CN114047264A - 一种快速鉴别硫熏白芷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别硫熏白芷的方法。它包括如下步骤：将待测样品配制成溶液，进行高效液相色谱法分离、高分辨质谱检测，当所述高分辨质谱中总离子流图中存在385.06的峰时，说明所述待测白芷样品是硫熏白芷；当所述总离子流图中不存在385.06的峰时，说明所述待测白芷样品不是硫熏白芷。本发明运用高分辨质谱技术在总离子流图中提取385.06的峰的方法，在有无标准品时，均能快速区分硫熏与无硫白芷，具有简便、快速、专属性强、灵敏度高的优点。

Description

一种快速鉴别硫熏白芷的方法

技术领域

本发明涉及一种快速鉴别硫熏白芷的方法，属于分析检测领域。

背景技术

白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan(AD)的干燥根。在中国、日本、韩国等国家作传统药材使用，具有解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓的功效。此外亦是生活中常见的使用香料及香薰料，同时，白芷具有润肤美白，改善局部微循环，促进皮肤新陈代谢、延缓皮肤衰老的作用。其用于美容，有2千年多年的历史，《神农本草经》中将白芷列为上品，谓其能“长肌肤，润泽，可作面脂”。《本草经集注》：“可作膏药，面脂，润颜色”。作为生活中常见的调料和煲汤材料，亦可与其他中药一起作为茶饮。近年来，由于市场需求量增大，2013年仅中国白芷年产量就有12000吨。可见，白芷使用历史悠久、功效明确，用途广泛，种植栽培面积大，是一种前景可观的经济作物。

现代研究表明白芷中主要含有香豆素类、挥发油类、多糖等化学成分。而富含多糖的中药在存储的过程中易于霉变及虫蛀。因此在食品及中药加工中常使用亚硫酸及其盐类物质以防止食物发霉变质。二氧化硫遇水形成亚硫酸，是较强的还原剂，在被氧化时可将着色物质还原退色，使食品保持鲜艳色泽，还可抑制食品中的氧化酶，防止食品褐变。由于其还原作用，可直接杀死成虫、虫卵、幼虫，还可阻断微生物的正常生理氧化过程，抑制微生物繁殖，从而起到防虫防腐作用。其独特的特性使其受到食品、中药加工者的青睐，以用作漂白剂和防腐剂。白芷在产地加工中亦常使用硫熏处理的方法。但硫熏处理可能会使其中的化学成分发生改变，从而影响白芷的质量。

同时，目前对于硫熏白芷的鉴别主要依赖二氧化硫残留量。有研究表明二氧化硫残留量与硫熏人参的质量、有效性和安全性没有直接关系，并且随着存贮时间的延长，硫熏白芷中二氧化硫残留量逐渐降低。并且现有的二氧化硫残留量测定方法灵敏度低，因此，以二氧化硫残留量判定中药是否硫熏及硫熏程度具有很大的局限性。因此，寻找硫熏白芷的含硫标记物是较为可靠的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速鉴别硫熏白芷的方法。

本发明灵敏度高，二氧化硫残留量仅为56.83mg/Kg的样品，也可快速检出，该方法具有快速，简便，专属性强的特点。

本发明提供的一种快速鉴别硫熏白芷的方法，包括如下步骤：将待测样品配制成溶液，进行高效液相色谱法分离、高分辨质谱检测，当所述高分辨质谱中总离子流图中存在385.06的峰时，说明所述待测白芷样品是硫熏白芷；当所述总离子流图中不存在385.06的峰时，说明所述待测白芷样品不是硫熏白芷。

上述的方法中，所述高效液相色谱法的条件如下：

洗脱溶剂：A相为0.1％甲酸水，B相为0.1％甲酸乙腈；

梯度洗脱程序如下：5％B相，0-2min；由5％到30％B相，2-7min，由30％到45％B相，7-12min；由45％到60％B相，12-25min；由60到90％B相，25-30min；由90％到98％B相，30-30.05min；98％B相，30.05-33min；以上均以体积百分比计；

进样量：1μL；

流速：0.5mL/min；

柱温：40℃。

上述的方法中，所述高分辨质谱检测的条件如下：

采用ESI离子源，Masslynx V4.1信号采集系统；

负离子模式；

UPLC-Q-TOF-PDA-MS系统；

检测数据格式：continuum；

锥孔电压：40V；

碰撞能量：30-60eV；

毛细管电压：2kV；

锥孔气流速度：50L/Hr；

脱溶剂气流速度：650L/Hr；

数据采集范围：50-1500Da；

校正液为亮氨酸脑啡肽，负离子模式下准确分子质量设置为554.2620。

上述的方法中，所述方法中还包括将标准品配制成溶液作为对照品，进行高效液相色谱法分离、高分辨质谱检测；

所述标准品为结构式如下式I所示的化合物：

本发明中，当不采用对照品进行检测时，直接按照所述高效液相色谱法的条件和所述高分辨质谱检测的条件进行实验，当所述高分辨质谱中总离子流图中存在385.06的峰时，说明所述待测白芷样品是硫熏白芷；否则不是硫熏白芷。

本发明中，当采用式I所示的化合物作为标准品，进行对照品检测时，可按照直接按照所述高效液相色谱法的条件和所述高分辨质谱检测的条件进行实验，或不按照上述条件，当所述待测样品采用所述高效液相色谱法分离到上述式I所示的化合物的峰为准，然后对照进行高分辨质谱检测，当所述高分辨质谱中总离子流图中存在385.06的峰时，说明所述待测白芷样品是硫熏白芷；否则不是硫熏白芷。

本发明具有以下优点：

运用高分辨质谱技术在总离子流图中提取385.06的峰的方法，在有无标准品时，均能快速区分硫熏与无硫白芷，具有简便、快速、专属性强、灵敏度高的优点。

附图说明

图1为化合物1的质谱裂解途经。

图2为化合物1的¹H NMR(600MHz，D₂O)谱图。

图3为化合物1的¹³C NMR(125MHz，D₂O)谱图。

图4为化合物1的异核多碳相关谱图(简称HMBC谱图)。

图5为化合物1的立体构型的确定图；其中图5中A为氘代水中氢原子与碳原子的主要远程相关；图5中B为化合物1的MTPA(α-甲氧基三氟甲基苯基乙酸)酯之间的Δδ值(Δδ＝b_S-b_R)；图5中C为化合物1的电子圆二色谱图(简称ECD)。

图6为化合物1的异核多量子相关谱图(简称HSQC谱图)。

图7为不同硫熏程度白芷提取的含385.06的峰。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、

1、实验仪器、试剂及材料

仪器及试剂：ACQUITYI-Class超高效液相色谱仪-Waters Xevo-G2-SQTofMS质谱系统(美国Waters公司)、ACQUITY UPLCTM I-Class系统，采用电喷雾离子源，WatersACQUITYUPLC-HSS-T3色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm，美国Waters公司)、梅特勒-托利多(Mettler Toledo)New classic MF型十万分之一分析天平梅特勒-托利多(瑞士MettlerToledo公司)，BSA224S型万分之一分析天平(德国Sartorius公司)、Centrifuge 5415D型离心机(德国Eppendorf公司)、SB-800-DTD型超声清洗机，超声功率500W(宁波新芝生物科技股份有限公司)、Pacific T-II型超纯水仪(美国Thermo公司)。0.22μmhydrohpobic疏水PTFE微孔滤头(Millipor公司，美国)。水为超纯水、甲醇，乙腈为色谱纯(美国FisherScientific公司)，其余试剂均为分析纯。HPLC(安捷伦，美国加利福尼亚州圣克拉拉)。

实验材料：2019年8月31日从安徽亳州采集的白芷新鲜样品，经鉴定其原植物为伞形科植物白芷。

2、硫熏样品制备

将采得的新鲜白芷洗净，表面晾干。将其分为无硫组和硫熏组。硫熏组使用硫磺与样品的比例分别为1∶20。(每组3份样品，每份样品约200g)。将分好组的样品分别置于2个塑料箱，每组以点燃12ml酒精点燃。2小时后取出，于40℃烘箱中干燥3d。将干燥好的样品粉碎，继续于40℃烘箱中干燥45h，粉末保存于4℃冰箱。

3、化合物分离

取硫熏白芷药材粉末10Kg，加入80％乙醇水溶液约130L，浸泡过夜，超声提取30min，关闭仪器，打开阀门，使过滤液流出。反复超声提取三次后，将样品浓缩，得到约3L浓缩液，离心至溶液澄清。取出上清液分别用石油醚，乙酸乙酯萃取。将得到的各部位分别浓缩，挥干溶剂后复溶，各取1μL进UPLC-PDA(超高效液相色谱-二极管阵列检测器)，结果表明目标化合物存在于水部位。

将得到的水部位过大孔吸附树脂柱，分别用纯水，15％乙醇水，30％乙醇水，50％乙醇水，纯乙醇洗脱，每个梯度溶剂分别使用3个柱体积的溶剂洗脱。每500ml接一次流份，每个各取1μL进UPLC-PDA。结果表明：目标化合物存在于15％及30％的乙醇洗脱液中，其中含有一个较纯的目标化合物。将目标流份(含目标化合物的收集液)过凝胶柱，以纯水洗脱，得化合物1(记为OXH-S)。

4、化合物结构的鉴定

将OXH-S(4mg，0.010mmol)用500μLpyridine-d5溶于核磁管中，加入R-(-)-MTPACl(4μL，0.021mmol)，处于氩气保护下于室温过夜，得到R-OXH-S。类似地，从OXH-S(4mg，0.010mmo1)和S-(+)-MTPACl(4μl，0.021mmol)中得到S-OXH-S。

电子圆二色性(ECD)计算过程：基于xtb程序，采用GFN-xtb方法，在Molclus(1.9.9.4版)中搜索化合物1的构象。在B3LYP/6-31g(d)水平下，用Gaussian-09程序对相对能量小于3kcal/mol的构象进行了进一步优化。根据Boltzmann分布(>1％)，对(4R，12S)-46和(4S，12S)-OXH-S分别选择了6个和5个优势构象。最后用含时密度泛函理论(TD-DFT)在MeOH中对优化好的几个优势构象在CAM-B3LYP/6-31+g(d，p)水平上进行了ECD的理论计算，计算了50个激发态的旋光强度，拟合了优势构象的ECD图。

5、供试品溶液的制备

取以上各样品粉末约0.2g，分别加入1.6ml甲醇溶液(80％)，混匀，超声1h，补充差重，15000rpm的转速离心10min，过0.22μm滤膜，分别得各样品溶液。再分别取各品种样品溶液50μL混匀，得混合样品溶液(作为质量控制对照组)。

6、液相条件

以0.1％甲酸水(A)、0.1％甲酸乙腈(B)为洗脱溶剂，梯度洗脱程序见下表。梯度洗脱程序如下：5％B(0-2min)，5→30％B(2-7min)，30→45％B(7-12min)，45→60％B(12-25min)，60→90％B(25-30min)，90→98％B(30-30.05min)，98％B(30.05-33min)。进样量：1μL，流速：0.5mL/min，柱温：40℃。以上百分比均以体积百分比计。

7、质谱条件

采用ESI离子源，MasslynxV4.1信号采集系统。负离子模式下采集数据，离子源参数为锥孔电压(Sample cone)：40V；碰撞能量(Ramp High Energy)：30-60eV；毛细管电压(Capillary)：2kV；锥孔气流速度(Cone Gas Flow)：50L/Hr；脱溶剂气流速度：650L/Hr。将以上制备的各样品及标准品溶液注入UPLC-Q-TOF-PDA-MS系统。检测数据格式(SurveyData Format)：continuum；数据采集范围(Acquisition mass range)：50-1500Da；校正液(lock mass)为亮氨酸脑啡肽(Leucine enkephalin)，负离子模式下准确分子质量设置为554.2620。

8、二氧化硫残留量的测定

按照2020版《中华人民共和国药典》附录四中二氧化硫残留量测定方法对硫熏白芷中二氧化硫残留量进行测定。

实验结果：

1、化合物1的结构鉴定

化合物1为黄色粉末。高分辨质谱数据显示m/z 385.0591[M-H]-(calcd385.0587)，m/z 771.1204[M-H]^-(calcd 771.1212)，and m/z 793.1116[M-Na+2H]^-(calcd793.1084)，说明其分子式为C₁₆H₁₈O₉S。与水合氧化前胡素及香豆素((R)-heraclenol)相比，分子式中多一分子的H₂SO₃，因此，推测化合物1为水合氧化前胡素或(R)-heraclenol与H₂SO₃发生加成反应生成的。其质谱裂解途经如图1所示。

如图2所示，¹H NMR(600MHz，D₂O)数据如下δ：7.74(H，s，H-2’)，7.10(H，s，H-8)，7.10(H，s，H-3′)，4.69(H，d，J＝10.2HZ，H-11a)，4.45(H，t，J＝8.6HZ，H-11b)，3.84(H，m，H-12)，1.28(3H，s，H-14)，1.26(3H，s，H-15))。与水合氧化前胡素的数据较为一致。同时δ_H4.92(H，s，H-4)及3.29(H，d，J＝17.4HZ，H-3)的化学位移值比水和氧化前胡素低，显示C-3和C-4之间双键断开。如图3所示为¹³C NMR(125MHz，D₂O)数据。此外，H-3与C-2/C-4/C-10远程相关，H-4与C-2/C-3/C-5/C-9/C-10远程相关，说明该磺酸基团位于C-4上。H-11与C-5/C-12/C-13远程相关，H-12与C-11/C-13/C14/C15远程相关，H-14与C-12/C-13/C-15远程相关，H-15与C-12/C-13/C-14远程相关，说明2，3-二羟基-3-甲基丁氧基(英文名称为2，3-dihydroxy-3-methylbutoxy)连接在C-5上(HMBC谱见图4)。主要H与C原子的远程耦合见图5中A所示。HMQC谱如图6所示。

为确定化合物1的绝对构型，分别采用mosher法确定了C-11为S构型，C-4为R构型。Mosher法计算的S构型与R构型的化合物1-MATP酯的氢原子的化学位移差值如图5中B所示，说明C-11为S构型。运用高斯软件拟合的化合物1的(4R，11S)的圆二色谱曲线与实验曲线较为相似(见图5中C)，因此，确定C-11为S构型，C-4为R构型。并将其命名为(4R，12S)-4-磺酸基-(3，4)-二氢水合氧化前胡素(英文名称为(4R，12S)-3，4-dihydrooxypeucedaninhydrate-4-sulfonic acid)，其结构式如下式I所示：

2、不同硫熏程度的白芷的鉴别

化合物1仅在硫熏白芷中出现，说明化合物1可作为硫熏白芷特异性成分鉴别硫熏和无硫白芷。对不同含硫量的白芷样品分别按照2020版《中国药典》酸碱滴定法及本发明高分辨质谱法检测。如表1所示，表1中二氧化硫残留量检测结果表示为SO₂(mg/Kg)含量，式I所示化合物的峰面积表示通过高分辨质谱法检测的结果。N-1～N-4为无硫样品，由表1中结果可知，二氧化硫残留量检测结果均出现假阳性，但本发明质谱检测并未出现385.05的峰，说明本发明质谱检测的方法具有更高的准确性。如图7所示，化合物1的特征离子为385.06。在不同硫熏程度白芷总离子流图中提取385.06，如表1及图7中S-1样品通过二氧化硫残留量检测，测定二氧化硫残留量仅为56.83mg/kg时，本发明方法亦能检测出385.06的峰，说明本发明方法具有较高的灵敏度。

表1不同硫熏程度白芷中二氧化硫残留量及385.06峰面积

注：N-1～N-4为无硫样品；S-1～S-15为硫熏样品。

3、结论

运用高分辨质谱技术在总离子流图中提取385.06的峰的方法，区分硫熏与无硫白芷具有简便、快速、专属性强、灵敏度高度的优点。

Claims (4)

1.一种快速鉴别硫熏白芷的方法，包括如下步骤：将待测样品配制成溶液，进行高效液相色谱法分离、高分辨质谱检测，当所述高分辨质谱中总离子流图中存在385.06的峰时，说明所述待测白芷样品是硫熏白芷；当所述总离子流图中不存在385.06的峰时，说明所述待测白芷样品不是硫熏白芷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述高效液相色谱法的条件如下：

洗脱溶剂：A相为0.1％甲酸水，B相为0.1％甲酸乙腈；

梯度洗脱程序如下：5％B相，0-2min；由5％到30％B相，2-7min，由30％到45％B相，7-12min；由45％到60％B相，12-25min；由60到90％B相，25-30min；由90％到98％B相，30-30.05min；98％B相，30.05-33min；以上均以体积百分比计；

进样量：1μL；

流速：0.5mL/min；

柱温：40℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述高分辨质谱检测的条件如下：

采用ESI离子源，Masslynx V4.1信号采集系统；

负离子模式；

UPLC-Q-TOF-PDA-MS系统；

检测数据格式：continuum；

锥孔电压：40V；

碰撞能量：30-60eV；

毛细管电压：2kV；

锥孔气流速度：50L/Hr；

脱溶剂气流速度：650L/Hr；

数据采集范围：50-1500Da；

校正液为亮氨酸脑啡肽，负离子模式下准确分子质量设置为554.2620。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将标准品配制成溶液作为对照品，进行高效液相色谱法分离、高分辨质谱检测；

所述标准品为结构式如下式I所示的化合物：

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