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CN107779494B - 一种检测感染性阴道炎的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种检测感染性阴道炎的试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测感染性阴道炎的试剂盒。所述试剂盒包括干化学反应装置、样品稀释液和至少一种显色剂：其中反应装置具有至少一种检测以下指标的反应孔：过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β‑葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β‑内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶；样品稀释液中含有TritonX‑100和树胶；显色剂由固蓝B、固红B、固蓝BB、固蓝RR、固紫B或固红TR中的至少一种组成。本发明试剂盒产品可同时评估受检者生殖道微生态环境、清洁度和细菌性阴道病致病菌状，其操作简便、快速、成本低廉。

Description

一种检测感染性阴道炎的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于医学检验测定技术领域，具体地说，涉及一种检测感染性阴道炎的试剂盒及其制备方法。
背景技术
感染性阴道炎/病是妇科常见疾病，当病原体侵入阴道，在一定的条件下使阴道黏膜产生炎症变化而形成阴道炎，其是最常见的女性生殖器官炎症，各个年龄阶段都可以罹患。发病率约占妇科门诊患者的1/3，而临床上约50％-60％的阴道炎为混合性感染。
阴道混合感染是指2种或2种以上病原体所致的感染，如果单纯依靠镜检或试剂盒，只针对某种阴道炎症或疾病进行检测，临床上50％以上的阴道炎/病将会出现漏诊、误诊的情况。
因此，为了能够降低诊断过程中出现的漏诊、误诊情况，针对于混合感染的检测是十分必要的，这不仅可以提高患者的诊治正确诊治率，同时可帮助后续治疗的给药建议，提高病人的康复率，减少患病复发率。由此可见，针对感染性阴道炎/病多指标的联合检测试剂盒是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测感染性阴道炎的试剂盒及其制备方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的检测感染性阴道炎的试剂盒，其包括：
1)干化学反应装置
所述反应装置具有至少一种检测以下指标的反应孔：过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶；
2)样品稀释液；
3)至少一种显色剂。
前述的试剂盒，所述反应装置的反应基板由ABS工程塑料制成，其中基板上设有若干个形状、大小一致的孔，分别为上述各指标的反应孔，在每个反应孔中装有相应的反应垫。
优选地，所述反应装置的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别作为过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶的反应孔。
所述反应装置的过氧化氢反应孔包被有辣根过氧化物酶、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物和3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐。
所述反应装置的唾液酸苷酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐，其对应的显色剂A为固紫B或固红TR。
所述反应装置的白细胞酯酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐。
所述反应装置的β-葡萄糖醛酸酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸盐。
所述反应装置的凝固酶反应孔包被有甘氨酰精氨酸-β-萘胺，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR，优选固蓝B。
所述反应装置的乳酸反应孔包被有D-乳酸脱氢酶、黄递酶和谷丙转氨酶。
所述反应装置的乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，其对应的显色剂A为固紫B或固红TR。
所述反应装置的β-内酰胺酶反应孔包被有头孢硝噻吩。
所述反应装置的脯氨酸氨肽酶反应孔包被有L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺盐酸盐，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR，优选固蓝B。
所述反应装置的丙氨酸氨肽酶反应孔包被有L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR，优选固蓝B。
前述的试剂盒，所述样品稀释液中含有TritonX-100和树胶。
本发明的检测感染性阴道炎的试剂盒，可按照如下方法制备得到：
(1)反应基板的制备：
反应基板由ABS工程塑料制成，其中由ABS工程塑料制成的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别对应过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶孔，在每个反应孔中填入相应的反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
(2)过氧化氢反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有酶垫和底物垫：
所述酶垫由酶溶液滴加在载体上制备而成；以0.001-1g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，用10mL水溶解，然后加入10000U的辣根过氧化物酶制成；
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以100-300mmol/L pH7.0-8.0的BK-柠檬酸缓冲液为溶剂，加入0.001-1g3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐制成；
(3)唾液酸苷酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含1-10mol/L NaClO的100-300mmol/L pH5.0-6.0的乙酸盐缓冲液为溶剂，加入0.001-1g 5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐制成；
(4)白细胞酯酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含2wt％硫酸钠的100-1000mmol/L pH 6.0-7.0的磷酸盐缓冲液为溶剂，加入0.001-1g 5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐制成；
(5)β-葡萄糖醛酸酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含10-100mmol/L乙二醇的100-300mmol/L pH 6.0-7.0的磷酸盐缓冲液为溶剂，加入0.001-1g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸盐制成；
(6)凝固酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以100-300mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液为溶剂，加入0.001-1g甘氨酰精氨酸-β-萘胺制成；
(7)乳酸反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和酶垫：
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液由500μL二甲基亚砜溶解0.001-0.1g NBT(氯化硝基四氮唑兰)，加入2mL饱和β-环糊精溶液后，再加入2.5mL乳酸显色剂保护液和0.001-0.1g NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)制成；
所述酶垫由酶溶液滴加在载体上制备而成，酶溶液以5mL酶保护液为溶剂，加入5KU D-乳酸脱氢酶，搅拌至完全溶解，再加入10-100mg黄递酶和10-100mg谷丙转氨酶制成；
上述底物溶液的乳酸显色剂保护液由pH6-7 0.1-1mol/L Tris-HCl缓冲液加入10-100g葡聚糖T70及10-100g肌醇制得；
上述酶保护液由pH7-8 500-600mmol/L双甘肽缓冲液，加入1-10g蔗糖、1-10g D-海藻糖、1-10g牛血清白蛋白、1-10g肌醇和100-1000μL吐温-20制得；
(8)乙酰氨基葡萄糖苷酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以pH5.0-6.0 500-600mmol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液为溶剂，加入0.001-1g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，同时加入葡聚糖T70和L-组氨酸制成；底物溶液中葡聚糖T70和L-组氨酸终浓度均为0.005％-50％，L-组氨酸终浓度为0.005％-50％；
(9)β-内酰胺酶反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫：
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以异丙醇为溶剂，制成0.001-0.01g/mL头孢硝噻吩、0.005％-50％甲基纤维素、10％聚乙烯吡咯烷酮、1％L-半胱氨酸和50mmol/L柠檬酸的混合液作为底物溶液；
所述缓冲垫由缓冲溶液滴加在载体上制备而成，缓冲溶液为200-600mmol/L pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液；
(10)脯氨酸氨肽酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以pH8.0-9.0 400-500mmol/L的Tris-HCl为缓冲液，制成10-40mg/mL L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、0.005％-50％TritonX-100、1％葡聚糖T70和1％D-海藻糖的混合液作为底物溶液；
(11)丙氨酸氨肽酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以500-1000mmol/LpH8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液为溶剂，制成0.001-0.01g/mL L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、0.005％-50％葡聚糖T70、1％D-海藻糖和10％TritonX-100的混合液作为底物溶液；
(12)将步骤(2)-(11)制备的反应垫填入相应的反应孔中，用冲压机压实，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置，于2-8℃保存；
(13)样品稀释液的配制：
所述样品稀释液含有0.9％NaCL、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES，pH6.5±0.2；
(14)显色剂的配制：
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固紫B或固红TR溶液；
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR溶液。
在本发明的一个具体实施方式中，所述检测试剂盒的制备方法如下：
(1)反应基板的制备：
反应基板由ABS工程塑料制成，其中由ABS工程塑料制成的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别对应过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶孔，在每个反应孔中填入相应的反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
(2)过氧化氢反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有酶垫和底物垫：
酶垫由酶溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000061
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液用10mL水溶解0.011g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，加入15000UU的辣根过氧化物酶制成；
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000062
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液用10mL pH 6.8 200mmo/L的BK-柠檬酸缓冲液为溶剂，加入0.140g 3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐制成；
(3)唾液酸苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000063
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2mol/L NaClO的200mmol/L pH5.5的乙酸盐缓冲液10mL，加入0.05g5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐制成；
(4)白细胞酯酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000071
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2wt％硫酸钠的300mmol/L pH8.3的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐制成；
(5)β-葡萄糖醛酸酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000072
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含50mmol/L乙二醇的200mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸盐制成；
(6)凝固酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000073
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以200mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液10mL，加入0.05g甘氨酰精氨酸-β-萘胺制成；
(7)乳酸反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和酶垫：
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000074
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液由500μL二甲基亚砜溶解0.01g NBT，再加入2mL饱和β-环糊精溶液后，加入2.5mL乳酸显色剂保护液和0.065g NAD制成；
乳酸显色剂保护液是以80mL的pH 6.5 0.8mol/L Tris-HCl缓冲液，加入16g葡聚糖T70及12g肌醇制得；
酶垫由酶溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000075
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液以5mL酶保护液为溶剂，加入5KU D-乳酸脱氢酶，搅拌至完全溶解，再加入76.9mg黄递酶和35mg谷丙转氨酶制成；
酶保护液由pH 7.5 600mmol/L双甘肽缓冲液45mL，加入2g蔗糖、2g D-海藻糖、1g牛血清白蛋白、3g肌醇和250μL吐温-20制得；
(8)乙酰氨基葡萄糖苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000081
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 5.0 500mmol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液5mL，加入0.025g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷、0.025g葡聚糖T70、0.0582g L-组氨酸制成；
(9)β-内酰胺酶反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫：
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000082
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以异丙醇为溶剂，制成10g/mL头孢硝噻吩、1％甲基纤维素、10％聚乙烯吡咯烷酮、1％L-半胱氨酸和50mmol/L柠檬酸的混合液作为底物溶液；
缓冲垫由缓冲溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000083
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
所述缓冲垫由缓冲溶液滴加在载体上制备而成，缓冲溶液为pH7.0、200mmol/L磷酸盐缓冲液；
(10)脯氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000084
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.0 500mmol/L的Tris-HCl 5mL为缓冲液，制成20mg/mL L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10％TritonX-100、1％葡聚糖T70和1％D-海藻糖的混合液作为底物溶液；
(11)丙氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000091
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.5 500mmol/L的Tris-HCl缓冲液5mL，制成3.5g/L L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、1％葡聚糖T70、1％D-海藻糖和10％TritonX-100的混合液作为底物溶液。
(12)将步骤(2)-(11)制备的反应垫填入相应的反应孔中，用冲压机压实，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置，于2-8℃保存。
(13)样品稀释液的配制：
所述样品稀释液含有0.9％NaCL、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES，pH6.5±0.2。
(14)显色剂的配制：
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固紫B或固红TR溶液；
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR溶液。
本发明进一步提供上述试剂盒在检测感染性阴道炎的中的应用。考虑到试剂盒保存的需要，所制备的反应垫必须具备相当高的稳定性，在大量实验研究的基础上，最终确定了上述酶液、显色液和各种底物液的组成及其配方，使得试剂盒具有理想的稳定性，能够在实际应用中推广。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(一)本发明解决了液体试剂的不稳定问题，通过加入激活剂、酶稳定剂等物质，在保证试剂垫上试剂稳定的前提下，能够快速地提高反应的灵敏度和准确性；试剂盒操作简便快速，准确性高，适用于临床常规检测特别是临床病人床旁检测使用，进而指导合理临床用药。
(二)采用本发明的试剂盒对临床上感染性阴道炎进行检测试剂盒检测结果准确率达95％以上。
(三)本发明试剂盒避免了单独观察单一指标产生的片面性和干扰因素，采用联合指标的检测对于临床上阴道混合感染的检测更准确有效。
(四)本发明试剂盒产品可在医院急诊室、基层医疗与保健单位及病人家庭使用。可同时评估受检者生殖道微生态环境、清洁度和细菌性阴道病致病菌状，其操作简便、快速、成本低廉。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1一种感染性阴道炎的干化学检测试剂盒的制备
本实施例的感染性阴道炎检测试剂盒包括：①干化学反应装置：具有检测过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶指标反应孔的反应基板；②阴道分泌物稀释液；③显色剂A及显色剂B。
反应装置按如下方法制备获得：
(1)反应基板的制备：
反应基板由ABS工程塑料制成，其中由ABS工程塑料制成的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别对应过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶孔，在每个反应孔中填入相应的反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
(2)过氧化氢反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有酶垫和底物垫：
酶垫由酶溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000111
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液用10mL水溶解0.011g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，加入15000UU的辣根过氧化物酶制成；
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000112
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液用10mL pH 6.8 200mmo/L的BK-柠檬酸缓冲液为溶剂，加入0.140g 3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐制成；
(3)唾液酸苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000113
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2mol/L NaClO的200mmol/L pH5.5的乙酸盐缓冲液10mL，加入0.05g5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐制成；
(4)白细胞酯酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000114
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2wt％硫酸钠的300mmol/L pH8.3的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐制成；
(5)β-葡萄糖醛酸酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000115
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含50mmol/L乙二醇的200mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸盐制成；
(6)凝固酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000121
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以200mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液10mL，加入0.05g甘氨酰精氨酸-β-萘胺制成；
(7)乳酸反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和酶垫：
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000122
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液由500μL二甲基亚砜溶解0.01g NBT，再加入2mL饱和β-环糊精溶液后，加入2.5mL乳酸显色剂保护液和0.065g NAD制成；
乳酸显色剂保护液是以80mL的pH 6.5 0.8mol/L Tris-HCl缓冲液，加入16g葡聚糖T70及12g肌醇制得；
酶垫由酶溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000123
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液以5mL酶保护液为溶剂，加入5KU D-乳酸脱氢酶，搅拌至完全溶解，再加入76.9mg黄递酶和35mg谷丙转氨酶制成；
酶保护液由pH 7.5 600mmol/L双甘肽缓冲液45mL，加入2g蔗糖、2g D-海藻糖、1g牛血清白蛋白、3g肌醇和250μL吐温-20制得；
(8)乙酰氨基葡萄糖苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000124
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 5.0 500mmol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液5mL，加入0.025g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷、0.025g葡聚糖T70、0.0582g L-组氨酸制成；
(9)β-内酰胺酶反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫：
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000131
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以异丙醇为溶剂，制成10g/mL头孢硝噻吩、1％甲基纤维素、10％聚乙烯吡咯烷酮、1％L-半胱氨酸和50mmol/L柠檬酸的混合液作为底物溶液；
缓冲垫由缓冲溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000132
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
所述缓冲垫由缓冲溶液滴加在载体上制备而成，缓冲溶液为pH7.0、200mmol/L磷酸盐缓冲液；
(10)脯氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000133
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.0 500mmol/L的Tris-HCl 5mL为缓冲液，制成20mg/mL L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10％TritonX-100、1％葡聚糖T70和1％D-海藻糖的混合液作为底物溶液；
(11)丙氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000134
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.5 500mmol/L的Tris-HCl缓冲液5mL，制成3.5g/L L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、1％葡聚糖T70、1％D-海藻糖和10％TritonX-100的混合液作为底物溶液。
将上述步骤(2)-(11)制备的反应垫填入相应的反应孔中，用冲压机压实，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置，于2-8℃保存。
阴道分泌物稀释液(样品稀释液)的配制：
所述样品稀释液含有0.9％NaCL、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES，pH6.5±0.2。
显色剂的配制：
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固紫B或固红TR溶液；
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR溶液。
实施例2本发明阴道炎的干化学检测试剂盒的应用
本发明的试剂盒既可以对临床上患有妇科炎症人群的阴道分泌物样本进行检测，也可对健康人群的阴道分泌物样本进行检测，以检查待测人群是否患有阴道疾病，可作为病人的诊断、鉴别诊断和疗效评价的辅助指标，也可作为健康人阴道微生态评价的辅助工具。
本发明实施例1制备的试剂盒的具体使用方法如下：
1)在使用时，首先将试纸垫(反应垫)从保存温度下取出，平衡到室温开始使用；
2)稀释液处理：用棉签从阴道后穹窿取分泌物后加入400μL稀释液稀释分泌物；
3)取25μL分泌物稀释液分别加到试纸垫上；
4)唾液酸苷酶及乙酰氨基葡萄糖苷酶孔滴加显色液A；
5)在干浴器(设置温度为45℃)上反应7min后，凝固酶、脯氨酸氨肽酶和丙氨酸氨肽酶孔滴加显色液B，继续反应3min读取各孔显色结果。本领域技术人员应当理解，根据本领域的现有技术，在使用其他保温容器如培养箱、烘箱、水浴容器等的设置温度为35-50℃的条件下反应后，也能够实现结果的对比判断。
该试剂盒可一次性快速诊断临床常见的阴道炎症，主要用于辅助诊断女性阴道微生态健康状况，包括细菌性阴道病(BV)、外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)、滴虫性阴道炎(TV)、需氧菌性阴道炎(AV)。其中丙氨酸氨肽酶阳性提示阴道分泌物内存在革兰氏阴性菌，脯氨酸氨肽酶阳性提示BV或VVC阳性，β-内酰胺酶阳性提示存在β-内酰胺类抗生素耐药菌，乙酰氨基葡萄糖苷酶阳性提示VVC或TV阳性，乳酸阳性提示阴道内部有乳酸存在，凝固酶阳性提示AV阳性，β-葡萄糖苷酶阳性提示AV阳性，白细胞酯酶阳性提示炎症存在，唾液酸苷酶阳性提示BV阳性，过氧化氢阳性提示阴道微生态异常。以上结果仅供参考，需结合临床其它病理指征进行综合判断。
反应结果判定标准：过氧化氢孔显蓝色，唾液酸苷酶孔不显色或黄色，白细胞酯酶孔不显色，β-葡萄糖醛酸苷酶孔不显色、凝固酶孔不显色或黄色，乳酸孔显蓝色、乙酰氨基葡萄糖苷酶不显色或显黄色、β-内酰胺酶孔显黄色、脯氨酸氨基肽酶不显色或显黄色、丙氨酸氨基肽酶不显色或显黄色，为阴性反应结果；过氧化氢孔不显色或显绿色，唾液酸苷酶孔显紫红色或蓝色，白细胞酯酶孔显蓝色或绿色，为阳性反应结果；β-葡萄糖醛酸苷酶孔显蓝色或绿色，凝固酶孔显紫色红色、橘黄色，乳酸孔不显色、乙酰氨基葡萄糖苷酶孔显紫红色，β-内酰胺酶孔显红色，脯氨酸氨基肽酶显红色、丙氨酸氨基肽酶显红色，为阳性反应结果。
本发明的试剂盒性能稳定，保质期为18个月。
采用本发明的试剂盒对临床上感染性阴道炎进行检测，本发明试剂盒检测结果准确率达95％以上。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
1.Sobel,J.D.,Vaginitis.New England Journal of Medicine,1997.337(26):p.1896.
2.Pheifer,T.A.,et al.,Nonspecific vaginitis:role of Haemophilusvaginalis and treatment with metronidazole.New England Journal of Medicine,1978.298(26):p.1429.
3.张萍,常见阴道炎症的治疗.中国慢性病预防与控制,2011.19(2):p.218-219.
4.郜正美and黄爱武,女性阴道单纯感染和多重感染的鉴别诊断.中国微生态学杂志,2013.25(2):p.206-207.
5.肖冰冰,刘朝晖,and廖秦平,妇科门诊不同阴道症状就诊者阴道微生态状况调查.中华妇产科杂志,2009.44(1):p.6-8.

Claims (3)

1.一种检测感染性阴道炎的试剂盒，其特征在于，其包括：
1)干化学反应装置
所述反应装置包括检测以下指标的反应孔：过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶和丙氨酸氨肽酶；
2)样品稀释液；
3)至少一种显色剂；
所述反应装置的过氧化氢反应孔包被有辣根过氧化物酶、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物和3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐；
所述反应装置的唾液酸苷酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐，其对应的显色剂A为固紫B或固红TR；
所述反应装置的白细胞酯酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐；
所述反应装置的β -葡萄糖醛酸酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸盐；
所述反应装置的凝固酶反应孔包被有甘氨酰精氨酸-β-萘胺，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR；
所述反应装置的乳酸反应孔包被有D-乳酸脱氢酶、黄递酶和谷丙转氨酶；
所述反应装置的乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，其对应的显色剂A为固紫B或固红TR；
所述反应装置的β-内酰胺酶反应孔包被有头孢硝噻吩；
所述反应装置的脯氨酸氨肽酶反应孔包被有L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺盐酸盐，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR；
所述反应装置的丙氨酸氨肽酶反应孔包被有L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR；
所述反应装置的反应基板上设有若干个形状、大小一致的孔，分别为上述各指标的反应孔，在每个反应孔中装有相应的反应垫；
所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
（1）反应基板的制备：
反应基板由ABS工程塑料制成，其中由ABS工程塑料制成的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别对应过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶孔，在每个反应孔中填入相应的反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
（2）过氧化氢反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有酶垫和底物垫：
所述酶垫由酶溶液滴加在载体上制备而成；以0.001g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，用10mL水溶解，然后加入10000U的辣根过氧化物酶制成；
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以200 mmol/L pH 6.8的BK-柠檬酸缓冲液为溶剂，加入0.140g 3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐制成；
（3）唾液酸苷酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含2mol/L NaClO的200mmol/L pH5.5的乙酸盐缓冲液为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐制成；
（4）白细胞酯酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含2wt%硫酸钠的300mmol/L pH 8.3的磷酸盐缓冲液为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐制成；
（5）β -葡萄糖醛酸酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含50mmol/L乙二醇的200mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸盐制成；
（6）凝固酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以200 mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液为溶剂，加入0.05g甘氨酰精氨酸-β-萘胺制成；
（7）乳酸反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和酶垫：
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液由500μL二甲基亚砜溶解0.01g氯化硝基四氮唑兰，加入2mL饱和β-环糊精溶液后，再加入2.5mL乳酸显色剂保护液和0.065g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸制成；
所述酶垫由酶溶液滴加在载体上制备而成，酶溶液以5mL酶保护液为溶剂，加入5KU D-乳酸脱氢酶，搅拌至完全溶解，再加入76.9mg黄递酶和35mg谷丙转氨酶制成；
上述底物溶液的乳酸显色剂保护液pH 6.5 0.8mol/L Tris-HCl缓冲液加入16g葡聚糖T70及12g肌醇制得；
上述酶保护液由pH7.5 600 mmol/L双甘肽缓冲液，加入2g蔗糖、2g D-海藻糖、1g牛血清白蛋白、3g肌醇和250μL吐温-20制得；
（8）乙酰氨基葡萄糖苷酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以pH 5.0 500mmol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液为溶剂，加入0.025g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，同时加入0.025g葡聚糖T70和0.0582 g L-组氨酸制成；
（9）β-内酰胺酶反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫：
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以异丙醇为溶剂，制成10g/mL头孢硝噻吩、1%甲基纤维素、10%聚乙烯吡咯烷酮、1% L-半胱氨酸和50mmol/L柠檬酸的混合液作为底物溶液；
所述缓冲垫由缓冲溶液滴加在载体上制备而成，缓冲溶液为pH 7.0、200mmol/L磷酸盐缓冲液；
（10）脯氨酸氨肽酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以pH 8.0 500mmol/L的Tris-HCl为缓冲液，制成20mg/mL L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10% TritonX-100、1%葡聚糖T70和1% D-海藻糖的混合液作为底物溶液；
（11）丙氨酸氨肽酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以pH 8.5 500mmol/L的Tris-HCl缓冲液为溶剂，制成3.5g/L L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、1%葡聚糖T70、1% D-海藻糖和10% TritonX-100的混合液作为底物溶液；
（12）将步骤（2）-（11）制备的反应垫填入相应的反应孔中，用冲压机压实，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置，于2-8℃保存；
（13）样品稀释液的配制：
所述样品稀释液含有0.9％NaCL、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES，pH6.5±0.2；
（14）显色剂的配制：
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固紫B、固红TR、固蓝B、固蓝BB或固蓝RR溶液。
2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
（1）反应基板的制备：
反应基板由ABS工程塑料制成，其中由ABS工程塑料制成的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别对应过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶孔，在每个反应孔中填入相应的反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
（2）过氧化氢反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有酶垫和底物垫：
酶垫由酶溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液用10mL水溶解0.011g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，加入15000UU的辣根过氧化物酶制成；
底物垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液用10mL pH 6.8 200mmo/L的BK-柠檬酸缓冲液为溶剂，加入0.140g 3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐制成；
（3）唾液酸苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2mol/L NaClO的200mmol/L pH5.5的乙酸盐缓冲液10mL，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐制成；
（4）白细胞酯酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2wt%硫酸钠的300mmol/L pH8.3的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐制成；
（5）β -葡萄糖醛酸酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含50mmol/L乙二醇的200mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸盐制成；
（6）凝固酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以200mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液10mL，加入0.05g甘氨酰精氨酸-β-萘胺制成；
（7）乳酸反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和酶垫：
底物垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液由500μL二甲基亚砜溶解0.01g氯化硝基四氮唑兰，再加入2mL饱和β-环糊精溶液后，加入2.5mL乳酸显色剂保护液和0.065g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸制成；
乳酸显色剂保护液是以80mL的pH 6.5 0.8mol/L Tris-HCl缓冲液，加入16g葡聚糖T70及12g肌醇制得；
酶垫由酶溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液以5mL酶保护液为溶剂，加入5KU D-乳酸脱氢酶，搅拌至完全溶解，再加入76.9mg黄递酶和35mg谷丙转氨酶制成；
酶保护液由pH 7.5 600 mmol/L双甘肽缓冲液45mL，加入2g蔗糖、2g D-海藻糖、1g牛血清白蛋白、3g肌醇和250μL吐温-20制得；
（8）乙酰氨基葡萄糖苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 5.0 500mmol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液5mL，加入0.025g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷、0.025g葡聚糖T70、0.0582 g L-组氨酸制成；
（9）β-内酰胺酶反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫：
底物垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以异丙醇为溶剂，制成10g/mL头孢硝噻吩、1%甲基纤维素、10%聚乙烯吡咯烷酮、1% L-半胱氨酸和50mmol/L柠檬酸的混合液作为底物溶液；
缓冲垫由缓冲溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
所述缓冲垫由缓冲溶液滴加在载体上制备而成，缓冲溶液为pH 7.0、200mmol/L磷酸盐缓冲液；
（10）脯氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.0 500mmol/L的Tris-HCl 5mL为缓冲液，制成20mg/mL L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10% TritonX-100、1%葡聚糖T70和1% D-海藻糖的混合液作为底物溶液；
（11）丙氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.5 500mmol/L的Tris-HCl缓冲液5mL，制成3.5g/L L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、1%葡聚糖T70、1% D-海藻糖和10% TritonX-100的混合液作为底物溶液。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中含有TritonX-100和树胶。
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