CN111579763B - 检测白细胞线粒体呼吸功能的方法及检测肾阴虚症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法及检测肾阴虚症的方法，其中所述检测白细胞线粒体呼吸功能的方法可以包括白细胞的提取(S1)，采集血液样本并对所述血液样本进行分离，并提取其中的所述白细胞；接种所述白细胞(S2)，用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理，并配制白细胞培养基，用所述白细胞培养基稀释所述白细胞并将其接种到所述细胞培养板上；以及线粒体呼吸功能的检测(S3)，通过检测所述细胞培养板中接种的所述白细胞的不同状态的氧消耗速率，以实时监测所述白细胞中的所述线粒体呼吸功能。根据本发明的方法，能够检测完整细胞状态下的线粒体功能，能够对细胞能量代谢过程进行实时监测。

Description

检测白细胞线粒体呼吸功能的方法及检测肾阴虚症的方法

技术领域

本发明总体涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法及使用该方法检测肾阴虚症实验动物的方法。

背景技术

线粒体是机体能量产生的重要场所，细胞内90％以上的ATP都由线粒体提供。研究表明，多种人类慢性疾病(如肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病)的发生与细胞能量代谢异常密切相关。因此，研究线粒体功能，并对细胞能量代谢过程进行实时监测，对于临床疾病诊断和药物开发具有重要的指导意义。而目前传统的线粒体功能研究方法是将细胞破碎后抽提线粒体组分，然后进行相应的生理、生化指标检测，存在杂质污染、线粒体活性下降等诸多缺点，不能完全客观反映细胞的能量代谢过程。

肾阴虚是中医理论体系中重要的症候之一，机体物质代谢，能量代谢异常是该症候的典型特征，但中医“症”存在主观不确定性使其临床评价指标存在很大争议，而如今尚缺少适用于该项研究的技术方法。

发明内容

为了至少解决在上述背景技术所描述的现有技术缺陷，本发明的技术方案在多个方面提供了一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法及使用该方法检测肾阴虚症实验动物的方法。

根据本发明的第一方面，提供一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法，包括：白细胞的提取S1，采集血液样本并对所述血液样本进行分离，并提取其中的所述白细胞；接种所述白细胞S2，用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理，并配制白细胞培养基，用所述白细胞培养基稀释所述白细胞并将其接种到所述细胞培养板上；以及线粒体呼吸功能的检测S3，通过检测所述细胞培养板中接种的所述白细胞的不同状态的氧消耗速率，以实时监测所述白细胞中的所述线粒体呼吸功能。

根据本发明的一个实施例，所述线粒体呼吸功能的检测S3包括：呼吸水平基础值的检测S31，检测所述白细胞的基础氧消耗速率，以得到所述白细胞的呼吸水平基础值；三磷酸腺苷ATP关联呼吸值的检测S32，向所述细胞培养板中加入ATP合成酶阻断剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到的稳定速率值作为第一速率值，并将所述呼吸水平基础值与所述第一速率值作差值，以得到所述ATP关联呼吸值；呼吸能力储备值的检测S33，向所述细胞培养板中加入呼吸链解偶联剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到氧消耗最大速率值，并将所述氧消耗最大速率值与所述呼吸水平基础值作差值，以得到所述呼吸能力储备值；以及呼吸最大潜能值的检测S34，向所述细胞培养板中加入呼吸链抑制剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到的稳定速率值作为第二速率值，将所述氧消耗最大速率值与所述第二速率值作差值，以得到所述呼吸最大潜能值。

根据本发明的另一个实施例，所述白细胞的提取S1包括：将采集的所述血液样本与抗凝剂混合均匀并静置，常温下对其进行离心分离，以得到中间层细胞S11；吸取所述中间层细胞并向其中加入磷酸平衡盐PBS缓冲液，离心后除去上层的所述PBS缓冲液，得到白细胞混合液S12；除去残留红细胞步骤S13，向所述白细胞混合液中加入红细胞裂解液，吹打均匀并于冰上2～8℃裂解，离心分离以除去红细胞杂质；以及洗涤步骤S14，用所述PBS缓冲液一次或多次的洗涤除杂后的所述白细胞混合液，以得到所述白细胞。

根据本发明的又一个实施例，所述除去残留红细胞步骤S13中的裂解温度为4℃，裂解时间为3分钟；所述方法进一步包括：在所述洗涤步骤S14之前重复所述除去残留红细胞步骤S13一次或多次，直至所述白细胞混合液中的所述红细胞杂质完全裂解。

根据本发明的一个实施例，所述用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理包括：将细胞黏附剂加入到碳酸钠缓冲液中，并吹打均匀；将稀释后的细胞黏附剂加入到所述细胞培养板的每个检测孔内并静置；以及吸弃所述每个检测孔内的所述碳酸钠缓冲液，用无菌水洗涤所述细胞培养板，吹干后于4℃保存备用。

根据本发明的另一个实施例，所述白细胞培养基包括丙酮酸钠、谷氨酰胺和葡萄糖，且所述白细胞培养基的pH值为7.4，所述丙酮酸钠、谷氨酰胺和葡萄糖的浓度比为1：2：10。

根据本发明的又一个实施例，所述配制白细胞培养基包括：将1mL的100mM丙酮酸钠、1mL的200mM谷氨酰胺及400μL的2.5M葡萄糖加入至97.6mL的基础培养基中，混匀后加入氢氧化钠溶液以调节pH值为7.4，过滤除菌后于4℃保存。

根据本发明的一个实施例，在进行所述线粒体呼吸功能的检测S3之前进一步包括：对检测探针板进行水化处理；以及向所述检测探针板的加药仓中加入一种或多种影响所述白细胞状态的药剂，以便于在所述线粒体呼吸功能的检测S3过程中向所述细胞培养板中接种的所述白细胞加入所述药剂。

根据本发明的第二方面，提供一种使用如本发明的第一方面中任一项所述的方法检测肾阴虚症实验动物的方法，包括：设置对照组和模型组S10，将实验动物分为所述对照组和所述模型组，其中所述模型组的实验动物具有所述肾阴虚症；检测所述对照组和所述模型组的白细胞线粒体呼吸功能S20，分别采集所述对照组和所述模型组的实验动物的血液样本，并按照如本发明的第一方面中任一项所述的方法进行检测；以及对比所述对照组和所述模型组的白细胞线粒体呼吸功能的检测结果，以评价所述模型组的实验动物的线粒体呼吸功能S30。

根据本发明的一个实施例，所述设置对照组和模型组S10包括：将实验动物按照体重随机分为所述对照组和所述模型组，其中所述模型组的实验动物灌胃给与450mg/kg体重的甲状腺片混悬液，所述对照组的实验动物灌胃给予0.9％的氯化钠注射液，两组实验动物均每天灌胃一次，连续灌胃14天。

通过上述对本发明的技术方案及其多个实施例的描述，本领域技术人员可以理解本发明的检测白细胞线粒体呼吸功能的方法通过提取完整白细胞，并对其进行线粒体呼吸功能的检测，可以用于研究完整细胞状态下的线粒体功能，能够对细胞能量代谢过程进行实时监测，并可以有效避免检测过程中线粒体的活性下降以及杂质污染等因素的影响。进一步地，本发明还提供了一种使用上述方法检测肾阴虚症实验动物的方法，以便于研究肾阴虚症的实验动物的线粒体呼吸功能，从而为肾阴虚症的研究提供了一种全新的方法。

附图说明

通过结合附图，可以更好地理解本发明的上述特征，并且其众多目的，特征和优点对于本领域技术人员而言是显而易见的，其中相同的附图标记表示相同的部件，并且其中：

图1是总体上示出根据本发明的检测白细胞线粒体呼吸功能的方法的流程示意图；

图2是示出根据本发明的线粒体呼吸功能的检测S3的一个实施例流程示意图；

图3是示出根据本发明实施例的如图2所示的方法检测白细胞氧消耗速率的曲线示意图；

图4是根据本发明实施例的白细胞的提取S1的流程示意图；

图5是总体上示出根据本发明的检测肾阴虚症实验动物的白细胞线粒体呼吸功能的方法流程示意图；

图6是示出根据本发明实施例的对照组和模型组实验大鼠的体征示意图；

图7是示出根据本发明实施例的对照组和模型组实验大鼠的直肠温测量结果示意图；

图8是示出根据本发明实施例的对照组和模型组实验大鼠的给药时间与体重变化的曲线示意图；

图9是示出根据本发明实施例的对照组和模型组实验大鼠白细胞在一个测定周期中氧消耗速率动态变化曲线示意图；以及

图10是示出根据本发明的对照组和模型组实验大鼠的呼吸水平基础值和呼吸能力储备值的柱状统计示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，参考标号是指本发明中的组件、技术，以便本发明的优点和特征在适合的环境下实现能更易于被理解。下面的描述是对本发明权利要求的具体化，并且与权利要求相关的其它没有明确说明的具体实现也属于权利要求的范围。

本发明针对现有技术的不足，提供了一种全新的可实现的解决方案。特别的，本发明通过对血液样本中的完整白细胞进行分离和提取，以保证白细胞的活性，以及对完整白细胞进行能量代谢检测，从而保证白细胞内的线粒体免受杂质污染以及能够在保持活性的状态下进行呼吸功能的检测，以保证检测结果的准确性和可靠性。进一步地，本发明还提供了使用该方法对肾阴虚症实验动物进行检测的方法，通过制造肾阴虚症动物模型组和对照组的对比实验，以评价肾阴虚症实验动物的线粒体呼吸功能的受损情况，可以为肾阴虚症的研究和药物开发提供参考。

下面将结合附图来详细描述本发明的多个实施例。

图1是总体上示出根据本发明的检测白细胞线粒体呼吸功能的方法的流程示意图。如图1中所示，提供一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法，可以包括：白细胞的提取S1，采集血液样本并对所述血液样本进行分离，并提取其中的所述白细胞；接种所述白细胞S2，用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理，并配制白细胞培养基，用所述白细胞培养基稀释所述白细胞并将其接种到所述细胞培养板上；以及线粒体呼吸功能的检测S3，通过检测所述细胞培养板中接种的所述白细胞的不同状态的氧消耗速率，以实时监测所述白细胞中的所述线粒体呼吸功能。

如图1中所示，白细胞的提取S1可以是通过采集血液样本并对该血液样本中的白细胞进行分离和提取，具体地，可以包括血液样本的采集、血液样本的分离、白细胞的提取以及除杂等步骤。在一个实施例中，可以通过离心操作对血液样本进行分离，离心后的血液样本可见明显分层，其中上层为血浆层，中间白色薄膜层为白细胞层，下层为红细胞层。通过提取中间白细胞层，可以获得完整的白细胞。

如图1中所示，接种白细胞S2可以将提取的白细胞接种到细胞培养板内进行培养，以保持白细胞的活性。上文中所述的细胞培养板可以具有一个或多个用于培养和检测细胞的检测孔，可以用于一个或多个平行实验。例如在一个实施例中，细胞培养板是12孔细胞培养板。在另一个实施例中，细胞培养板是24孔细胞培养板。在又一个实施例中，细胞培养板是72孔细胞培养板。细胞培养板的检测孔数可以根据需要进行选择。细胞黏附剂可以用于使白细胞贴附于细胞培养板中，避免白细胞的聚集，有利于培养。经过细胞黏附剂处理后的细胞培养板内(例如细胞培养板的检测孔内)可以在表面(例如检测孔内的底层表面)形成一层黏附层，用于对白细胞的黏附。

根据本发明的一个实施例，所述用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理可以包括：将细胞黏附剂进行稀释，优选地将细胞黏附剂加入到碳酸钠缓冲液中进行稀释，并吹打均匀；将稀释后的细胞黏附剂加入到所述细胞培养板的每个检测孔内并静置；以及吸弃所述每个检测孔内的所述碳酸钠缓冲液，用无菌水洗涤所述细胞培养板，吹干后于4℃保存备用。

上述将细胞黏附剂进行稀释的过程中，细胞黏附剂与碳酸钠缓冲液的配比不仅与使用试剂的浓度有关，还可以根据涂敷容器的尺寸和数量计算总表面积来获得。在一个优选的实施方式中，该配比可以保证加入的细胞黏附剂完全覆盖细胞板检测孔的底面积以便于细胞黏附。进一步地，加入细胞黏附剂的量与具体应用和细胞类型也存在关系。例如根据本发明的一个优选实施例中，吸取16μL的细胞黏附剂母液，加入到1284μL的0.1M中性碳酸钠缓冲液(pH＝6.5～8)中，吹打混匀；在10分钟内(以防止时间过长，混合溶液内的细胞黏附剂覆盖于容器内，使得加入到检测孔内的量变少)将稀释好的细胞黏附剂以例如50μL/孔加入到细胞培养板每个检测孔内，静置至少20分钟，以使细胞黏附剂充分吸附于检测孔底；以及吸弃每个检测孔内的碳酸钠缓冲液，用200μL无菌水洗涤细胞培养板两遍，并吹干后于4℃保存备用。

上文中所述的白细胞培养基可以用于为白细胞提供营养物质，例如提供白细胞能量代谢所需要的供能物质，以保持白细胞的活性。进一步地，通过调节白细胞和白细胞培养基的比例，可以将白细胞稀释，以使白细胞均匀的分布于白细胞培养基中并接种于细胞培养板内，便于观察和检测白细胞的状态。本领域技术人员可以根据需要调节白细胞和白细胞培养基的调配比例，以满足检测所需的白细胞密度。

根据本发明的一个实施例，所述白细胞培养基可以包括丙酮酸钠、谷氨酰胺和葡萄糖等，且所述白细胞培养基的pH值为7.4(误差范围可以±0.05)，所述丙酮酸钠、谷氨酰胺和葡萄糖在所述白细胞培养基中的浓度比可以为1：2：10。例如在一个实施例中，所述配制白细胞培养基可以包括：将1mL的100mM丙酮酸钠、1mL的200mM谷氨酰胺及400μL的2.5M葡萄糖加入至97.6mL的基础培养基中，混匀后加入氢氧化钠溶液(例如1M的氢氧化钠溶液)以调节pH值为7.4，过滤除菌后可以分装并于4℃保存。pH值为7.4是根据本发明的细胞培养的最适pH值，该pH值太高或太低都会影响检测结果。该基础培养基可以是包括培养细胞的基础营养物质，例如可以是市售的商品化试剂，而根据本发明的白细胞培养基可以在此基础上额外添加丙酮酸钠、谷氨酰胺和葡萄糖等，以用作白细胞进行线粒体有氧呼吸的底物。本文中所述的mM是mmol/L，M是mol/L。

根据本发明的又一个实施例，在进行如图1中所示的线粒体呼吸功能的检测S3之前可以进一步包括：对检测探针板进行水化处理；向所述检测探针板的加药仓中加入一种或多种影响所述白细胞状态的药剂，以便于在所述线粒体呼吸功能的检测S3过程中向所述细胞培养板中接种的所述白细胞加入所述药剂。

上文中所述的检测探针板可以包括一个或多个探针，用于检测白细胞呼吸的氧气消耗速率。检测探针板可以与细胞培养板配套使用，例如检测探针板上的探针数量与细胞培养板的检测孔的数量相等，且可以一一对应进行检测，即检测探针板上的每个探针可以插入到细胞培养板的一个相应检测孔内。探针可以是检测电极或者传感器，用于检测相应检测孔内的氧气浓度、氢离子浓度、氧离子浓度等中的至少一个，从而实现监测检测孔内的白细胞呼吸的氧气消耗速率的目的。

上文中所述的检测探针板进行水化处理可以使探针在插入到细胞培养板内之前保持湿润状态，以保证探针在检测时(例如检测初始阶段)的准确性。例如在一个实施例中，在用于水化处理的底层板的每孔内加入探针校准液，并以避免产生气泡的方式将检测探针板盖于底层板上，其中底层板可以具有与细胞培养板类似的结构，在进行水化处理时与检测探针板配套使用；将检测探针板和底层板放置于37℃无二氧化碳的孵箱中备用，以防止二氧化碳的环境改变水化液的pH值，进而影响探针板的水化效果，备用期间可观察检测探针板上是否有气泡，如果有气泡需要排出气泡。防止检测探针板上产生气泡可以有效避免探针检测时带入气体，从而进一步保证检测数据的准确性。

上文中所述的检测探针板上还可以设置有一个或多个加药仓，可以用于加入实验所需的药剂，所述加药仓上可以设置有控制阀门，以便于在线粒体呼吸功能的检测S3过程中根据需要进行药剂投放。

图1中所示的线粒体呼吸功能的检测S3可以通过检测细胞培养板内接种的白细胞在不同状态下的氧消耗速率，以实时监测白细胞中的线粒体呼吸功能。下面将对根据本发明的线粒体呼吸功能的检测S3的原理进行说明。

细胞能量代谢是细胞对供能物质(例如葡萄糖、脂肪、氨基酸等)的利用和生成三磷酸腺苷ATP的过程。细胞的能量代谢过程以两种形式存在，即有氧气存在时的有氧呼吸过程(氧气消耗)和在没有氧气存在时的糖酵解过程(产生H+离子)，这两种能量代谢方式在细胞内同时存在，因此有氧呼吸过程可以以细胞氧气消耗速率为指标来表征有氧呼吸功能，无氧呼吸过程可以以细胞外酸化率为指标来表征无氧呼吸功能。而本发明的线粒体呼吸功能的检测S3过程以检测有氧呼吸功能为主，对细胞能量代谢过程进行实时监测。

细胞进行有氧呼吸依赖于线粒体膜上的五种呼吸链复合物，其中呼吸链复合物I(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH氧化酶)和复合物II(琥珀酸脱氢酶)是电子进入线粒体电子传递链的主要组成部分。复合物I催化NADH氧化，复合物II催化琥珀酸氧化为延胡索酸。随后，辅酶Q(CoQ)形成辅酶QH₂，最终导致终端的电子受体O₂减少。线粒体呼吸链复合物III(细胞色素c氧化还原酶)是线粒体氧化磷酸化的必要蛋白质。线粒体呼吸链复合物IV(细胞色素c氧化酶)是线粒体电子传递链的终端电子受体。复合物IV通过对细胞色素c的氧化，将O₂转化为水，此过程与线粒体细胞膜ATP合成有关。线粒体呼吸链复合物V与上述四个复合物一起完成氧化磷酸化生成ATP，也称为ATP合成酶。细胞在氧化呼吸过程中释放的能量能不断将细胞内的H+离子以逆浓度梯度方式泵到细胞膜外，细胞膜外的H⁺离子则通过特异性的质子通道(即线粒体呼吸链复合物V)以顺浓度梯度的方式进入细胞内，该过程中释放的自由能使ADP结合一个磷酸基团生成ATP。

线粒体呼吸链复合物活性的抑制会导致线粒体呼吸功能受阻，如果活性长期受到抑制则会因产生线粒体毒性而导致疾病的发生。基于以上原理，本发明的线粒体呼吸功能的检测S3通过检测白细胞在不同状态下的氧消耗速率，以实时监测白细胞中的线粒体呼吸功能。例如在一个实施例中，可以检测白细胞在自然状态下的氧消耗速率。在另一个实施例中，可以通过改变线粒体呼吸链复合物的活性，以改变白细胞的状态并检测白细胞的线粒体呼吸功能。

以上结合图1总体上对根据本发明的检测白细胞线粒体呼吸功能的方法进行了描述，并对本发明的线粒体呼吸功能的检测的基本原理进行了说明，通过上面的描述，本领域技术人员应该理解的是，以上描述的实施例是示例性的而非限制性的，本领域技术人员可以根据需要进行调整，例如血液样本的分离不限于上述的离心分离，在一个实施例中，可以通过自然沉降的方式分离血液样本。在另一个实施例中，可以加入高分子聚合物促使红细胞凝聚成串钱状，从而加速红细胞沉降，使之与白细胞分离，其中常用的高分子聚合物有明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮PVP及甲基纤维素等。白细胞培养基的配制可以根据需要进行调整，例如根据不同来源(例如不同生物体)的细胞的特性进行调配。线粒体呼吸功能的检测S3可以根据需要改变白细胞的状态，例如通过投放不同功能的药剂以模拟白细胞的不同状态，以下将结合图2和图3进行示例性的说明。

图2是示出根据本发明的线粒体呼吸功能的检测S3的一个实施例流程示意图。图3是示出根据本发明实施例的如图2所示的方法检测白细胞氧消耗速率的曲线示意图。如图2中所示，根据本发明的一个实施例，所述线粒体呼吸功能的检测S3可以包括：呼吸水平基础值的检测S31，检测所述白细胞的基础氧消耗速率，以得到所述白细胞的呼吸水平基础值；三磷酸腺苷ATP关联呼吸值的检测S32，向所述细胞培养板中加入ATP合成酶阻断剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到的稳定速率值作为第一速率值，并将所述呼吸水平基础值与所述第一速率值作差值，以得到所述ATP关联呼吸值；呼吸能力储备值的检测S33，向所述细胞培养板中加入呼吸链解偶联剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到氧消耗最大速率值，并将所述氧消耗最大速率值与所述呼吸水平基础值作差值，以得到所述呼吸能力储备值；以及呼吸最大潜能值的检测S34，向所述细胞培养板中加入呼吸链抑制剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到的稳定速率值作为第二速率值，将所述氧消耗最大速率值与所述第二速率值作差值，以得到所述呼吸最大潜能值。

上文中所述的呼吸水平基础值的检测S31是检测正常白细胞体外培养时的基础呼吸水平，通过检测正常白细胞的基础氧消耗速率，可以得到线粒体有氧呼吸的氧气消耗速率基础值，即白细胞的呼吸水平基础值。例如如图3中所示，在检测初始阶段对体外培养的正常白细胞的氧消耗速率进行检测(例如图示中进行了三个时间点的检测)，得到一个相对平稳的氧消耗速率值(为便于观察，图3中以横向虚线10示出)，将该氧消耗速率值与非线粒体氧气消耗速率作差值①(如图示中的虚线双箭头①示出)，得到线粒体有氧呼吸的氧气消耗速率基础值，即为白细胞的呼吸水平基础值。

上文中所述的ATP合成酶阻断剂是一种线粒体呼吸链复合物V阻断剂，可通过阻断ADP的氧化磷酸化过程来阻断ATP的生成。该ATP合成酶阻断剂可以是寡霉素等。在步骤S32中可以向细胞培养板内接种的白细胞加入ATP合成酶阻断剂，以阻断ATP的合成，检测此时的氧消耗速率，例如图3中所示的加入寡霉素后(单箭头示出)，细胞氧气消耗速率急剧下降到一个稳定的水平，该稳定的水平对应的氧气消耗速率值作为第一速率值。此时得到的第一速率值与呼吸水平基础值的差值②(图中虚线双箭头②示出)即为ATP关联呼吸值。

上文中所述的呼吸链解偶联剂是一种线粒体呼吸链解偶联剂，可以增加细胞膜对H⁺离子的通透性，促使H⁺离子被动扩散进入细胞，从而消除细胞膜内外的质子浓度梯度，呼吸链解偶联剂不能使细胞再合成ATP，但是氧化反应过程仍能进行，即解除了氧化和磷酸化的偶联作用。该呼吸链解偶联剂可以是三氟甲氧基苯腙羰基氰化物FCCP、2,4-二硝基苯酚DNP等中的至少一个。在步骤S33中可以向细胞培养板内接种的白细胞加入呼吸链解偶联剂，以增加细胞膜对H⁺离子的通透性，检测此时的氧消耗速率值，可以得到氧消耗最大速率值。例如图3中所示的加入FCCP(单箭头示出)后，白细胞的氧消耗速率急剧上升，达到最大值时即为氧消耗最大速率值(为了便于观察，图示中以横向虚线20示出)。此时的氧消耗最大速率值与呼吸水平基础值的差值③(图中虚线双箭头③示出)即为呼吸能力储备值。该呼吸能力储备值可用于评估白细胞在不同应激条件下对能量代谢挑战的能力。

上文中所述的呼吸链抑制剂可以是线粒体呼吸链复合物I、II、III和IV中的至少一个的阻断剂，使H⁺离子不能再逆浓度梯度泵到胞外，氧化呼吸反应过程受阻。该呼吸链抑制剂可以是鱼藤酮ROT、安密妥、杀粉蝶菌素、抗霉素A(AA)、氰化物、叠氮化物、CO、H₂S等中的至少一种。在步骤S34中可以向细胞培养板内接种的白细胞加入呼吸链抑制剂，以使白细胞的氧化呼吸反应过程受阻，检测此时的氧消耗速率值，得到一个很低的稳定的速率值作为第二速率值，即非线粒体氧气消耗速率。例如图3中所示的加入鱼藤酮或抗霉素A(单箭头示出)等之后，白细胞的氧消耗速率急剧下降到一个很低的水平，此时的白细胞几乎不能进行有氧呼吸，因此此时的氧消耗速率代表了非线粒体途径的氧消耗，即第二速率值或称非线粒体氧气消耗速率(为了便于观察，图3中以横向虚线30示出)。将加入呼吸链解偶联剂后得到的氧消耗最大速率值与非线粒体途径的氧消耗的第二速率值的差值④(图中虚线双箭头④示出)作为呼吸最大潜能值。

以上结合图2和图3对根据本发明实施例的线粒体呼吸功能的检测S3进行了示例性的说明，本领域技术人员可以在本公开的教导下，根据需要进行调整。例如检测过程中的每个阶段的检测点不限于图3中所示的三个，可以根据需要设置的更多或者更少检测点。图3中所示的加入寡霉素、FCCP、鱼藤酮或者抗霉素A等均是示例性的，本领域技术人员可以根据需要选择其他的ATP合成酶阻断剂、呼吸链解偶联剂以及呼吸链抑制剂等。下面将结合图4对根据本发明的白细胞的提取S1进行示例性描述。

图4是根据本发明实施例的白细胞的提取S1的流程示意图。如图4中所示，根据本发明的一个实施例，所述白细胞的提取S1可以包括：血液样本与抗凝剂混合，离心分离得到中间层细胞S11；吸取中间层细胞并加入磷酸平衡盐PBS缓冲液，离心去除上层S12；除去残留红细胞步骤S13；以及洗涤步骤S14。

图4中所示的步骤S11中可以将采集的所述血液样本与抗凝剂混合均匀并静置，常温下对其进行离心分离，以得到中间层细胞。该中间层细胞包括白细胞。该抗凝剂可以是肝素、柠檬酸钠、氟化钾等。图示中的步骤S12可以包括吸取所述中间层细胞并向其中加入磷酸平衡盐PBS缓冲液(以对中间层细胞中的白细胞进行清洗)，离心后除去上层的所述PBS缓冲液，得到白细胞混合液。除去残留红细胞步骤S13可以包括向所述白细胞混合液中加入红细胞裂解液(以对白细胞混合液中的红细胞进行裂解，便于后续的去除)，吹打均匀并于冰上2～8℃裂解，离心分离以除去红细胞杂质。在一个实施例中，裂解温度为2℃。在另一个实施例中，裂解温度为8℃。优选地，在又一个实施例中，裂解温度为4℃，裂解时间为3分钟。在一个实施例中，重复除去残留红细胞步骤S13一次或多次，直至所述白细胞混合液中的红细胞杂质完全裂解并去除。洗涤步骤S14可以包括用所述PBS缓冲液一次或多次的洗涤除杂后的所述白细胞混合液，以得到高纯度的所述白细胞。

以上结合图4对根据本发明实施例的白细胞的提取S1进行了示例性的描述，根据上面的描述，本领域技术人员应该理解的是，通过上述的白细胞的提取步骤，可以提取完整的高纯度的白细胞，以便于后续的检测步骤，提高了实验结果的准确性。经过以上结合图1-图4的描述，本领域技术人员可以理解的是，根据本发明的检测白细胞线粒体呼吸功能的方法可以在保证完整细胞状态以及保持细胞活性的条件下检测线粒体的呼吸功能，有利于客观的反应细胞的能量代谢过程，对于研究具有细胞能量代谢异常的疾病和相关药物开发具有重要意义。以下将结合图5对该方法应用于检测肾阴虚症实验动物的线粒体呼吸功能的方法进行描述。

图5是总体上示出根据本发明的检测肾阴虚症实验动物的白细胞线粒体呼吸功能的方法流程示意图。如图5中所示，提供了一种检测肾阴虚症实验动物的白细胞线粒体呼吸功能的方法，可以包括：设置对照组和模型组S10，将实验动物分为所述对照组和所述模型组，其中所述模型组的实验动物具有所述肾阴虚症；检测所述对照组和所述模型组的白细胞线粒体呼吸功能S20，分别采集所述对照组和所述模型组的实验动物的血液样本，并按照如本发明的第一方面中任一项所述的方法进行检测；以及对比所述对照组和所述模型组的白细胞线粒体呼吸功能的检测结果，以评价所述模型组的实验动物的线粒体呼吸功能S30。本发明可以通过构建肾阴虚症模型组并且与对照组进行对比的方法，评价肾阴虚症中机体细胞的能量代谢特征。以下将结合具体实施例进行说明。

根据本发明的一个实施例，所述设置对照组和模型组S10可以包括：将实验动物按照体重随机分为所述对照组和所述模型组，其中所述模型组的实验动物灌胃给与450mg/kg体重的甲状腺片混悬液，所述对照组的实验动物灌胃给予0.9％的氯化钠注射液，两组实验动物均每天灌胃一次，连续灌胃14天。以实验大鼠作为实验动物为例，图6是示出根据本发明实施例的对照组和模型组实验大鼠的体征示意图。如图6中所示，通过对图示中的实验大鼠的体征观察，模型组的实验大鼠在被连续14天灌服甲状腺片混悬液(450mg/kg体重)后与对照组实验大鼠相比，形体明显消瘦、毛发松、精神不振，躁动易惊。

图7是根据上述设置对照组和模型组S10的实施例的实验大鼠的直肠温测量结果示意图。如图7中所示，模型组的实验大鼠在被连续14天灌服甲状腺片混悬液(450mg/kg体重)后与对照组实验大鼠相比，模型组的实验大鼠的直肠温度为38.2±0.4℃，显著高于对照组的实验大鼠的直肠温度36.8±0.6℃，说明模型组的实验动物存在阴虚内热症状。图7中所示的圆点表示对照组的多个检测数据，方型点表示模型组的多个检测数据，**表示P<0.01，P<0.01表示具有极显著统计学差异，进一步说明了对照组和模型组实验动物的直肠温的差异明显。

图8是根据上述设置对照组和模型组S10的实施例的实验大鼠的给药时间与体重变化的曲线示意图。如图8中所示，模型组的实验大鼠在被灌服甲状腺片混悬液(450mg/kg体重)后，体重增长较对照组动物明显放缓，模型组实验动物从第7天起体重与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)；至给药后第14天模型组动物平均体重为293.40±13.39克，对照组实验动物的平均体重为350.75±25.37克，二者相差57.35克，差异明显。图8中所示的*表示P＜0.05，P＜0.05表示具有显著统计学差异。**与上文中所述的相同或相似，此处不再赘述。

以下将根据上述检测白细胞线粒体呼吸功能的方法对上述对照组和模型组的白细胞线粒体呼吸功能进行检测S20。具体地，根据本发明的一个实施例，首先分别对所述对照组和所述模型组进行步骤S1白细胞的提取，即可以分别采集所述对照组和所述模型组的实验动物的外周血作为血液样本，例如使用柠檬酸钠真空采血管每管采集血液4-5mL，采集后应缓慢颠倒采血管混匀，以保证血液与抗凝剂充分混匀，静置30分钟。将采血管置于25℃，850g离心力下离心20分钟，得到中间层细胞。尽可能多的吸取中间层细胞层于2mL离心管中，补加PBS缓冲液至2mL，550g离心力下离心10分钟。弃去上层PBS缓冲液，每管加入1mL红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，冰上4℃裂解3分钟，300g离心力下4℃离心10分钟。若红细胞未充分裂解，应再加入500μL红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，离心，重复上述操作直至红细胞裂解完全。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，用白细胞培养基将白细胞稀释到检测所需的合适密度。

然后进行接种白细胞S2的步骤，其中用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理和配制白细胞培养基的步骤已经在前文中进行了详细的描述，此处不再赘述。进一步地，将稀释后的白细胞接种到细胞培养板内，静置20～30分钟。然后可以将细胞培养板常温离心，例如800g离心力离心5分钟后，放置于37℃无二氧化碳的孵箱中20～30分钟，以保证最佳检测条件和检测效果。无二氧化碳的孵箱环境可以避免二氧化碳对白细胞培养基溶液pH值的影响。37℃的孵箱环境可以使检测孔内的溶液也处于37℃。通过将离心后的细胞培养板放置20-30min，可以确保细胞完全稳定的黏附在检测孔底，并保证培养的白细胞在检测前能够适应检测孔内的溶液环境。

其次，在进行线粒体呼吸功能的检测S3之前，可以对检测探针板进行水化处理，例如在测试开始前1天，在用于水化处理的底层板的每孔内加入1mL探针校准液，并且以避免产生气泡的方式将检测探针板盖于底层板上，将检测探针板和底层板放置于37℃无二氧化碳的孵箱中12小时以上，期间可以拿出以观察检测探针板是否有气泡产生，如果有气泡产生，可以通过上下移动检测探针板的方式，排出其中的气泡。然后在上述细胞培养板内接种了白细胞后静置的20～30分钟内，可以向检测探针板的加药仓中加药，例如可以在加药仓A孔中加入56μL的寡霉素，B孔加入62μLFCCP，C孔加入69μLROT/AA，D孔不加任何药物，其中寡霉素的浓度可以是10μM，FCCP的浓度可以是5μM，ROT/AA的浓度可以是5μM，μM表示μmol/L。

上文中所述的寡霉素、三氟甲氧基苯腙羰基氰化物(FCCP)以及鱼藤酮/抗霉素A(ROT/AA)的配置方法可以是：例如将寡霉素粉末加入到630μL的白细胞培养基溶解，以得到浓度100mM的寡霉素母液；吸取寡霉素母液300μL加入到2700μL的白细胞培养基中，形成所需浓度10μM的寡霉素药剂。例如将三氟甲氧基苯腙羰基氰化物FCCP粉末加入到720μL的白细胞培养基溶解，以得到浓度100mM的FCCP母液；吸取FCCP母液150μL加入到2850μL的白细胞培养基中，形成所需浓度5μM的FCCP药剂。例如将鱼藤酮/抗霉素A(ROT/AA)粉末加入到540μL的白细胞培养基溶解，以得到浓度50mM的ROT/AA母液；吸取ROT/AA母液300μL加入到2700μL的白细胞培养基中，形成所需浓度5μM的ROT/AA药剂。

以上步骤完成后，可以开始进行步骤S3，即线粒体呼吸功能的检测。根据本发明图2中所示的步骤以及上文中所描述的检测原理，分别对模型组和对照组的实验大鼠进行检测，然后对比所述对照组和所述模型组的白细胞线粒体呼吸功能的检测结果(例如可以得到例如图9所示的检测结果对比曲线图)，以评价所述模型组的实验动物的线粒体呼吸功能S30。图9是示出对照组实验大鼠和模型组实验大鼠白细胞在一个测定周期中氧消耗速率动态变化曲线示意图。如图9中所示，模型组实验大鼠的白细胞氧消耗最大速率值明显小于对照组实验大鼠的白细胞氧消耗最大速率值，由此可知，肾阴虚症(即模型组)实验大鼠的呼吸能力储备值和呼吸最大潜能值较对照组实验大鼠都将会有明显下降，说明模型组的实验大鼠的白细胞能量代谢能力明显下降，线粒体呼吸功能显著受损。

图10是对照组和模型组实验大鼠的呼吸水平基础值和呼吸能力储备值的柱状统计示意图。如图10中所示，模型组(即肾阴虚症)实验大鼠的呼吸水平基础值略低于对照组实验大鼠的呼吸水平基础值，但是模型组(即肾阴虚症)实验大鼠的呼吸能力储备值明显小于对照组实验大鼠的呼吸能力储备值，进一步说明了肾阴虚症实验大鼠的线粒体呼吸功能受损明显。

以上结合实施例对根据本发明的检测肾阴虚症实验动物的白细胞线粒体呼吸功能的方法进行了示例性说明，通过以上实施例的定量检测实验和结合图6-图10对多方面实验结果的对比，说明了本发明的方法可以有效的评价肾阴虚症实验动物的线粒体呼吸功能以及有效的检测出肾阴虚症的细胞能量代谢异常的结果，并且可以在实验全过程中实时监测白细胞线粒体呼吸功能的变化情况，有利于研究线粒体呼吸功能受损的机理以及追踪线粒体呼吸功能受损的状态，对于研究肾阴虚症疾病的特征和药物开发等具有重要的参考和指导意义。本领域技术人员应该理解的是，以上实施例的描述是示例性的而非限制性的，例如对于对照组和模型组的直肠温的检测不限于图7中所示的四个检测点，可以根据需要检测的更多或更少个检测点。在一个检测观察周期中每个阶段的检测点也不限于图9中所示的三个，可以根据需要检测的更多或者更少个检测点。加入的药剂不限于图9中所示的药剂，可以根据需要进行调整等。

通过上面的描述，本领域技术人员可以理解在本发明的上述方案及其不同实施例中，根据本发明的检测白细胞线粒体呼吸功能的方法能够检测动物等生物体的完整白细胞状态下的线粒体呼吸功能，并对细胞能量代谢过程实行全过程实时监测，不仅可以避免提取线粒体导致的杂质污染以及线粒体活性下降等因素的影响，使研究过程更接近于线粒体实际状态，而且能够有效保证检测结果的准确性和真实性，还可以追溯细胞能量代谢全过程，对细胞研究、线粒体研究以及疾病研究等具有重要意义。特别地，本发明还将该方法应用于肾阴虚症，对于研究肾阴虚症线粒体呼吸功能具有显著的效果，可以得到明显的线粒体呼吸功能受损的检测结果。本领域技术人员可以在本公开的指导下，将本发明的方法应用于对例如肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等的线粒体呼吸功能的研究中，因此本发明的方法具有广泛的应用前景。

另外，以上实施例的附图中的检测点或柱状图上出现的T型线条或者倒立的T型线条代表误差线，可以用标准差表示。应该注意的是，上述实施例对本发明进行说明而不是对本发明进行限制，并且本领域技术人员在不脱离所附权利要求的范围的情况下可设计出替换实施例。在权利要求中，不应将位于括号之间的任何参考符号构造成对权利要求的限制。

Claims (7)

1.一种检测肾阴虚症实验动物的方法，其特征在于，步骤为：

设置对照组和模型组(S10)，将实验动物分为所述对照组和所述模型组，其中所述模型组的实验动物具有所述肾阴虚症；

检测所述对照组和所述模型组的白细胞线粒体呼吸功能(S20)，分别采集所述对照组和所述模型组的实验动物的血液样本，并按照检测白细胞线粒体呼吸功能的方法进行检测；以及

对比所述对照组和所述模型组的白细胞线粒体呼吸功能的检测结果，以评价所述模型组的实验动物的线粒体呼吸功能(S30)；

检测白细胞线粒体呼吸功能的方法，为：

白细胞的提取(S1)，采集血液样本并对所述血液样本进行分离，并提取其中的所述白细胞；

接种所述白细胞(S2)，用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理，并配制白细胞培养基，用所述白细胞培养基稀释所述白细胞并将其接种到所述细胞培养板上；以及

线粒体呼吸功能的检测(S3)，通过检测所述细胞培养板中接种的所述白细胞的不同状态的氧消耗速率，以实时监测所述白细胞中的所述线粒体呼吸功能；

其中所述白细胞的提取(S1)为：

将采集的所述血液样本与抗凝剂混合均匀并静置，常温下对其进行离心分离，以得到中间层细胞(S11)；

吸取所述中间层细胞并向其中加入磷酸平衡盐PBS缓冲液，离心后除去上层的所述PBS缓冲液，得到白细胞混合液(S12)；

除去残留红细胞步骤(S13)，向所述白细胞混合液中加入红细胞裂解液和高分子聚合物，吹打均匀并于冰上2～8℃裂解，离心分离以除去红细胞杂质；所述高分子聚合物为明胶、右旋糖酐、聚乙烯比咯烷酮或甲基纤维素；以及

洗涤步骤(S14)，用所述PBS缓冲液一次或多次的洗涤除杂后的所述白细胞混合液，以得到所述白细胞；

其中所述线粒体呼吸功能的检测(S3)为：

呼吸水平基础值的检测(S31)，检测所述白细胞的基础氧消耗速率，以得到所述白细胞的呼吸水平基础值；

三磷酸腺苷ATP关联呼吸值的检测(S32)，向所述细胞培养板中加入ATP合成酶阻断剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到的稳定速率值作为第一速率值，并将所述呼吸水平基础值与所述第一速率值作差值，以得到所述ATP关联呼吸值；所述ATP合成酶阻断剂为寡霉素；

呼吸能力储备值的检测(S33)，向所述细胞培养板中加入呼吸链解偶联剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到氧消耗最大速率值，并将所述氧消耗最大速率值与所述呼吸水平基础值作差值，以得到所述呼吸能力储备值；所述呼吸链解偶联剂为2,4-二硝基苯酚；以及

呼吸最大潜能值的检测(S34)，向所述细胞培养板中加入呼吸链抑制剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到的稳定速率值作为第二速率值，将所述氧消耗最大速率值与所述第二速率值作差值，以得到所述呼吸最大潜能值；所述呼吸链抑制剂为鱼藤酮、安密妥、杀粉蝶菌素或抗霉素A。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述设置对照组和模型组(S10)包括：

将实验动物按照体重随机分为所述对照组和所述模型组，其中所述模型组的实验动物灌胃给与450mg/kg体重的甲状腺片混悬液，所述对照组的实验动物灌胃给予0.9％的氯化钠注射液，两组实验动物均每天灌胃一次，连续灌胃14天。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述除去残留红细胞步骤(S13)中的裂解温度为4℃，裂解时间为3分钟；

所述方法进一步包括：在所述洗涤步骤(S14)之前重复所述除去残留红细胞步骤(S13)一次或多次，直至所述白细胞混合液中的所述红细胞杂质完全裂解。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理包括：

将细胞黏附剂加入到碳酸钠缓冲液中，并吹打均匀；

将稀释后的细胞黏附剂加入到所述细胞培养板的每个检测孔内并静置；以及

吸弃所述每个检测孔内的所述碳酸钠缓冲液，用无菌水洗涤所述细胞培养板，吹干后于4℃保存备用。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述白细胞培养基包括丙酮酸钠、谷氨酰胺和葡萄糖，且所述白细胞培养基的pH值为7.4，所述丙酮酸钠、谷氨酰胺和葡萄糖的浓度比为1：2：10。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述配制白细胞培养基包括：将1mL的100mM丙酮酸钠、1mL的200mM谷氨酰胺及400μL的2.5M葡萄糖加入至97.6mL的基础培养基中，混匀后加入氢氧化钠溶液以调节pH值为7.4，过滤除菌后于4℃保存。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，在进行所述线粒体呼吸功能的检测(S3)之前进一步包括：

对检测探针板进行水化处理；以及

向所述检测探针板的加药仓中加入一种或多种影响所述白细胞状态的药剂，以便于在所述线粒体呼吸功能的检测(S3)过程中向所述细胞培养板中接种的所述白细胞加入所述药剂。

Images