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CN114099417B - 中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药凝胶及其制法和使法 - Google Patents

中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药凝胶及其制法和使法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶及其制备方法和使用方法，所述载药水凝胶包括正电性组蛋白和负电性海藻酸钠；所述制备方法包括将组蛋白水溶液缓慢滴加至海藻酸钠水溶液中，溶液迅速发生沉淀；收集白色沉淀，将白色沉淀塑形成为片状的聚合物复合物，并放置至聚合物复合物变的几乎透明，得到水凝胶。本发明所用材料生物相容性高，制备条件简单温和，利用肿瘤术后生理过程实现水凝胶材料降解，并实现NETs局部药物释放，从而纠正NETs局部的高免疫抑制作用；同时本发明所述水凝胶载药体系具有优于游离药物的抗肿瘤转移疗效，且术后植入方式方便简单，有利于临床应用。

Description

中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药凝胶及其制法和使法
技术领域
本发明涉及纳米材料制备及生物医药领域，尤其涉及一种中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶及其制备方法和使用方法。
背景技术
手术切除是恶性肿瘤的主要治疗方式。手术切除肿瘤后，手术过程中受损组织释放各种生长因子和细胞因子以促进炎性反应和损伤修复，但其中的一些因子也可以促进肿瘤生长。这些因子导致肿瘤在切除原位复发，同时也可以促进肿瘤远处转移的形成。
中性粒细胞会在炎症状态下，释放精氨酸脱亚胺酶，促使与DNA结合的组蛋白结构内的精氨酸瓜氨酸化，使得正电性组蛋白变成电中性，染色体解聚释放 DNA链，形成中性粒细胞胞外杀菌网络NETs(neutrophil extracellular traps)， NETs由核酸物质组成，不含任何其他细胞骨架蛋白。研究发现由于中性粒细胞 NETs会脱颗粒释放基质金属蛋白酶形成局部高浓度，使NETs局部微环境免疫抑制程度加重，促进肿瘤进展与转移。
现有的针对肿瘤术后复发及转移的响应性水凝胶，大多响应整个肿瘤组织或术后切面。尚未有针对NETs局部递药的载药水凝胶。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种纠正NETs局部的高免疫抑制作用、抑制肿瘤的复发与转移的中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶；本发明的另一目的是提供一种中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶的制备方法；本发明的另一目的是提供一种中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶的使用方法。
技术方案：本发明的中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶，所述载药水凝胶包括正电性组蛋白和负电性海藻酸钠。
所述组蛋白为H2A、H2B、H3或H4，优选地为H3。
一种上述的载药水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将组蛋白水溶液缓慢滴加至海藻酸钠水溶液中，溶液迅速发生沉淀。
(2)收集白色沉淀，将白色沉淀塑形成为片状的聚合物复合物，并放置至聚合物复合物变的几乎透明，得到水凝胶。
进一步地，所述的滴加方法为蠕动泵滴加。
进一步地，组蛋白水溶液浓度和海藻酸钠水溶液浓度相同。
进一步地，收集白色沉淀的方法为离心。
进一步地，放置温度为4-8℃。
一种上述的载药水凝胶的使用方法，所述使用方法为将载药水凝胶冷冻干燥后浸入待载的药物的水溶液中，静置一段时间以达到溶胀平衡的状态。
一种水凝胶载药系统，该载药系统包括中性粒细胞NETs局部响应性水凝胶和加载到该水凝胶中的药物；该水凝胶由正电性组蛋白及负电性海藻酸钠组成，中性粒细胞会在炎症状态下，释放精氨酸脱亚胺酶，促使与DNA结合的组蛋白结构内的精氨酸瓜氨酸化，使得正电性组蛋白变成电中性，导致水凝胶于NETs 局部解聚释放药物。
由于手术切除肿瘤后，手术过程中受损组织释放各种生长因子和细胞因子以促进炎性反应和损伤修复，但其中的一些因子也可以促进肿瘤生长；这些因子导致肿瘤在切除原位复发，也可以促进肿瘤远处转移的形成。同时手术部位的炎症环境将募集中性粒细胞在切除部位形成NETs，由于NETs会脱颗粒释放基质金属蛋白酶形成局部高浓度，使NETs局部微环境免疫抑制程度加重，促进肿瘤进展与转移。本发明利用正电性的组蛋白，与负电性的海藻酸钠的静电相互作用形成聚电解质水凝胶，利用中性粒细胞形成NETs的原理，在精氨酸脱亚胺酶作用下，使材料中正电性组蛋白变为电中性，水凝胶载入手术切除部位，实现NETs 局部药物释放，并形成局部高浓度，从而纠正NETs局部的高免疫抑制作用，从而有效的抑制肿瘤的复发及转移。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：所用材料生物相容性高，制备条件简单温和，利用肿瘤术后生理过程实现水凝胶材料降解，并实现 NETs局部药物释放，从而纠正NETs局部的高免疫抑制作用；同时本发明所述水凝胶载药体系具有优于游离药物的抗肿瘤转移疗效，且术后植入方式方便简单，有利于临床应用。
附图说明
图1为本发明的水凝胶照片，(A)为水凝胶，(B)为水饱和后水凝胶；
图2为实施例2中不同组别的水凝胶降解率；
图3为实施例3中不同组别的水凝胶降解率；
图4为实施例4中不同组别的肺部H&E染色切片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：载药水凝胶制备
本发明的中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶，载药水凝胶包括正电性组蛋白和负电性海藻酸钠，其中，正电性组蛋白为H2A、H2B、H3或H4。
本发明的中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶制备方法步骤：(1)采用沉淀塑性法制备水凝胶贴片，将10mg/mL组蛋白水溶液1mL通过蠕动泵缓慢滴加至1mL浓度为10mg/mL的海藻酸钠水溶液中，由于聚电解质之间强烈的静电作用迅速发生沉淀。
(2)15000g离心力作用下离心5min收集白色沉淀，并通过两块玻璃片将其塑形成为片状的聚合物复合物。4℃放置5天，直至聚合物复合物变的几乎透明。
如图1所示，水凝胶为透明的，水饱和后水凝胶为白色。
实施例2：体外凝胶降解实验
将所制备水凝胶贴片冷冻干燥24h并称重，后浸入水中4℃静置24小时以达到溶胀平衡的状态，擦干表面水分称重。水凝胶含水率通过以下公式进行计算 Qe＝(M1-M2)/M1*100％。其中M1：水凝胶在水中吸水饱和48h，滤纸吸干表面水分后的重量；M2：水凝胶冷冻干燥至恒重的重量。所制备水凝胶贴片含水率 75.5％。
采用干态浸泡法进行单抗药物的载药。将所制备的水凝胶贴片浸入含有2 mg/mLTGF-β单抗的水溶液中。4℃静置24小时以达到溶胀平衡的状态。BCA 试剂盒测定载药后上清中药物浓度，确定凝胶包载药物的含量。干态水凝胶对水和药物无选择性吸收，因此凝胶的载药量取决于凝胶的吸水量及水中药物浓度。
体外凝胶降解实验分为三组。NETs组：中性粒细胞加PMA；对照组A (Neutrophil&PBS)：中性粒细胞加PBS；对照组B(PMA&PBS)：PMA加 PBS。
首先将所提取的中性粒细胞按4×105个/孔接种至24孔板中(含1％血清)，其中中性粒细胞由小鼠骨髓中提取分离得到，每孔0.5mL，CO2培养箱中培养1 h静置处理细胞。随后NETs组中加入0.50mL 100nM PMA和灭菌凝胶，对照组A中加入0.5mL PBS和灭菌凝胶，对照组B中不含细胞，为0.5mL 100nM PMA加0.5mL PBS。隔天提取中性粒细胞，更换介质。1，3，7天后，剩余水凝胶冻干称重。如图2所示，NETs存在的条件下，所制备的水凝胶会更快的降解。
实施例3：动物模型中水凝胶降解实验
构建乳腺癌原位模型，肿瘤长至200mm3，进行术后切除(保留10％的肿瘤模拟术后残留)。术后小鼠模型分为三组，组蛋白海藻酸钠水凝胶组(SA-H)，壳聚糖海藻酸钠水凝胶组(SA-C)及组蛋白海藻酸钠水凝胶小鼠中性粒细胞耗竭组(SA-H，neutrophildepletion)。将材料植入术后腔中，于术后1、3、7、14 天取出材料，称重，SEM观察内部结构。
如图3所示，组蛋白海藻酸钠水凝胶在乳腺癌小鼠术后模型中，14天降解 78.8％，对照组壳聚糖海藻酸钠水凝胶降解19.8％，小鼠中性粒细胞耗竭组降解 12.7％。
实施例4：水凝胶载药抗癌效果实验
构建乳腺癌原位模型，肿瘤长至200mm3，进行术后切除(保留10％的肿瘤模拟术后残留)。术后小鼠模型分为三组，生理盐水组(Control(saline))，游离药组(Free TGF-βmonoclonal antibody)及水凝胶组(Hydrogel)，游离药组和水凝胶组中使用的药物为TGF-β单克隆抗体，给药剂量为100μg/只。观察术后十四天中肺部转移情况。
如图4所示，肺部H&E染色观察到空白组小鼠有多个转移灶，游离药组小鼠转移灶少于空白组，凝胶组小鼠肺部未发生转移，说明本发明所涉及的水凝胶载药后可有效的抑制乳腺癌的术后转移，且优于游离药物的抗肿瘤转移疗效。
本发明的水凝胶载药后，可实现局部药物释放，并形成局部高浓度，从而减少NETs造成的局部高免疫抑制，与待载药协同作用，提高待载药药效，有效抑制肿瘤转移。

Claims (7)

1.一种中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶，其特征在于，所述载药水凝胶由正电性组蛋白和负电性海藻酸钠组成；所述载药水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）将组蛋白水溶液缓慢滴加至海藻酸钠水溶液中，溶液迅速发生沉淀；（2）收集白色沉淀，将白色沉淀塑形成为片状的聚合物复合物，并放置至聚合物复合物变的几乎透明，得到水凝胶。
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶，其特征在于，所述组蛋白为H3。
3.根据权利要求1所述的中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶，其特征在于，步骤（1）中，所述的滴加的方法为蠕动泵滴加。
4.根据权利要求1所述的中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶，其特征在于，步骤（1）中，组蛋白水溶液浓度和海藻酸钠水溶液浓度相同。
5.根据权利要求1所述的中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶，其特征在于，步骤（2）中，收集白色沉淀的方法为离心。
6.根据权利要求1所述的中性粒细胞胞外杀菌网络响应性载药水凝胶，其特征在于，步骤（2）中，放置温度为4-8 ℃。
7.一种根据权利要求1-6任一所述的载药水凝胶在制备药物载体/制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，药物负载过程中，将载药水凝胶冷冻干燥后浸入待载的药物的水溶液中，静置一段时间以达到溶胀平衡的状态。
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