CN114112567A - 一种结核感染t细胞斑点试验样本的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，涉及医学检测技术领域，包括以下步骤：采集样本；外周血单个核细胞的分离和提取；外周血单个核细胞的计数；制得最终的试验样本。本发明可被用来结核感染T细胞斑点试验样本制备过程中完成对外周血单个核细胞的提取和计数。在提取和计数过程中能够减少对人员经验、精力、体力的要求，简单、准确地提取和计数结核感染T细胞斑点试验过程中外周血单个核细胞；所述恒速细胞提取装置，采用防呆设计的理念，使人员手持装置插入外周血单个核细胞层上方，即可通过溶液浓度发射的光信号控制对细胞提取的速度，进而准确地提取结核感染T细胞斑点试验过程中外周血单个核细胞层。

Description

一种结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体是一种结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。结核感染T细胞斑点试验是一种新型免疫检测技术，其原理是结核病患者体内存在特异的效应T细胞，效应T细胞再次受到结核特异性抗原早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和培养滤过蛋白(CFP-10)刺激时会产生γ干扰素(IFN-γ)，通过体外检测IFN-γ诊断结核病及潜伏结核感染，有助于潜伏结核感染的早期筛查，检测结果特异性达到100%。结核感染T细胞斑点试验过程中样本制备的准确度直接决定了试验结果的准确性，但目前在样本制备过程中，对外周血单个核细胞提取时采用手工吸取细胞层的方式，对人员操作经验要求较高，采用仪器计数细胞的成本过高，采用手工计数时，因红细胞的混入或计数人员的水平不足，导致无法准确地提取和计数外周血单个核细胞的数量，直接影响了检测结果的准确性。

目前对外周血单个核细胞提取时采用手工吸取细胞层的方式，因人员操作经验不足或操作吸液管力度控制不好，导致提取的细胞数量不足或混入过多的非目标细胞；采用仪器计数，涉及仪器设备和试剂耗材的成本较高；采用手工计数时，因在细胞提取过程中无法避免红细胞的混入，以及人员肉眼判别细胞形态的水平不足，导致结核感染T细胞斑点试验在样本制备时，无法准确地提取和计数外周血单个核细胞的数量，直接影响了检测结果的准确性。为此本领域技术人员提出了一种结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，以解决上述背景中提出的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，包括以下步骤：

第一步，采集肝素抗凝的静脉全血

样本采集的标本为肝素抗凝的静脉全血，采集完成后室温保存不应超过4个小时，不可冷藏、冷冻和低温保存；

第二步，外周血单个核细胞的分离和提取

选用离心装置和恒速细胞提取装置对所述外周血单个核细胞进行分离和提取；

第三步，外周血单个核细胞的计数

采用血细胞计数板完成对单个核细胞的计数；

第四步，制得最终的试验样本

根据上述第三步所计数的细胞数量，加入AIM细胞培养液，最终配制每100ul含有25万个细胞的标准溶液500ul。

作为本发明进一步的方案：所述样本采集过程中的所需采集的样本量与采集对象的年龄相关，采集对象的年龄≥10岁，采集其肝素抗凝的静脉全血8ml；采集对象的年龄小于10岁，采集其肝素抗凝的静脉全血2-8ml。

作为本发明再进一步的方案：所述样本采集完成后应4小时内进行外周血单个核细胞的分离。

作为本发明再进一步的方案：所述外周血单个核细胞的分离和提取包括以下步骤：

若4小时内未进行分离，则在采样管中根据样本量加入一定40:1的细胞延长剂，放置20min；

将获得的样本与培养液等体积混合，再在室温的条件下，按体积比2-3:1,加在人外周血淋巴细胞分离液上层,离心22分钟；

采用恒速细胞提取装置提取白色、云雾状外周血单个核细胞层并转移至15ml分离管内，加入细胞培养液至10ml；

离心7分钟,弃去上清液，用自动重悬装置将底部的沉淀物与离心管分离并重新制备成悬液，加入培养液至10ml；

离心7分钟，弃去上清液，再次用自动重悬装置将底部的沉淀物与离心管分离并重新制备成悬液，加入500ul的AIM细胞培养液，获得了原倍的细胞溶液。

作为本发明再进一步的方案：所述外周血单个核细胞的计数包括以下步骤：

取40ul 3%冰乙酸至0.5ml离心管中，加入混匀后的20ul上述E步骤所获得的细胞溶液，再加入40ul 0.4%(w/v)台盼蓝染液；

混匀后，吸取10ul进行细胞计数，则每微升细胞溶液所包含的细胞数的计算公式如下：

；

其中，

为每微升细胞溶液所包含的细胞数，

为10ul所存在的外周血单个核细胞数，K为稀释倍数。

在本发明所述的结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法中，还包括恒速细胞提取装置，包括：

筒腔，所述筒腔上表面设置有挂钩，所述筒腔侧表面设置有把手，所述筒腔表面还设置有开关；

充电组件，所述充电组件设置于筒腔的上表面，所述充电组件用于为筒腔内的用电元件充电；

抓取组件，所述抓取组件设置于筒腔的侧面，所述抓取组件由所述充电组件为其供能。

作为本发明再进一步的方案：所述筒腔表面还设置有侧门，所述侧门与筒腔铰接，所述筒腔内部还设有支撑板，所述支撑板上方设置有储电池，所述储电池与充电组件电连接。

作为本发明再进一步的方案：所述充电组件包括充电口和盖帽，所述充电口设置于所述筒腔的上表面，所述盖帽与充电口配合，所述盖帽盖合于充电口上方。

作为本发明再进一步的方案：所述抓取组件包括光信号感应器、抓取构件和一次性吸管，所述光信号感应器设置于侧门表面，所述抓取构件设置于所述筒腔表面，所述抓取构件与光信号感应器电连接，所述一次性吸管与所述抓取构件配合。

作为本发明再进一步的方案：所述抓取构件包括连接块、速度抓手和管头腔，所述连接块设置于所述筒腔表面，所述速度抓手与所述连接块连接，所述管头腔与所述速度抓手连接，所述管头腔与所述一次性吸管配合。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明可被用来结核感染T细胞斑点试验样本制备过程中完成对外周血单个核细胞的提取和计数。在提取和计数过程中能够减少对人员经验、精力、体力的要求，简单、准确地提取和计数结核感染T细胞斑点试验过程中外周血单个核细胞；所述恒速细胞提取装置，采用防呆设计的理念，使人员手持装置插入外周血单个核细胞层上方，即可通过溶液浓度发射的光信号控制对细胞提取的速度，进而准确地提取结核感染T细胞斑点试验过程中外周血单个核细胞层。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1为恒速细胞提取装置的正视结构示意图；

图2为恒速细胞提取装置的右视结构示意图；

图3为恒速细胞提取装置的局部结构剖视图；

图4为恒速细胞提取装置的俯视结构示意图；

图5为恒速细胞提取装置中A处的结构放大示意图；

图中：1、筒腔；2、挂钩；3、把手；4、开关；5、侧门；6、支撑板；7、储电池；8、充电口；9、盖帽；10、光信号感应器；11、一次性吸管；12、连接块；13、速度抓手；14、管头腔。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例一：一种结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，包括以下步骤：

第一步，采集样本

样本采集的标本为肝素抗凝的静脉全血，采集完成后室温保存不应超过4个小时，不可冷藏、冷冻和低温保存；

第二步，外周血单个核细胞的分离和提取

选用离心装置和恒速细胞提取装置对所述外周血单个核细胞进行分离和提取；

第三步，外周血单个核细胞的计数

采用Fuchs-Rosenthal血细胞计数板完成对单个核细胞的计数；该计数线划分方法与普通血细胞计数板不同，Fuchs-Rosenthal型血细胞计数板将计数池划分为16个大方格，面积为1mm，每个大方格又划分为16个小方格，边长为0.25mm，面积为0.0625

。

第四步，制得最终的试验样本

根据上述第三步所计数的细胞数量，加入适量的AIM细胞培养液，最终配制每100ul含有25万个细胞的标准溶液500ul。

进一步地，所述样本采集过程中的所需采集的样本量与采集对象的年龄相关，采集对象的年龄在10岁以上的，采集其肝素抗凝的静脉全血8ml；采集对象的年龄在10岁以下的，采集其肝素抗凝的静脉全血2-8ml。

进一步地，所述样本采集完成后应尽快进行外周血单个核细胞的分离，尽快对外周血单个核细胞进行分离可有效的保障外周单个核细胞的生物活性，同时在样本采集完毕后进行分离可有效的降低外周血单个核细胞的分离难度，一定程度上提升了分离后的外周血单个核细胞的纯度，保障了后续的实验结果的准确性。

进一步地，所述外周血单个核细胞的分离和提取包括以下步骤：

A、在采样管中根据样本量加入一定比例的细胞延长剂，放置20min；加入一定比例的细胞延长剂可增强外周血单个核细胞的生物活性以使得外周血单个核细胞能够存活较长的时间，以便于工作人员在外周血单个核细胞存活期间能够完成后续的实验操作；

B、将第一步获得的样本与RPMI1640培养液等体积混合，再按体积比2-3:1小心的加在人外周血淋巴细胞分离液上层,室温(18-25℃),离心22分钟；

C、采用恒速细胞提取装置提取白色、云雾状外周血单个核细胞层并转移至15ml分离管内，加入细胞培养液至10ml；

D、离心7分钟,弃去上清液，用自动重悬装置将底部的沉淀物与离心管分离并重新制备成悬液，加入培养液至10ml；

E、离心7分钟，弃去上清液，再次用自动重悬装置将底部的沉淀物与离心管分离并重新制备成悬液，加入500ul的AIM细胞培养液，获得了原倍的细胞溶液。

进一步地，所述外周血单个核细胞的计数包括以下步骤：

①、取40ul 3%冰乙酸至0.5ml离心管中，加入混匀后的20ul上述E步骤所获得的细胞溶液，再加入40u1 0.4%(w/v)台盼蓝染液；

②、混匀后，吸取10ul进行细胞计数，则每微升细胞溶液所包含的细胞数的计算公式如下：

；

其中，

为每微升细胞溶液所包含的细胞数，

为10ul所存在的外周血单个核细胞数，K为稀释倍数。

采用本发明方法可有效的降低实验的出错率，且大大提升了实验的工作效率。

请参阅图1-5，一种恒速细胞提取装置，包括：

筒腔1，所述筒腔1上表面设置有挂钩2，所述筒腔1侧表面设置有把手3，所述筒腔1表面还设置有开关4；所述筒腔1的制作材料具备以下特性，耐酸、耐碱、耐高温、无毒和易成型，根据上述特性最好选用PPSU（聚亚苯基砜树脂），PPSU具备以下特性为略带琥珀色的线型聚合物，除强极性溶剂、浓硝酸和硫酸外，对一般酸、碱、盐、醇、脂肪烃等稳定，部分溶于酯酮芳烃,可溶于卤烃DM，刚性和韧性好，耐温、耐热氧化，抗蠕变性能优良，耐无机酸、碱、盐溶液的腐蚀，耐离子辐射，无毒，绝缘性和自熄性好，容易成型加工。故采用PPSU作为筒腔1的制作材料，使得其可以进行高温消毒或酒精、次氯酸钠等消毒液擦拭，且具有容纳和支持相关部件的作用；

通过设置有挂钩2使得该装置在不工作的状态下能够悬挂放置。

充电组件，所述充电组件设置于筒腔1的上表面，所述充电组件用于为筒腔1内的用电元件充电；

抓取组件，所述抓取组件设置于筒腔1的侧面，所述抓取组件由所述充电组件为其供能。

进一步地，所述筒腔1表面还设置有侧门5，所述侧门5与筒腔1铰接，所述筒腔1内部还设有支撑板6，所述支撑板6上方设置有储电池7，所述储电池7与充电组件电连接；

所述侧门5和支撑板6的制作材料也为PPSU（聚亚苯基砜树脂），PPSU具备以下特性为略带琥珀色的线型聚合物，除强极性溶剂、浓硝酸和硫酸外，对一般酸、碱、盐、醇、脂肪烃等稳定，部分溶于酯酮芳烃,可溶于卤烃DM，刚性和韧性好，耐温、耐热氧化，抗蠕变性能优良，耐无机酸、碱、盐溶液的腐蚀，耐离子辐射，无毒，绝缘性和自熄性好，容易成型加工。故采用PPSU作为筒腔1的制作材料，使得其可以进行高温消毒或酒精、次氯酸钠等消毒液擦拭；

所述储电池7可为普通蓄电池、干荷蓄电池和免维护蓄电池，最好采用免维护蓄电池，因为普通蓄电池的极板是由铅和铅的氧化物构成，电解液是硫酸的水溶液，普通蓄电池虽然电压稳定、价格便宜；缺点是比能低(即每公斤蓄电池存储的电能)、使用寿命短和日常维护频繁，给实验人员带来的一定的麻烦；干荷蓄电池它的全称是干式荷电铅酸蓄电池，它的主要特点是负极板有较高的储电能力，在完全干燥状态下，能在两年内保存所得到的电量，使用时，只需加入电解液，等过20-30分钟就可使用，这就延长了实验周期，使得外周血单个核细胞的存活率降低，一定程度的影响了实验结果的准确性；免维护蓄电池由于自身结构上的优势，电解液的消耗量非常小，在使用寿命内基本不需要补充蒸馏水，它还具有耐震、耐高温、体积小、自放电小的特点，使用寿命一般为普通蓄电池的两倍，因此适合作为恒速细胞提取装置的供电电池。

请参阅图1和图3，进一步地，所述充电组件包括充电口8和盖帽9，所述充电口8设置于所述筒腔1的上表面，所述盖帽9与充电口8配合，所述盖帽9盖合于充电口8上方；

所述盖帽9的制作材料为橡胶，橡胶具备具有弹性，耐磨、耐寒、不易泄气等优点，橡胶是由成千上万个异戊二烯分子组成的。其分子链本身就有柔软、韧性的特点，这叫柔顺性。一般说来，柔顺性好的橡胶，弹性大，耐磨耐寒性也好。有些人工合成橡胶，因为特意改变了它们的分子结构，才使它们具有特别的优点。例如，由异丁烯和少量异戊二烯共聚而成的丁基橡胶，由于分子中有大量的甲基侧链，分子链运动受到阻碍，所以具有优良的气密性。另外，橡胶分子的大小，分子之间的排列是否整齐，都会影响橡胶的性能。一般说，橡胶的分子量低，弹性就差；分子量过大，橡胶变硬。因此选用橡胶作为盖帽9的制作材料使得盖帽9与充电口8的配合处密封性好，进而能够防止因灰尘或水的进入导致充电时该装置损坏。

请参阅图1、图2、图3和图4，进一步地，所述抓取组件包括光信号感应器10、抓取构件和一次性吸管11，所述光信号感应器10设置于侧门5表面，所述抓取构件设置于所述筒腔1表面，所述抓取构件与光信号感应器10电连接，所述一次性吸管11与所述抓取构件配合；

所述光信号感应器10用于识别一次性吸管11内所吸取的溶液的浓度，以控制对管头腔14的抓取力度，进而通过抓取力度的大小来实时的控制调节一次性吸管11吸取液体的速度，进而减少了对人员经验、精力、体力的要求，使得工作人员能够简单、准确地提取和计数结核感染T细胞斑点试验过程中外周血单个核细胞。

请参阅图1和图5，进一步地，所述抓取构件包括连接块12、速度抓手13和管头腔14，所述连接块12设置于所述筒腔1表面，所述速度抓手13与所述连接块12连接，所述管头腔14与所述速度抓手13连接，所述管头腔14与所述一次性吸管11配合；

所述管头腔14的制作材料也为橡胶，橡胶具备具有弹性，耐磨、耐寒、不易泄气等优点，橡胶是由成千上万个异戊二烯分子组成的。其分子链本身就有柔软、韧性的特点，这叫柔顺性。一般说来，柔顺性好的橡胶，弹性大，耐磨耐寒性也好。有些人工合成橡胶，因为特意改变了它们的分子结构，才使它们具有特别的优点。例如，由异丁烯和少量异戊二烯共聚而成的丁基橡胶，由于分子中有大量的甲基侧链，分子链运动受到阻碍，所以具有优良的气密性。另外，橡胶分子的大小，分子之间的排列是否整齐，都会影响橡胶的性能。因橡胶的弹性优异，因此可通过速度抓手13对管头腔14的抓取力度的大小来控制一次性吸管11吸取液体的速度。

恒速细胞提取装置的工作过程：工作人员手持把手3将一次性吸管11无液体插入离心管中，通过光信号感应器10感对白色、云雾状外周血单个核细胞层液体浓度的识别，速度抓手13开始放松管头腔14，使一次性吸管11均速吸入液体，随着液体浓度的变化，最终停止吸入液体，完成对外周血单个核细胞层的提取。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

采集肝素抗凝的静脉全血；

选用离心装置和恒速细胞提取装置对采集的肝素抗凝的静脉全血的外周血单个核细胞分离和提取；

采用血细胞计数板对分离和提取的外周血单个核细胞计数；

将计算的外周血单个核细胞，加入AIM细胞培养液，配制每100ul含有25万个细胞的标准溶液500ul。

2.根据权利要求1所述的结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，其特征在于，所述样本采集过程中的所需采集的样本量与采集对象的年龄相关，采集对象的年龄≥10岁，采集其肝素抗凝的静脉全血8ml；采集对象的年龄＜10岁，采集其肝素抗凝的静脉全血2-8ml。

3.根据权利要求2所述的结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，其特征在于，所述样本采集完成后4小时内进行外周血单个核细胞的分离。

4.根据权利要求3所述的结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞的分离和提取包括以下步骤：

若4小时内未进行分离，则在采样管中根据样本量加入40:1的细胞延长剂，放置20min，得到样本；

将获得的样本与培养液等体积混合，再在室温的条件下,按体积比2-3:1加在人外周血淋巴细胞分离液上层,离心22分钟；

采用恒速细胞提取装置提取白色、云雾状外周血单个核细胞层并转移至15ml分离管内，加入细胞培养液至10ml；

离心7分钟,弃去上清液，用自动重悬装置将底部的沉淀物与离心管分离并重新制备成悬液，加入培养液至10ml；

离心7分钟，弃去上清液，再次用自动重悬装置将底部的沉淀物与离心管分离并重新制备成悬液，加入500ul的AIM细胞培养液，获得了原倍的细胞溶液。

5.根据权利要求1所述的结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞的计数包括以下步骤：

取40ul 3%冰乙酸至0.5ml离心管中，加入混匀后的20ul的原倍的细胞溶液，再加入40u1 0.4%(w/v)台盼蓝染液；

混匀后，吸取10ul进行细胞计数，则每微升胞溶液所包含的细胞数的计算公式如下：

；

其中，

为每微升细胞溶液所包含的细胞数，

为10ul所存在的外周血单个核细胞数，K为稀释倍数。

6.根据权利要求4所述的结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，其特征在于，所述恒速细胞提取装置包括：

筒腔，所述筒腔上表面设置有挂钩，所述筒腔侧表面设置有把手，所述筒腔表面还设置有开关；

充电组件，所述充电组件设置于筒腔的上表面，所述充电组件用于为筒腔内的用电元件充电；

抓取组件，所述抓取组件设置于筒腔的侧面。

7.根据权利要求6所述的结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，其特征在于，所述筒腔表面还设置有侧门，所述侧门与筒腔铰接，所述筒腔内部还设有支撑板，所述支撑板上方设置有储电池，所述储电池与充电组件电连接。

8.根据权利要求7所述的结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，其特征在于，所述充电组件包括充电口和盖帽，所述充电口设置于所述筒腔的上表面，所述盖帽与充电口配合，所述盖帽盖合于充电口上方。

9.根据权利要求8所述的结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，其特征在于，所述抓取组件包括光信号感应器、抓取构件和一次性吸管，所述光信号感应器设置于侧门表面，所述抓取构件设置于所述筒腔表面，所述抓取构件与光信号感应器电连接，所述一次性吸管与所述抓取构件配合。

10.根据权利要求9所述的结核感染T细胞斑点试验样本的制备方法，其特征在于，所述抓取构件包括连接块、速度抓手和管头腔，所述连接块设置于所述筒腔表面，所述速度抓手与所述连接块连接，所述管头腔与所述速度抓手连接，所述管头腔与所述一次性吸管配合。

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