CN115947854B

CN115947854B - 抗人cd40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN115947854B
Application number: CN202211730821.1A
Authority: CN
Inventors: 娄阳; 黄海斌; 程昊; 陈嘉琛; 彭晓旺; 岳涵
Original assignee: Yourui Seth Wuhan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yourui Seth Wuhan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: CN115947854A

Abstract

本申请公开了抗人CD40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用。以商品化的人CD40蛋白作为免疫原，基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，制备该抗人CD40蛋白兔单克隆抗体，经检测，与人CD40蛋白具有较强的亲和力，达到7.2×10^‑10M。本申请中所提供的抗人CD40蛋白的兔单克隆抗体，可以用于开发检测人CD40蛋白的流式抗体及相关试剂盒。本申请所提供的抗人CD40蛋白的兔单克隆抗体，可以作为人CD40蛋白激动剂激活B细胞使用，该抗体激活的B细胞CD86和MHC‑Ⅱ的表达水平，是CD40L激活的B细胞的3～9倍。

Description

抗人CD40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及抗人CD40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用。

背景技术

人CD40蛋白是一种I型跨膜糖蛋白，由N端信号肽(20aa)、胞膜外区(193aa)、跨膜区(22aa)和胞浆区(62aa)组成。CD40蛋白广泛表达于免疫细胞表面，包括B细胞、T细胞，单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，是细胞表面重要的功能蛋白，参与多种免疫细胞的激活。同时也表达于部分非免疫细胞的表面如上皮细胞。另外，CD40还表达于白血病B细胞上，且在某些癌症细胞，比如上皮癌细胞表面也有表达。

人CD40蛋白的配体CD40L(也称CD154)，CD40L主要表达于活化的CD4+T淋巴细胞表面，提供B淋巴细胞活化所必需的协同刺激信号。受体细胞被激活后，表达在细胞表面的CD40L随后会被切下来流入血液，产生一个仍具有生物活性、可溶性的、三聚态的片段，又称为可溶性CD40L。

CD40-CD40L共刺激途径对于胸腺依赖的体液免疫十分重要，B细胞的激活，分化以及免疫记忆都离不开该共刺激途径。同时对激活抗原提呈细胞(APC)也非常重要，是T细胞激活的关键。

其他表达CD40蛋白的免疫细胞被激活后，会分泌多种的细胞因子，发挥不同的免疫功能。比如，巨噬细胞会分泌TNF-α，树突状细胞和巨噬细胞会分泌白细胞介素12，这些细胞因子对与T细胞和NK细胞介导的抗肿瘤免疫作用十分重要。

正是因为CD40蛋白在免疫系统中发挥的重要作用，使得CD40蛋白成为免疫细胞共刺激分子中最有潜力的靶点之一。国内外制药企业都有布局CD40激动剂抗体的开发，目前进入临床二期7个，临床一期6个，主要适应症为黑色素瘤、非小细胞肺癌、胰腺癌等，用药方式有单独用药，也有和其他治疗方式联合用药。

现有技术中的CD40激动剂抗体大多源于鼠单克隆抗体，亲和力相对较弱。因此，本领域亟需开发一种新的高亲和力、高激活活性的单克隆抗体，给基于CD40靶点的治疗性抗体提供新的选择。

发明内容

本申请提供一种抗人CD40蛋白的高亲和力兔单克隆抗体，以在一定程度上解决上述技术问题之一。该兔单克隆抗体能够识别人CD40蛋白，该抗体和重组表达的人CD40蛋白结合的亲和常数为7.2×10^-10M。该抗体能够和人B细胞表面表达的CD40蛋白结合，并且激活B细胞，相同实验条件下，激活效果优于CD40L。所述的抗人CD40蛋白兔单克隆抗体的免疫原为商品化的人CD40蛋白；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。所述单克隆抗体能够可特异性结合人CD40蛋白，因此，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人CD40蛋白的试剂盒，以达到人CD40蛋白检测或相关疾病诊断的临床应用价值，为实现此目的，本申请提供了如下技术方案：

第一方面，本申请提供了一种抗体，其特异性结合人CD40蛋白，所述抗体包含根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VL CDR3，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；

和/或

包含根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VH CDR2，其由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VH CDR3，其由SEQ IDNO:10所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；优选地，所述置换为保守性置换。

第二方面，本申请提供了一种抗体，其特异性结合人CD40蛋白，所述抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)；所述轻链可变区(VL)由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成；所述重链可变区(VH)由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成。

第三方面，本申请提供了一种抗体，其包含轻链和重链，所述轻链由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成；所述重链由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成。

第四方面，本申请提供了一种缀合物，其包含第一至第三方面任一项所述的抗体，及与所述抗体连接的可检测的标记。

第五方面，本申请提供了一种试剂盒，用于检测人CD40蛋白，所述试剂盒包括第一至三方面任一项所述的抗体或第四方面所述的缀合物。

第六方面，本申请公开了一种人CD40蛋白激动剂，所述蛋白激动剂包括第一至第三方面任一方项所述抗体，所述蛋白激动剂可激活B细胞表达共刺激信号分子(CD86)和抗原呈递分子(MHC-Ⅱ)。

第七方面，本申请公开了第一至第三方面任一项所述抗体或第五方面所述试剂盒在检测人CD40蛋白的应用。

与现有技术相比，本申请的优点及积极效果至少如下：

本申请采用商品化的人CD40蛋白作为免疫原，基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，制备抗人CD40蛋白兔单克隆抗体，经检测，与人CD40蛋白具有较强的亲和力，达到7.2×10^-10M。

本申请中所提供的抗人CD40蛋白的兔单克隆抗体，可以用于开发检测人CD40蛋白的流式抗体及相关试剂盒。

本申请所提供的抗人CD40蛋白的兔单克隆抗体，可以作为人CD40蛋白激动剂激活B细胞使用，该抗体激活的B细胞CD86和MHC-Ⅱ的表达水平，是CD40L激活的B细胞的3～9倍。

附图说明

图1为本申请实施例提供的人CD40蛋白兔单克隆抗体的亲和力测定结果。

图2为本申请实施例提供的人CD40蛋白兔单克隆抗体和人CD40蛋白的ELISA结合曲线。

图3为本申请实施例提供的人CD40蛋白兔单克隆抗体和daudi细胞(人B淋巴母细胞系)的流式结合峰图。

图4为本申请实施例提供的经过人CD40蛋白兔单克隆抗体激活后，人B细胞表面CD86和MHC-Ⅱ的表达图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

术语解释

在本申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，可以保留该抗体与人CD40蛋白特异性结合的能力。

在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术制得。

在本申请中，术语“兔抗体”或“抗人CD40蛋白单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在其中一个实施例中，抗人CD40蛋白兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR和骨架区(FR)。在其中一个实施例中，抗人CD40蛋白的兔抗体或兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR。

在本申请中，术语“抗体”是指，由四条异源性多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。

重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region，HVR)或互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。VH和VL的3个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。

重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。

在本申请中，术语“构架区”或“骨架区”的残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

在本申请中，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本申请中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。

在本申请中，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

在本申请中，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，那么各分子在该位置上是同一的。例如，如果两个序列的10个位置中有8个匹配，那么这两个序列具有80％的同一性。

在本申请中，术语“保守性置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。

在本申请中，术语“激动剂”为一类结合人CD40蛋白并激活免疫系统作用的化合物，其激活作用主要体现在免疫反应的早期阶段。本申请所述的人CD40蛋白，由于其抗原呈递过程中起着关键作用，在免疫反应时，最先起作用。本申请所提供的免单克隆抗体，作为一种人CD40蛋白的“激动剂”，特异性结合人CD40蛋白，激活B细胞中MHC-II和CD86等共刺激分子的表达，并诱导B细胞中的Ig类别转换。活化的B细胞迁移到淋巴器官，在那里向T细胞呈递抗原，CD40激活的DC和B细胞通过释放免疫刺激性细胞因子和趋化因子如IL-6、IL-12p70、IFNγ、CXCL10和TNF-α等来支持免疫应答。

抗体

本申请实施例中公开的一种抗体，其特异性结合人CD40蛋白，所述抗体包含根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VL CDR3，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；

和/或

在某些实施例中，所述抗体的轻链可变区(VL)由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成；所述抗体的重链可变区(VH)由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成。

在某些实施例中，所述抗体的轻链由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成；所述重链由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成。

在某些实施例中，该抗人CD40蛋白的抗体可以具有Y型分子结构。在其中一个实施例中，抗人CD40蛋白的抗体可以包括一对重链和一对轻链。重链可以包括一个重链可变区和一个或多个重链恒定区。哺乳动物的抗体一般包括五种类型的重链：γ、δ、α、μ和ε，相对应组成的抗体就称为IgG，IgD，IgA，IgM和IgE五种抗体。轻链可以是一个相对于重链更小的一个多肽亚基。轻链可以包括一个轻链可变区和一个轻链恒定区。VL通常是轻链的N端部分，在氨基酸序列上表现出更高的变异性。不同抗体之间的VL具有特异的氨基酸序列。在其中一个实施例中，重链可变区VH和轻链可变区VL可均用于识别和结合人CD40蛋白。在其中一个实施例中，抗体的轻链恒定区为κ链，抗体的重链恒定区为IgG1型。

兔源单克隆抗体的制备

本申请公开了上述抗体的制备方法，本申请的单克隆抗体可以采用本领域已知的各种方法来制备，如通过基因工程重组技术来获得；通过化学合成或PCR扩增获得编码本申请抗体的重链和轻链基因的DNA分子，将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，并在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本申请的抗体。

本发明用来制备人CD40兔单克隆抗体的免疫原来自外购的商品化人CD40蛋白(义翘神州Cat:10774-H02H)；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。在一些实施例中，所述制备方法包括：以人CD40蛋白作为免疫原，免疫新西兰大白兔；从大白免的脾脏细胞中分选B淋巴细胞并进行培养；提取B淋巴细胞中的RNA，反转录成cDNA；cDNA经PCR扩增获得天然配对的的兔单克隆抗体；将然配对的的兔单克隆抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因分别装载至表达载体上，并将载体转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从宿主细胞的培养液分离，纯化获得所述的单克隆抗体。

具体来说，一个该兔源单克隆抗体的制备实施过程包括：

1、动物免疫

以商品化的人CD40蛋白为免疫原，免疫新西兰大白兔，每只大白兔免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取150μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对人CD40蛋白的滴度，并将最后一次免疫后血清纯化成抗体，WB、IF和IHC检测内源样本，取血清滴度高且内源检测最好的兔子，用200μg免疫原皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。

2、分离脾脏细胞。

3、B淋巴细胞分选

参见专利“201910125091.4从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法”。

4、编码兔单克隆抗体基因的克隆

培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列。

5、单克隆抗体的生产和纯化

为了获得多株识别人CD40蛋白的兔单克隆抗体，本发明将兔单克隆抗体重链、轻链基因分别装载在表达载体上，将质粒转染293F细胞；转染72～96小时获得培养上清中含有重组的识别人CD40蛋白的抗体。使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人CD40蛋白的兔单克隆抗体，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。

6、结果

本实施例筛选得到了一种能识别人CD40蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体的轻链由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成，重链由SEQ IDNO:2所示氨基酸序列组成；该单克隆抗体的轻链可变区(VL)由SEQ IDNO:3所示氨基酸序列组成；重链可变区(VH)由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成；轻链可变区(VL)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成；以及VL CDR3，其由SEQ IDNO:7所示氨基酸序列组成；重链可变区(VH)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成；VH CDR2，其由SEQ IDNO:9所示氨基酸序列组成；以及VH CDR3，其由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列组成。

兔单克隆抗体与人CD40蛋白亲和力检测

利用GE公司的Biacore 3000生物分子相互作用分析仪对本申请所述的抗人CD40蛋白兔单克隆抗体的亲和力进行精确测定；其中使用所选定抗体的浓度为37nM，并将其固定在CM5芯片上；然后用37.5nM、75nM和150nM三个浓度的重组人CD40蛋白去结合，获得亲和力曲线；最终通过曲线拟合和计算，亲和力曲线如图1所示，拟合结果如表1所述。获得的抗人CD40蛋白的兔单克隆抗体的亲和力为7.2X 10^-10M。

表1

注：K_off(dissociation rate constant)表示分子之间的解离速率常数，代表分子间解离时的快慢；K_on(association rate constant)为分子间的结合速率常数，代表分子间结合时的快慢

兔单克隆抗体的应用

1、本申请所提供兔单克隆抗体用于ELISA结合活性检测

检测方法如下：

使用碳酸盐缓冲液(pH9.4,0.05M)将抗人CD40蛋白的兔单克隆抗体和CD40L蛋白进行包被，4度孵育过夜；洗涤液洗板；用含有5％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH7.2,0.05M)进行封闭；将生物素化的重组人CD40蛋白，0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液梯度稀释后，加入到酶标板中，常温条件孵育1小时，然后用洗涤液洗板；加入用含1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释的亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)，常温条件孵育1小时，然后用洗涤液洗板；加入TMB显色液，常温显色10分钟，加草酸终止显色，然后分别与450nm和630nm下测定吸光值，OD450减去OD630为校正后的吸光值；以人CD40蛋白浓度的对数值(Log10)为横坐标，吸光值的校正值(OD450)为纵坐标作图。

检测结果：如图2所示，抗CD40的兔单克隆抗体和CD40蛋白的结合活性比CD40L基本相同。

2、兔单克隆抗体与阳性细胞结合检测

本申请实施例中，采用抗体的流式结合活性检测法进行检测，具体检测方法如下：

取1.5×10⁶个daudi细胞，均分成3份，用PBS+0.1％BSA的缓冲液清洗一遍；分别加入100μl PBS+0.1％BSA，100μl Isotype mAb(10μg/ml)，anti-CD40 mAb(10μg/ml)，4℃孵育30分钟；400g，离心3分钟，弃上清，分别用100μl PBS+0.1％BSA，100μl G&R_IgG_FITC(1:500稀释)，100μl G&R_IgG_FITC(1:500稀释)重悬细胞，4℃孵育30分钟；400g，离心3分钟，弃上清，用100μl PBS+0.1％BSA缓冲液清洗两遍；使用安捷伦NovoCyte Advanteon分析型流式细胞仪检测细胞表面的荧光信号；用Novoexpress软件作图。

结果如图3所示，抗人CD40蛋白的兔单克隆抗体和阳性细胞的流式结合信号有2个log的跃迁。

3、兔单克隆抗体作为人CD40蛋白激动剂的应用

本申请实施例中，采用抗体的流式结合活性检测法对本申请提供的兔单克隆抗体对B细胞激活活性进行检测，具体检测方法如下：

解冻人外周血单核细胞(PBMCs)并培养4小时；用Stemcell Pan-B细胞试剂盒纯化B细胞；将纯化的B细胞以2.5×10⁶个细胞/孔装入96孔平底板中(在0.2ml B细胞培养基中加入50μg/ml polymyxin B)；将兔抗人CD40单克隆抗体或对照组兔抗mAb与山羊抗兔Fc在RT下交联30分钟；将交联的兔抗人CD40单克隆抗体或对照抗体，或CD40L(Kactus，5μg/ml或者1μg/ml)加入人Pan-B细胞，培养18小时；收集Pan-B细胞，用Zombie NIR(1:1500)鉴别活/死细胞；用抗人CD19、CD86和MHC-II抗体对Pan-B细胞进行染色并固定；使用安捷伦NovoCyte Advanteon分析型流式细胞仪检测细胞表面的荧光信号；用Novoexpress软件作图。

图4为流式细胞仪检测出的细胞表面的荧光信号图，具体的检测结果如表2所示，抗人CD40蛋白兔单克隆抗体对B细胞的激活效果为CD40L的3～9倍。

表2

实验分组	CD86+/MHC-Ⅱ+比例
		Blank	0.44％
无关对照抗体(5μg/ml)	0.58％
		抗人CD40单克隆抗体(5μg/ml)	5.18％
抗人CD40单克隆抗体(1μg/ml)	5.34％
		CD40L(5μg/ml)	1.37％
CD40L(1μg/ml)	0.62％

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种抗体，其特异性结合人CD40蛋白，所述抗体包含根据Kabat编号系统定义的轻链可变区（VL），所述轻链可变区（VL）具有三个互补决定区（CDRs），分别为：VL CDR1，其由SEQID NO:5所示氨基酸序列组成；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成；以及VLCDR3，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成；

和

包含根据Kabat编号系统定义的重链可变区（VH），所述重链可变区（VH）具有三个互补决定区（CDRs），分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成；VH CDR2，其由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列组成；以及VH CDR3，其由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列组成。

2.一种抗体，其特异性结合人CD40蛋白，所述抗体包含轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）；所述轻链可变区（VL）由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成；所述重链可变区（VH）由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成。

3.一种抗体，其包含轻链和重链，所述轻链由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成；所述重链由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成。

4.一种缀合物，其包含权利要求1~3任一项所述的抗体，及与所述抗体连接的可检测的标记。

5.一种试剂盒，用于检测人CD40蛋白，所述试剂盒包括权利要求1~3任一项所述的抗体或权利要求4所述的缀合物。

6.一种人CD40蛋白激动剂，所述蛋白激动剂包括权利要求1~3任一项所述抗体，所述蛋白激动剂可激活B细胞表达CD86和MHC-Ⅱ。

7.权利要求1~3任一项所述抗体或权利要求5所述试剂盒在检测人CD40蛋白的应用，所述检测用于非疾病的诊断及治疗。