抗体的结合活性。在一些实施方案中，该方法包括通过将亲本抗体的氨基酸序列与许多相关抗体的氨基酸序列进行比较来鉴定亲本抗体中的可取代位置，这些抗体各自与相同谱系中的亲本抗体结合相同的抗原和表位。
在一些实施方案中，可取代位置的氨基酸可以被不同的氨基酸取代而不显著影响抗体的活性。本方法可用于改变CDR的氨基酸序列而不显著降低抗体的亲和力。
在人源化方法或其他抗体工程方法中，本发明可用于多种治疗和诊断应用。
双特异性/双互补位抗体或抗原结合片段可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见，例如，Songsivilai&Lachmarm,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)，Kos-telny等,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。此外，双特异性抗体可以形成“双抗体(diabodies)”或“双特异性单链分子(Janusins)”。多个VHH可变域也可以通过连接物偶联以形成二价和多价抗体。
VH1和VL1(Vκ或Vλ)配对谱系可以通过考虑VH1-VL1“锚定”氨基酸序列来鉴定，这些氨基酸序列在异源杂交瘤和/或流式分选的单B细胞分泌的抗体中相互配对(见图6)。
如何识别原始的、天然的H和L对，是利用NGS技术开发骆驼科动物常规IgG1的一个挑战。通常使用(1)异源杂交瘤和(2)单B细胞分选，两种方法来建立锚点H和L(κ和λ)谱系。在用这些锚点对谱系对进一步分组后，从每个谱系对中选择代表性序列H/L对进行DNA合成、结合筛选和作为VHH抗体的生物活性测试。
I.异源杂交瘤法
从免疫骆驼科动物的PBMC或脾脏或淋巴结中分离淋巴细胞；将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤融合伴侣细胞系如SP/20融合并产生异源杂交瘤；使用ELISA和生物活性测定法筛选异源杂交瘤的上清液；序列VH1和VL1来自所选异源杂交瘤；这些VH和VL对用作锚用以配对来自IgG1 NGS库的VH1和VL1谱系。
II.单B细胞NGS方法
a)在淘选和增殖后收获抗原特异性B细胞；b)单B细胞分选；c)VH1-VL1谱系PCR以放大扩增子；d)NGS并通过生物信息学鉴定VH1-VL1对序列(VH1-Vκ或VH1-Vλ)作为锚。
这种方法能够从免疫中捕获整个抗原特异性B细胞库，包括HcAb和常规IgG1与NGS，并利用HcAb的简单性：
a)IgG2/HcAb,IgG3/HcAb,IgG1/κ和IgG1/λ
b)具有不同CDR3_不同表位的谱系
c)具有序列特征_不同表位的VHH谱系
d)VH-Vk或VH-Vλ谱系与异源杂交瘤产生的VH-VL锚配对
可以选择识别广谱抗原表位的抗体谱系(如图7所示)。
每个谱系或谱系对识别一个独特的表位，因此来自前100个谱系/谱系对的一个代表性序列(VHH)或一个代表性对(VH1-VL1)(例如，VHH的70个序列和VH1-V或VH-V的30个序列对)被选择用于基因合成、结合物筛选和生物活性测试。谱系选择标准(优先因素)包括但不限于：
1)序列丰度从高到低的谱系：每个谱系的独特cDNA总数(序列丰度)从2到50,000，序列丰度最高的谱系可能表明抗原刺激后最广泛的克隆扩增；
2)扩增系数从高到低的谱系，B细胞富集/增殖前后序列丰度的动态变化(扩增倍数可在5到1,000之间)；
3)谱系序列丰度在免疫过程中发生变化，表明抗原特异性序列富集和抗体亲和力成熟(序列丰度/独特的cDNA计数变化范围为2至1,000)；
4)在耗尽某些不需要的B细胞之前和之后(如果适用)谱系序列丰度的变化(序列丰度/独特的cDNA计数变化范围可能从2到1,000)；
5)在VHH和VH1之间谱系具有相同幼稚B细胞起源(相同的V和J分配)；
6)避免可开发性不佳序列(avoidance of developability liabilitysequences)：有些序列由会导致开发性问题的某些氨基酸组成，开发性问题例如热稳定性(疏水核心、电荷簇残基等)、化学稳定性(脱酰胺和异构化)、溶解性(表面疏水性等)和异质性(糖基化)(Tomoyuki Igawa等mAbs,2011)。应避免选择这些谱系或谱系对。
选择标准也可以是上述优先因素的组合。
选择的谱系序列或对用于DNA合成并构建到表达载体中，例如VHH、scFv、Fab、HcAb、骆驼科IgG1和人Fc嵌合体。
在一些情况下，选定的VHH谱系和选定的VH1-VL1谱系对可以具有相同的幼稚B细胞起源。
另一方面，在第一轮选择中相同靠前谱系对中的更多对(例如，70个VHH序列和30个VH1-Vκ或VH1-Vλ序列对)被选择用于基因合成、结合物筛选和生物活性测试，因为VH1-Vκ或VH1-Vλ的代表性序列对需要进行更多的组合检验才能确定最佳序列对。
如果前100个抗体未产生所需结果，在接下来的100个排名靠前的谱系中的更多序列和对(例如，VHH的70个序列和VH1-Vκ或VH1-Vλ的30个序列对)被选择用于基因合成、结合物筛选和生物活性测试。
该方法的意义在于能够系统地、相互关联地从每个谱系中选择具有代表性的序列进行检测，以高分辨率覆盖更多表位。这改进了以下情况下的抗体发现能力：
a)从大量候选物中发现具有最佳亲和力、特异性和可开发性的治疗性抗体；
b)平行发现伴侣诊断抗体和其他应用；
c)二价和多价抗体的构建和开发；
d)抗体重链和轻链对的发现；
结合相同表位的抗体可以通过谱系相关序列来鉴定(图8所示)。
众所周知，CDR3序列是结合表位的主要决定因素，而CDR1和CDR2或多或少地参与确定其他结合特性。在从每个谱系中筛选出先导(例如图8中用@和+标记)后，可以鉴定更多具有不同特征(例如亲和力、特异性、功能性、生产力和可开发性)的候选者，以测试和选择最需要的抗体，因为来自相同谱系的抗体能够识别相同或相似的表位。这一步也有助于为进一步抗体药物开发建立一个庞大的候选库。
可能有大约10-20％的VHH和VH1具有相同的幼稚B细胞来源。从第一轮选择中选出的VHH序列有助于鉴定与VHH具有相同V(D)J排列的VH1，并进一步测试它们的VH-VL对以获得更多选择。选择标准包括：
1)CDR1和/或CDR2差异>2aa(氨基酸)；
2)FR1和/或2和/或3和/或4差异>2aa；
3)在VHH和常规VH之间具有相同幼稚B细胞来源的序列；
4)可以与Vλ和Vκ两者配对的VH序列；
选择的序列或对用于DNA合成；并构建成表达载体，如VHH、scFv、Fab、HcAb、骆驼科IgG1和人Fc嵌合体。
可以选择更多的序列和对，直到鉴定出最好的抗体，并将剩余的克隆保留为进一步候选物的库。
VHH(VHH2和VHH3)、VH1-Vκ和VH1-Vλ通过谱系分析进行人源化。
非经典VHH基因与常规VH具有相同的幼稚细胞，这有助于(1)对VHH谱系细分亚组，(2)选择识别相同或相似表位的HcAb和常规IgG，(3)促进HcAb和常规IgG的人源化。
VHH结构域通常与人类3型VH结构域(VH3)的具有高度序列同一性，这可能是它们免疫原性较低的原因(Cortez-Retamozo V,Int J Cancer.98(3):456-62,2002)。此外，骆驼VH1、常规抗体的Vλ和Vκ结构域在序列和结构上也显示出与人类对应物具有显著同源性(Alex Klarenbeek等,mAbs7:4,693--706；2015)。图9，众所周知，相同谱系组内的序列共享相同或相似的CDR3序列并识别相同的表位。通过功能筛选，我们可以在包括CDR和FR的可变区内鉴定这些氨基酸，它们构成相同的生物学功能(即使这些氨基酸在谱系内不同)，因此它们也是可取代的。因此，可以用人类种系抗体氨基酸替换这些耐受位置，并且可替换的氨基酸甚至可以在CDR区域内以实现更好的人源化。
此外，如前所述，这些非经典VHH(无FR2亲水性氨基酸)源自与常规VH1相同的IGHV3或IGHV4、D和J基因的基因座，在这些组中VHH和VH1序列之间的谱系结构是相似的，可以通过谱系分析进一步支持彼此的人源化设计。
药物制剂
在另一方面，本发明提供一种组合物，例如一种药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起配制的本发明的一种或多种单克隆抗体或其抗原结合部分。此类组合物可包括本发明的一种或多种(例如，两种或更多种不同的)抗体、或免疫缀合物或双特异性分子组合。例如，本发明的药物组合物可包含结合靶抗原上的不同表位的抗体或具有互补活性的抗体(或免疫偶联物或双特异性抗体)的组合。
实施例
s实施例1:使用B细胞分离和扩增(BIA)/NGS序列分析和单B细胞方法鉴定与抗原特异性结合的VHH抗体组
1A.BIA/NGS
材料和方法
BIA
A1.表达CD40L的EL4.IL-2-C的构建
细胞系TIB-181(EL4.IL-2)自美国典型培养物保藏中心获取，以pCMV-6为基础的载体稳定转染，该载体包含编码人CD40L的cDNA并能表达人CD40L。选择稳定的细胞系并用丝裂霉素处理作为饲养细胞。
A2.羊驼条件培养基
将脾细胞分离用于羊驼条件培养基制备。制备含有10％FBS、植物血凝素(PHA)和丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)的活化培养基。4×108个脾细胞悬浮在T175烧瓶的活化培养基中并在37℃5％CO2下温育48h。孵育后，收集过滤上清液并作为羊驼条件培养基。
A3.动物免疫
抗原(如，0.5mL PBS中的400μg Keyhole Limpet Cyanin(“KLH”))用0.5mL完全弗氏佐剂乳化。乳化抗原沿羊驼的颈部和背部皮下注射。注射五次总共约200μL(或更少)。每14天进行3次免疫接种。
A4.从不同器官中分离淋巴细胞
为了从血液中分离PBMC，用含有2％FBS的1x DPBS将来自免疫羊驼的含有EDTA血液样品进行稀释两倍。然后将稀释的血液缓慢置于Ficoll-Paque PLUS密度梯度培养基上进行密度离心。取出上层，将淋巴细胞层转移到干净的离心管中。然后用1x DPBS洗涤PBMC两次。
为了从脾脏中分离淋巴细胞，用1x DPBS洗涤经免疫羊驼的脾脏并放入干净的盘中。通过注射培养基使脾脏膨胀，直到释放出大部分淋巴细胞。然后使用20cc注射器的底部将脾脏压碎。大力挤压有助于获得尽可能最好的淋巴细胞产量。通过温和离心进行收集所有释放的细胞，例如1400rpm。吸出上清液，抽吸上清，加入5x体积的红细胞裂解缓冲液，静置至少4min。然后加入RPMI 1640培养基以终止裂解。然后将淋巴细胞用1x DPBS洗涤两次。
为了从淋巴结中分离淋巴细胞，从免疫的羊驼中收集肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结。通过在RPMI 1640培养基中研磨淋巴结来释放淋巴细胞。细胞通过细胞筛网并通过离心收集。将5×体积的红细胞裂解缓冲液颗粒加入样品中，样品静置至少4min以去除RBC。然后加入RPMI 1640终止红细胞裂解。然后将淋巴细胞用1x DPBS洗涤两次。
为了从骨髓中分离淋巴细胞，在骨骼的两端打开免疫羊驼的胫骨和桡骨并取出骨髓。通过在RPMI 1640培养基中研磨骨髓来释放细胞。细胞通过细胞筛网并通过离心收集。将5×体积的红细胞裂解缓冲液颗粒加入样品中，让样品静置至少4min以去除RBC。然后加入RPMI 1640终止裂解并将淋巴细胞用1x DPBS洗涤两次。
A5.去除非特异性细胞
将收集的细胞重悬于含有10％FBS、1％青霉素-链霉素和0.05μM 2-巯基乙醇的RPMI1640培养基中，得到1M/mL细胞悬浮液。将细胞在6孔培养板中37℃预孵育1h，使巨噬细胞和单核细胞非特异性粘附于板表面。预孵育后，收集并计数未结合的细胞。
A6.B细胞淘选
将收集的细胞重悬于含有10％FBS、1％青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中，以获得100万/mL的细胞悬浮液。细胞于每10cm培养皿预涂抗原500万的条件下37℃孵育1.5h进行特异性B细胞淘选。孵育后，将接种的细胞用RPMI1640培养基洗涤2-10次，直到只有少数细胞处于悬浮状态。收集并计数所有未结合的细胞，计数为A1。
A7.B细胞体外培养
将20mL B细胞培养基加入到含有淘选保留的B细胞的培养皿中。B细胞培养基含有10％FBS、1％青霉素-链霉素、10％羊驼条件培养基、各种生长因子，例如一种或多种浓度为1-50ng/mL白细胞介素和2.5M MMC预处理的饲养细胞(EL4.IL-2-C3，表达羊驼CD40L)。还培养仅B细胞和仅饲养细胞的培养皿作为质量控制测试中的对照。细胞在5％CO2中培养8-10天。
A8.细胞收集和质量控制
在第10天，将来自B细胞培养物的50μL上清液用于ELISA以测试抗体分泌。收集并计数共培养皿中的所有细胞，该计数被视为A2。收集并计数仅饲养细胞的培养皿中的细胞，该计数为A3。B细胞扩增倍数(BCAF)，由以下公式计算：
BCAF＝(A2-A3)/(5M-A1)
A9.NGS库构建
将每次筛选得到的B细胞制备模板RNA，用于构建NGS cDNA库。为了计算序列富集，还使用淘选前的B细胞构建库。
i.RNA分离
使用TRIzol方法从共培养的B细胞中提取RNA。
通过重复移液或通过注射器和针头，用TRIZOL试剂裂解培养的B细胞。每0.5-1X106个细胞使用1mL试剂。加入20％氯仿，搅拌约15s。使用移液管小心地除去水相。将等体积的异丙醇加入水相中并轻轻混合。样品以最大速度(12,000rpm)离心10分钟。除去异丙醇，将沉淀用1ml 75％乙醇在DEPC处理过的水中洗涤并轻轻混合。沉淀在7,000rpm下重新离心1min。在大约70μl无RNase的水中回收RNA。
ii.逆转录
在0.2mL PCR混合物中，分别使用不同的引物(随机6聚体、Oligo dT和Al.CH2+Al.CH2.2)扩增8个反应。RNA-引物混合物在65℃下加热5min，然后在冰上孵育至少1min。制备RT反应混合物并在以下条件下进行逆转录：30℃ 10min；42℃ 50min；75℃ 15min。
iii.cDNA扩增PCR
大约2μL逆转录的cDNA用作模板，用于50μL PCR反应，其中包含25μL 2×Primerstar mix、18μL RNase Free dH2O、1μL各引物NGS-leader1_L(GCAGTGGCTGCAGGTGTCCACTCG–SEQ ID NO.63)-leader2_L(GCAGGTCCCCAAGGTGTCCTGTCC–SEQ ID NO.64)、NGS-leader3_L(GGTGGTCCTGGCTGCTCT–SEQ ID NO.65)、NGS-hinge1_L(TTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG–SEQ ID NO.66)和NGS-hinge2_L(GGGGTCTTCGCTGTGGTGCGC–SEQID NO.67)并循环如下：98℃ 3分钟；20个循环(98℃ 15，58℃ 30s和72℃ 30s)；72℃ 3分钟。根据制造商的说明，使用
Figure BDA0003321972400000311
PCR纯化试剂盒纯化得到的扩增子，截断值≥300bp。
iv.PCR索引
每个扩增子样品在包含25μL 2x Primer star mix、18μL RNase Free dH2O、1μL各引物对(例如P5-seqF和P7-index1-seqR)的第二个“加标签”50μL PCR反应中单独进行条码标记，以100ng首轮PCR为模板，循环如下：98℃ 30s；12个循环(98℃ 10s，65℃ 30s和72℃ 30s)；72℃ 5分钟。合并最终三个扩增子(来自三个不同的反向引物)并使用
Figure BDA0003321972400000322
PCR纯化试剂盒从1.5％(w/v)琼脂糖凝胶中纯化。
A10.NGS数据分析
扩增的cDNA使用MiSeq测序系统(Illumina,Miseq,300x2)测序。从每个样本中，生成1-3百万个读数。数据使用NGS QC工具包进行质量检查，并使用FLASH进行组装。组装的序列被翻译成蛋白质序列，并通过计算确定CDR1、CDR2和CDR3区域(基于IMGT编号)。根据相同的CDR3长度、小于或等于1的CDR3汉明距离和相同映射的V/J种系，序列被聚类成谱系/组，如图4所示。基于相同的CDR3长度和80％或以上的CDR3同源性，序列被进一步细分为簇。例如，可以通过具有至少12个氨基酸的CDR3长度、0或1的CDR3汉明距离(与参考序列相比)和具有相同V/J区氨基酸序列的克隆来定义谱系。序列或序列组的富集分数是使用淘选前后从B细胞构建的库之间的频率比计算的。
基于图7所示的谱系优先因素从不同谱系中选择代表性克隆(20个或更多)，并通过ELISA、FACS等多种结合检测方法检测其产生的抗体。从不同的谱系中选择的克隆通常与目标蛋白的不同表位结合。为了优化现有克隆，可以从相同谱系中选择其他克隆，如图8所示。从谱系中选择的克隆通常会与相同表位的不同部分结合。
选择A：挑选簇中计数最高的克隆
如下面的屏幕截图所示，C328簇在富集后频率增加了357倍。集群中计数最高的克隆NBL505-A1L1-P3R3_355是进行下一步测试的良好选择。
Figure BDA0003321972400000321
选择B：挑选具有最高富集分数的克隆。
通过比较富集前后文库中的序列(例如通过淘选或流分选)，可以基于富集前后的序列频率计算富集分数。为了增加挑选分泌功能性VHH的克隆的机会，可以使用富集分数来确定克隆挑选的优先级。在下面的屏幕截图中，克隆NBL505-A1L2-P3R2_5559是根据富集倍数选择的。
C473(NBL505-A1L2-P3R2)中的序列富集
Figure BDA0003321972400000331
1B.单B细胞
B1.从免疫羊驼PBMC中分选Ag特异性单B细胞
采用Ficoll密度梯度离心法(GE)从免疫羊驼获得外周血单核细胞(PBMC)，并将其分成含有200×106个细胞的试管进行免疫染色。将细胞与200μL KLH-生物素(在MACS缓冲液(PBS加2％FBS加2mM EDTA)中稀释至5μg/mL)在4℃下孵育30min，然后用5mL冰冷的MACS缓冲液洗涤两次。然后用兔抗美洲驼IgG(H&L)、APC-链霉亲和素、和活/死染料对细胞进行染色。然后在Moflo Cell Sorter Cytometer(Beckman)上收集染色样品，并将单个IgG+KLH+Live+细胞收集在每孔含有10μL缓冲液的单独PCR管中，缓冲液含有8μL裂解缓冲液(Tiandz)、1mM dNTP(Takara)、3.75μM随机6聚体(Takara)和1.25μM Oligo dT引物(Takara)。
B2.单细胞RT-PCR和B细胞克隆
收集的抗原特异性羊驼B细胞在收集管中裂解，然后加热至65℃ 5min。冷却至4℃后，在终体积20μL中对裂解的单细胞的总RNA进行逆转录，包含：4μL 5×PrimeScipt II缓冲液(Takara)、20U RNase抑制剂(Takara)、200U PrimeScript II RTase(Takara)和4.5uL无RNase水(Takara)，在30℃下10min的初始步骤以进行随机六聚体杂交后，在42℃下作用50min。72℃孵育15min终止反应。
接下来通过两轮嵌套PCR从每个单细胞cDNA分别扩增重排重链(HC)基因座、λ(LCλ)或κ(LCκ)轻链基因座的可变区。对于每个可变片段，在3μL cDNA上进行第一轮PCR，98℃5min、98℃ 15s、HC为55℃ 1min(LCκ为62℃，LCλ为58℃)、72℃ 1min，进行40个循环，然后在含有2X PrimeStar MAX缓冲液(Takara)和100nM引物的40-μL反应体积中，于72℃进行最终延伸7min。4μL的第一次扩增产物通过第二轮PCR进一步扩增。第二轮PCR方案由以下组成：98℃进行5min的样品变性步骤，然后进行40个扩增循环(98℃ 30s，HC在58℃ 30s(LCκ为62℃，LCλ为58℃)，以及72℃ 1min)，最后一步是使用2X PrimeStar MAX缓冲液(Takara)和100nM引物在50μL反应体积中72℃持续7min。在1.5％琼脂糖GelRed凝胶上检测来自每个单细胞的PCR产物。来自每个孔的PCR产物通过市售纯化试剂盒(Tiangen)过滤纯化。
用10uL Genbuilder plus cloning-Ligase(Genscript)、100ng消化和纯化的PCR产物和100ng线性化载体在20μL的总体积中进行连接。用20μL连接产物转化电感受态大肠杆菌TOP10细菌。分别使用PET-SEQ-F(TGCTGGTCTGCTGCTCCTCGC–SEQ ID NO.68)作为正向引物和PET-SEQ-R(ACCGTCTATCAGGGCGATGG–SEQ ID NO.69)作为反向引物，通过PCR筛选菌落。预期的插入带长度约为700bp。为确保一致的可变基因序列，对于每个平板，从十个菌落中分离并测序质粒DNA。
使用上述单B细胞分选方法和纯化的表皮生长因子受体(EGFR)作为抗原，鉴定了一组11个克隆，每个克隆都表达以高亲和力特异性结合EGFR的VHH抗体。参见图10。
使用上述淘选B细胞富集方法以及使用间皮素(MSLN)作为抗原，用谱系和CDR3长度和特征分组方法从NGS数据中挑选一组克隆。在库中最丰富的12个序列的克隆中，其中有7个克隆被证明是有效的MSLN结合剂。(见下表1。)重要的是，MSLN由三个域组成；并且，5个MSLN结合克隆的抗体与MSLN结构域1中的表位特异性结合。此外，所选克隆之一的抗体与结构域2特异性结合，而其中一个克隆的抗体仅与结构域3特异性结合。因此，通过单一的谱系分组和挑选，可以鉴定能识别全长抗原的广谱表位的克隆。这将为在不同病症的抗原结合治疗中挑选克隆提供更多机会，或为双特异性组合提供更多选择。此外，该方法还可以鉴定那些表现为抗原-配体复合物的阻断剂或非阻断剂的克隆。例如，在7个MSLN结合克隆中，鉴定到2个克隆的抗体结合MSLN的结构域2或3，但不抑制CA125与MSLN的结合。相比之下，结构域5表位1的结合剂可防止CA125与MSLN结合。本发明公开的方法能够有效系统地、相关地选择用于测试的抗体，以高分辨率覆盖广泛表位。
表1：选定的MSLN结合克隆
Figure BDA0003321972400000351
在鉴定产生抗原特异性抗体的克隆的另一个实例中，通过以下程序发现产生抗KLH抗体的克隆。
抗原特异性B细胞分离，在进一步的实验中，通过标准免疫方案，使用市售的KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)免疫一只编号#009的羊驼，所述标准免疫方案使用一次完全弗氏佐剂中的200μg KLH，然后是每两周使用不完全弗氏佐剂中的100μg KLH(sigma)。在通过ELISA对系列稀释样品评估抗血清后，根据制造商的说明，使用Ficoll-Paque密度梯度技术(GE)抽取100-200mL血液用于分离外周血单核细胞(PBMC)。将分离的PBMC(活力>95％)重新悬浮在完整的RPMI1640培养基中，以获得106/mL的细胞悬浮液。将4mL PBMC悬浮液添加到6孔板的每个孔中并孵育1h以捕获非特异性结合细胞。然后收集未结合的细胞并在完整的RPMI1640培养基中重悬至106/mL。将5mL细胞悬液加入到预包被有抗原的10cm高结合培养皿(蛋白质结合能力>500ng/cm2)中，在37℃下以50rpm轻轻摇动1.5h。孵育后，未结合的细胞用1×DPBS洗2-10次以去除非特异性结合细胞。在B细胞培养基中重悬丝裂霉素处理的EL4.IL-2-C3饲养细胞(稳定表达羊驼CD40L)，然后将其以0.5x106细胞/mL添加到培养皿中，用于B细胞体外共培养。每10cm培养皿的最终体积为20mL。B细胞共培养基含有10％FBS(胎牛血清)、1％青霉素-链霉素、10％来自羊驼空白PBMC培养物的羊驼条件培养基和各种生长因子，例如一种或多种白细胞介素，浓度从1到50ng/mL。
共培养10天后，将50μL上清液用于ELISA以测试抗体分泌和与KLH免疫原结合的特异性。同时，收集共培养细胞并计算总细胞数。B细胞分离和扩增后的B细胞扩增由总细胞数减去饲养细胞对照的细胞数计算。为了将此富集的细胞数与添加的初始细胞量进行比较，我们可以计算抗原特异性B细胞的扩增。如图11所示，来自5个不同共培养皿的B细胞显示出一致的抗原特异性VHH抗体分泌。在B细胞分离和扩增(BIA)后，PBMC中的抗原特异性B细胞扩增了4到6倍。
在BIA之后，使用共培养细胞的mRNA构建三个NGS库。Oligo-dT、随机六聚体和CH2特异性引物分别用于逆转录。(Maass DR,Sepulveda J,Pernthaner A,ShoemakerCB.Alpaca(Lama pacos)as a convenient source of recombinant camelid heavychain antibodies(VHHs).J Immunol Methods.2007；324(1-2):13–25.)然后对这些cDNA进行两轮PCR反应。将这三个库都送往中国南京金斯瑞(Genscript)公司，在MiSeq测序系统(Illumina，Miseq，300x2)上进行测序，添加30％PhiX基因组DNA，每个样本生成4-5百万个读数。数据使用NGS QC工具包进行质量检查，并使用FLASH进行组装。基于相同的CDR3长度、小于或等于1的CDR3汉明距离和相同的映射V/J种系，将序列聚类成谱系/组，如图4所示。基于相同的CDR3长度和80％或更多的CDR3相同性，序列被进一步细分为簇。为每个库生成了800多个组。应用几个谱系优先因素从这些组中筛选克隆：序列丰度、经典VHH与非经典VHH以及CDR3长度。从20个不同的组中选出20个克隆，合成、表达和纯化。下表2至4中展示了与挑选的克隆有关的生物信息学数据。由每个挑选的克隆表达抗体的完整氨基酸序列表示为每个域(FR1、CDR1等)的连续序列。
表2-所选抗KLH VHH克隆的生物信息学数据
Figure BDA0003321972400000371
表3–所选抗KLH克隆的生物信息学数据(续)
Figure BDA0003321972400000372
Figure BDA0003321972400000381
表4–所选克隆的生物信息学数据(续)
Figure BDA0003321972400000382
Figure BDA0003321972400000391
通过ELISA进行抗体的抗原特异性结合验证。基于亚组特征(序列丰度、经典VHH与非经典VHH和CDR3长度)调查抗体库。在本例中，每个簇集只选择一个克隆。在本例中，大多数选定的克隆产生经典VHH而不是非经典VHH。具有长铰链序列和短铰链序列的氨基酸序列都包括在本例的选定克隆中，即，与通常的VHH序列相比，在CDR3内具有一对额外二硫键的克隆。通过这种克隆挑选策略，我们在选择具有结合活性的克隆方面取得了100％的成功率。如ELISA测定所示，所选的20个克隆都显示出对KLH抗原KLH的特异性结合活性(图13)。其中18个的平均结合EC为0.465nm(除了第6个和第9个是异常值)。3个克隆(序号1、3和13)是有效的KLH结合剂，EC50分别为67、77和72pmol/L。大多数先导(lead)显示具有亚纳摩尔的效能。因此，可以通过BIA和NGS鉴定分泌强效KLH结合抗体的克隆B细胞。为了确认CDR3长度与结合活性之间的相关性，列表中包括了不同CDR3长度的克隆。观察到最短CDR3长度为9个氨基酸，而最长的为21个。20个VHH抗体的平均CDR3长度为16个氨基酸。如图42所示，在CDR3长度和克隆ELISA活性之间观察到正相关性。
表5-所选克隆的抗KLH ELISA
Figure BDA0003321972400000392
Figure BDA0003321972400000401
实施例2：通过表位预测发现阻断PD-1:PD-Ll复合的抗体
实验方法概述
图14显示发现阻断配体的抗体的工作流程:受体结合作用(络合作用)。该工作流程通过计算或晶体学方法，从配体和受体的三维结构和/或它们的复合物的结构的鉴定开始。形成结合界面的受体和配体的部分可以通过检查“对接”蛋白质的界面来确定。可以通过检查结构来确定发生相互作用从而建立或稳定结合复合物的氨基酸。来自改变界面氨基酸的实验数据，并观察这种变化对复合物结合强度的影响，有助于确定相互作用形成和稳定复合物的氨基酸。
选择位于复合物界面的配体或受体的2-4个氨基酸的短线性氨基酸序列部分，然后搜索NGS氨基酸序列库以鉴定在序列的CDR部分(优选在抗体序列的CDR3部分)编码所选短氨基酸序列的抗体cDNA克隆。以2-4个氨基酸长度的筛选肽序列为关键词，从NGS数据库中搜索CDR3序列，得到满意的VHH序列及其丰度。
选择NGS库中高于选定丰度阈值的序列用于基因合成并在HEK293细胞中与人IgG4-FC标签融合表达。纯化表达的蛋白质，然后进行功能测试，例如用于抗原结合和抑制PD-1:PD-L1复合物的形成。
PD-1/PD-Ll结构分析
从PDB数据库(PDB ID:4ZQK)下载PD-1/PD-Ll复合物的结构。PYMOL软件用于结构分析。结构显示PD-L1覆盖了PD-1的两条肽段(图15)，黄色的是SFVLNWYRMSPSNQTDKLAA(SEQID NO.141)，紫色的是YLCGAISLPAKAQIKESLR(SEQ ID NO.142)。选择在PD-1/PD-L1晶体结构中观察到的极性接触残基区域。PYMOL中通过使用“动作查找与其他非溶剂的极性接触(actions-find-polar contacts-to others excluding solvent)”，显示了PD-1和PD-L1之间的极性接触。
图15显示了PD-1:PD-L1复合物(该复合物的数据是公开可用的——蛋白质数据库ID号：4ZQK)的界面，以及作为潜在的“阻断”肽的PD-1的两个相邻肽，它们抑制复合物形成。图16为PD-1蛋白与该相邻两肽相互作用分析结果；PD-1的SFV…SLR肽和PD-L1的AFT…RIT肽在其复合物界面处相互作用的氨基酸通过连接线识别。
通过以上分析，确定了PD-L1的极性接触残基，它们是F-D-Q-ADYKR。由于F-D-Q-A中有很长的氨基酸间隔(>2个氨基酸)，因此只有肽段ADYKR适合选择策略。选择两到四个氨基酸肽用于VHH选择。然后将肽ADYK(SEQ ID NO.145)、DYKR(SEQ ID NO.146)、ADY、DYK、YKR、AD、DY、YK和KR设置为从NGS数据库的筛选标准(表2)。
与多种抗体复合的PD-1的其他结构也是可用的，也可从PDB数据库下载并以上述相同的方式进行分析。PD-1与多种抗PD-1抗体之间的复合物以及通过上述复合物相互作用分析确定为潜在阻断肽的短肽列于表6中：
表6
Figure BDA0003321972400000411
Figure BDA0003321972400000421
需特别关注CDR3序列，因为VHH中的CDR3是与抗原的主要结合区，并且在VHH抗体中CDR3部分比常规(VHVL)抗体中更长，并且CDR3越长为VHH抗体提供的结合面积约大。从NGS数据库中提取包括筛选肽在内的CDR3序列，并对其丰度进行计数以消除重复序列。发现2-4个氨基酸适合在NGS数据库中搜索；两个氨基酸可能太短(导致无法控制的命中数)，四个氨基酸可能会过度限制选择的数量。因此，选择了3个氨基酸序列进行NGS数据库检索。
先前的出版物描述了通过淘选噬菌体表面VHH展示库来发现抗体的方案。但是这种方法往往只能获得文库中丰度高的VHH克隆，导致丢失了一些低丰度的VHH。基于使用不同筛选肽序列的关键字搜索，从NGS数据库中选择了一系列不同丰度(携带编码选定氨基酸序列的DNA的所有克隆的百分比)的VHH序列。表7中给出了在具有不同丰度校准值(tare)的选定克隆中编码的氨基酸序列的CDR3部分。
表7：选择作为可能阻断抗体的cDNA克隆
Figure BDA0003321972400000422
Figure BDA0003321972400000431
从NGS数据库中选择CDR3序列
我们确定了一系列具有2-4个氨基酸长度的筛选肽。我们假设CDR3包含筛选肽可能与PD-1结合并阻断PD-L1。由于VHH中的CDR3是与抗原的主要结合区，因此它比常规抗体更长，并且较长的CDR3为VHH提供大结合区域。从NGS数据库中提取包括筛选肽在内的CDR3序列，并计算丰度以消除重复序列。由于筛选肽段不同，我们发现2-4个氨基酸比较合适，但需要说明的是2个AA可能太短，4个AA可能限制了选择的数量，3个氨基酸长度的筛选肽是最好的选择。
抗体表达和纯化
编码所选VHH抗体序列的核酸被合成并插入到pCDNA 3.4载体中，该载体融合了具有(G4S)3接头序列的IgG4-FC标签。通过测序确认重组质粒。然后将VHH-FC构建体转化到HEK293细胞中。转化细胞培养5-7天得到重组蛋白。然后从过滤的培养上清液中纯化重组VHH抗体。所得抗体的蛋白质浓度通过280nm处的UV吸光度测量。纯化的重组抗体的纯度通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的考马斯染色和高效液相色谱(HPLC)进行评估。
ELISA结合测定
将2μg/mL的PD-1蛋白包被在96孔板上过夜，用于ELISA结合测定。将重组VHH-FC蛋白加入孔中并静置一段时间，然后加入1μg/mL的HRP偶联的抗FC抗体作为检测抗体并加入测定试剂。在450nm处读取吸光度。纳武单抗(nivolumab)的结合作为阳性对照，涂有BSA的平板作为阴性对照组。
ELISA封闭测定
96孔微量滴定板的每个孔都涂有2μg/mLPD-1蛋白的PBS，并用1％BSA封闭。将浓度为5μg/mL的纯化VHH-FC蛋白添加到每个孔中。
然后将2μg/L生物素标记的PD-L1蛋白加入到每个孔中。PD-L1蛋白使用HRP偶联的抗人IgG和TMB作为底物进行检测。在450nm处测量显色强度。未添加PD-1和未添加VHH-FC的孔分别为阴性和阳性对照。
选择三十个克隆并且从选择的克隆中纯化VHH抗体。选择三十个克隆用于如上所述的表达和纯化。19个克隆能良好表达重组VHH抗体。
如上所述，通过ELISA评估来自19个克隆的纯化VHH抗体与PD-L1的结合和对PD-1:PD-L1复合物形成的抑制。结果分别见表8和表9：
表8：从所选cDNA克隆表达的VHH抗体的PD-L1结合活性
Figure BDA0003321972400000441
Figure BDA0003321972400000451
表9：所选VHH克隆的阻断活性
Figure BDA0003321972400000452
Figure BDA0003321972400000461
1194-z0-IgG4是一种已知具有阻断PD-1:PD-L1复合活性的阳性对照抗体。NBL507-BMK2-H4-IgG4是用作阴性对照的无关抗体。
所选克隆中的7个产生了与PD-1具有实质结合活性的VHH抗体，并且选择结合最强的五个克隆用于测试阻断PD-1:PD-L1复合物形成的活性。发现克隆SS5甚至比阳性对照1194-z0-IgG4表现出更强的复合抑制。
从获得的结果来看，表达含这样的CDR3序列的抗体的克隆集合极有可能包括至少一个表达与抗原特异结合的VHH抗体的克隆并阻碍抗原与其特定蛋白结合伴侣的复合，所述CDR3序列在所有所选克隆中出现至少10个拷贝。例如，在本发明公开的实验中，所含CDR3序列在所选克隆中出现超过10个拷贝的克隆100％表达与PD-1结合的VHH抗体，并且其中33％表达能阻断PD-1与PD-L1结合的VHH抗体。相比之下，所含CDR3序列在所选克隆中出现少于10个拷贝的克隆仅25％表达与PD-1结合的VHH抗体，并且所选克隆中没有一个表达能阻止PD-1与PD-L1结合的VHH抗体。
在如上进行的额外实验中，如上所述挑选出30个用于表达和纯化的克隆。19个克隆良好表达重组VHH抗体。其中，7种表现出与人PD-1的强结合。鉴定分泌抗原结合VHH抗体的克隆-NGS引导的克隆选择的总体成功率为37％。
实施例3:序列特征和克隆选择规则的开发
BCMA免疫的动物之间的收敛(重叠)序列(Convergent(overlapping)sequences)。在该实验中，用人重组BCMA蛋白免疫了两种名为507-A1(A1)和507-A2(A2)的羊驼。动物A1和A2使用相同的免疫方案接受等量的重组人BCMA。实验发现具有独特CDR3氨基酸序列的93和40VHH序列可分别作为动物A1和A2的有潜力的先导(promising leads)。在动物之间，选择免疫和克隆鉴定双盲的克隆，有20种序列在两种动物中共用CDR3序列。表11显示了两种动物共有的20个独特的CDR3序列。
表11–重叠克隆的CDR3序列
Figure BDA0003321972400000471
图18中的维恩图展示了来自动物A1和A2的CDR3序列之间的关系。
VHH2(长铰链)和VHH3(短铰链)序列共享的抗体序列。在A1羊驼中，发现了6个VHH序列具有长区域或短铰链区。如图19A所示，发现了249个序列的原始库并且发现其中135个具有铰链序列。其中发现26个具有长铰链序列的非冗余序列和89个具有短铰链序列的非冗余序列。其中，19个独特的CDR3序列具有长铰链序列，53个独特的CDR3序列具有短铰链序列。在这两组中，有6个CDR3序列是共享的。
对动物A2的克隆的氨基酸序列进行相似计算(Similar consideration)，鉴定发现A2动物在长铰链或短铰链库中的2个序列是共享的，，如图20A和20B所示。
A1和A2动物中总计有8个序列即位于长铰链序列库也在短铰链序列库中。
羊驼传统抗体(VH)和VHH2/VHH3之间的收敛序列。从2只动物中鉴定出19种单链抗体与人BCMA能够良好结合。令人惊讶的是，长铰链库和短铰链库共享的2个VHH序列，1A1和1D2，也存在于传统VH库的先导序列中。不同类别的抗体共有序列数量如图21A所示。图21B显示了长铰链或短铰链共享的8个VHH CDR3序列，突出显示的序列由所有VH/VHH2和VHH3共享。
共享序列显示为有效的BCMA结合剂。为了测试重叠序列是否是优选特征，纯化了由VHH2和VHH3共享的8个收敛VHH克隆表达的抗体。通过ELISA或流式细胞术，发现这些都是有效的BCMA结合剂。图21B中突出显示的序列(SEQ ID NOS.117和118)，命名为1A1和1D2，由VH和VHH抗体共享。8种收敛VHH抗体结合过表达BCMA的肿瘤细胞系RPMI8226的细胞，但不结合BCMA表达阴性的293T细胞。使用His-或Fc-偶联的人BCMA作为包被抗原，ELISA显示出相似的结果(表12)。
表12-BCMA与选定抗体的结合
Figure BDA0003321972400000481
NBL507-A1L1-P1R2-1A1-(1)-PME207-SEQF_A01 SEQ ID NO.132
NBL507-A1L1-P1R2-1D2-(9)-PME207-SEQF_A02 SEQ ID NO.133
NBL507-A1L1-P1R2-1E2-(10)-PME207-SEQF_B02 SEQ ID NO.134
NBL507-A1L1-P1R2-1B6-(31)-PME207-SEQF_G04 SEQ ID NO.135
NBL507-A1L1-P1R2-1B8-(44)-PME207-SEQF_D06 SEQ ID NO.136
NBL507-A1L1-P1R2-1G8-(48)-PME207-SEQf_H06 --
NBL507-A2L1-P1R2-1C1-(273)-PME207-SEQF_E11 SEQ ID NO.137
NBL507-A2L1-P1R2-1H1-(275)-PME207-SEQF_G11 SEQ ID NO.138
重叠序列特征。最后，在A1和A2动物中也发现了VH/VHH2/VHH3共有的2个序列(见图22)。因此，挑选那些在多种动物/VH/VHH种系中发现的序列，被认为是抗体表现出对抗原强特异性结合的有用特征。
支持其他特征的数据。检查了经典VHH和非经典VHH与人BCMA结合的亲和力。经典VHH比非经典VHH具有更高的亲和力。结果如图23所示；P<0.05。
其他特征统计
FR2亲水区：对于大多数VHH抗体，与常规IgG相比，FR2具有独特的氨基酸取代：37Phe/Tyr、44Glu、45Arg和47Gly。图24显示了在三个库的每个库中，具有VHH抗体的这些FR2独特氨基酸的克隆比例，各针对不同的抗原(NBL501(抗-MSLN)、NBL504(抗-PD1)和NBL602(抗-KLH))。意外的是，这三个库中的全VHH克隆库中高达8％的克隆具有这种特殊的FR2取代模式。还检测FR2独特序列中第37、44、45和47位(Kabat编号)的单独取代频率，数据见图25。
有趣的是，独特的序列取代是多样化的。虽然在第44和45位，Glu和Arg是主要的氨基酸，但第37和47位是可变的。在NBL501抗MSLN中，70％的Tyr和10％的Phe占据了37位。相比之下，在抗PD1(NBL504)和抗KLH(NBL602)中，37Phe达到70％，37Tyr约25％。在第47位观察到一致高百分比的Leu而不是甘氨酸，并且也有相当比例的克隆在该位置含有Phe和Trp。该位置的特征氨基酸Gly仅占不到10％的频率。因此，37Phe/Tyr、44Glu、45Arg和47Gly/Leu/Phe被认为是羊驼VHH FR2的特征。
延长的CDRl和CDR2：VHH在CDRl旁边具有额外的高变区(残基27-30，根据Kabat的编号)。具有该区域和长CDR3区域的VHH抗体增加了与抗原相互作用的表面积。然而，具有这种特征的抗体并不常见。
CDR2结构域的长度通常为5-9个氨基酸。然而，许多克隆都包含一个“长CDR2”，其长度为14-17个氨基酸。重要的是，发现含有长CDR2的VHH比那些具有较短CDR2的VHH对其抗原具有更高的结合亲和力。图27展示了来自三个不同库的抗体的ELISA数据。
CDR3内的额外二硫键：大约5-10％的VHH抗体在CDR3结构域内具有额外的二硫键，这可能表明这些抗体结合的表位是更“构象”的识别位点，其由抗原的三维结构形成，而不是较短的线性氨基酸序列。大约2-19％的CDR3包含内二硫键。图28显示了三个抗体库中在CDR3域内具有额外二硫键的比例(额外的Cys残基—即CDR3中的2个半胱氨酸氨基酸)。NBL504抗PD1库包含具有长CDR3结构域的高百分比抗体，它包含的CDR3内二硫键明显多于其他两个库，其中此类克隆比例约为2％。
CDRl和CDR2之间的额外二硫键：虽然频率低，但可以发现在CDRl和CDR2之间具有额外二硫键的抗体，即额外Cys氨基酸CDRl或CDR2。见图29和30。
CDR1-CDR3或FR2-CDR3之间的额外二硫键：在骆驼和单峰骆驼中，82％的VHH抗体在CDR1和CDR3之间具有二硫键，而在美洲驼和羊驼中，74％的VHH抗体在FR2-CDR3之间具有二硫键。70-80％的VHH抗体序列不含此外的二硫键。10-25％的VHH序列可能包含一个此外的二硫键(序列中有4个半胱氨酸)。5-10％的VHH抗体序列包含未配对的半胱氨酸。这些VHH抗体如何以及是否可以通过在未配对的半胱氨酸之间形成二硫键从而与另一VHH抗体配对尚不清楚。单VHH序列中观察到总共多达7个半胱氨酸。这些数据表明，剩余未配对的半胱氨酸可以形成多达3个结构域内的二硫键。图31显示了对三个不同库中所选VHH抗体的氨基酸序列中半胱氨酸残基数量的分析。
在CDR1和CDR3之间可以具有额外二硫键，但这很少见。见图32。
VHH抗体中的大多数额外二硫键位于FR2/CDR2-CDR3之间。与总半胱氨酸数计算一致，大多数其他二硫键位于FR2/CDR2(取决于IMGT或KABAT的命名)和CDR3之间。其他的配对半胱氨酸占NGS库中所有VHH序列的2-9％，见图33。
克隆的上清液OD值与其氨基酸序列中的半胱氨酸数目呈显著负相关(见图34)。因此，在挑选克隆时，建议避免VHH氨基酸序列中出现奇数个半胱氨酸。此外，优选避免挑选包含超过1对半胱氨酸序列的VHH序列。额外的二硫键可能会影响VHH的表达产量或对结合亲和力产生负面影响。因此，额外的二硫键会对纳米抗体下游制造的可开发性产生不利影响。
长CDR3：在PD1 NGS库(NBL504)中，多达86％的VHH克隆具有超过15个氨基酸的“长CDR3”结构域。见图35。
图36、图37和图38显示CDR3结构域的长度与抗体亲和力呈正相关，通过FACS检测VHH抗BCMA抗体与表达BCMA的两种细胞系(CHO.K1和RPMI8226)的表面结合，以及通过ELISA方法检测上清。所有相关性的p值均小于等于0.001。CDR3长度和抗体与其抗原的结合亲和力具有显著相关性。因此，在可能选择的克隆数量较多的情况下，优选CDR3结构域长度大于14个氨基酸的抗体。
还观察到具有相似长度的CDR3变体可能与单一抗原的相似表位结合。本发明发现结合某些抗原的几乎相同表位或相同表位的VHH抗体群体的CDR3长度范围很窄。见图39。
此外，结合相同表位的抗体可以通过谱系相关序列来鉴定。例如，CDR3长度差异为0或1个氨基酸的克隆。克隆1182、1202和1734选自抗PD1抗体的相同谱系，它们都与Keytruda竞争结合PD1(见图40)。可以看出，从具有相同CDR3长度的相关谱系中挑选的克隆都在相同框区域(bin)中。本发明公开的实验表明，具有相同长度CDR3结构域的谱系相关克隆更有可能与完全相同的表位结合。在根据NGS数据挑选克隆时，优选减少所选库中此类冗余克隆的数量。
具有与常规IgG相同的V和J种系的非经典VHH：无论是VHH抗体还是IgG1抗体，与常规IgG1具有相同幼稚B细胞来源(相同V和J分配)的VHH谱系组都能够识别相同或相似的表位。在507数据库中，81个序列中有2个由VHH2/VHH3/VH共享，约占克隆的2.5％。
具有独特序列特征的非经典VHH—被Arg118取代的保守Trp118和或在FR3中具有较低的疏水性特征：在NBL501、NBL504和NBL602库中的任意一个库均可以找到Trp 118，并且百分比高达3％。见图41。
总的来说，上述数据总结得到以下克隆选择规则:
1、如果免疫单个动物，选择VHH2和VHH3共享的VHH序列。如果调查VHVL，选择VH和VHH之间共享的序列。
2、收敛基序或序列特性：相同实验组的不同动物可以通过相同的VDJ分配收敛产生相同的基序或序列特征。由这些基序或序列特征编码的抗体互补位可以靶向功能表位。如果免疫多只动物，选择动物之间共享的收敛序列。
3、FR2亲水区：对于大多数VHH抗体，FR2对常规IgG具有独特的氨基酸取代：37Phe/Tyr、44Glu、45Arg和47Gly/Leu/Phe。
4、具有独特序列特征的非经典VHH：保守的Trp118被Arg118取代和或FR4中的疏水性较低。
5、经典VHH比非经典VHH具有更高的亲和力。在挑选克隆时，应该更倾向于挑选经典的VHH。非经典VHH不包含FR2特征。
6、避免选择序列中半胱氨酸数目为奇数的克隆：我们选择了一个带有3个半胱氨酸的克隆用于合成，发现它无法表达。一些具有3个半胱氨酸的筛选克隆表达水平低于平均水平。
7、在常规抗体中，发现CDR3中连续的正负电荷残基会导致折叠问题。在VHH中，我们挑选了一个在CDR3中具有3个精氨酸的克隆，该克隆未能表达。一些具有三个连续正电荷(赖氨酸或精氨酸或它们的混合)的筛选克隆表达水平低于平均水平。应避免在CDR3中选择具有3个或更多连续正电荷的克隆。
8、避免N端带正电荷的克隆。我们挑了两个此类克隆，都没有表达。筛选出的克隆几乎没有在N端带正电荷。
9、一些羊驼的VHH具有长CDR2(17aa而不是8/9)，长CDR2的克隆具有高结合亲和力。
10、对于某些项目，CDR3长度与结合亲和力呈正相关，优先选择长CDR3簇。
11、对于具有相似CDR3长度的相关簇，避免选择过多的冗余候选，因为我们发现相似长度的同源CDR3与相似表位的结合。
12、收敛基序或序列特征：相同实验组的不同动物可以通过相同的VDJ分配以收敛形式产生相同的基序或序列特征。由这些基序或序列特征编码的抗体互补位可以靶向功能表位。
13、新的经典结合环结构：位于关键位点的超突变热点决定经典环结构，使VHH结构库更加多样化。晶体学研究强调骆驼VHH的CDR1和CDR2环经常偏离常规VH的已知经典结构。基于序列的新Ag结合环构象预测应支持进一步对谱系进行分组(Laura S.Mitchell,Lucy J.Colwell,Comparative analysis of nanobody sequence and structure data,Proteins.2018；86:697-706)。
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Val Ala Asp Tyr Arg Val Trp Gly Thr Arg Ile Ala Gly Thr Lys Tyr
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 19
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1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gln Asn Gly Gly Ser Gln Gly Tyr Ala Glu Ala Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Asn Lys Val Val Ala
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Gly Asp Ala Ser Asp Arg Ser Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
100 105 110
Tyr Lys Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
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<400> 20
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Val Thr Trp Gly Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ile Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
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<213> 羊驼(alpaca)
<400> 21
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Val Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<213> 羊驼(alpaca)
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
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<213> 羊驼(alpaca)
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp His Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
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65 70 75 80
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<213> 羊驼(alpaca)
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<213> 羊驼(alpaca)
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Gly Phe Thr Glu His
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<213> 羊驼(alpaca)
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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<211> 123
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Asn Phe Ser Ser Tyr
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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 124
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
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<213> 羊驼(alpaca)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<211> 124
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<213> 羊驼(alpaca)
<400> 36
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20 25 30
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<213> 羊驼(alpaca)
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<213> 羊驼(alpaca)
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Thr Tyr
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<213> 羊驼(alpaca)
<400> 39
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<213> 羊驼(alpaca)
<400> 40
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<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 41
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<400> 42
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<211> 124
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<213> 羊驼(alpaca)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Thr Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Gly Ser Tyr
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<211> 125
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Asn Phe Ser Arg Tyr
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<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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<211> 127
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<213> 羊驼(alpaca)
<400> 46
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Val Ser Ser Tyr
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100 105 110
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<210> 47
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<213> 羊驼(alpaca)
<400> 47
Arg Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Pro Leu Asn Thr Ala
20 25 30
Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ile Thr Gly Asp Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Ile Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ile Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ala Pro Trp Asp Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 124
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Thr Ala Ile Asn Trp Ser Gly Ala Ile Lys Asn Tyr Gly Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Leu Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Gln Gly Asn Met Gly Asp Leu Val Val Lys Ser Gly Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 49
<211> 125
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Arg His
20 25 30
Val Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Asn Gly Arg Val Thr Asn Tyr Ala Leu Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asp Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Met Ala Phe Asp Ser Asp Ser Asn Phe Pro Ala Thr Tyr
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 50
<211> 125
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 50
Gln Val Gln Leu Thr Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Pro Asp Thr Pro Ser Thr Tyr
20 25 30
Thr Ile Ala Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val
35 40 45
Ala Asn Ile Ala Arg Ala Gly Thr Thr Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Tyr Ser Pro Gly Ser Ile Ile Ala Arg Asp Ser Thr Gln Tyr
100 105 110
Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Glu
115 120 125
<210> 51
<211> 124
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Ser Arg Arg Gly Thr Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Ser Asp Val Phe Glu Lys Asp Pro Gly Tyr Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 116
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Pro Val Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Gly Ile Tyr Ser Asp Gly Arg Thr Ser Asn Leu Val Ser Leu Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Leu Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ile Gly Ala Ala Ala Val Gly Gly Leu Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 128
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 53
Gln Val Ser Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg Arg Ser
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asp Pro Asp Ile Ala
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Leu Lys Thr Thr Tyr Ser Gly Gly Pro Tyr Asp Tyr Thr Lys Gly
100 105 110
Pro Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 120
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Leu Ser Gly Ser Lys Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Leu Lys Asp Gly Glu Pro Pro Ala Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 126
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 55
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Asp Ser Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Val Ser Ala Ser Gly Ala Ile Arg Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Ala Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Phe Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Val Ser Thr Ala Val His Pro Phe Lys Pro Thr Ser
100 105 110
Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Val
115 120 125
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<211> 120
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Val Thr Asp Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys Tyr
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Phe Ser Gly Thr Phe Gly Ile Tyr Gly
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Gly Val Ser Arg His Gly Leu Thr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Arg Ser Arg Leu Ser Ala Ser Leu Leu Val Thr Ala Ser Asp Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 122
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr Thr Phe Asp Arg Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Glu Arg His Val Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Trp Ser Gly Ala Asn Thr Tyr Val Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Leu Ala Val Pro Gly Ser Arg Trp Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 118
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Ser Phe Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gln Arg Glu Val Val
35 40 45
Ala Arg Ile Ala Gly Pro Gly Val Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Thr Arg Trp Ser Val Gly Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 121
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Arg Pro Pro Gly Lys Ala Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Leu Ile Arg Trp Ser Asn Gly Arg Thr Ala Val Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Cys Asp Gln Ala Leu Asp Pro Pro Arg Cys Asn Asp Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 61
<211> 122
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Phe Thr Tyr
20 25 30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Asn Gly Asp Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Val Ile Thr His Asp Tyr Thr Arg Pro Leu Phe Ala Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 122
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 62
Arg Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Phe Ser Ile Leu Ser Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly
85 90 95
Asp Gly Thr Ile Ala Ser Val Leu Thr Thr Ser Gly Val Asn Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NGS测序引物
<400> 63
gcagtggctg caggtgtcca ctcg 24
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NGS测序引物
<400> 64
gcaggtcccc aaggtgtcct gtcc 24
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NGS测序引物
<400> 65
ggtggtcctg gctgctct 18
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NGS测序引物
<400> 66
ttgtggtttt ggtgtcttgg g 21
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NGS测序引物
<400> 67
ggggtcttcg ctgtggtgcg c 21
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sanger测序引物
<400> 68
tgctggtctg ctgctcctcg c 21
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sanger测序引物
<400> 69
accgtctatc agggcgatgg 20
<210> 70
<211> 4
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 70
Ala Asp Tyr Lys
1
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 71
Ala Ala Ser Thr Met Val Val Thr Thr Val Ala Ala Asp Tyr Lys Tyr
1 5 10 15
<210> 72
<211> 22
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 72
Ala Ala Gly Leu Lys Ala Asp Tyr Gly Asp Ser Tyr Val Asp Thr Ser
1 5 10 15
Thr Arg Asn Tyr Asn Tyr
20
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 73
Ala Ala Asp Tyr Asn Arg Leu Gln Ile Gly Gln Arg Ser Arg Asp Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 74
Ala Gly Arg Pro Phe Gly Leu Gln Leu Asp Thr His Gln Ala Asp Tyr
1 5 10 15
Asn Ile
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 75
Gly Val Asp Arg Arg Gln Tyr Gly Leu Gly Ile Pro Pro Leu Ala Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 76
<211> 18
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 76
Val Ala Asp Tyr Arg Val Trp Gly Thr Arg Ile Ala Gly Thr Lys Tyr
1 5 10 15
Asp Ser
<210> 77
<211> 21
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 77
Ala Ala Asp Gly Asp Ala Ser Asp Arg Ser Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Tyr Glu Tyr
20
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 78
Ala Ala Asp Asn Val Gly Asp Ser Trp Tyr Ser Asp Asp Tyr Lys Tyr
1 5 10 15
<210> 79
<211> 19
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 79
Asn Ala Arg Pro Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr Ser Asp Tyr Lys Ser Gly
1 5 10 15
Val Asp Tyr
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 80
Asn Arg Gly Asn Tyr Tyr Arg Asp Tyr Lys Pro Glu Phe
1 5 10
<210> 81
<211> 18
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 81
Thr Thr Glu Val Ala Cys Tyr Ser Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ile
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 82
Asn Tyr Lys Arg Gly His Tyr Pro Asp Gly Val Ser Thr Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 83
Ser Tyr Lys Arg Gly Arg Tyr Pro Asp Gly Val Ser Thr Leu Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 84
Ala Asn Ser Thr Tyr Phe Asn Asp Asp Pro Glu Tyr Asp Arg
1 5 10
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 85
Asn Ala Gly Arg Leu Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn Asp Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 86
<211> 18
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 86
Asn Thr Asp Tyr Thr Phe Ala Lys Leu Thr Ala Pro Asp Arg Arg Asn
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 87
<211> 12
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 87
Asn Ala Asp Thr Ile Ala Thr Met Thr Asp Asp Tyr
1 5 10
<210> 88
<211> 18
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 88
Asn Ala Thr Arg Pro Arg Asp Asp Tyr Tyr Tyr Thr Gly Gly Phe Leu
1 5 10 15
Tyr Tyr
<210> 89
<211> 16
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 89
Arg Pro Tyr Ser Asp Tyr Val Thr Tyr Asp Pro Asp Asp Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 90
<211> 16
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 90
Asn Thr Asp Pro Asp Tyr Ser Asp Tyr Asp Asp Met Tyr Val Arg Ser
1 5 10 15
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 91
Ala Ala Thr Asn Ser Asn Thr Asp Trp Arg Thr Tyr Thr Glu Tyr Asn
1 5 10 15
Tyr
<210> 92
<211> 19
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 92
Ala Ala Lys Phe Thr Ser Ser Ser Phe Tyr Tyr Arg Ser Pro Arg Glu
1 5 10 15
Tyr Ser Ser
<210> 93
<211> 20
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 93
Ala Ala Lys Asn Val Pro Gly Phe Tyr Tyr Ser Asp Tyr Ala Asn His
1 5 10 15
Glu Tyr Asp Tyr
20
<210> 94
<211> 18
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 94
Asn Ala Pro Lys Gly Gly Ser Tyr Tyr Phe Pro Ala Val Gly Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 95
Arg Val Glu Ser Gln Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Asp Arg Asp Ser
1 5 10 15
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 96
Ala Thr Gly Tyr Trp Tyr Thr Pro Gly Asp
1 5 10
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 97
Asn Ala Lys Arg Tyr Trp Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 98
<211> 20
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 98
Ala Ala Asp Phe Asp Thr Tyr Arg Phe Cys Ser Gly Phe Gly Pro Asp
1 5 10 15
Ala Tyr Ser Ser
20
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 99
Ala Val Leu Val Asp Ser Thr Tyr Arg Phe
1 5 10
<210> 100
<211> 14
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 100
Asn Ala Asp Ile Ser Arg Tyr Arg Phe Ser Arg Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 101
Ala Ile Gly Ala Pro Asp Pro Phe Asn Tyr Ser Gly Trp Arg Arg Asn
1 5 10 15
Leu
<210> 102
<211> 16
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 102
Ala Ile Gly Ile Ser Pro His Tyr Gly Ser Asp Trp Tyr Ala Leu Arg
1 5 10 15
<210> 103
<211> 13
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 103
Ala Ile Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Arg Asp Pro Asn Leu
1 5 10
<210> 104
<211> 13
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 104
Ala Ile Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Ser Asp Pro Asn Leu
1 5 10
<210> 105
<211> 13
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 105
Ala Leu Gly Ala Met Arg Glu Gly Val Tyr Ser Asp Leu
1 5 10
<210> 106
<211> 13
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 106
Ala Val Gly Ala Pro Leu Val Ser Ser Pro Tyr Arg Ser
1 5 10
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 107
Ala Val Gly Ala Trp Tyr Glu Lys Arg Lys Lys Glu Lys Gly Leu
1 5 10 15
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 108
Ala Val Gly Ile Val Val Pro Tyr Ser Glu Asp Ala Trp Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Leu
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 109
Gly Ile Gly Arg Trp Tyr Asp Gln Arg Lys Lys Glu Glu Gly Leu
1 5 10 15
<210> 110
<211> 16
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 110
Asn Ala Ala Pro Trp Gly Ser Tyr His Pro Gln Thr Asp Ile Val Ser
1 5 10 15
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 111
Asn Ala Ala Pro Trp Gly Ser Tyr Ser Pro Gly Pro Gly Asp Ile Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 112
<211> 14
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 112
Asn Gly Ala Pro Trp Gly Asp His Ala Pro Val Val Gly Ser
1 5 10
<210> 113
<211> 14
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 113
Asn Gly Ala Pro Trp Gly Asp Ile Ala Pro Val Ala Val Ser
1 5 10
<210> 114
<211> 15
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 114
Asn Pro Ala Pro Trp Gly Asp Tyr Thr Ala Thr Asp Phe His Ser
1 5 10 15
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 115
Gln Leu Gly Ile His Pro Gly Ala Phe
1 5
<210> 116
<211> 13
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 116
Gln Val Gly Arg Tyr Val Ser Gly Val Asp Tyr Gln Pro
1 5 10
<210> 117
<211> 13
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 117
Gln Val Gly Arg Tyr Val Ser Gly Val Tyr Tyr Gln Pro
1 5 10
<210> 118
<211> 14
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 118
Val Ile Gly Arg Gly Gly Tyr Ala Met Gly Asp Arg Arg Leu
1 5 10
<210> 119
<211> 14
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 119
Val Ile Gly Arg Arg Gly Tyr Ala Met Gly Asp Arg Thr Leu
1 5 10
<210> 120
<211> 14
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 120
Val Val Gly Arg Arg Gly Tyr Ala Met Gly Ser Arg Gln Leu
1 5 10
<210> 121
<211> 127
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 121
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Asn Asn Gly Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Tyr Ile Trp Cys Thr Val Ala Ala Gly Ile Gly Ser Leu Gly
100 105 110
Asp Leu Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 122
<211> 131
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 122
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Arg Gly Gly Asp Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asp Leu Arg Val Pro Val Glu Glu Met Cys Val Met
100 105 110
Ala Asp Asn Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Pro Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 123
<211> 119
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 123
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Arg Ser Ile Ser Ser Met Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Met Val
35 40 45
Ala Val Met Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Lys
85 90 95
Gly Glu Asp Trp Thr Thr Pro Val Arg Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 124
<211> 130
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 124
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Gly Ser Trp Asn Phe Asp Ala Met Arg Pro Cys Ser Ile
100 105 110
Gln Glu Ala Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 125
<211> 119
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 125
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Leu Ser Gly Leu Gly Phe Ser Pro Asn
20 25 30
His Met Cys Trp Tyr Arg Gln Ser Pro Gly Lys Leu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ala Cys Ile Thr Ser Gly Gly Ser Pro Asn Tyr Ser Asp Thr Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Arg Thr Thr Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Leu Lys
85 90 95
Ala Glu Asp Trp Thr Thr Thr Pro Arg Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 126
<211> 116
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Arg Ile Ala
20 25 30
Val Gly Trp Tyr Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
35 40 45
Arg Val Ser Ser Gly Gly Ile Leu Trp Tyr Asp Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Ile Ile Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Arg Gly
85 90 95
Ser Asp Ser Asp Arg Phe Leu Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 127
<211> 127
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 127
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Val Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Phe Thr Ser Ala Asp Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Thr Lys Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Glu Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ser Val Arg Val Tyr Arg Cys Thr Gly Arg Lys Cys Cys Asp Pro Leu
100 105 110
Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 128
<211> 115
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 128
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ile Ser Gly Phe Thr Phe Asp Arg Phe
20 25 30
Pro Met Thr Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Met Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Arg Val Ser Thr Thr Gly Leu Thr Glu Tyr Phe Ala Asn Ala Leu
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Val Val Pro Pro Leu Arg Gln Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 129
<211> 131
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 129
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Val His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ala Ile Ile Asp Asp Thr Tyr Tyr Gly Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Ala Asn Ala Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Arg Thr Asp Ile Ala Phe Trp Leu Gln Val Gly Gly Asp Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Arg His Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 130
<211> 119
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 130
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Gly Ile Phe Thr Phe Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Val Val
35 40 45
Val His Phe Thr Ser Gly Asp Ser Glu Phe Trp Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Arg Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Tyr Met Asn Asn Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ala Glu Asp Trp Thr Thr Ser Pro Arg Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 131
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗（Cetuximab）
<400> 131
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Leu Leu
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser
145 150 155 160
Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser
180 185 190
Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
245
<210> 132
<211> 119
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 132
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Tyr Pro Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Ile Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys Gln
85 90 95
Val Gly Arg Tyr Val Ser Gly Val Tyr Tyr Gln Pro Arg Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 133
<211> 120
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Cys Val
35 40 45
Ser Asp Ile Tyr Pro Asp Gly Thr Ser Ser Tyr Ala Asp Ser Met Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Arg Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Val Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Ile Gly Arg Gly Gly Tyr Ala Met Gly Asp Arg Arg Leu Arg Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 134
<211> 120
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 134
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Thr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Ala Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys Asn
85 90 95
Gly Ala Pro Trp Gly Asp Ile Ala Pro Val Ala Val Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 135
<211> 119
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 135
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Met Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Leu Gly Ala Met Arg Glu Gly Val Tyr Ser Asp Leu Leu Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 136
<211> 120
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 136
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Gly Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asp Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Asn
85 90 95
Gly Ala Pro Trp Gly Asp His Ala Pro Leu Val Ala Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 137
<211> 117
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 137
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Ala Val Ser Glu Arg Ile Ala Ser Phe Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gln Arg Glu Val Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Val Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ala Lys Asp Asn Asp Lys Asn Thr Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Ala
85 90 95
Val Ile Val Gly Thr Tyr Asp Thr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 138
<211> 117
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 138
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Leu Ser Phe Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gln Arg Glu Val Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Val Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Phe Lys Asp Asn Gly Lys Asn Thr Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Ala
85 90 95
Val Thr Val Gly Asp Val Asp Thr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 139
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OPDIVO
<400> 139
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile
180 185 190
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys
<210> 140
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KEYTRUDA
<400> 140
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
130 135 140
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met
145 150 155 160
Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly
165 170 175
Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn
180 185 190
Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 141
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 141
Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp
1 5 10 15
Lys Leu Ala Ala
20
<210> 142
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 142
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg
<210> 143
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 143
Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp
1 5 10 15
Lys Leu Ala Ala Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg
35
<210> 144
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 144
Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Lys Asn Ile Ile
1 5 10 15
Gln Phe Val His Gly Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr
20 25 30
<210> 145
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1:PDL1筛选肽1
<400> 145
Ala Asp Tyr Lys
1
<210> 146
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1:PDL1筛选肽2
<400> 146
Asp Tyr Lys Arg
1
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 154
Lys Ala Val Ile Val Gly Thr Tyr Asp Thr Glu Tyr
1 5 10
<210> 155
<211> 12
<212> PRT
<213> 羊驼(alpaca)
<400> 155
Lys Ala Val Thr Val Gly Asp Val Asp Thr Glu Tyr
1 5 10

Claims (24)

1.一种产生对抗原特异的骆驼抗体的方法，包括：
a)从对抗原特异的免疫骆驼科动物中富集和增殖B细胞；
b)生成抗体NGS库，其中包含来自抗原特异性B细胞的VHH2、VHH3和VH1链序列；
c)按谱系对NGS库中VHH2、VHH3和VH1链的抗体序列分组；
d)通过一个或多个谱系优先因素对来自步骤c)的谱系排序；
e)从NGS库中根据步骤d)的排名靠前的含VHH2或VHH3的谱系中选择代表性序列；和
f)测试包含步骤e)中所选序列的抗体以确定该抗体是否与抗原或其部分结合。
2.如权利要求1所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，在来自谱系的CDR3组中特定CDR3的最小CDR3距离小于或等于1，其中，特定CDR3的最小CDR3距离是此类CDR3相较其他相同长度的CDR3的最小汉明距离。
3.如权利要求1或2所述的产生骆驼抗体的方法，所述方法还包括以VHH独特特征细分谱系，所述VHH独特特征选自下组：
i)FR2亲水区，
ii)延长的CDR1，
iii)CDR1-CDR3或FR2-CDR3之间的额外二硫键，
iv)CDR3内的额外二硫键，
v)长CDR3(≥15aa)，
vi)CDR1内的额外二硫键，
vii)具有与常规IgG1相同的V和J种系的非经典VHH，
viii)具有预定序列特征的非经典VHH，
ix)新的经典结合环结构，以及
x)收敛基序或序列特征。
4.如权利要求1-3任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其中谱系优先因素选自下组：序列丰度从高到低的谱系、扩增系数从高到低的谱系、免疫过程谱系序列丰度变化、在耗尽某些不需要的B细胞之前和之后谱系序列丰度变化、在VHH和VH1之间共享相同幼稚B细胞来源的谱系、避免可开发性不佳序列，和它们的组合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，在e)中选择VHH2和VHH3的前100个谱系。
6.如权利要求1-5任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，f)中的抗体由原核或真核细胞表达。
7.如权利要求1-6中任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，所述方法还包括监测骆驼抗体IgG2(HcAb)、IgG3(HcAb)和IgG1(常规IgG)的免疫反应。
8.如权利要求1-7中任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，还包括重复e)-f)步骤以优化所选VHH2或VHH3仅重链抗体的相同谱系组内的序列。
9.一种产生对抗原特异的骆驼抗体的方法，包括：
a)从对抗原特异的免疫骆驼科动物中富集和增殖B细胞，
b)产生抗体NGS库，其中包含来自所述抗原特异性B细胞的VHH2、VHH3、VH1和VL1链序列，
c)按谱系对NGS库中VHH2、VHH3、VH1和VL1的序列分组，
d)根据通过单B细胞分选和异源杂交瘤方法产生的锚定结合物将VH1/VL1谱系配对，
e)通过一个或多个谱系优先因素对步骤c)和步骤d)中的谱系和谱系对排序，
f)分别从NGS库中根据步骤e)的排名靠前的VHH2或VHH3谱系和VH1/VL1谱系对中选择代表性序列或序列对，
g)测试包含来自步骤f)的所选序列对或序列的抗体，以确定该抗体是否与抗原或其部分结合。
10.如权利要求9所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，IgG1库的锚通过单B细胞分选和异源杂交瘤方法产生。
11.如权利要求9或权利要求10所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，步骤e)中的谱系对的排序基于所述谱系对的VH1谱系的谱系优先因素。
12.如权利要求10所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，从100个排名靠前的谱系或谱系对组中选择一个VHH代表性序列或一个VH1/VL1代表性对作为锚。
13.如权利要求12所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，所述100个谱系或谱系对组包括70个VHH谱系组和30个VH1/Vκ或VH1/Vλ谱系组对。
14.如权利要求10-13中任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，所述谱系优先因素选自下组：序列丰度从高到低的谱系、扩增系数从高到低的谱系、免疫过程中谱系序列丰度变化、在耗尽某些不需要的B细胞之前和之后谱系序列丰度变化，在VHH和VH1之间共享相同的幼稚B细胞来源的谱系、避免可开发性不佳序列，和它们的组合。
15.如权利要求9-14中任一项所述的产生骆驼抗体的方法，所述方法还包括重复f)-g)，其中VHH克隆具有选自下组的特征：
i)FR2亲水区，
ii)延长的CDR1，
iii)CDR1-CDR3或FR2-CDR3之间的额外二硫键，
iv)CDR3内的额外二硫键，
v)长CDR3(≥15aa)，
vi)CDR1内的额外二硫键，
vii)具有与常规IgG相同的V和J种系的非经典VHH，
viii)具有预定序列特征的非经典VHH，
ix)新的经典结合环结构，以及
x)收敛基序或序列特征。
16.一种产生对抗原特异的人源化VHH2或VHH3抗体的方法，包括
a)从对抗原特异的免疫骆驼科中富集和增殖B细胞，
b)生成抗体NGS库，其中包含来自抗原特异性B细胞的VHH2、VHH3、VH1链序列，
c)按谱系对NGS库中VHH2、VHH3、VH1的序列分组，
d)通过将其氨基酸序列与多种相关抗体的氨基酸序列进行比较，鉴定共享相同幼稚B细胞来源的亲本VHH2、VHH3抗体或VH1中的可取代位置，其中相关抗体各自与相同谱系中的亲本抗体结合相同的表位，
e)将亲本VHH2、VHH3抗体的一个或多个可取代位置的氨基酸取代为人抗体中相应位置的氨基酸，
f)测试在所选序列内包含取代残基的抗体以确定该抗体是否与抗原或其部分结合。
17.如权利要求16所述的产生人源化VHH抗体的方法，其特征在于，所述可取代位置在CDR区。
18.如权利要求16所述的产生人源化VHH抗体的方法，其特征在于，所述可取代位置在FR区。
19.如权利要求1-18中任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，所述抗原为复合免疫原，所述方法进一步包括：使用在步骤(f)中确定的抗体与所述复合免疫原结合，通过蛋白质阵列、细胞/组织抗原cDNA库或基于质谱的免疫沉淀来鉴定所述复合免疫原中所包含的单独抗原。
20.如权利要求9-19中任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，所述方法还包括应用所选的VHH序列来指导对共享相同幼稚B细胞来源的克隆进行VH1-VL1对的选择，其中所述选择的标准包括以下一个或多个：1)VHH和VH1之间的相同CDR3序列；2)CDR1和CDR2的差异；和3)FR1、FR2、FR3和FR4的差异。
21.如权利要求1-8中任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，所述方法还包括重复e)-f)步骤以产生抗体。
22.如权利要求9-15任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，所述方法还包括重复f)-g)步骤以产生骆驼抗体。
23.如权利要求1-28中任一项所述的产生骆驼抗体的方法，其特征在于，所测抗体的表达细胞包括真核细胞。
24.由权利要求1-29中任一项所述的方法产生的分离的骆驼抗体或抗原结合部分。
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