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CN113939518B - 作为激酶抑制剂的稠合三环化合物 - Google Patents

作为激酶抑制剂的稠合三环化合物 Download PDF

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CN113939518B CN202080020962.7A CN202080020962A CN113939518B CN 113939518 B CN113939518 B CN 113939518B CN 202080020962 A CN202080020962 A CN 202080020962A CN 113939518 B CN113939518 B CN 113939518B
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Abstract

一类含有三环杂芳基化合物。具体地，提供了如下式(I)所示结构的化合物、含有式(I)化合物的药物组合物及所述化合物，以及这些化合物的同位素衍生物，手性异构体，变构体，不同的盐，前药，制剂等等。式(I)化合物能够有效抑制蛋白激酶(包括EGFR、EGFR(C797S)、ALK、和HPK1等)，从而起到治疗各种肿瘤的作用。

Description

作为激酶抑制剂的稠合三环化合物
技术领域
本发明涉及药物化学领域；具体地说，本发明涉及一类新型含有三环杂芳基的衍生物，其合成方法及其作为一种或多种蛋白激酶抑制剂在制备药物用于治疗肿瘤等相关疾病中的应用。
背景技术
癌症亦称恶性肿瘤，是世界上发病率最高和死亡率最高的一种疾病之一，其特点是以细胞异常增殖及转移，在发病后短时间内或相对短时间内扩散，转移。传统的治疗方案包括切除(如果符合切除条件)，放疗，化疗。近年来发展起来的靶向治疗法，有降低毒性和对病人的负作用，及提高生存率等优点。但在使用靶向药物一段时间内又会产生抗药性，之后癌细胞的生长扩散就会异常迅猛。常见的癌症有：血癌，肺癌，肝癌，膀胱癌，直肠癌，胃癌，等等。
在所有癌症中，肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的前几位。其中，非小细胞肺(NSCLC)癌约占所有肺癌的80％。
目前针对非小细胞肺癌最有效的手段是个体化靶向治疗，常见的靶点有C-met、ALK和EGFR。
表皮生长因子受体酪氨酸激酶(epidermal growth factor receptor tyrosinekinase,EGFR)是由1186个氨基酸组成，编码分子量为170-kDa的一种跨膜糖蛋白。EGFR能够介导多条信号传导通路，将胞外信号传递到胞内，对正常细胞和肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡均发挥重要的调节作用。EGFR是许多正常上皮组织(如皮肤和毛囊)的组成性表达成分，而在大部分实体瘤中，EGFR存在过表达或者高表达。例如，在肺癌中，EGFR的表达率达到40～80％。因此选择性地抑制EGFR，干扰其介导的信号转导途径，可以达到治疗肺癌的目的，为靶向治疗肺癌开辟了一条可行之路。
间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,简称ALK)基因是一种跨膜受体酪氨酸激酶,可在多种恶性肿瘤中发生变异或与其他癌基因融合,是肿瘤的致癌驱动基因。ALK抑制剂可用于治疗肺癌。
有研究表明，在非小细胞肺癌患者体内,特别是使用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂药物后一段时间，其EGFR的突变最为常见，其中约30％～40％的亚洲NSCLC患者在确诊时携带EGFR突变，尤其是无吸烟史的中年女性。因此，研制新一代的EGFR抑制剂以对抗癌症的突变，是科学家所要攻克的难题，也是当今生物医药领域研究热点之一。
目前已经上市的EGFR抑制剂共有三代，其中第一代的代表性抑制剂为吉非替尼厄洛替尼和埃克替尼(凯美纳)，第二代的代表性抑制剂为阿法替尼(afatinib)，第三代的代表性抑制剂为奥希替尼(AZD9291)。奥希替尼(AZD9291)是一种口服的小分子第三代EGFR-TKI，是首个针对EGFR T790M突变的肺癌药物，能靶向非小细胞肺癌的EGFR基因突变(包括18，19，21突变)和EGFR-TKI获得性耐药(T790M)，它的问世给更多的肺癌患者带来了好的生存获益。AZD9291可明显延长生存期一年左右。但是之后耐药性发展非常迅速，一般是在9-13个月内。2016年8月世界顶尖学术杂志《Nature》发表了一篇重磅文章，宣布了一种能够克服AZD9291耐药的新一代靶向药化合物EAI045，可用于一代药物耐药且有T790M突变的病人，或者用于AZD9291耐药且有C797S突变的病人，即第四代抑制剂主要是针对耐药突变有L858R/T790M双突变和C797S突变的病人。
造血祖细胞激酶1(Hematopoietic progenitor kinase 1，HPK1,又称MAP4K1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶生发中心激酶家族成员，主要是由造血细胞表达，是T细胞增殖和信号传导的细胞内负调节因子，在树突状细胞活化中发挥着重要作用，是一种新的抗癌免疫治疗靶点，因此，用小分子抑制剂抑制HPK1通过单药或与其它药物联用，具有治疗癌症和其他疾病的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一类新型的蛋白激酶抑制剂。
本发明的第一方面，提供了一种如下式(I)所示结构的化合物，或其光学异构体(包括消旋体、单一的对映异构体、可能的非对映异构体)，药学上可接受的盐，前药，氘代衍生物，水合物，溶剂合物：
式(I)中：
“*”表示手性中心；
各个R各自独立为C1-4烷基；
各个R1各自独立为氢、氘、卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、杂芳基、ORh、或CN；
各个R2各自独立为氢、氘、卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、杂芳基、或CN；
各个R3各自独立为氢、氘、或C1-4烷基；或当两个R3同时连接到同一个碳原子上时，这两个R3与其相连的碳原子可以任选地共同形成羰基(C＝O)；
各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、ORh、SRh、NRhRh、CN、C(O)Re、C(O)ORh，C(O)NRhRh、OC(O)Re、NRhC(O)Re、或S(O)2Re；
J和G各自独立地为NRf、O、S、S(O)、S(O)2或CRgRg；
m为0、1、2、3、或4；
n为0、1、2、或3；
p为0、1、或2；
q为0、1、2、或3；
Rf为氢、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、3-至12-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中，上述各个基团为未取代或被1-3个Re取代；
各个Re各自独立地为选自下组的基团：氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基取代的C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4卤代烯基、C1-4烷氧基取代的C2-4烯基、羟基取代的C2-4烯基、二(C1-4烷基)胺基取代的C2-4烯基、C3-8环烷基取代的C2-4烯基、3-至8-元杂环基取代的C2-4烯基、芳基取代的C2-4烯基、杂芳基取代的C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4卤代炔基、C1-4烷氧基取代的C2-4炔基、羟基取代的C2-4炔基、二(C1-4烷基)胺基取代的C2-4炔基、C3-8环烷基取代的C2-4炔基、3-至8-元杂环基取代的C2-4炔基、芳基取代的C2-4炔基、杂芳基取代的C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、或杂芳基；
各个Rg各自独立地选自下组：氢、卤素、或C1-4烷基；或两个Rg与其相连的碳原子共同形成羰基(C＝O)；或两个Rg与其连接的同一个碳原子一起形成3-至8-元环状结构，此环状结构任选地含有0、1或2个选自N、O、S的杂原子；
各个Rh各自独立为氢、或C1-4烷基；或两个Rh与其连接的氮原子一起形成3-至-8元杂环基，此杂环基含有1或2个N原子以及0或1个选自O、S的杂原子；
其中，各个上述的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、NRhC(O)Re、或S(O)2Re，前提条件是所形成的化学结构是稳定的和有意义的；其中Re和Rh的定义如上所述；
除非特别说明，上述的芳基为含有6-12个碳原子的芳香基团；杂芳基为5-至15-元杂芳香基团；环状结构为饱和的或不饱和的、含杂原子或不含杂原子的环状基团。
在另一优选例中，式(I)为：
其中各个基团的定义如上所述。
在另一优选例中，各个R各自独立为C1-2烷基；
各个R1各自独立为氢、氘、卤素、或C1-2烷基；
各个R2各自独立为氢、氘、卤素、或C1-2烷基；
各个R3各自独立为氢或C1-4烷基；或当两个R3同时连接到同一个碳原子上时，这两个R3与其相连的碳原子共同形成羰基(C＝O)；
各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-4烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；
m为0、1、或2；
n为0、1、或2；
p为0、1、或2；
q为0、1、或2；
其中Re和Rh的定义如上所述。
在另一优选例中，式(I)为：
其中R2为F、Cl、或Br；各个R3各自独立为氢或C1-4烷基；或当两个R3同时连接到同一个碳原子上时，这两个R3与其相连的碳原子共同形成羰基(C＝O)；各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-4烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；n为0、1、或2；q为0、1、或2；其中J、G、自Re、和Rh的定义如上中所述。
在另一优选例中，式(IIIa)中的结构片段选自：
表示上述结构片段与式(IIIa)中其它结构的连接位点；
其中，各个R3各自独立为氢或C1-4烷基；当两个R3连接在同一个碳原子上时，两个R3和连接它们的碳原子可以一起组成C＝O；
各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-2烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；
n为0、1、或2；q为0或1；
Rf为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中各个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、NRhC(O)Re、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中Re和Rh的定义如上所述。
在另一优选例中，式(I)为：
其中，各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-2烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；q为0或1；
Rf为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中各个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、NRhC(O)Re、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中Re和Rh的定义如上所述。
在另一优选例中，所述的Rf选自下组：氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、或S(O)2Re；其中各个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2、ORe、SRe、NReRe、C(O)Re、C(O)ORe、C(O)NReRe、NReC(O)Re、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中Re和Rh的定义同上所述。
在另一优选例中，式(I)为：
其中，R4为氢、卤素、C1-2烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；
Rf为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、或S(O)2Re；其中各个烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、NRhC(O)Re、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中Re和Rh的定义如上所述。
在另一优选例中，式(I)为：
其中，R4为氢、卤素、C1-2烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；
Rf为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、或S(O)2Re；其中各个烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、NRhC(O)Re、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中Re和Rh的定义如本发明第一方面中所述。
在另一优选例中，式(I)为：
其中，R4为氢、卤素、C1-2烷基；
s和t各自独立为1、2、或3；
A为NRk、O、或CRgRg；其中Rk为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、羟基取代的C1-4烷基、C1-4烷氧基取代的C1-4烷基、二(C1-4烷基)胺基取代的C1-4烷基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中各个Re各自独立地选自下组：氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C1-4烷氧基取代的C2-4烯基、二(C1-4烷基)胺基取代的C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、或杂芳基；Rg和Rh的定义如本发明第一方面中所述。
在另一优选例中，所述的各个Re各自独立地选自下组的基团：氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基取代的C1-4烷基、C2-4烯基、C1-4烷氧基取代的C2-4烯基、羟基取代的C2-4烯基、二(C1-4烷基)胺基取代的C2-4烯基、3-至6-元杂环基取代的C2-4烯基、芳基取代的C2-4烯基、杂芳基取代的C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、或杂芳基。
在另一优选例中，各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-2烷基、或NHC(O)CH＝CH2。
在另一优选例中，所述化合物选自下组：
其中，“*”表示手性中心，在没有标明是R或S的情况下，带“*”的化合物表示可以是消旋体，也可以是R构型，或者是S构型。
在另一优选例中，用于：
(a)制备治疗与蛋白激酶活性或表达量相关的疾病的药物；
(b)制备蛋白激酶靶向抑制剂；和/或
(c)体外非治疗性地抑制蛋白激酶的活性；
其中，所述的蛋白激酶选自下组：EGFR、EGFR(C797S)、ALK、HPK1等，或其组合。
本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：(i)有效量的如本发明第一方面所述的式I化合物，或其光学异构体，药学上可接受的盐，前药，氘代衍生物，水合物，溶剂合物；和(ii)药学上可接受的载体。
本发明的第三方面，提供了一种式(I)化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
用式4-D1化合物与式1-A2反应，得到式4-D2-1或4-D2-2化合物；
在钯催化剂存在下，用式4-D2-1或式4-D2-2化合物与Me4Sn进行反应，得到式4-D3-1或式4-D3-2化合物；
用式4-D3-1或式4-D3-2化合物进行还原反应，得到式4-D4-1或式4-D4-2化合物；
用式Ib化合物与式4-D4-1化合物或式4-D4-2化合物进行反应，得到式IIIf化合物或IIIg化合物。化合物IIIf或化合物IIIg是式(I)化合物的一部分。
本发明的第四方面，提供了一种式(I)化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
用式5-E2化合物与式Ib化合物进行反应，得到式IIIh化合物；
用式IIIh化合物与式5-E3化合物进行还原胺化反应，得到式IIIi化合物。化合物IIIi是式(I)化合物的一部分。
本发明的第五方面，提供了一种抑制EGFR和/或EGFR(C797S)和/或ALK和/或HPK1活性的方法，其包括步骤：对抑制对象施用抑制有效量的如本发明第一方面所述的式(I)化合物，或其光学异构体，药学上可接受的盐，前药，氘代衍生物，水合物，溶剂合物，或对抑制对象施用抑制有效量的如本发明第三方面所述的药物组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现了一类结构新颖的含有三环芳基化合物的蛋白激酶抑制剂，以及它们的制备方法和应用。所述的蛋白激酶抑制剂可以抑制EGFR、EGFR(C797S)、ALK、和HPK1等蛋白激酶，本发明化合物可以应用于与EGFR(包括所产生的各种突变)、ALK、和HPK1的活性相关的各种疾病的治疗。其中，抑制EGFR(C797S)其特点是能够克服第三代EGFR抑制剂所产生的耐药性。具体的，本发明所包含的是一类EGFR(特别是EGFR(C797S))抑制剂，可以对L858R/T790M双突变和C797S突变的EGFR产生有效的抑制作用。另外，本发明化合物可抑制免疫靶点HPK1，可通过单药或与其它药物联用治疗多种癌症和其他疾病。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
除特别说明之处，本文中提到的“或”具有与“和/或”相同的意义(指“或”以及“和”)。
除特别说明之处，本发明的所有化合物之中，各手性碳原子(手性中心)可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。
如本文所用，在单独或作为其他取代基一部分时，术语“烷基”指只含碳原子的直链(即，无支链)或支链饱和烃基，或直链和支链组合的基团。当烷基前具有碳原子数限定(如C1-10)时，指所述的烷基含有1-10个碳原子。例如，C1-8烷基指含有1-8个碳原子的烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。
如本文所用，在单独或作为其他取代基一部分时，术语“烯基”是指直链或支链，具有至少一个碳-碳双键的碳链基团。烯基可以是取代的或未取代的。当烯基前具有碳原子数限定(如C2-8)时，指所述的烯基含有2-8个碳原子。例如，C2-8烯基指含有2-8个碳原子烯基，包括乙烯基、丙烯基、1,2-丁烯基、2,3-丁烯基、丁二烯基、或类似基团。
如本文所用，在单独或作为其他取代基一部分时，术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的脂肪族碳氢基团。所述的炔基可以是直链或支链的，或其组合。当炔基前具有碳原子数限定(如C2-8炔基)时，指所述的炔基含有2-8个碳原子。例如，术语“C2-8炔基”指具有2-8个碳原子的直链或支链炔基，包括乙炔基、丙炔基、异丙炔基、丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、叔丁炔基、或类似基团。
如本文所用，在单独或作为其他取代基一部分时，术语“环烷基”指具有饱和的或部分饱和的单元环，二环或多环(稠环、桥环或螺环)环系基团。当某个环烷基前具有碳原子数限定(如C3-10)时，指所述的环烷基含有3-10个碳原子。在一些优选实施例中，术语“C3-8环烷基”指具有3-8个碳原子的饱和或部分饱和的单环或二环烷基，包括环丙基、环丁基、环戊基、环庚基、或类似基团。“螺环烷基”指单环之间共用一个碳原子(称螺原子)的二环或多环基团，这些可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。“稠环烷基”指系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对碳原子的全碳二环或多环基团，其中一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。“桥环烷基”指任意两个环共用两个不直接连接的碳原子的全碳多环基团，这些可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。所述环烷基所含原子全部为碳原子。如下是环烷基的一些例子，本发明并不仅局限下述的环烷基。
除非有相反陈述，否则下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。“芳基”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，例如苯基和萘基。所述芳基环可以稠合于其它环状基团(包括饱和和不饱和环)，但不能含有杂原子如氮，氧，或硫，同时连接母体的点必须在具有共轭的π电子体系的环上的碳原子上。芳基可以是取代的或未取代的。如下是芳基的一些例子，本发明并不仅局限下述的芳基。
“杂芳基”指包含一个到多个杂原子(任选自氮、氧和硫)的具有芳香性的单环或多环基团，或者包含杂环基(含一个到多个杂原子任选自氮、氧和硫)与芳基稠合形成的多环基团，且连接位点位于芳基上。杂芳基可以是任选取代的或未取代的。如下是杂芳基的一些例子，本发明并不仅局限下述的杂芳基。
“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其中一个或多个环原子选自氮、氧或硫，其余环原子为碳。单环杂环基的非限制性实施例包含吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基。多环杂环基指包括螺环、稠环和桥环的杂环基。“螺环杂环基”指系统中的每个环与体系中的其他环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环基团，其中一个或多个环原子选自氮、氧或硫，其余环原子为碳。“稠环杂环基”指系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，而且其中一个或多个环原子选自氮、氧或硫，其余环原子为碳。“桥环杂环基”指任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环基团，这些可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，而且其中一个或多个环原子选自氮、氧或硫，其余环原子为碳。如果杂环基里同时有饱和环和芳环存在(比如说饱和环和芳环稠合在一起)，连接到母体的点一定是在饱和的环上。注：当连接到母体的点在芳环上时，称为杂芳基，不称为杂环基。如下是杂环基的一些例子，本发明并不仅局限下述的杂环基。
如本文所用，在单独或作为其他取代基一部分时，术语“卤素”指F、Cl、Br和I。
如本文所用，术语“取代”(在有或无“任意地”修饰时)指特定的基团上的一个或多个氢原子被特定的取代基所取代。特定的取代基为在前文中相应描述的取代基，或各实施例中所出现的取代基。除非特别说明，某个任意取代的基团可以在该基团的任何可取代的位点上具有一个选自特定组的取代基，所述的取代基在各个位置上可以是相同或不同的。环状取代基，例如杂环基，可以与另一个环相连，例如环烷基，从而形成螺二环系，即两个环具有一个共用碳原子。本领域技术人员应理解，本发明所预期的取代基的组合是那些稳定的或化学上可实现的组合。所述取代基例如(但并不限于)：C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、3-至12-元杂环基，芳基、杂芳基、卤素、羟基、羧基(-COOH)、C1-8醛基、C2-10酰基、C2-10酯基、氨基。
为了方便以及符合常规理解，术语“任意取代”或“任选取代”只适用于能够被取代基所取代的位点，而不包括那些化学上不能实现的取代。
如本文所用，除非特别说明，术语“药学上可接受的盐”指适合与对象(例如，人)的组织接触，而不会产生不适度的副作用的盐。在一些实施例中，本发明的某一化合物的药学上可接受的盐包括具有酸性基团的本发明的化合物的盐(例如，钾盐，钠盐，镁盐，钙盐)或具有碱性基团的本发明的化合物的盐(例如，硫酸盐，盐酸盐，磷酸盐，硝酸盐，碳酸盐)。
用途：
本发明提供了一类式(I)化合物，或它们的氘代衍生物、它们的盐、异构体(对映异构体或非对映异构体，如果存在的情况下)、前药、水合物、溶剂合物、可药用载体或赋形剂用于抑制蛋白激酶的用途。这里所指的蛋白激酶包括EGFR、EGFR(C797S)、ALK、和HPK1在内，但并不仅限于以上几种激酶。
本发明化合物可用作一种或多种激酶抑制剂，例如一些实施例中，本发明中的某类化合物可用作EGFR和/或EGFR(C797S))和/或ALK和/或HPK1激酶抑制剂。
在癌症病人体内，上述所提到的各种蛋白激酶的表达或活性都明显增高。这些过度表达和/或异常的蛋白激酶活性水平与肿瘤的发生发展直接关联。本发明化合物是这些蛋白激酶的单一和/或双重抑制剂。通过调节这些蛋白激酶活性得到预防、缓解或治愈疾病。所指疾病包括肝癌、直肠癌、膀胱癌、咽喉癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、卵巢癌、头颈部鳞癌、宫颈癌、食管癌、肾癌、胰腺癌、结肠癌、皮肤癌、淋巴瘤、胃癌、多发性骨髓癌和实体瘤等等。
从某种角度上说，双重蛋白激酶抑制剂同时干扰两种不同的激酶，所产生的抗肿瘤效果往往具有叠加性，因此具有更有效治疗各种癌症的潜力。
本发明化合物可与生物制剂如PD-1抑制剂和作为组合药物治疗各种癌症及相关疾病。
可将本发明化合物及其氘代衍生物，以及药学上可接受的盐或其异构体(如果存在的情况下)或其水合物和/或组合物与药学上可接受的赋形剂或载体配制在一起，得到的组合物可在体内给予哺乳动物，例如男人、妇女和动物，用于治疗病症、症状和疾病。组合物可以是：片剂、丸剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、胶囊、气雾剂、无菌注射液。无菌粉末等。一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘露醇、羟丙基-β-环糊精、β-环糊精(增加)、甘氨酸、崩解剂(如淀粉、交联羧甲基纤维素钠、复合硅酸盐和高分子聚乙二醇)，造粒粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶)和润滑剂(如硬脂酸镁、甘油和滑石粉)。在优选的实施方式中，所述药物组合物是适于口服的剂型，包括但不限于片剂、溶液剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、粉剂。向患者施用本发明化合物或药物组合物的量不固定，通常按药用有效量给药。同时，实际给予的化合物的量可由医师根据实际情况决定，包括治疗的病症、选择的给药途径、给予的实际化合物、患者的个体情况等。本发明化合物的剂量取决于治疗的具体用途、给药方式、患者状态、医师判断。本发明化合物在药物组合物中的比例或浓度取决于多种因素，包括剂量、理化性质、给药途径等。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
化合物的通用合成方法
本发明的式I化合物可以通过以下方法制备得到：
在惰性溶剂中，用(Ia)化合物与(Ib)反应，得到(I)化合物；
上述各式中，各基团的定义如上文中所述。各步骤的试剂和条件可以选用本领域进行该类制备方法常规的试剂或条件，在本发明的化合物结构公开后，上述选择可以由本领域技术人员根据本领域知识进行。
更具体地，本发明通式I所示化合物可通过如下的方法制得，然而该方法的条件，例如反应物、溶剂、碱、所用化合物的量、反应温度、反应所需时间等不限于下面的解释。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
在本发明的制备方法中，各反应通常在惰性溶剂中，反应温度通常为-20～150℃(优选0～120℃下进行。各步反应时间通常为0.5～48h，较佳地为2～12h。
反应式1描述了中间体1-A5-1和1-A5-2的通用合成方法：
反应式1:
反应式2描述了中间体2-B3-1和2-B3-2的通用合成方法：
反应式2:
反应式3描述了中间体3-C7的通用合成方法：
反应式3:
化合物IIIa是化合物I的一部分。反应式4描述了化合物IIIa的通用合成方法：反应式4:
化合物IIIb是化合物I的一部分。反应式5描述了化合物IIIb的通用合成方法：反应式5:
化合物IIIc是化合物I的一部分。反应式6描述了化合物IIIc的通用合成方法：反应式6:
化合物IIId是化合物I的一部分。反应式7描述了化合物IIId的通用合成方法：反应式7:
化合物IIIe是化合物I的一部分。反应式8描述了化合物IIIe的通用合成方法：反应式8:
化合物IIIf和IIIg是化合物I的一部分。反应式9描述了化合物IIIf和IIIg的通用合成方法：
反应式9:
化合物IIIh和IIIi是化合物I的一部分。反应式10描述了化合物IIIh和IIIi的通用合成方法：
反应式10:
上述反应式1-10中R、R1、R2、R4、Rf、m、p、q、s、t、A的定义与上文中表述相同。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有优异的对一系列蛋白激酶的抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解与EGFR、EGFR(C797S)、ALK、和HPK1等蛋白激酶活性或表达量相关的疾病。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如 )、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
1.提供了一种如式(I)所示的化合物。
2.提供了一种结构新颖的EGFR、EGFR(C797S)、ALK、和HPK1等蛋白激酶的活性抑制剂，及其制备和应用，所述的抑制剂在极低浓度下即可抑制上述蛋白激酶的活性。
3.提供了一类治疗与EGFR、EGFR(C797S)、ALK、和HPK1等蛋白激酶活性相关疾病的药物组合物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1:化合物1的制备
向1,2-二氟-4-硝基苯(1a,1.11g,7.0mmoL)和消旋体3-羟甲基哌嗪-1-碳酸叔丁酯(1b,1.30g,6.0mmoL)的干燥DMSO(15mL)溶液中加入KOH(1.01g,18.0mmoL)。混合物在室温下搅拌3小时，然后加热到60℃反应8小时。反应完成后，将冰水加入到反应液中。所形成的固体经过滤收集，水洗，然后用快速柱色谱(石油醚:乙酸乙酯＝6:1)纯化得到黄色固体产物1c(1.41g,收率70.0％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.79(dd,J＝9.1Hz,2.6Hz,1H),7.66(d,J＝2.6Hz,1H),6.76(d,J＝9.2Hz,1H),4.30(dd,J＝11.0Hz,3.0Hz,1H),4.18-4.09(m,2H),3.99(dd,J＝11.1Hz,8.0Hz,1H),3.79(d,J＝11.0Hz,1H),3.35-3.31(m,1H),3.04-2.93(m,2H),2.67(br,1H),1.49(s,9H)；HRMS(+):m/z 358.1370([M+Na]+,C16H21N3O5Na+calcd:358.1373。
将化合物1c(2.0克,6.0毫摩尔)溶于二氯甲烷(20mL)中，在室温搅拌下加入三氟乙酸(5mL)。室温搅拌1小时后，TLC监测反应完成。反应液减压浓缩除去三氟乙酸，再将残留物溶于二氯甲烷(30mL)中，用碳酸钠水溶液(1M)调pH到9～10，将有机相和水相分开。水层用二氯甲烷萃取两次。合并的有机相用饱和食盐水(30mL)洗一次，用无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，滤液在减压条件下浓缩，得到黄色固体化合物1d(1.2克)。MS m/z 236.1[M+H]+。
将上述化合物1d(1.2克)溶于甲醇(20mL)中，加入甲醛水溶液(37％,6mL)，再加入2滴醋酸，室温下搅拌30分钟后，加入氰基硼氢化钠(0.8g,12.7mmol)，然后在室温下继续搅拌3小时。TLC监测反应完成。反应液减压浓缩得到粗产物。粗品经硅胶柱纯化(DCM:MeOH＝60:1)得黄色固体化合物1e(1.0g)。MS m/z 250.2[M+H]+。
室温下向甲醇(3mL)中加入化合物1e(145mg,0.58mmol)和钯碳催化剂(10％,15mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下反应1小时，TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到棕色固体化合物1f(100mg)。粗品直接用于下一步。MS m/z 220.2[M+H]+。
将化合物1g(3.0g,14mmol)和化合物1h(1.2g,15mmol)溶解在DMF(60mL)中,依次加入Pd(OAc)2(0.2g,)、X-Phos(0.3g)、和K3PO4(5.9g,28mmol)。混合物用氮气置换3次，然后在氮气氛围下加入至120℃，直到反应完全为止。混合物在减压条件下浓缩，残余物经硅胶柱层析(DCM:MeOH＝1:40洗脱)分离得到白色固体化合物1i(0.75g,收率33％)。
向化合物1i(750mg,4.4mmol)和化合物1j(812mg,4.4mmol)的IPA(20mL)溶液中加入K2CO3(1.2g,8.8mmol)。所得的悬浮液在微波反应器加热至105℃，反应1h。混合物在减压条件下浓缩，残余物经硅胶柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:1洗脱)分离得乳白色的固体化合物1k(450mg,收率32％)。液相色谱条件：色谱柱X Brdige C18:4.6mm*30mm*3.5um，流动相A:水(0.01mol/L NH4HCO3)，流动相B:乙腈，流速2.0mL/min，从10％的B到95％的B 0.5分钟梯度洗脱，然后恒定95％B 1.5分钟。纯度95％,保留时间0.95min；MS m/z 316.0[M+H]+。
将化合物1f(22mg,0.1mmol)和化合物1k(31.5mg,0.1mmol)在盐酸的水溶液(2Min EtOH,2mL)里加热至80℃搅拌直到反应完全。反应混合物在减压条件下浓缩，残留物用制备HPLC分离得淡黄色的固体化合物1(5.6mg,收率11％)。液相色谱条件：色谱柱X BrdigeC18:4.6mm*30mm*3.5um，流动相A:水(0.01mol/L NH4HCO3)，流动相B:乙腈，流速2.0mL/min，从5％的B到100％的B1.6分钟梯度洗脱，然后恒定100％B 1.4分钟。纯度90％。保留时间1.56min。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.48-8.52(m,1H),8.03(s,1H),7.53-7.61(m,2H),7.24-7.26(m,1H),7.03-7.04(m,1H),6.89-6.91(m,1H),6.75-6.77(m,1H),4.21-4.24(m,1H),3.94-3.99(m,1H),3.72-3.75(m,1H),3.08-3.09(m,1H),2.97-3.00(m,1H),2.87-2.90(m,1H),2.72-2.73(m,1H),2.38(s,3H),2.29-2.36(m,1H),1.87-1.92(m,1H),1.86(s,3H),1.84(s,3H)。MS m/z 499.2[M+H]+。
实施例2:化合物1R的制备
室温下向甲醇(15mL)中加入化合物1R-1a(650mg,2.60mmol)和钯-碳催化剂(10％,65mg)。反应体系用氢气置换三次。该反应混合物在室温和氢气(1大气压)氛围下搅拌过夜。TLC监测反应完成。反应混合物经硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到棕色粗品，随后粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝40:1至20:1)得到黄色油状化合物1R-1b(180mg,收率32％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.62(d,J＝8.4Hz,1H),6.24(dd,J＝8.4,2.6Hz,1H),6.21(d,J＝2.5Hz,1H),4.14(dd,J＝10.5,2.6Hz,1H),4.03-3.95(m,1H),3.56(dt,J＝11.5,2.7Hz,1H),3.36(s,br.,2H),3.12-3.03(m,1H),2.91(dd,J＝11.3,2.2Hz,1H),2.81-2.75(m,1H),2.72(td,J＝11.7,3.1Hz,1H),2.33(s,3H),2.25(td,J＝11.5,3.2Hz,1H),1.83(t,J＝10.6Hz,1H)。
将化合物1R-1b(70mg,0.32mmol)和化合物1k(72mg,0.23mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，然后再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.24mL)。将上述反应混合物置于封管中，加热至120℃，搅拌过夜。TLC监测反应原料消失，停止反应，待冷却后反应液在减压条件下浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝40:1至20:1)得到米白色固体化合物1R(79mg,收率50％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.88(s,1H),8.65(dd,J＝8.4,4.3Hz,1H),8.06(s,1H),7.48(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.29-7.22(m,1H),7.11-7.06(m,2H),6.92(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H),6.74-6.70(m,2H),4.20(dd,J＝10.5,2.7Hz,1H),4.03(dd,J＝10.4,9.1Hz,1H),3.67-3.61(m,1H),3.22-3.15(m,1H),2.94(d,J＝10.9Hz,1H),2.84-2.77(m,2H),2.36(s,3H),2.26(td,J＝11.6,3.2Hz,1H),1.87(d,J＝10.7Hz,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 499.4[M+H]+。
实施例3:化合物1S的制备
室温下向甲醇(10mL)中加入化合物1S-1a(800mg,3.20mmol)和钯-碳催化剂(10％,80mg)。反应体系用氢气置换三次。该反应混合物在室温和氢气(1大气压)氛围下搅拌过夜。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到棕色粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝40:1至20:1)得到黄色油状化合物1S-1b(400mg,收率57％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ6.54(d,J＝8.4Hz,1H),6.06(d,J＝8.5Hz,1H),6.01(s,1H),4.47(s,br.,2H),4.10(d,J＝10.4Hz,1H),3.80(t,J＝9.8Hz,1H),3.49(d,J＝11.4Hz,1H),2.82(t,J＝9.5Hz,2H),2.72(d,J＝10.6Hz,1H),2.48-2.40(m,1H),2.19(s,3H),2.07(td,J＝11.0,1.9Hz,1H),1.66(t,J＝10.5Hz,1H)。
将化合物1S-1b(70mg,0.32mmol)和化合物1k(72mg,0.23mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，然后再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.24mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃，搅拌过夜。TLC监测反应原料消失。反应液冷却至室温，在减压条件下浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝40:1至20:1)得到米白色固体化合物1S(44mg,收率38％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.88(s,1H),8.65(dd,J＝8.3,4.4Hz,1H),8.05(s,1H),7.48(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.28-7.22(m,1H),7.11-7.06(m,2H),6.92(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.79-6.72(m,2H),4.20(dd,J＝10.5,2.6Hz,1H),4.03(dd,J＝10.4,9.0Hz,1H),3.67-3.61(m,1H),3.22-3.15(m,1H),2.95(d,J＝10.9Hz,1H),2.85-2.78(m,2H),2.36(s,3H),2.27(td,J＝11.5,3.2Hz,1H),1.87(d,J＝10.7Hz,1H),1.83(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 499.4[M+H]+。
实施例4:化合物2R的制备
将化合物2R-1a(63mg,0.20mmol)和化合物1k(46mg,0.14mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，然后再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.15mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃，搅拌过夜。TLC监测反应原料消失。反应混合物冷却至室温，在减压条件下浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝40:1至20:1)得到米白色固体化合物2R(21mg,收率25％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.91(s,1H),8.64(dd,J＝8.3,4.4Hz,1H),8.06(s,1H),7.48(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.30-7.23(m,1H),7.16(d,J＝2.5Hz,1H),7.13-7.09(m,1H),6.95(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.80(s,1H),6.75(d,J＝8.8Hz,1H),4.26(dd,J＝10.7,2.7Hz,1H),4.04(dd,J＝10.7,8.2Hz,1H),3.86-3.77(m,2H),3.75-3.70(m,1H),3.28-3.22(m,1H),3.10(td,J＝11.6,2.8Hz,1H),2.90(td,J＝11.9,3.1Hz,1H),2.75(t,J＝11.0Hz,1H),2.30-2.23(m,1H),1.84(s,3H),1.82(s,3H),1.23-1.68(m,2H),1.05-1.00(m,2H)。MSm/z 589.4[M+H]+。
实施例5:化合物3R的制备
将化合物3R-1a(86mg,0.30mmol)和化合物1k(67mg,0.20mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，然后再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.22mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃，搅拌过夜。TLC监测反应原料消失。反应混合物冷却至室温，在减压条件下浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离(二氯甲烷:甲醇＝20:1)得到米白色固体化合物3R(70mg,收率62％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.89(s,1H),8.66(dd,J＝8.2,4.4Hz,1H),8.05(s,1H),7.48(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.28-7.22(m,1H),7.11-7.06(m,2H),6.92(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.75-6.70(m,2H),4.20(dd,J＝10.4,2.7Hz,1H),4.09-3.98(m,3H),3.67(d,J＝11.5Hz,1H),3.39(t,J＝11.4Hz,2H),3.17-3.10(m,1H),3.06(d,J＝11.0,1H),2.91(d,J＝10.4Hz,1H),2.77(td,J＝11.5,2.9Hz,1H),2.53-2.41(m,2H),2.03(t,J＝10.5Hz,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H),1.80-1.76(m,4H)。MS m/z 569.6[M+H]+。
实施例6:化合物4R的制备
室温下向化合物4R-1a(3.0g,8.94mmol)的甲醇(35mL)溶液里加入钯-碳催化剂(10％,250mg)。反应体系用氢气置换三次。反应混合物在室温和氢气(1大气压)氛围下搅拌过夜。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到棕色粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1至1:1)得到黑紫色固体化合物4R-1b(2.48g,收率91％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.63(d,J＝8.5Hz,1H),6.25(dd,J＝8.5,2.5Hz,1H),6.21(d,J＝2.5Hz,1H),4.17(dd,J＝10.6,2.6Hz,1H),4.14-4.00(m,2H),3.96(dd,J＝10.5,9.1Hz,1H),3.56(d,J＝11.0Hz,1H),3.38(s,2H),3.04(s,1H),2.95(ddd,J＝11.7,5.5,2.7Hz,1H),2.59(td,J＝11.8,3.1Hz,2H),1.47(s,9H)。
将化合物4R-1b(100mg,0.33mmol)和化合物1k(74mg,0.24mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，然后再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.25mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃，搅拌过夜。TLC监测反应原料消失。反应混合物冷却至室温，减压条件下浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离(二氯甲烷:丙酮＝1:1,2％三乙胺)得到米白色固体化合物4R(6mg,收率5％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.49(dd,J＝8.2,4.6Hz,1H),8.03(s,1H),7.63-7.52(m,2H),7.26-7.22(m,1H),7.08(d,J＝2.4Hz,1H),6.93(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.80(d,J＝8.9Hz,1H),4.26(dd,J＝10.7,2.5Hz,1H),4.00(dd,J＝10.8,8.2Hz,1H),3.90(d,J＝12.7Hz,1H),3.27-3.16(m,3H),3.11(td,J＝12.5,3.5Hz,1H),2.81(td,J＝12.6,3.1Hz,1H),2.75(t,J＝11.4Hz,1H),1.86(s,3H),1.83(s,3H)。MS m/z 485.4[M+H]+。
实施例7:化合物4S的制备
在冰水浴下，向搅拌的化合物4S-1a(500mg,2.10mmol)的1,4-二氧六环(8mL)溶液中，加入NaOH水溶液(1N,2mL)，接着加入二碳酸二叔丁酯(510mg,2.30mmol)。反应混合物升至室温，并搅拌约30min。TLC监测反应原料消失。将反应液倒入冰水中，用二氯甲烷(20mL x3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得到黄色固体粗品4S-1b。所得粗品直接用于下一步反应。
室温下，向粗品4S-1b的甲醇(20mL)溶液中加入钯-碳催化剂(10％,80mg)。反应体系用氢气置换三次。反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌过夜。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到棕色粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)得到白色固体化合物4S-1c(432mg,两步总收率67％)。MS m/z306.3[M+H]+。将化合物4S-1c(48mg,0.16mmol)和化合物1k(50mg,0.16mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，然后再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.16mL)。反应混合物置于封管中，加热至120℃，搅拌过夜。TLC监测反应原料消失。反应冷却至室温，在减压条件下浓缩。所得粗品经制备型薄板层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到米白色固体化合物4S(45mg,收率57％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.86(s,1H),8.65(dd,J＝8.4,4.5Hz,1H),8.05(s,1H),7.48(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.31-7.21(m,1H),7.13-7.05(m,2H),6.92(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.84(s,1H),6.72(d,J＝8.8Hz,1H),4.18(dd,J＝10.5,2.5Hz,1H),4.01(dd,J＝10.4,9.1Hz,1H),3.62(d,J＝11.4Hz,1H),3.17(d,J＝12.3Hz,1H),3.09-2.93(m,3H),2.66(td,J＝11.7,3.3Hz,1H),2.54(t,J＝10.9Hz,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z485.3[M+H]+。
实施例8:化合物5R的制备
在0℃下向化合物4R(60mg,0.12mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)溶液中加入DIPEA(32mg,0.24mmol)，接着缓慢滴加乙酰氯(12mg,0.15mmol)的二氯甲烷(1.0mL)溶液。滴加完毕，将反应液维持在0℃条件下搅拌1h。TLC监测反应完毕。反应液中加入水(10mL)，再用二氯甲烷(10mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:丙酮＝2:1,2％三乙胺)得到米白色固体化合物5R(29mg,收率46％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.90(s,1H),8.65(dd,J＝7.9,4.5Hz,1H),8.06(s,1H),7.48(t,J＝8.0Hz,1H),7.30-7.23(m,1H),7.19-7.08(m,2H),6.94(ddd,J＝32.3,8.7,2.5Hz,1H),6.82(d,J＝3.6Hz,1H),6.74(dd,J＝14.9,8.8Hz,1H),4.75-4.57(m,1H),4.26(dd,J＝10.7,2.6Hz,1H),4.04(td,J＝10.7,8.6Hz,1H),3.90(d,J＝13.2Hz,1H),3.76-3.67(m,1H),3.11-2.96(m,2H),2.75-2.64(m,1H),2.51-2.42(m,1H),2.16(S,3H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 527.5[M+H]+。
实施例9:化合物6R的制备
0℃条件下向化合物4R(60mg,0.12mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)溶液中加入DIPEA(32mg,0.24mmol)，随后缓慢滴加丙烯酰氯(14mg,0.15mmol)的二氯甲烷(1.0mL)溶液。滴加完毕后，反应液在0℃下继续搅拌1h。TLC监测反应完毕。反应液中加入水(10mL)，再用二氯甲烷(10mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:丙酮＝2:1,2％三乙胺)得到米白色固体化合物6R(21mg,收率32％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.94(s,1H),8.64(dd,J＝8.4,4.4Hz,1H),8.05(s,1H),7.48(t,J＝8.1Hz,1H),7.31-7.23(m,1H),7.21-7.08(m,2H),7.01-6.82(m,2H),6.79-6.67(m,1H),6.67-6.55(m,1H),6.35(d,J＝16.8Hz,1H),5.77(dd,J＝10.6,1.7Hz,1H),4.72(dd,J＝50.4,11.5Hz,1H),4.34-4.19(m,1H),4.13-3.87(m,1H),3.74(d,J＝11.4Hz,1H),3.47-3.37(m,1H),3.13-2.93(m,2H),2.73(m,1H),2.61-2.52(m,1H),1.84(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z 539.5[M+H]+。
实施例10:化合物6S的制备
在0℃下，向化合物4S(60mg,0.12mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液中加入DIPEA(32mg,0.24mmol)，接着缓慢滴加丙烯酰氯(14mg,0.15mmol)的二氯甲烷(2.0mL)溶液。滴加完毕，将反应在0℃条件下继续搅拌1h。TLC监测反应完毕。反应液中加入水(10mL)，再用二氯甲烷(10mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物6S(16mg,收率24％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.89(s,1H),8.64(dd,J＝8.4,4.4Hz,1H),8.06(s,1H),7.48(t,J＝7.9Hz,1H),7.31-7.22(m,1H),7.20-7.07(m,2H),7.00-6.80(m,2H),6.79-6.69(m,1H),6.68-6.54(m,1H),6.34(dd,J＝16.8,1.4Hz,1H),5.77(dd,J＝10.5,1.8Hz,1H),4.71(dd,J＝40.3,12.5Hz,1H),4.36-4.20(m,1H),4.13-3.88(m,1H),3.73(d,J＝12.1Hz,1H),3.48-3.34(m,1H),3.14-2.96(m,2H),2.79-2.66(m,1H),2.64-2.50(m,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 539.6[M+H]+。
实施例11:化合物7R的制备
向化合物4R(48.5mg,0.10mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液中，加入2-溴乙醇(7R-1a,6.3mg,0.05mmol)的甲苯(1.5mL)溶液。随后将反应混合物置于封管中，加热至回流温度，搅拌反应1h。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温，减压条件下浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物7R(13mg,收率50％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.89(s,1H),8.66(dd,J＝8.5,4.4Hz,1H),8.05(s,1H),7.48(dd,J＝8.4,7.6Hz,1H),7.29-7.20(m,1H),7.12-7.07(m,2H),6.92(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.81(s,1H),6.72(d,J＝8.8Hz,1H),4.20(dd,J＝10.5,2.6Hz,1H),4.03(dd,J＝10.4,9.1Hz,1H),3.70-3.63(m,3H),3.19-3.11(m,1H),3.02(d,J＝10.9,1H),2.90-2.85(m,1H),2.83-2.74(m,1H),2.66-2.56(m,2H),2.40(td,J＝11.5,3.1Hz,1H),2.04-1.95(m,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 529.5[M+H]+。
实施例12:化合物8R的制备
向化合物4R(48.5mg,0.10mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中加入碳酸钾(27.6mg,0.20mmol)，接着滴加溴乙烷(8R-1a,10.9mg,0.10mmol)的甲苯(1.5mL)溶液。随后将反应混合物置于封管中，加热至回流温度，搅拌反应3h。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温，加入水(10mL)，再用二氯甲烷(10mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离(二氯甲烷:丙酮＝2:1,2％三乙胺)得到白色固体化合物8R(18mg,收率35％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.88(s,1H),8.65(dd,J＝8.5,4.5Hz,1H),8.05(s,1H),7.48(t,J＝7.9Hz,1H),7.29-7.21(m,1H),7.12-7.04(m,2H),6.92(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.78(s,1H),6.72(d,J＝8.7Hz,1H),4.21(d,J＝10.4,1H),4.03(t,J＝9.7Hz,1H),3.65(d,J＝11.8Hz,1H),3.18(t,J＝9.7Hz,1H),3.05(d,J＝11.4Hz,1H),2.94-2.87(m,1H),2.85-2.75(m,1H),2.53-2.45(m,2H),2.24(td,J＝11.4,2.6Hz,1H),1.85-1.82(s,3H),1.81(s,3H),1.14(t,J＝7.2Hz,3H)。MS m/z513.3[M+H]+。
实施例13:化合物9R的制备
向化合物4R(48.5mg,0.10mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(0.6mL)溶液里加入碳酸钾(27.6mg,0.20mmol)，然后滴加溴乙腈(9R-1a,13.2mg,0.11mmol)的乙腈(1.5mL)溶液。反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物在减压条件下浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到米白色固体化合物9R(26mg,收率50％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.89(s,1H),8.65(dd,J＝8.3,4.4Hz,1H),8.06(s,1H),7.51-7.46(m,1H),7.29-7.23(m,1H),7.16-7.08(m,2H),6.94(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.79(s,1H),6.73(d,J＝8.8Hz,1H),4.21(dd,J＝10.5,2.7Hz,1H),4.06(dd,J＝10.5,9.0Hz,1H),3.74-3.69(m,1H),3.60(s,2H),3.23-3.17(m,1H),2.90(dd,J＝10.4,2.0Hz,1H),2.85-2.74(m,2H),2.68(td,J＝11.1,3.2Hz,1H),2.30-2.23(m,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 524.4[M+H]+。
实施例14:化合物10R的制备
向化合物4R(48.5mg,0.10mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(0.6mL)溶液里加入碳酸钾(27.6mg,0.20mmol)，然后缓慢滴加2-氯乙基甲基醚(10R-1a,9.5mg,0.10mmol)的甲苯(1.5mL)溶液。滴加完毕，反应混合物置于封管中，加热至90℃，搅拌2h。TLC监测反应仍有较多原料剩余，再补加DIPEA(25.9mg,0.20mmol)后继续反应2h。反应混合物冷却至室温，减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离(二氯甲烷:丙酮＝2:1,2％三乙胺)得到白色固体化合物10R(12mg,收率22％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.89(s,1H),8.65(dd,J＝8.3,4.3Hz,1H),8.05(s,1H),7.47(dd,J＝8.3,7.4Hz,1H),7.29-7.22(m,1H),7.12-7.07(m,2H),6.91(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.80(s,1H),6.72(d,J＝8.8Hz,1H),4.20(dd,J＝10.5,2.6Hz,1H),4.02(dd,J＝10.5,8.8Hz,1H),3.64(d,J＝11.7Hz,1H),3.59(t,J＝5.3Hz,2H),3.38(s,3H),3.28(dd,J＝12.8,7.3Hz,1H),3.10(d,J＝10.8Hz,1H),2.98(d,J＝10.7Hz,1H),2.94-2.86(m,1H),2.68(d,J＝3.3Hz,2H),2.42-2.31(m,1H),2.04-1.92(m,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 543.4[M+H]+。
实施例15:化合物11R的制备
向化合物4R(60mg,0.12mmol)的二氯甲烷(1.5mL)溶液中，依次加入N-甲基-4-哌啶酮(11R-1a,42mg,0.37mmol)和2滴醋酸。反应混合物在室温下搅拌1h。随后冷却至0℃，分批次向混合物中加入三乙酰氧基硼氢化钠(80mg,0.37mmol)。反应升至室温下搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应液中加入水淬灭反应，然后再加入饱和碳酸氢钠溶液，再用乙酸乙酯(10mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到白色固体化合物11R(9mg,收率13％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.86(s,1H),8.65(dd,J＝8.5,4.4Hz,1H),8.04(s,1H),7.47(t,J＝7.8Hz,1H),7.28-7.21(m,1H),7.11-7.05(m,2H),6.91(dd,J＝8.6,1.9Hz,1H),6.81(s,1H),6.71(d,J＝8.7Hz,1H),4.18(dd,J＝10.5,2.0Hz,1H),4.01(t,J＝9.7Hz,1H),3.65(d,J＝11.2Hz,1H),3.12(t,J＝9.5Hz,1H),3.01(d,J＝10.8Hz,1H),2.95(d,J＝11.3Hz,2H),2.86(d,J＝10.9Hz,1H),2.79-2.66(m,1H),2.35-2.30(m,3H),2.06-1.95(m,2H),1.83(s,3H),1.81(s,3H),1.69-1.50(m,2H)。MS m/z582.5[M+H]+。
实施例16:化合物12R的制备
向1,2-二氟-4-硝基苯(1a,326mg,2.05mmol)和(S)-3-羟甲基吗啉(12R-1a,200mg,1.70mmol)的干燥DMSO(6mL)溶液中加入KOH(286mg,5.10mmol)。混合物在室温下搅拌3小时，然后加热到60℃反应5小时。TLC监测反应原料几乎消耗完。反应混合物冷却至室温，加入冰水，并用二氯甲烷(20mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压条件下浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝6:1)得到黄色固体化合物12R-1b(187mg,收率46％)。
室温下向化合物12R-1b的甲醇(10mL)溶液里加入钯-碳催化剂(10％,50mg)。反应体系用氢气置换三次。反应混合物在室温和氢气(1大气压)氛围下搅拌过夜。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到棕色粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1)得到无色油状化合物12R-1c(38mg,收率24％)。MS m/z 207.8[M+H]+。
向化合物12R-1c(38mg,0.18mmol)和化合物1k(58mg,0.18mmol)的2-甲氧基乙醇(1.5mL)溶液中加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.22mL)。反应混合物置于封管中，加热至120℃，搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温，减压条件下浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到黄色固体化合物12R(30mg,收率34％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.87(s,1H),8.65(dd,J＝8.5,4.4Hz,1H),8.06(s,1H),7.48(t,J＝8.6,1H),7.33-7.20(m,3H),7.13-7.06(m,2H),6.93(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H),6.77(s,1H),6.69(d,J＝8.7Hz,1H),4.16(dd,J＝10.5,2.7Hz,1H),4.05(dd,J＝11.5,3.5Hz,1H),3.98(dd,J＝10.5,9.1Hz,1H),3.88(dd,J＝10.9,3.1Hz,1H),3.76(td,J＝11.6,2.8Hz,1H),3.51-3.45(m,1H),3.30(t,J＝10.7Hz,1H),3.24-3.18(m,1H),2.84(td,J＝11.8,3.6Hz,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 486.9[M+H]+。
实施例17:化合物12S的制备
向1,2-二氟-4-硝基苯(1a,317mg,2.05mmol)和(R)-3-羟甲基吗啉(12S-1a,200mg,1.70mmol)的干燥DMSO(6mL)溶液中加入KOH(286mg,5.10mmol)。混合物在室温下搅拌3小时，然后加热到60℃反应5小时。TLC监测反应原料几乎消耗完。反应混合物冷却至室温，加入冰水，并用二氯甲烷(25mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(40mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝6:1)得到黄色固体化合物12S-1b。该化合物直接用于下一步反应。
室温下向化合物12S-1b的甲醇(15mL)溶液中加入钯-碳催化剂(10％,100mg)。反应体系用氢气置换三次。反应混合物在室温和氢气(1大气压)氛围下搅拌过夜。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到棕色粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1)得到无色油状化合物12S-1c(44mg,两步总收率:13％)。MSm/z 207.4[M+H]+。
向化合物12S-1c(44mg,0.21mmol)和化合物1k(68mg,0.21mmol)的2-甲氧基乙醇(2mL)溶液里加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.22mL)。反应混合物置于封管中，加热至120℃，搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温，减压条件下浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到黄色固体化合物12S(11mg,收率11％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.87(s,1H),8.65(dd,J＝8.4,4.4Hz,1H),8.05(s,1H),7.48(t,J＝7.9Hz,1H),7.30-7.21(m,1H),7.14-7.06(m,2H),6.93(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.83(s,1H),6.69(d,J＝8.7Hz,1H),4.16(dd,J＝10.5,2.6Hz,1H),4.05(dd,J＝11.5,3.2Hz,1H),3.98(dd,J＝10.3,9.2Hz,1H),3.88(dd,J＝10.8,2.8Hz,1H),3.76(td,J＝11.6,2.8Hz,1H),3.53-3.44(m,1H),3.30(t,J＝10.6Hz,1H),3.25-3.15(m,1H),2.89-2.77(m,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z486.5[M+H]+。
实施例18:化合物13R的制备
在0℃下，向化合物4R-1a(1.5g,4.5mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中缓慢加入三氟乙酸(4.5mL)。反应在室温下搅拌1h。TLC监测反应完毕。反应混合物在减压条件下浓缩，再加入饱和碳酸氢钠溶液中和。混合物用二氯甲烷(20mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(40mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到粗品13R-1a(3.06g)。该粗品直接用于下一步反应。
在0℃和搅拌下向粗品13R-1a(3.06g)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入DIPEA(3.36g,26.0mmol)。然后向其中缓慢滴加三氟乙酸酐(3.0g,14.3mmol)。随后将反应移至室温下搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物减压浓缩，然后加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8左右，再用二氯甲烷(30mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(40mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)得到黄色固体化合物13R-1b(1.2g,两步总收率63％)。MS m/z 332.5[M+H]+。
向化合物13R-1b(950mg,2.87mmol)的THF(10mL)溶液中加入BH3-THF(1.0M,7.17mL)。反应混合物在回流状态下搅拌2h。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温，并减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝8:1)得到黄色固体化合物13R-1c。该粗产物直接用于下一步反应。
室温下向化合物13R-1c的甲醇(20mL)溶液中加入钯-碳催化剂(10％,200mg)。反应体系用氢气置换三次。该反应混合物在室温和氢气(1大气压)氛围下搅拌过夜。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到棕色粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1至20:1)得到黄色固体化合物13R-1d(520mg,两步总收率63％)。MS m/z 288.4[M+H]+。
向化合物13R-1d(91mg,0.32mmol)和化合物1k(100mg,0.32mmol)的2-甲氧基乙醇(2mL)溶液中加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.33mL)。反应混合物置于封管中，加热至120℃，搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温，减压条件下浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到黄色固体化合物13R(71mg,收率40％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.80(s,1H),8.58(dd,J＝8.3,4.4Hz,1H),7.99(s,1H),7.41(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.22-7.15(m,1H),7.05-7.00(m,2H),6.85(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.69(s,1H),6.65(d,J＝8.8Hz,1H),4.11(dd,J＝10.5,2.7Hz,1H),3.94(dd,J＝10.5,8.9Hz,1H),3.56(dt,J＝11.4,2.4Hz,1H),3.16-3.08(m,1H),3.02-2.93(m,3H),2.88-2.82(m,1H),2.77(td,J＝11.6,3.1Hz,1H),2.62(td,J＝11.3,2.9Hz,1H),2.21(t,J＝10.6Hz,1H),1.77(s,3H),1.74(s,3H)。MS m/z 567.6[M+H]+。
实施例19:化合物14R的制备
向封管中依次加入化合物4R(50mg,0.10mmol)，二甲氨基氯乙烷盐酸(14R-1a,16mg,0.10mmol)，碘化钠(16mg,0.10mmol)和碳酸钾(42mg,0.30mmol)，最后加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)将其溶解。反应混合物在封管中加热至80℃，搅拌过夜。TLC监测反应仍有原料剩余。反应混合物冷却至室温，加入水(10mL)，用二氯甲烷(15mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(25mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝3:1)得到米白色固体化合物14R(2mg,收率4％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.89(s,1H),8.65(dd,J＝8.3,4.5Hz,1H),8.05(s,1H),7.48(t,J＝7.5Hz,1H),7.26(d,J＝20.4Hz,1H),7.15-7.07(m,2H),6.92(dd,J＝8.6,2.0Hz,1H),6.79(s,1H),6.71(d,J＝8.8Hz,1H),4.20(dd,J＝10.4,2.2Hz,1H),4.05-3.97(m,1H),3.63(d,J＝11.6Hz,2H),3.19(dd,J＝10.3,9.0Hz,1H),3.04(d,J＝10.3Hz,1H),2.91(d,J＝10.1Hz,1H),2.82(td,J＝11.5,2.5Hz,1H),2.73-2.63(m,2H),2.56-2.39(s,6H),2.37-2.29(m,2H),2.24-2.18(m,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 556.5[M+H]+。
实施例20:化合物15R的制备
向封管中依次加入化合物4R-2(48mg,0.10mmol)，醋酸钯(0.2mg,0.001mmol)，RuPhos(0.9mg,0.002mmol)，叔丁醇钠(11.5mg,0.12mmol)和3-溴吡啶(15R-1a，17.4mg,0.11mmol)，最后加入N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)。反应混合物在封管中加热至110℃，搅拌过夜。TLC监测反应仍有原料剩余。反应混合物冷却至室温，加入水(10mL)，用二氯甲烷(10mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(25mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到黄色固体化合物15R(6mg,收率11％)。MS m/z 562.5[M+H]+。
实施例21:化合物16R的制备
向封管里依次加入化合物4R-2(48mg,0.10mmol)，醋酸钯(0.2mg,0.001mmol)，RuPhos(0.9mg,0.002mmol)，叔丁醇钠(11.5mg,0.12mmol)和溴苯(16R-1a,17.3mg,0.11mmol)，最后加入N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)。反应混合物在封管里，加热至110℃，搅拌过夜。TLC监测反应仍有原料剩余。反应混合物冷却至室温后，加入水(10mL)，用二氯甲烷(10mL x 3)萃取。合并的有机相饱和食盐水(25mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到黄色固体化合物16R(4mg,收率7％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.82(s,1H),8.59(dd,J＝8.5,4.4Hz,1H),7.99(s,1H),7.43(dd,J＝8.7,7.7Hz,1H),7.27-7.16(m,3H),7.07(d,J＝2.5Hz,1H),7.03(td,J＝7.4,1.4Hz,1H),6.95-6.82(m,4H),6.75-6.69(m,2H),4.24(dd,J＝10.5,2.6Hz,1H),4.05(dd,J＝10.5,9.0Hz,1H),3.75-3.62(m,2H),3.55-3.48(m,1H),3.28-3.20(m,1H),2.97-2.82(m,2H),2.53(t,J＝11.1Hz,1H),1.78(s,3H),1.75(s,3H)。MS m/z561.6[M+H]+。
实施例22:化合物17R的制备
室温下，将化合物4R(48.5mg,0.1mmol)，17R-1a(10.5mg，0.15mmol)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(57mg,0.15mmol)和N,N-二异丙基乙胺(20mg,0.15mmol)溶于DMF(1.5mL)中，反应混合物搅拌0.5h。TLC监测反应完毕。反应混合物中加入水(10mL)，用二氯甲烷(15mL x 3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)得到黄色固体化合物17R。MS m/z 537.6[M+H]+。
实施例23:化合物18R的制备
将化合物13R-1a(400mg,1.70mmol)，18R-1a(422mg,2.55mmol)，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲(970mg,2.55mmol)和二异丙基乙基胺(330mg,2.55mmol)溶于乙腈(20mL)中，反应混合物在室温下搅拌30分钟。TLC监测反应完毕。反应混合物减压浓缩，所得粗品再经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到黄色固体化合物18R-1b(417mg,收率71％)。MS m/z 347.5[M+H]+。
将化合物18R-1b(326mg,0.94mmol)和二水合二氯化锡(977mg,4.71mmol)溶于乙醇(8mL)中，再加入HCl水溶液(2.0M,2.35mL)，反应混合物在90℃下搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物减压浓缩，再溶于少量二氯甲烷中，加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH至7-8，二氯甲烷(20x 3mL)萃取。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后得到黄色固体化合物18R-1c(203mg,收率68％)。MS m/z 317.4[M+H]+。
将化合物18R-1c(80mg,0.25mmol)和化合物1k(80mg,0.25mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.26mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝9:1)得到淡黄色固体化合物18R(14mg,收率9％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.90(s,1H),8.66-8.62(m,1H),8.06(s,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,1H),7.30-7.24(m,1H),7.15(d,J＝2.4Hz,1H),7.14-7.10(m,1H),6.96-6.92(m,1H),6.91-6.81(m,2H),6.80(s,1H),6.76-6.70(m,1H),4.79-4.60(m,1H),4.39-4.13(m,2H),4.08-4.02(m,1H),3.76(d,J＝11.6Hz,1H),3.51-3.34(m,3H),3.15-2.91(m,2H),2.77-2.70(m,1H),2.56(s,6H),1.84(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z596.5[M+H]+。
实施例24:化合物19R的制备
0℃下将化合物13R-1a(500mg,2.13mmol)和三乙胺(258mg,2.55mmol)溶于二氯甲烷(15mL)中，再缓慢加入化合物19R-1a(416mg,2.55mmol)的二氯甲烷稀释液(5mL)，该反应混合物在室温下搅拌1小时。TLC监测反应完毕。反应混合物减压浓缩，所得粗品再经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1至1:2)得到黄色固体化合物19R-1b(153mg,收率22％)。MS m/z 326.3[M+H]+。
将化合物19R-1b(150mg,0.46mmol)和二水合二氯化锡(479mg,2.31mmol)溶于乙醇(8mL)中，再加入HCl水溶液(2.0M,1.15mL)，反应混合物在90℃下搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物减压浓缩，再溶于少量二氯甲烷中，饱和碳酸氢钠溶液调节pH至7-8，二氯甲烷(20x 3mL)萃取。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。所得粗品再经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物19R-1c(107mg,收率78％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ6.84(dd,J＝16.5,10.0Hz,1H),6.60(d,J＝8.6Hz,1H),6.21(d,J＝10.0Hz,1H),6.15(d,J＝16.5Hz,1H),6.09(dd,J＝8.5,2.4Hz,1H),6.03(d,J＝2.4Hz,1H),4.59(bs,2H),4.22(dd,J＝10.6,2.5Hz,1H),3.82(dd,J＝10.5,8.7Hz,1H),3.72(d,J＝12.1Hz,1H),3.51(t,J＝10.2Hz,2H),2.96-2.90(m,1H),2.81-2.74(m,1H),2.57-2.51(m,1H),2.42(t,J＝11.1Hz,1H)。
将化合物19R-1c(50mg,0.17mmol)和化合物1k(54mg,0.17mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.18mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝50:1,2％三乙胺)得到淡黄色固体化合物19R(32mg,收率32％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.93(s,1H),8.65-8.61(m,1H),8.05(s,1H),7.50-7.45(m,1H),7.30-7.24(m,1H),7.16(d,J＝2.5Hz,1H),7.14-7.09(m,1H),7.03(s,1H),6.96-6.92(m,1H),6.73(d,J＝8.8Hz,1H),6.44(dd,J＝16.6,9.9Hz,1H),6.30(d,J＝16.6Hz,1H),6.10(d,J＝9.9Hz,1H),4.26-4.22(m,1H),4.04-3.99(m,1H),3.81-3.74(m,2H),3.68-3.64(m,1H),3.31-3.23(m,1H),2.94-2.84(m,2H),2.54(t,J＝11.1Hz,1H),1.84(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z 575.5[M+H]+。
实施例25:化合物20R的制备
室温下将4-溴巴豆酸(20R-1a,1.0g,6.06mmol)溶于甲醇(60mL)中，再加入甲醇钠的甲醇溶液(1.64g,30.3mmol,10mL)。反应混合物室温下搅拌30分钟，再在回流条件下搅拌2小时。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩，再将其溶于水和乙酸乙酯的混合液(v/v＝50/50)中，滴加入HCl水溶液(2.0M)调节pH至1,用乙酸乙酯萃取(3x 20mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝2:1)得到黄色固体化合物20R-1b(622mg,收率88％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.06(dt,J＝15.7,4.1Hz,1H),6.08(dt,J＝15.7,2.1Hz,1H),4.12(dd,J＝4.1,2.1Hz,2H),3.41(s,3H)。
化合物13R-1a(200mg,0.85mmol)，4-甲氧基巴豆酸(20R-1b,148mg,1.28mmol)，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲(487mg,1.28mmol)和二异丙基乙基胺(165mg,1.28mmol)溶于乙腈(15mL)中，反应混合物在室温下搅拌30分钟。TLC监测反应完毕。反应混合物减压浓缩，所得粗品再经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物20R-1c(700mg)直接用于下一步反应。MS m/z 334.3[M+H]+。
化合物20R-1c(700mg,2.10mmol)和铁粉(586mg,10.5mmol)加入到乙酸乙酯/水(v/v＝10mL/6mL)的混合液中，再加入氯化铵(702mg,13.12mmol)，反应混合物在室温下搅拌4小时。TLC监测反应完毕。过滤反应混合物，滤液用乙酸乙酯萃取(3x 25mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。所得粗品再经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物20R-1d(55mg,两步收率21％)。MS m/z304.4[M+H]+。
将化合物20R-1d(55mg,0.18mmol)和化合物1k(60mg,0.18mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.20mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物20R(8.3mg,收率8％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.95(s,1H),8.66-8.63(m,1H),8.04(s,1H),7.48(t,J＝7.9Hz,1H),7.30-7.24(m,1H),7.20-7.09(m,2H),7.04(s,1H),6.98-6.89(m,2H),6.77-6.70(m,1H),6.61-6.51(m,1H),4.82-4.60(m,1H),4.32-4.25(m,1H),4.17-3.90(m,4H),3.73(d,J＝11.0Hz,1H),3.43(s,3H),3.11-2.92(m,2H),2.77-2.66(m,1H),2.61-2.50(m,1H),1.84(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z 583.6[M+H]+。
实施例26:化合物21R的制备
将化合物13R-1a(300mg,1.28mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，再依次加入N-Boc-哌啶酮(21R-1a,381mg,1.91mmol)和2滴醋酸。反应混合物室温下搅拌2小时。随后缓慢加入三乙酰氧基硼氢化钠(405mg,1.91mmol)，然后室温下搅拌过夜。反应完毕后，0℃下向反应混合物中加入1N氢氧化钠溶液，再将该混合液倒入冰水中，二氯甲烷萃取(3x 20mL)。合并的有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物21R-1b(483mg,收率91％)。MS m/z 419.5[M+H]+。
室温下向甲醇(20mL)中加入化合物21R-1b(200mg,0.48mmol)和钯碳催化剂(10％,50mg)。该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。该粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得到无色油状化合物21R-1c(77mg,收率41％)。MS m/z 389.6[M+H]+。
将化合物21R-1c(77mg,0.20mmol)和化合物1k(63mg,0.20mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.21mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝3:1,2％三乙胺)得到黄色固体化合物21R(26mg,收率23％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ10.89(s,1H),8.67-8.63(m,1H),8.04(s,1H),7.51-7.45(m,1H),7.29-7.22(m,1H),7.12-7.07(m,2H),6.92(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.88(s,1H),6.71(d,J＝8.8Hz,1H),4.22-4.14(m,1H),4.06-3.93(m,1H),3.66(d,J＝11.4Hz,1H),3.50-3.39(m,2H),3.14-3.06(m,1H),2.98(d,J＝10.5Hz,1H),2.92-2.81(m,3H),2.78-2.70(m,1H),2.60-2.47(m,3H),2.11-1.88(m,4H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 568.5[M+H]+。
实施例27:化合物22R的制备
将化合物21R-1b(283mg,0.73mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，0℃下缓慢滴加三氟乙酸(1.5mL)。反应混合物在室温下搅拌30分钟。反应完毕后，反应混合物减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1,2％三乙胺)得到黄色固体化合物22R-1a(150mg,收率65％)。MS m/z 319.4[M+H]+。
化合物22R-1a(150mg,0.47mmol)和二异丙基乙基胺(67mg,0.52mmol)溶于二氯甲烷(8mL)中，0℃下向其中缓慢滴加丙烯酰氯(47mg,0.52mmol)的二氯甲烷稀释液(2mL)。反应混合物在室温下搅拌30分钟。反应完毕后，反应混合物减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝15:1)得到黄色固体化合物22R-1b(240mg)直接用于下一步反应。MS m/z 373.5[M+H]+。
化合物22R-1b(240mg,0.64mmol)和铁粉(180mg,3.22mmol)溶于乙酸乙酯/水混合溶剂(v/v＝5mL/3mL)中，再加入氯化铵(215mg,4.03mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完毕后，反应混合物经硅藻土过滤，滤液用乙酸乙酯萃取(3x 25mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物22R-1c(91mg,两步收率56％)。MS m/z 343.5[M+H]+。
将化合物22R-1c(91mg,0.27mmol)和化合物1k(85mg,0.27mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.28mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得到黄色固体化合物22R(12mg,收率7％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.91(s,1H),8.67-8.63(m,1H),8.04(s,1H),7.48(t,J＝7.9Hz,1H),7.29-7.22(m,1H),7.12-7.06(m,2H),6.93(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.89(s,1H),6.72(d,J＝8.8Hz,1H),6.58(dd,J＝16.8,10.6Hz,1H),6.28(dd,J＝16.8,1.8Hz,1H),5.69(dd,J＝10.6,1.8Hz,1H),4.72(d,J＝10.5Hz,1H),4.24-4.16(m,1H),4.11-3.98(m,2H),3.68(d,J＝11.4Hz,1H),3.27-2.96(m,3H),2.93-2.75(m,2H),2.73-2.48(m,3H),2.19-2.08(m,1H),2.00-1.88(m,2H),1.74-1.57(m,2H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 622.6[M+H]+。
实施例28:化合物23R的制备
化合物23R-1a(5.0g,21.01mmol)，23R-1b(4.54g,21.01mmol)和氢氧化钾(3.54g,63.03mmol)溶于二甲亚砜(60mL)中，室温下搅拌3小时，再在60℃下搅拌3小时。反应完毕后，待反应混合物冷却后将其倒入冰水中，室温下搅拌1小时。该混合物再用二氯甲烷萃取(3x 40mL)。合并的有机相再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后滤液减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到黄色固体化合物23R-1c(5.0g,收率57％)和黄色固体化合物24R-1a(1.4g,收率16％)。23R-1c:1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.04-8.02(m,1H),7.72-7.70(m,1H),4.25-4.14(m,2H),3.87-3.76(m,2H),3.64-3.55(m,1H),3.51-3.32(m,2H),3.29-3.16(m,2H),1.49(s,9H)；24R-1a:1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝2.4Hz,1H),7.63(d,J＝2.2Hz,1H),4.50-4.43(m,1H),4.28-4.05(m,3H),3.75-3.70(m,1H),3.22–3.15(m,1H),3.12-2.99(m,1H),2.84(td,J＝11.8,2.9Hz,1H),2.69-2.56(m,1H),1.49(s,9H)。
将化合物23R-1c(2.0g,4.83mmol)，四甲基锡(1.73g,9.66mmol)，四三苯基膦钯(279mg,0.24mmol)和氯化锂(409mg,9.66mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(35mL)混合液加热至95℃，搅拌过夜。反应完毕后，将反应混合物过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝15:1)得到黄色固体化合物23R-1d(1.37g,收率81％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.64(d,J＝2.5Hz,1H),7.58(d,J＝2.6Hz,1H),4.25-4.13(m,2H),3.87-3.80(m,2H),3.60-3.52(m,1H),3.35(s,1H),3.23(s,1H),3.10-2.97(m,2H),2.36(s,3H),1.48(s,9H)。
室温下向甲醇(8mL)中加入化合物23R-1d(200mg,0.57mmol)和钯碳催化剂(10％,80mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。该粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得到灰白色固体化合物23R-1e(162mg,89％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.14(d,J＝2.4Hz,1H),6.10(d,J＝2.4Hz,1H),4.31(t,J＝10.9Hz,1H),4.17-3.93(m,3H),3.34(s,1H),3.20-2.97(m,2H),2.90(d,J＝12.2Hz,1H),2.79-2.66(m,1H),2.20(s,3H),1.47(s,9H)。
将化合物23R-1e(50mg,0.16mmol)和化合物1k(50mg,0.16mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.16mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1,2％三乙胺)得到淡黄色固体化合物23R(59mg,收率75％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.86(s,1H),8.67-8.63(m,1H),8.07(s,1H),7.53-7.47(m,1H),7.30-7.23(m,1H),7.13-7.09(m,1H),7.08(d,J＝2.4Hz,1H),6.92(s,1H),6.81(d,J＝2.3Hz,1H),4.67(t,J＝10.8Hz,1H),4.05(dd,J＝10.8,3.0Hz,1H),3.35(dd,J＝12.8,4.3Hz,1H),3.23-3.18(m,1H),3.17-3.00(m,4H),2.94-2.87(m,1H),2.25(s,3H),1.84(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z 499.4[M+H]+。
实施例29:化合物23S的制备
化合物23R-1a(100mg,0.42mmol)，23S-1a(91mg,0.42mmol)和氢氧化钾(71mg,1.26mmol)溶于二甲亚砜(5mL)中，室温下搅拌3小时，再在60℃下搅拌3小时。反应完毕后，待反应混合物冷却后将其倒入冰水中，室温下搅拌1小时。混合物再用二氯甲烷萃取(3x25mL)。合并的有机相经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后滤液减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到黄色固体化合物23S-1b(64mg,收率37％)和黄色固体化合物24S-1a(64mg,收率37％)。23S-1b:1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.03(d,J＝2.5Hz,1H),7.71(d,J＝2.6Hz,1H),4.26-4.15(m,2H),3.86-3.78(m,2H),3.60(dd,J＝13.8,4.1Hz,1H),3.52-3.36(m,2H),3.29-3.15(m,2H),1.48(s,9H)；24S-1a:1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝2.5Hz,1H),7.63(d,J＝2.5Hz,1H),4.49-4.44(m,1H),4.28-4.04(m,3H),3.71(d,J＝11.3Hz,1H),3.22-3.15(m,1H),3.10-3.01(m,1H),2.88-2.79(m,1H),2.66-2.57(m,1H),1.49(s,9H)。
将化合物23S-1b(64mg,0.16mmol)，四甲基锡(56mg,0.31mmol)，四三苯基膦钯(9mg,0.01mmol)和氯化锂(13mg,0.31mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)混合液加热至90℃，搅拌过夜。反应完毕后，将反应混合物过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到黄色固体化合物23S-1c(33mg,收率60％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.65(d,J＝2.5Hz,1H),7.59(d,J＝2.6Hz,1H),4.24-4.14(m,2H),3.89-3.78(m,2H),3.60-3.49(m,1H),3.39-3.30(m,1H),3.28-3.18(m,1H),3.10-2.98(m,2H),2.37(s,3H),1.48(s,9H)。
室温下向甲醇(6mL)中加入化合物23S-1c(33mg,0.09mmol)和钯碳催化剂(10％,40mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成，反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品，随后粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得到淡黄色固体化合物23S-1d(23mg,76％)。MS m/z320.4[M+H]+。
将化合物23S-1d(23mg,0.07mmol)和化合物1k(23mg,0.07mmol)溶于2-甲氧基乙醇(1mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.08mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕，反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝5:1)得到淡黄色固体化合物23S(14mg,收率38％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.50-8.45(m,1H),8.04(s,1H),7.62-7.53(m,2H),7.27-7.22(m,1H),6.98(d,J＝2.4Hz,1H),6.82(d,J＝2.1Hz,1H),4.53(t,J＝11.0Hz,1H),4.02(dd,J＝10.7,2.8Hz,1H),3.30-3.26(m,1H),3.18-3.09(m,2H),3.07-2.99(m,3H),2.87-2.80(m,1H),2.20(s,3H),1.86(s,3H),1.83(s,3H)。MS m/z499.4[M+H]+。
实施例30:化合物24R的制备
将化合物24R-1a(1.0g,2.41mmol)，四甲基锡(863mg,4.83mmol)，四三苯基膦钯(140mg,0.12mmol)和氯化锂(205mg,4.83mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(15mL)混合液加热至95℃，搅拌过夜。反应完毕后，将反应混合物过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝15:1)得到黄色固体化合物24R-1b(861mg,收率100％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.60-7.54(m,2H),4.38(dd,J＝10.8,2.8Hz,1H),4.26-4.09(m,2H),4.06(dd,J＝10.8,8.8Hz,1H),3.73-3.68(m,1H),3.14-3.01(m,2H),2.82-2.73(m,1H),2.65-2.55(m,1H),2.21(s,3H),1.49(s,9H)。
室温下向甲醇(6mL)中加入化合物24R-1b(150mg,0.43mmol)和钯碳催化剂(10％,50mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。该粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得到灰白色固体化合物24R-1c(119mg,87％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.11(d,J＝2.3Hz,1H),6.05(d,J＝2.0Hz,1H),4.19(dd,J＝10.7,2.7Hz,1H),4.15-3.98(m,2H),3.91(dd,J＝10.6,8.4Hz,1H),3.62-3.57(m,1H),3.10-3.03(m,1H),3.02-2.97(m,1H),2.74-2.67(m,1H),2.64-2.59(m,1H),2.09(s,3H),1.48(s,9H)。
将化合物24R-1c(50mg,0.16mmol)和化合物1k(50mg,0.16mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.16mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕，反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1,2％三乙胺)得到淡黄色固体化合物24R(52mg,收率66％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.14(s,1H),9.04(s,1H),8.67-8.52(m,1H),8.14(s,1H),7.61-7.55(m,1H),7.46(t,J＝7.8Hz,1H),7.16(t,J＝7.4Hz,1H),6.98(s,1H),6.91(s,1H),4.32-4.28(m,1H),3.96-3.91(m,1H),3.59(d,J＝12.3Hz,1H),3.30-3.24(m,3H),2.92(t,J＝12.1Hz,1H),2.83(t,J＝12.4Hz,1H),2.69(t,J＝11.8Hz,1H),2.05(s,3H),1.80(s,3H),1.77(s,3H)。MS m/z 499.4[M+H]+。
实施例31:化合物24S的制备
将化合物24S-1a(39mg,2.41mmol)，四甲基锡(34mg,0.19mmol)，四三苯基膦钯(6mg,0.004mmol)和氯化锂(8mg,0.19mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)混合液加热至95℃，搅拌过夜。反应完毕后，将反应混合物过滤，滤液减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到黄色固体化合物24S-1b(28mg,收率85％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.60-7.55(m,2H),4.40-4.35(m,1H),4.25-4.02(m,3H),3.71(d,J＝11.4Hz,1H),3.16-3.00(m,2H),2.83-2.73(m,1H),2.66-2.57(m,1H),2.21(s,3H),1.49(s,9H)。
室温下向甲醇(6mL)中加入化合物24S-1b(28mg,0.08mmol)和钯碳催化剂(10％,40mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。该粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得到灰白色固体化合物24S-1c(12mg,47％)。MS m/z320.4[M+H]+。
将化合物24S-1c(12mg,0.04mmol)和化合物1k(12mg,0.04mmol)溶于2-甲氧基乙醇(1mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.04mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝5:1)得到黄色固体化合物24S(8mg,收率42％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.52-8.48(m,1H),8.02(s,1H),7.62-7.55(m,1H),7.51(t,J＝7.9Hz,1H),7.25-7.20(m,1H),6.89(d,J＝2.0Hz,1H),6.74(d,J＝1.9Hz,1H),4.27-4.21(m,1H),3.96-3.90(m,1H),3.50(d,J＝11.9Hz,1H),3.08-3.01(m,3H),2.89-2.80(m,1H),2.63-2.56(m,1H),2.51(t,J＝11.7Hz,1H),2.07(s,3H),1.87(d,J＝2.9Hz,3H),1.84(d,J＝2.9Hz,3H)。MS m/z 499.4[M+H]+。
实施例32:化合物25R的制备
室温下将化合物23R-1d(1.17g,3.35mmol)溶于甲醇(15mL)中，再滴加HCl甲醇溶液(4.0M,1.36mL)，混合液在60℃下搅拌1小时。反应完毕后，反应混合物减压浓缩，再溶于二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液中和。该混合物用二氯甲烷萃取(3x 20mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物25R-1a(465mg,收率56％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.57(d,J＝2.5Hz,1H),7.51(d,J＝2.6Hz,1H),4.37-4.27(m,1H),4.10-4.01(m,1H),3.19-3.12(m,2H),3.09-2.91(m,5H),2.29(s,3H)。
化合物25R-1a(150mg,0.60mmol)，甲醛溶液(37％,1.5mL)和2滴醋酸的甲醇(6mL)混合液在室温下搅拌1小时。随后加入氰基硼氢化钠(113mg,1.81mmol)，反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完毕后，反应混合物减压浓缩，加入水(15mL)后再用二氯甲烷萃取(3x15mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝30:1)得到黄色固体化合物25R-1b(155mg,收率98％)。MS m/z 264.4[M+H]+。
室温下向甲醇(8mL)中加入化合物25R-1b(155mg,0.59mmol)和钯碳催化剂(10％,80mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。该粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得到淡黄色固体化合物25R-1c(123mg,90％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.12(d,J＝2.6Hz,1H),6.09(d,J＝2.6Hz,1H),4.62(t,J＝10.7Hz,1H),4.01-3.96(m,1H),3.42(bs,2H),3.18(d,J＝10.6Hz,1H),3.02-2.76(m,4H),2.59(d,J＝9.4Hz,1H),2.37-2.33(m,1H),2.31(s,3H),2.19(s,3H)。
将化合物25R-1c(50mg,0.22mmol)和化合物1k(68mg,0.22mmol)溶于2-甲氧基乙醇(1.5mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.22mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕，反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到淡黄色固体化合物25R(73mg,收率66％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ10.89(s,1H),8.68-8.64(m,1H),8.07(s,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,1H),7.30-7.22(m,1H),7.12-7.05(m,2H),6.96(s,1H),6.80(d,J＝2.3Hz,1H),4.62(t,J＝10.7Hz,1H),4.05(dd,J＝10.8,2.8Hz,1H),3.21(d,J＝10.8Hz,1H),3.07-3.02(m,1H),2.98-2.91(m,1H),2.87(d,J＝11.8Hz,1H),2.80(d,J＝10.0Hz,1H),2.63-2.56(m,1H),2.39-2.32(m,1H),2.31(s,3H),2.25(s,3H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 513.4[M+H]+。
实施例33:化合物26R的制备
将化合物25R-1a(150mg,0.60mmol)和二异丙基乙基胺(156mg,1.20mmol)溶于二氯甲烷(6mL)中，0℃下缓慢滴加丙烯酰氯(60mg,0.66mmol)的二氯甲烷(4mL)稀释液。反应混合液在室温下搅拌1小时。反应完毕后，反应混合物减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得到黄色固体化合物26R-1a(190mg,收率100％)。MS m/z304.3[M+H]+。
向化合物26R-1a(190mg,0.63mmol)和水合二氯化锡(650mg,3.13mmol)的乙醇(10mL)混合液中加入HCl水溶液(2.0M,1.57mL)，反应混合物在90℃下搅拌6小时。TLC监测反应完成。反应混合物减压浓缩，再溶于二氯甲烷，混合液经饱和碳酸氢钠水溶液中和，二氯甲烷萃取(3x 20mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到淡黄色固体化合物26R-1b(103mg,收率60％)。MS m/z 274.3[M+H]+。
将化合物26R-1b(50mg,0.18mmol)和化合物1k(58mg,0.18mmol)溶于2-甲氧基乙醇(1.5mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.19mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到白色固体化合物26R(16mg,收率16％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.97(s,1H),8.65-8.61(m,1H),8.06(s,1H),7.53-7.47(m,1H),7.31-7.24(m,1H),7.17-7.08(m,2H),7.00(s,1H),6.87-6.75(m,1H),6.63-6.51(m,1H),6.36(d,J＝16.7Hz,1H),5.76(d,J＝10.0Hz,1H),4.70-4.55(m,1H),4.38-4.20(m,1H),4.16-3.89(m,2H),3.55-3.45(m,1H),3.37-3.19(m,2H),3.07(d,J＝12.1Hz,1H),2.80(t,J＝12.3Hz,1H),2.27(s,3H),1.85(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z 553.5[M+H]+。
实施例34:化合物27R的制备
将化合物25R-1a(150mg,0.60mmol)，N-甲基哌啶酮(11R-1a,340mg,3.01mmol)和2滴醋酸的甲醇(8mL)混合液在室温下搅拌1小时。随后加入氰基硼氢化钠(113mg,1.81mmol)，反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完毕后，反应混合物减压浓缩，再经二氯甲烷萃取(3x 15mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝30:1)得到黄色固体化合物27R-1a(219mg)直接用于下一步反应。MS m/z 347.4[M+H]+。
室温下向甲醇(10mL)中加入化合物27R-1a(219mg,0.63mmol)和钯碳催化剂(10％,80mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。该粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％三乙胺)得到灰白色固体化合物27R-1b(182mg,两步收率96％)。MSm/z 317.4[M+H]+。
将化合物27R-1b(50mg,0.16mmol)和化合物1k(50mg,0.16mmol)溶于2-甲氧基乙醇(1.5mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.16mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝50:1,2％三乙胺)得到淡黄色固体化合物27R(43mg,收率46％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.51-8.45(m,1H),8.02(s,1H),7.60-7.50(m,2H),7.22(t,J＝6.5Hz,1H),6.96(d,J＝2.3Hz,1H),6.79(d,J＝2.3Hz,1H),4.53(t,J＝10.6Hz,1H),3.94(dd,J＝10.6,2.7Hz,1H),3.11-3.01(m,2H),3.00-2.77(m,5H),2.69(dd,J＝11.7,4.1Hz,1H),2.51-2.42(m,1H),2.26(s,3H),2.23-2.15(m,1H),2.17(s,3H),2.05(t,J＝11.0Hz,2H),1.88-1.80(m,2H),1.84(s,3H),1.82(s,3H),1.63-1.49(m,2H)。MS m/z 596.6[M+H]+。
实施例35:化合物27S的制备
将化合物23S-1c(200mg,0.57mmol)溶于甲醇(2mL)中，冰浴下滴加盐酸甲醇溶液(1mL,4M)。滴加完毕后，室温搅拌1小时。TLC检测反应完全。反应混合物减压浓缩，再加入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)，用乙酸乙酯(3x 10mL)萃取。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩得到黄色固体化合物27S-1a(100mg,收率70％)。MS m/z250.3[M+H]+。
将化合物27S-1a(100mg,0.40mmol)，N-甲基哌啶酮(11R-1a,227mg,2.00mmol)和2滴醋酸的甲醇(5mL)混合液在室温下搅拌1小时。随后加入氰基硼氢化钠(75mg,1.21mmol)，反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完毕后，反应混合物减压浓缩，再经二氯甲烷萃取(3x15mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝30:1)得到黄色固体化合物27S-1b(140mg)直接用于下一步反应。MS m/z 347.4[M+H]+。
室温下向甲醇(10mL)中加入化合物27S-1b(55mg,0.16mmol)和钯碳催化剂(10％,10mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到灰白色固体化合物27S-1c(50mg,收率99％)。MSm/z 317.4[M+H]+。
将化合物27S-1c(50mg,0.16mmol)和化合物1k(50mg,0.16mmol)溶于2-甲氧基乙醇(1.5mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.16mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕，反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝50:1,2％三乙胺)得到淡黄色固体化合物27S(33mg,收率35％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.51-8.45(m,1H),8.03(s,1H),7.60-7.51(m,2H),7.23(t,J＝6.5Hz,1H),6.96(s,1H),6.80(s,1H),4.55(t,J＝10.8Hz,1H),3.97(dd,J＝10.5,2.0Hz,1H),3.13-3.05(m,2H),3.00-2.94(m,3H),2.90-2.82(m,2H),2.72(dd,J＝12.0,4.0Hz,1H),2.51-2.42(m,1H),2.32(s,3H),2.26-2.12(m,3H),2.18(s,3H),1.93-1.80(m,2H),1.85(s,3H),1.82(s,3H),1.65-1.52(m,2H)。MS m/z 596.6[M+H]+。
实施例36:化合物28R的制备
室温下向甲醇(6mL)中加入化合物20R-1c(123mg,0.37mmol)和钯碳催化剂(10％,30mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品，随后粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝15:1)得到黄色固体化合物28R-1a(73mg,65％)。MS m/z 306.5[M+H]+。
将化合物28R-1a(73mg,0.24mmol)和化合物1k(76mg,0.24mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.25mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕，反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得到黄色固体化合物28R(28mg,收率21％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.95(s,1H),8.67-8.58(m,1H),8.05(s,1H),7.48(t,J＝7.7Hz,1H),7.30-7.24(m,1H),7.19-7.09(m,2H),6.99-6.88(m,2H),6.77-6.70(m,1H),4.68(dd,J＝53.0,13.0Hz,1H),4.30-4.22(m,1H),4.08-3.81(m,2H),3.71(d,J＝11.8Hz,1H),3.44(t,J＝5.9Hz,2H),3.34(s,3H),3.10-2.84(m,2H),2.74-2.63(m,1H),2.57-2.41(m,3H),1.98-1.90(m,2H),1.84(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z585.6[M+H]+。
实施例37:化合物29R的制备
将化合物29R-1a(2.0g，6.09mmol)，TMSN3(1.4g，12.19mmol)，2-氨基乙醇(820mg，13.14mmol)，铜粉(774mg，12.19mmol)溶于DMA(15mL)中，氮气保护下加热至95℃搅拌至反应完全。加入15mL水，以乙酸乙酯提取(3x 15mL)。合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂。所得粗品经柱层析纯化得黄色油状液体29R-1b(600mg，37％)。MS m/z265.3[M+H]+。
将化合物29R-1b(600mg，2.27mmol)，DMAP(55mg，0.45mmol)溶于乙腈(10mL)中，在冰浴下缓慢滴加Boc2O(1.49g，6.81mmol)，滴加完毕后加热至50℃搅拌至反应完全。加入15mL水，以乙酸乙酯提取(3x 15mL)。合并的有机层以无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂。所得粗品经柱层析纯化得黄色油状液体29R-1c(600mg，57％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.69(d,J＝2.6Hz,1H),7.59(d,J＝2.6Hz,1H),4.19–4.12(m,2H),3.67-3.24(m,3H),2.75-2.66(m,2H),2.41-2.34(m,5H),1.47(s,9H),1.44(s,9H)。
将化合物29R-1c(140mg,0.30mmol)和10％的钯碳催化剂(32mg,0.03mmol)溶于甲醇(3mL)中，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到淡黄色固体化合物29R-1d(60mg,46％)。MS m/z 435.6[M+H]+。
将化合物29R-1d(60mg,0.14mmol)和化合物1k(43mg,0.14mmol)溶于化合物2-甲氧基乙醇(1.5mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.35mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经制备型薄板层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到淡黄色固体化合物29R-1e(12mg,收率13％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.53-8.50(m,1H),8.01(s,1H),7.58-7.55(m,2H),7.23-7.20(m,1H),6.52-6.50(m,1H),6.47-6.45(m,1H),4.53(t,J＝11.0Hz,1H),4.01(dd,J＝10.8,1.8Hz,1H),3.30-3.29(m,1H),3.17(d,J＝10.5Hz,1H),2.99(d,J＝12.0Hz,1H),2.87(d,J＝10.5Hz,1H),2.77(t,J＝11.8Hz,1H),2.67-2.63(m,1H),2.44(t,J＝10.0Hz,1H),2.34(s,3H),1.85(s,3H),1.82(s,3H)。
将化合物29R-1e(12mg，0.023mmol)溶于1mL二氯甲烷中，加入二异丙基乙基胺(30mg，0.23mmol)，冰浴下滴加丙烯酰氯(2.1mg，0.023mmol)的1mL二氯甲烷稀释液。反应混合液在室温下搅拌1小时。TLC检测反应完全。将反应液以水猝灭，二氯甲烷提取。合并的二氯甲烷层以饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。所得粗品经制备型薄层板纯化得化合物29R(6mg，45％)。MS m/z 568.6[M+H]+。
实施例38:化合物30R的制备
将化合物25R-1a(400mg,1.60mmol)，N-叔丁氧碳基-4-哌啶酮(1.6g,8.02mmol)和3滴醋酸的甲醇(15mL)混合液在室温下搅拌1小时。随后加入氰基硼氢化钠(303mg,4.81mmol)，反应混合物在室温下搅拌3小时。反应完毕后，反应混合物减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝30:1)得到黄色油状化合物30R-1a(694mg)直接用于下一步反应。MS m/z 433.5[M+H]+。
室温下将化合物30R-1a(694mg,1.60mmol)溶于甲醇(15mL)中，再滴加HCl甲醇溶液(4.0M,0.80mL)。混合液在60℃下搅拌2小时。反应完毕后，反应混合物减压浓缩，再溶于二氯甲烷，加入饱和碳酸氢钠溶液中和。该混合液用二氯甲烷萃取(3x 20mL)。合并的有机相再经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物30R-1b(400mg,两步收率75％)。
将化合物30R-1b(150mg,0.45mmol)，碘甲烷(106mg,0.68mmol)和碳酸钾(125mg,0.90mmol)的甲苯/甲醇混合液(2mL/1mL)在50℃下搅拌5小时。TLC监测反应完毕。反应混合物减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物30R-1c(115mg,收率71％)。MS m/z 361.4[M+H]+。
室温下向甲醇(6mL)中加入化合物30R-1c(115mg,0.31mmol)和钯碳催化剂(10％,50mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌1小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到棕色固体化合物30R-1d(91mg,收率86％)。MS m/z 331.5[M+H]+。
将化合物30R-1d(91mg,0.28mmol)和化合物1k(104mg,0.33mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.29mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕，反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到淡黄色固体化合物30R(142mg,收率85％)。1HNMR(500MHz,CD3OD)δ8.51-8.45(m,1H),8.04(s,1H),7.62-7.52(m,2H),7.24(t,J＝7.5Hz,1H),6.96(s,1H),6.80(s,1H),4.56(t,J＝10.6Hz,1H),3.98(dd,J＝10.6,2.0Hz,1H),3.16-2.99(m,5H),2.94-2.82(m,2H),2.73(dd,J＝11.7,4.0Hz,1H),2.54-2.46(m,3H),2.30-2.22(m,1H),2.19(s,3H),2.11(t,J＝11.8Hz,2H),1.95-1.88(m,2H),1.86(s,3H),1.83(s,3H),1.64-1.52(m,2H),1.13(t,J＝7.1Hz,3H)。MS m/z 610.7[M+H]+。
实施例39:化合物30S的制备
将化合物27S-1a(157mg,0.63mmol)，N-乙基-4-哌啶酮(30S-1a,160mg,1.26mmol)和2滴醋酸的甲醇(5mL)混合液在室温下搅拌1小时。随后加入氰基硼氢化钠(118mg,1.89mmol)，反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完毕后，反应混合物在减压的条件下浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝25:1,2％氨水)得到淡黄色固体化合物30S-1b(230mg)直接用于下一步反应。MS m/z 361.5[M+H]+。
室温下向甲醇(10mL)中加入化合物30S-1b(230mg,0.53mmol)和钯碳催化剂(10％,80mg)，体系中的空气用氢气置换，然后该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌1小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。该粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝25:1,2％氨水)得到白色固体化合物33S-1c(136mg,两步收率64％)。MS m/z 331.4[M+H]+。
将化合物30S-1c(70mg,0.2mmol)和化合物1k(67mg,0.2mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.2mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后，在减压的条件下浓缩。将所得残余物溶于少量二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠溶液中和，再用二氯甲烷萃取(3x 10mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到白色固体化合物30S(50mg,收率39％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.52-8.42(m,1H),8.04(s,1H),7.63-7.49(m,2H),7.27-7.20(m,1H),6.96(d,J＝2.4Hz,1H),6.80(d,J＝2.0Hz,1H),4.56(t,J＝10.6Hz,1H),3.98(dd,J＝10.6,2.8Hz,1H),3.18-2.98(m,5H),2.95-2.80(m,2H),2.74(dd,J＝11.7,4.2Hz,1H),2.55-2.47(m,3H),2.27(t,J＝11.0Hz,1H),2.20(s,3H),2.15-2.06(m,2H),1.95-1.88(m,2H),1.86(s,3H),1.83(s,3H),1.65-1.55(m,2H),1.13(t,J＝7.2Hz,3H)。MS m/z 610.6[M+H]+。
实施例40:化合物31R的制备
将化合物25R-1a(150mg,0.60mmol)，四氢吡喃酮(31R-1a,301mg,3.01mmol)和2滴醋酸的甲醇(5mL)混合液在室温下搅拌1小时。随后加入氰基硼氢化钠(113mg,1.81mmol)，反应混合物在室温下搅拌3小时。反应完毕后，反应混合物减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物31R-1b(201mg)直接用于下一步反应。MS m/z 334.5[M+H]+。
室温下向甲醇(6mL)中加入化合物31R-1b(201mg,0.60mmol)和钯碳催化剂(10％,80mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到棕色固体化合物31R-1c(209mg,收率86％)。
将化合物31R-1c(209mg,0.69mmol)和化合物1k(218mg,0.69mmol)溶于2-甲氧基乙醇(4mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.72mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕，反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到淡黄色固体化合物31R(104mg,收率26％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ10.91(s,1H),8.69-8.64(m,1H),8.07(s,1H),7.51(t,J＝7.9Hz,1H),7.30-7.23(m,1H),7.14-7.06(m,2H),6.84(s,1H),6.80(s,1H),4.79-4.48(m,1H),4.10-3.97(m,3H),3.40(t,J＝11.6Hz,2H),3.30-2.72(m,6H),2.66-2.35(m,2H),2.25(s,3H),1.84(s,3H),1.81(s,3H),1.79-1.73(m,2H),1.66-1.56(m,2H)。MS m/z 583.6[M+H]+。
实施例41:化合物31S的制备
将化合物27S-1a(100mg,0.40mmol)，四氢吡喃酮(31R-1a,120mg,1.20mmol)和2滴醋酸的甲醇(4mL)混合液在室温下搅拌1小时。随后加入氰基硼氢化钠(76mg,1.20mmol)，反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完毕后，反应混合物减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到黄色固体化合物31S-1a(157mg)直接用于下一步反应。MS m/z 334.5[M+H]+。
室温下向甲醇(4mL)中加入化合物31S-1a(157mg,0.42mmol)和钯碳催化剂(10％,60mg)，体系中的空气用氢气置换，然后该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌1小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到黄色固体化合物31S-1b(126mg,两步收率100％)。MS m/z 304.5[M+H]+。
将化合物31S-1b(50mg,0.16mmol)和化合物1k(52mg,0.16mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.17mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后，在减压的条件下浓缩。将所得残余物溶于少量二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠溶液中和，再用二氯甲烷萃取(3x 10mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到白色固体化合物31S(57mg,收率59％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.91(s,1H),8.73-8.54(m,1H),8.07(s,1H),7.51(t,J＝7.9Hz,1H),7.30-7.27(m,1H),7.13-7.08(m,2H),6.83(s,1H),6.80(s,1H),4.78-4.50(m,1H),4.08-3.97(m,3H),3.40(t,J＝11.0Hz,2H),3.32-2.77(m,6H),2.66-2.41(m,2H),2.25(s,3H),1.84(s,3H),1.81(s,3H),1.81-1.76(m,2H),1.68-1.59(m,2H)。MS m/z 583.7[M+H]+。
实施例42:化合物32R的制备
0℃下将化合物30R-1b(150mg,0.45mmol)和二异丙基乙基胺(117mg,0.90mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中，再缓慢滴加乙酰氯(53mg,0.68mmol)的二氯甲烷(1mL)稀释液。反应混合液在室温下搅拌1小时。TLC监测反应完毕。反应混合物减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到黄色固体化合物32R-1a(142mg,收率84％)。MS m/z375.4[M+H]+。
室温下向甲醇(5mL)中加入化合物32R-1a(142mg,0.38mmol)和钯碳催化剂(10％,50mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌1小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝15:1)得到淡黄色固体化合物32R-1b(118mg,收率90％)。MS m/z 345.5[M+H]+。
将化合物32R-1b(60mg,0.17mmol)和化合物1k(66mg,0.21mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.18mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕，反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到淡黄色固体化合物32R(45mg,收率41％)。1HNMR(500MHz,CD3OD)δ8.50-8.45(m,1H),8.03(s,1H),7.62-7.51(m,2H),7.23(td,J＝7.5,1.3Hz,1H),6.96(d,J＝2.4Hz,1H),6.79(d,J＝2.2Hz,1H),4.54(t,J＝10.7Hz,1H),4.50-4.44(m,1H),4.00-3.89(m,2H),3.15-3.04(m,3H),3.03-2.97(m,1H),2.92-2.81(m,2H),2.79-2.73(m,1H),2.72-2.64(m,1H),2.59-2.44(m,2H),2.18(s,3H),2.09(s,3H),1.94-1.86(m,2H),1.85(s,3H),1.82(s,3H),1.55-1.32(m,2H)。MS m/z 624.7[M+H]+。
实施例43:化合物32S的制备
将化合物27S-1a(100mg,0.40mmol)，N-乙酰基-4-哌啶酮(32S-1a,170mg,1.20mmol)和2滴醋酸的甲醇(4mL)混合液在室温下搅拌1小时。随后加入氰基硼氢化钠(76mg,1.20mmol)，反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完毕后，反应混合物减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到粗品黄色固体化合物32S-1b(200mg)直接用于下一步反应。MS m/z 375.5[M+H]+。
室温下向甲醇(5mL)中加入化合物32S-1b(200mg,0.53mmol)和钯碳催化剂(10％,80mg)，体系中的空气用氢气置换，然后该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌1小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。该粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到黄色固体化合物32S-1c(190mg,两步收率100％)。MS m/z 345.5[M+H]+。
将化合物32S-1c(50mg,0.15mmol)和化合物1k(46mg,0.15mmol)溶于2-甲氧基乙醇(2mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.15mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后，在减压的条件浓缩。将所得混合物溶于少量二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠溶液中和，再用二氯甲烷萃取(3x 10mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到黄色固体化合物32S(36mg,收率40％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.92(s,1H),8.68-8.61(m,1H),8.06(s,1H),7.50(t,J＝7.9Hz,1H),7.26-7.21(m,1H),7.14-7.07(m,2H),6.87(s,1H),6.80(s,1H),4.69-4.56(m,2H),3.99(dd,J＝10.7,2.5Hz,1H),3.87(d,J＝14.6Hz,1H),3.27-3.20(m,1H),3.08(t,J＝12.6Hz,2H),2.97-2.81(m,4H),2.66-2.46(m,3H),2.25(s,3H),2.10(s,3H),1.84(s,3H),1.82(s,3H),1.73-1.61(m,2H),1.54-1.42(m,2H)。MS m/z 624.7[M+H]+。
实施例44:化合物33R的制备
将化合物25R-1a(100mg,0.40mmol)，1-环丙基-4-哌啶酮(33R-1a,168mg,1.20mmol)和2滴醋酸的甲醇(6mL)混合液在室温下搅拌1小时。随后加入氰基硼氢化钠(76mg,1.20mmol)，反应混合物在室温下搅拌3小时。反应完毕后，反应混合物减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到黄色固体化合物33R-1b(150mg,收率100％)。MS m/z 373.4[M+H]+。
室温下向甲醇(5mL)中加入化合物33R-1b(150mg,0.40mmol)和钯碳催化剂(10％,50mg)，该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌2小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到棕色固体化合物33R-1c(116mg,收率84％)。MS m/z 343.4[M+H]+。
将化合物33R-1c(50mg,0.15mmol)和化合物1k(55mg,0.18mmol)溶于2-甲氧基乙醇(1.5mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.15mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕，反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到淡黄色固体化合物33R(70mg,收率77％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.52-8.45(m,1H),8.04(s,1H),7.62-7.51(m,2H),7.24(t,J＝7.0Hz,1H),6.96(d,J＝2.1Hz,1H),6.80(d,J＝2.1Hz,1H),4.55(t,J＝10.7Hz,1H),3.97(dd,J＝10.6,2.6Hz,1H),3.15-3.04(m,4H),3.00(d,J＝11.7Hz,1H),2.91-2.80(m,2H),2.73(dd,J＝11.7,4.2Hz,1H),2.54-2.45(m,1H),2.32-2.21(m,3H),2.19(s,3H),1.91-1.78(m,2H),1.85(s,3H),1.82(s,3H),1.69-1.61(m,1H),1.57-1.43(m,2H),0.55-0.39(m,4H)。MS m/z 622.7[M+H]+。
实施例45:化合物34R的制备
将化合物23R(50mg,0.10mmol)，1-甲基-3-氮杂环丁酮盐酸盐(34R-1a,18mg,0.15mmol)，无水氯化锌(41mg,0.30mmol)溶于甲醇(3mL)中，再加入氰基硼氢化钠(19mg,0.30mmol)。将反应混合物置于封管中，加热至100℃搅拌2小时。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到白色固体化合物34R(21mg,收率37％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.90(s,1H),8.69-8.63(m,1H),8.07(s,1H),7.54-7.47(m,1H),7.30-7.23(m,1H),7.13-7.06(m,2H),6.81(d,J＝2.3Hz,1H),6.77(s,1H),4.61(t,J＝10.7Hz,1H),4.01(dd,J＝10.6,2.8Hz,1H),3.74-3.65(m,2H),3.22-3.17(m,1H),3.13-3.00(m,4H),2.91-2.84(m,1H),2.73-2.63(m,2H),2.48(s,3H),2.47-2.45(m,1H),2.24(s,3H),2.23-2.19(m,1H),1.84(s,3H),1.81(s,3H)。MS m/z 568.6[M+H]+。
实施例46:化合物34S的制备
将化合物23S(38mg,0.08mmol)，1-甲基-3-氮杂环丁酮盐酸盐(34R-1a,14mg,0.11mmol)，无水氯化锌(31mg,0.23mmol)溶于甲醇(3mL)中，再加入氰基硼氢化钠(14mg,0.23mmol)。将反应混合物置于封管中，加热至100℃搅拌2小时。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到白色固体化合物34S(16mg,收率37％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.90(s,1H),8.70-8.62(m,1H),8.07(s,1H),7.50(t,J＝7.9Hz,1H),7.31-7.27(m,1H),7.14-7.07(m,2H),6.82(s,1H),6.77(s,1H),4.60(t,J＝10.7Hz,1H),4.01(dd,J＝10.6,2.8Hz,1H),3.94-3.84(m,2H),3.33-3.13(m,4H),3.08-3.03(m,1H),2.88(td,J＝11.6,2.5Hz,1H),2.73-2.64(m,2H),2.61(s,3H),2.50(dd,J＝11.5,4.2Hz,1H),2.28-2.24(m,1H),2.24(s,3H),1.84(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z 568.7[M+H]+。
实施例47:化合物35S的制备
将化合物35S-1a(1.0g,5.65mmol)，23S-1a(1.22g,5.65mmol)和氢氧化钾(950mg,16.94mmol)溶于二甲亚砜(15mL)中，室温下搅拌3小时，再在60℃下搅拌3小时。反应完毕后，待反应混合物冷却后将其倒入冰水中，室温下搅拌1小时。混合物再用二氯甲烷萃取(3x30mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后滤液减压浓缩得到粗品。该粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷＝5:1:1)得到黄色固体化合物35S-1b(1.45g,收率73％)。MS m/z 354.4[M+H]+。
室温下将化合物35S-1b(1.45g,4.10mmol)溶于甲醇(15mL)中，再滴加HCl甲醇溶液(4.0M,4mL)，混合液在60℃下搅拌1小时。TLC监测反应完毕。反应混合液减压浓缩除去大部分甲醇，将析出的固体滤出干燥后得黄色固体化合物35S-1c(1.08g,收率91％)。MS m/z254.3[M+H]+。
将化合物35S-1c(500mg,1.73mmol)，N-甲基-4-哌啶酮(11R-1a,587mg,5.18mmol)和4滴醋酸的甲醇(8mL)混合液在室温下搅拌1小时。随后加入氰基硼氢化钠(326mg,5.18mmol)，反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完毕后，反应混合物减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到黄色固体化合物35S-1d(704mg)直接用于下一步反应。MS m/z 351.4[M+H]+。
室温下向甲醇(3mL)中加入化合物35S-1d(100mg,0.29mmol)和钯碳催化剂(10％,80mg)，体系中的空气用氢气置换，然后该反应混合物在室温和1大气压的氢气氛围下搅拌1小时。TLC监测反应完成。反应混合物经过硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到粗品。该粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到黄色油状化合物35S-1e(38mg,收率41％)。MS m/z 321.5[M+H]+。
将化合物35S-1e(38mg,0.12mmol)和化合物1k(41mg,0.13mmol)溶于2-甲氧基乙醇(1.5mL)中，再加入HCl甲醇溶液(2.5M,0.12mL)。将反应混合物置于封管中，加热至120℃搅拌过夜。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。将所得混合物溶于少量二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠溶液中和，再用二氯甲烷萃取(3x 10mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到白色固体化合物35S(60mg,收率84％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.89(s,1H),8.61-8.56(m,1H),8.07(s,1H),7.54(t,J＝7.9Hz,1H),7.31-7.27(m,1H),7.13(t,J＝6.8Hz,1H),7.07(dd,J＝14.8,2.4Hz,1H),6.81(s,1H),6.75(s,1H),4.18-4.05(m,2H),3.72-3.64(m,1H),3.25-3.18(m,1H),3.15-3.04(m,3H),2.85(dd,J＝10.9,2.8Hz,1H),2.81-2.74(m,1H),2.67-2.59(m,1H),2.50-2.42(m,1H),2.47(s,3H),2.40-2.22(m,3H),1.95-1.86(m,4H),1.84(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z 600.7[M+H]+。
实施例48:化合物36R的制备
将化合物23R(200mg,0.40mmol)，1-Boc-3-氮杂环丁酮(36R-1a,103mg,0.60mmol)，无水氯化锌(164mg,1.20mmol)溶于甲醇(10mL)中，再加入氰基硼氢化钠(76mg,1.20mmol)。将反应混合物置于封管中，加热至100℃搅拌1小时。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到淡黄色固体化合物36R-1b(258mg)直接用于下一步反应。MS m/z 654.7[M+H]+。
将化合物36R-1b(258mg,0.52mmol)溶于甲醇(10mL)中，再加入HCl的二氧六环溶液(4.0M,3mL)。反应混合物在40℃下搅拌2小时。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。将所得残余物溶于少量甲醇中，用氨水中和，再减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝12:1,2％氨水)得到淡黄色固体化合物36R-1c(185mg,两步收率83％)。MS m/z 554.6[M+H]+。
将化合物36R-1c(70mg,0.13mmol)和二异丙基乙基胺(34mg,0.26mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，0℃下缓慢滴加乙酰氯(10mg,0.13mmol)的二氯甲烷(1mL)稀释液。反应混合液在室温下搅拌15分钟。反应完毕后，反应混合物在减压条件下浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝15:1,2％氨水)得到白色固体化合物36R(31mg,收率41％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ11.21(s,1H),8.67-8.62(m,1H),8.01(d,J＝1.2Hz,1H),7.60-7.47(m,2H),7.32-7.27(m,1H),7.18-7.08(m,2H),6.80(dd,J＝10.7,2.2Hz,1H),4.65-4.56(m,1H),4.17-4.11(m,1H),4.07-3.91(m,3H),3.89-3.78(m,1H),3.23(d,J＝10.3Hz,1H),3.17-3.06(m,2H),2.94-2.86(m,1H),2.83-2.70(m,2H),2.57-2.49(m,1H),2.32-2.25(m,1H),2.25(s,3H),1.89(d,J＝1.9Hz,3H),1.85(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z 596.5[M+H]+。
实施例49：化合物36S的制备
将化合物23S(237mg,0.47mmol)，1-Boc-3-氮杂环丁酮(36R-1a,122mg,0.71mmol)，无水氯化锌(194mg,1.42mmol)溶于甲醇(15mL)中，再加入氰基硼氢化钠(90mg,1.42mmol)。将反应混合物置于封管中，加热至100℃搅拌1小时。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到淡黄色固体化合物36S-1a(340mg)直接用于下一步反应。MS m/z 654.7[M+H]+。
将化合物36S-1a(340mg,0.47mmol)溶于甲醇(15mL)中，再加入HCl的二氧六环溶液(4.0M,3mL)。反应混合物在40℃下搅拌2小时。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。将所得残余物溶于少量甲醇中，用氨水中和，再减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝12:1,2％氨水)得到淡黄色固体化合物36S-1b(206mg,两步收率78％)。MS m/z 554.6[M+H]+。
化合物36S-1b(40mg,0.07mmol)和二异丙基乙基胺(19mg,0.14mmol)溶于二氯甲烷(6mL)中，0℃下缓慢滴加乙酰氯(6mg,0.07mmol)的二氯甲烷(1mL)稀释液。反应混合液在室温下搅拌15分钟。反应完毕后，反应混合物在减压条件下浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝15:1,2％氨水)得到淡黄色固体化合物36S(24mg,收率56％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ11.10(s,1H),8.69-8.59(m,1H),8.03(s,1H),7.54-7.46(m,1H),7.35-7.27(m,2H),7.17-7.07(m,2H),6.80(dd,J＝10.5,2.3Hz,1H),4.65-4.56(m,1H),4.19-4.10(m,1H),4.07-3.91(m,3H),3.89-3.77(m,1H),3.24(d,J＝11.1Hz,1H),3.19-3.04(m,2H),2.95-2.85(m,1H),2.83-2.68(m,2H),2.59-2.47(m,1H),2.31-2.27(m,1H),2.25(s,3H),1.89(d,J＝1.9Hz,3H),1.85(s,3H),1.82(s,3H)。MS m/z 596.7[M+H]+。
实施例50:化合物37R的制备
将化合物36R-1c(50mg,0.09mmol)，乙醛(6mg,0.14mmol)，无水氯化锌(37mg,0.27mmol)溶于甲醇(5mL)中，再加入氰基硼氢化钠(17mg,0.27mmol)。将反应混合物置于封管中，加热至70℃搅拌2小时。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后在减压条件下浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到白色固体化合物37R(24mg,收率46％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.90(s,1H),8.68-8.63(m,1H),8.07(s,1H),7.53-7.47(m,1H),7.31-7.22(m,1H),7.13-7.05(m,2H),6.81(d,J＝2.2Hz,1H),6.76(s,1H),4.60(t,J＝10.7Hz,1H),4.00(dd,J＝10.6,2.8Hz,1H),3.80-3.65(m,2H),3.23-3.17(m,1H),3.16-2.96(m,4H),2.91-2.83(m,1H),2.76-2.61(m,4H),2.49(dd,J＝11.4,4.1Hz,1H),2.27-2.21(m,1H),2.24(s,3H),1.84(s,3H),1.82(s,3H),1.16-1.01(m,3H)。MSm/z 582.5[M+H]+。
实施例51：化合物37S的制备
将化合物36S-1b(40mg,0.07mmol)，乙醛(5mg,0.11mmol)，无水氯化锌(30mg,0.22mmol)溶于甲醇(8mL)中，再加入氰基硼氢化钠(14mg,0.22mmol)。将反应混合物置于封管中，加热至70℃搅拌1小时。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后在减压条件下浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝15:1,2％氨水)得到白色固体化合物37S(30mg,收率71％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.90(s,1H),8.72-8.59(m,1H),8.07(s,1H),7.50(t,J＝7.9Hz,1H),7.30-7.26(m,1H),7.13-7.05(m,2H),6.81(d,J＝2.3Hz,1H),6.76(s,1H),4.60(t,J＝10.7Hz,1H),4.00(dd,J＝10.6,2.8Hz,1H),3.82-3.61(m,2H),3.20(d,J＝10.7Hz,1H),3.15-2.93(m,4H),2.92-2.82(m,1H),2.75-2.61(m,4H),2.49(dd,J＝11.5,4.3Hz,1H),2.24(s,3H),2.22-2.17(m,1H),1.84(s,3H),1.82(s,3H),1.15-1.01(m,3H)。MS m/z 582.8[M+H]+。
实施例52:化合物38R的制备
将化合物23R(40mg,0.08mmol)，3-氧杂环丁酮(38R-1a,9mg,0.12mmol)，无水氯化锌(33mg,0.24mmol)溶于甲醇(3mL)中，再加入氰基硼氢化钠(15mg,0.24mmol)。将反应混合物置于封管中，加热至100℃搅拌2小时。TLC监测反应完毕。反应混合物冷却至室温后减压浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,2％氨水)得到白色固体化合物38R(25mg,收率56％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ11.29(s,1H),8.68-8.62(m,1H),7.99(s,1H),7.74(bs,1H),7.54-7.48(m,1H),7.32-7.27(m,1H),7.19-7.13(m,1H),7.11(d,J＝2.4Hz,1H),6.80(d,J＝2.2Hz,1H),4.74-4.53(m,5H),4.05(dd,J＝10.7,2.8Hz,1H),3.53-3.44(m,1H),3.26-3.20(m,1H),3.11-3.05(m,1H),2.98-2.91(m,1H),2.76-2.67(m,2H),2.54-2.49(m,1H),2.31-2.21(m,1H),2.25(s,3H),1.85(s,3H),1.83(s,3H)。MS m/z 555.4[M+H]+。
实施例53:激酶活性抑制实验
1.EGFR(C797S)激酶活性抑制实验:
采用Lantha screen Assay的方法，测试化合物在激酶EGFR(C797S)浓度10nM，ATP浓度0.1μM下的抑制活性，对照品均为Staurosporine。
实验步骤：
1)缓冲液配制：50mM HEPES，pH 7.5，0.0015％ Brij-35。
2)对照品Staurosporine和测试样品配制：将Staurosporine和本发明实施例化合物在100％ DMSO中配制成梯度浓度溶液，并用上述缓冲液将之稀释成10％ DMSO，加入384孔板。例如，化合物起始浓度为10μM，则用100％ DMSO配制成1000μM，并稀释10个浓度梯度，并用LIQUID HANDLE RS(LABCYTE，USA)转移100nL到384孔板中。
3)将激酶EGFR(C797S)用以下缓冲液稀释成所需浓度：50mM HEPES，pH 7.5，0.0015％ Brij-35，2mM DTT。转移5μL至384孔板中，与化合物共孵育10-15分钟。
4)将底物用以下缓冲液稀释成所需浓度：50mM HEPES，pH 7.5，0.0015％ Brij-35，10mM MgCl2。转移5μL至384孔板起始反应，并于室温反应30分钟。
测试实验中各试剂的反应浓度如下表1所示。
表1.
5)用TR-Fret dilution buffer配制2倍检测溶液，Antibody终浓度为2nM，EDTA终浓度为10mM，转移10μL检测溶液至384孔板反应孔中，振荡混匀，室温下静置60min。
6)在Envision上读取在340nm处激发，发射520nm与495nm的比值，计算抑制率。
7)用XL-fit软件拟合IC50。
代表性化合物的活性如表2所示，IC50值通过以下方式表示：
A:1nM<IC50值≤50nM；B:50nM<IC50值≤250nM；C:250nM<IC50值≤1000nM；D:
IC50值>1000nM。
表2.EGFR(C797S)激酶活性抑制(IC50值)
化合物 EGFR(C797S)
1 A
1R A
1S A
2R B
3R A
4R A
4S A
5R B
6R B
6S A
7R B
8R A
9R C
10R A
11R A
12R B
12S B
13R B
14R B
15R B
16R B
2.ALK激酶活性抑制实验:
方法1：采用Caliper迁移率变动检测技术(Caliper mobility shift assay)测定ALK蛋白激酶活性。将化合物用DMSO溶解后用激酶缓冲液稀释：pH 7.5的50mM HEPES，0.0015％ Brij-35,10mM MgCl2，2mM DTT；在384孔板中加入5μL的5倍反应终浓度的化合物(10％DMSO)。加入10μL的2.5倍酶溶液后在室温下孵育10分钟，再加入10μL的2.5倍底物(Peptide FAM-P22和ATP)溶液。28℃下孵育60分钟后加25μL终止液(pH 7.5的100mMHEPES,0.015％ Brij-35，0.2％ Coating Reagent#3，50mM EDTA)终止反应。Caliper EZReader II(Caliper Life Sciences)上读取转化率数据。把转化率转化成抑制率数据(％抑制率＝(max-转化率)/(max-min)*100)。其中max是指DMSO对照的转化率，min是指无酶活对照的转化率。以化合物浓度和抑制率为横纵坐标，绘制曲线，使用XLFit excel add-inversion5.4.0.8软件拟合曲线并计算IC50。
方法2：采用Caliper迁移率变动检测技术(Caliper mobility shift assay)测定ALK蛋白激酶活性。方法基本与方法1相同，个别参数进行了调整。化合物的起始浓度为1mM,依次进行4倍稀释成6个(个别化合物稀释为7个)浓度点。使用分液器Echo 550向目的板3573转移250nL 100倍终浓度的化合物，加入10μL终浓度分别为1.25nM ALK，室温下孵育10分钟(阴性对照孔含10μL激酶缓冲液和250nL 100％DMSO；阳性对照孔含10μL的激酶溶液和250nL 100％DMSO)。在激酶ALK上，加入15μL终浓度为30μM的ATP和3μM底物22号肽混合溶液反应25分钟；加入30μL含EDTA的终止检测液停止激酶反应。用Caliper EZ Reader读取转化率。换算抑制率％＝(阳性对照转化率均值％-样品转化率％/(阳性对照转化率均值％-阴性对照转化率均值％)。其中：阴性对照孔，代表没有酶活孔的转化率读数；阳性对照孔，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。以浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPad Prism 5的log(inhibitor)vs.response-Variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活性的IC50值。计算公式：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。
代表性化合物的活性如表3所示，IC50值通过以下方式表示：
A:1nM<IC50值≤50nM；B:50nM<IC50值≤250nM；C:250nM<IC50值≤1000nM；D:
IC50值>1000nM。
表3.ALK激酶活性抑制(IC50值)
注：化合物1-16R用方法1测试，化合物25R-32R用方法2测试。
3.EGFR(T790M/L858R/C797S)激酶活性抑制实验:
采用Caliper迁移率变动检测技术(Caliper mobility shift assay)的方法检测化合物对EGFR(T790M/L858R/C797S)激酶的活性抑制作用。基本方法同ALK的活性测试方法2相同。化合物测试浓度为2μM起始，5倍稀释成6个(个别化合物为7个)浓度点。使用分液器Echo 550向目的板3573转移250nL 100倍终浓度的化合物，加入10μL终浓度为2.5nM的EGFR(T790M/L858R/C797S)的激酶溶液，室温下孵育10分钟(阴性对照孔含10μL激酶缓冲液和250nL 100％DMSO；阳性对照孔含10μL的激酶溶液和250nL100％DMSO)。加入15μL终浓度为40μM的ATP和3μM底物22号肽混合溶液反应60分钟。加入30μL含EDTA的终止检测液停止激酶反应。用Caliper EZ Reader读取转化率。换算抑制率％＝(阳性对照转化率均值％-样品转化率％/(阳性对照转化率均值％-阴性对照转化率均值％)。其中：阴性对照孔，代表没有酶活孔的转化率读数；阳性对照孔，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。以浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPad Prism 5的log(inhibitor)vs.response-Variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活性的IC50值。计算公式：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。
代表性化合物的活性如表4所示，IC50值通过以下方式表示：
A:IC50值≤3nM；B:3nM<IC50值≤15nM；C:15nM<IC50值≤100nM；D:IC50值>100
nM。
表4.EGFR(T790M/L858R/C797S)激酶活性抑制(IC50值)
4.MAP4K1(HPK1)激酶活性抑制实验:
采用Caliper迁移率变动检测技术(Caliper mobility shift assay)的方法检测化合物对MAP4K1(HPK1)激酶的活性抑制作用。化合物测试起始浓度为500nM,5倍稀释，5个浓度点。使用分液器Echo 550向目的板3573转移250nL 100倍终浓度的化合物，加入10μL终浓度为1.25Nm MAP4K1(HPK1)的激酶溶液，室温下孵育10分钟(阴性对照孔含10μL激酶缓冲液和250nL 100％DMSO；阳性对照孔含10μL的激酶溶液和250nL100％DMSO)。在激酶MAP4K1(HPK1)上，加入15μL终浓度为10.1μM的ATP和3μM底物25号肽混合溶液反应120分钟。加入30μL含EDTA的终止检测液停止激酶反应。用Caliper EZ Reader读取转化率。换算抑制率％＝(阳性对照转化率均值％-样品转化率％/(阳性对照转化率均值％-阴性对照转化率均值％)。其中：阴性对照孔，代表没有酶活孔的转化率读数；阳性对照孔，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。以浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPadPrism 5的log(inhibitor)vs.response-Variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活性的IC50值。计算公式：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。
代表性化合物的活性如表5所示，IC50值通过以下方式表示：
A:IC50值≤1nM；B:1nM<IC50值≤10nM；C:10nM<IC50值≤100nM；D:IC50值>100
nM。
表5.MAP4K1(HPK1)激酶活性抑制(IC50值)
实施例54：Ba/F3_EGFR(del19-T790M-C797S)细胞抗增殖实验
方法1：细胞培养：Ba/F3_EGFR del19/T790M/C797S细胞培养基为RPMI-1640+10％FBS+1％双抗。细胞置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。
细胞铺板及化合物处理：1)细胞常规培养至细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞。2)用相应的新鲜培养基重悬，取少量细胞计数，配制成合适密度的细胞悬液。3)将细胞悬液以700个/孔接种到384孔板中，每孔30μL。4)用Echo将化合物加入对应的细胞孔内。化合物最高起始浓度为1-10μM，3倍稀释，8个浓度，空白对照孔为细胞加0.1％DMSO，正对照孔为细胞加10μM的Brigatinib。细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养72h。
CTG方法检测：1)每孔加30μL CTG试剂(CelltiterGlo试剂盒)，避光37℃、5％CO2条件下静置30min。2)用Envision仪器读取化学发光信号值。
数据分析：IC50结果由GraphPad Prism 6软件进行分析。利用以下非线性拟合公式来得到化合物的IC50(半数抑制浓度)：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)×HillSlope))。X:化合物浓度log值；Y:抑制率(％inhibition)；抑制率(％inhibition)＝(空白对照孔读数-化合物孔读数)/(空白对照孔读数-正对照读数)×100。
方法2：细胞铺板及化合物处理：1)取Ba/F3_EGFR Del19/T790M/C797S细胞，800rpm离心5min，弃掉上清液，重悬于新鲜培养基(RPMI-1640+10％ FBS)，取出少量细胞用ViCell计数。2)调整细胞密度，细胞以2000/孔接种于384孔板中，37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时。3)Tecan HP D300设置程序，将化合物加入孔板中。化合物最高起始浓度为1-4μM，3倍稀释，9个浓度，每孔中DMSO含量统一到0.2％。细胞在37℃、5％ CO2培养箱中培养72h。
CTG方法检测：1)将CTG试剂和细胞板取出放置室温平衡30min，每孔加25μL CTG，中速震荡2min，1000rpm离心1min，室温静置10min。2)Envision仪器读取化学发光信号值。
数据分析：IC50结果由IDBS公司的XL-fit 5.0软件进行分析。
代表性化合物的活性如表6所示，IC50值通过以下方式表示：
A:IC50值≤20nM；B:20nM<IC50值≤100nM；C:100nM<IC50值≤200nM；D:IC50值
>200nM。
表6.BaF3_EGFR(del19-T790M-C797S)细胞抗增殖活性抑制(IC50值)
实施例55：大鼠体内的药物动力学研究
仪器：Waters生产的XEVO TQ-S液质联用仪，所有的测定数据由Masslynx V4.1软件采集并处理，用Microsoft Excel计算和处理数据。用WinNonLin 8.0软件，采用统计矩法进行药代动学参数计算。主要包括动力学参数Tmax、T1/2、Cmax、AUClast等。色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱温40℃；流动相A为水(0.1％甲酸)，流动相B为乙腈，流速为0.350毫升/分钟，采用梯度洗脱，洗脱梯度为0.50min：10％B；1.50min：10％B；2.30min：95％B；2.31min：10％B；3.00min：stop。进样量：5μL。
动物：SD雄性大鼠3只，体重范围200-220g，购入后在实验动物中心实验室饲养2天后使用，给药前12小时及给药后4小时内禁食，试验期间自由饮水。大鼠灌胃后按既定的时间内点取血样。
溶媒：0.5％ Methylcellulose(含0.4％ Tween 80和1％乙醇的水溶液)。灌胃给药溶液的配制：精密称量化合物，加入溶媒中，常温下超声5分钟使药品完全溶解，配制成0.3毫克/毫升的药液。
药物样品：本发明专利式(I)所示结构的代表性化合物，一般采取多个结构类似的样品(分子量相差在2个单位以上)，准确称量，一起给药(cassette PK)。这样可以同时筛选多个化合物，比较它们的口服吸收率。也采用单一给药来研究药物样品在大鼠体内的药物动力学。
灌胃给药后分别于0.25、0.5、1、2、4、9、12和24小时眼眶取血，于肝素钠处理的塑料离心管中，离心后取上清液血浆用于LC-MS/MS分析。
准确称量化合物配制成不同的浓度，在质谱上进行定量分析，从而建立起标准曲线，然后测试上述血浆里化合物的浓度，得出不同时间点的化合物浓度。所有的测定数据由相关的软件采集并处理，采用统计矩法进行药代动学参数计算(主要包括动力学参数Tmax、T1/2、Cmax、AUClast等)。结果如下：
表7.化合物在SD大鼠上经灌胃给药后的药学动力学参数
化合物 剂量 T1/2(h) Tmax(h) Cmax(ng/mL) AUC0-24h(h*ng/mL)
1R 4mg/kg 12.67 1.08 23.10 101.89
25R 3mg/kg 6.75 6.33 61.44 585.35
27S 3mg/kg 5.20 10.00 140.33 2102.82
27R 3mg/kg 5.17 5.33 195.84 2751.90
31R 3mg/kg 5.18 6.33 78.37 686.57
31S 3mg/kg 6.27 1.00 160.17 1345.22
32R 3mg/kg 1.95 2.00 306.38 3419.6
32S 3mg/kg 2.22 3.33 351.99 3263.69
33R 3mg/kg 3.88 7.33 120.36 1775.84
35S 3mg/kg 3.97 4.33 15.03 179.27
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.一种如下式(I)所示结构的化合物，或其光学异构体，药学上可接受的盐：
式(I)中：
“*”表示手性中心；
各个R各自独立为C1-4烷基；
各个R1各自独立为氢、氘、卤素、C1-4烷基、或CN；
各个R2各自独立为氢、氘、卤素、C1-4烷基、或CN；
各个R3各自独立为氢、氘、或C1-4烷基；或当两个R3同时连接到同一个碳原子上时，这两个R3与其相连的碳原子可以任选地共同形成羰基(C＝O)；
各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、ORh、SRh、NRhRh、CN、C(O)Re、C(O)ORh，C(O)NRhRh、OC(O)Re、或NRhC(O)Re；
J为O；G为NRf或O；
m为0、1、2、3、或4；
n为0、1、2、或3；
p为0、1、或2；
q为0、1、2、或3；
Rf为氢、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、3-至12-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中，上述各个基团为未取代或被1-3个Re取代；
各个Re各自独立地为选自下组的基团：氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基取代的C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4卤代烯基、C1-4烷氧基取代的C2-4烯基、羟基取代的C2-4烯基、二(C1-4烷基)胺基取代的C2-4烯基、C3-8环烷基取代的C2-4烯基、3-至8-元杂环基取代的C2-4烯基、芳基取代的C2-4烯基、杂芳基取代的C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4卤代炔基、C1-4烷氧基取代的C2-4炔基、羟基取代的C2-4炔基、二(C1-4烷基)胺基取代的C2-4炔基、C3-8环烷基取代的C2-4炔基、3-至8-元杂环基取代的C2-4炔基、C3-8环烷基、或3-至8-元杂环基；
各个Rh各自独立为氢、或C1-4烷基；或两个Rh与其连接的氮原子一起形成3-至-8元杂环基，此杂环基含有1或2个N原子以及0或1个选自O、S的杂原子；
其中，各个上述的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、芳基、杂芳基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh，前提条件是所形成的化学结构是稳定的和有意义的；其中Re和Rh的定义如上所述；
除非特别说明，上述的芳基为含有6-12个碳原子的芳香基团；杂芳基为5-至15-元杂芳香基团。
2.如权利要求1所述的化合物，或其光学异构体，药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)为：
其中各个基团的定义如权利要求1中所述。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，各个R各自独立为C1-2烷基；
各个R1各自独立为氢、氘、卤素、或C1-2烷基；
各个R2各自独立为氢、氘、卤素、或C1-2烷基；
各个R3各自独立为氢或C1-4烷基；或当两个R3同时连接到同一个碳原子上时，这两个R3与其相连的碳原子共同形成羰基(C＝O)；
各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-4烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；
m为0、1、或2；
n为0、1、或2；
p为0、1、或2；
q为0、1、或2；
其中Re和Rh的定义如权利要求1中所述。
4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，式(I)为：
其中R2为F、Cl、或Br；各个R3各自独立为氢或C1-4烷基；或当两个R3同时连接到同一个碳原子上时，这两个R3与其相连的碳原子共同形成羰基(C＝O)；各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-4烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；n为0、1、或2；q为0、1、或2；其中J、G、Re、和Rh的定义如权利要求1中所述。
5.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，式(IIIa)中的结构片段选自：
表示上述结构片段与式(IIIa)中其它结构的连接位点；
其中，各个R3各自独立为氢或C1-4烷基；当两个R3连接在同一个碳原子上时，两个R3和连接它们的碳原子可以一起组成C＝O；
各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-2烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；
n为0、1、或2；q为0或1；
Rf为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中各个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、或C(O)NRhRh；其中Re和Rh的定义如权利要求1中所述。
6.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，式(IIIa)中的结构片段选自：
表示上述结构片段与式(IIIa)中其它结构的连接位点；
其中，各个R3各自独立为氢或C1-4烷基；当两个R3连接在同一个碳原子上时，两个R3和连接它们的碳原子可以一起组成C＝O；
各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-2烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；
n为0、1、或2；q为0或1；
Rf为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中各个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、或C(O)NRhRh；其中Re和Rh的定义如权利要求1中所述。
7.如权利要求5或6所述的化合物，其特征在于，式(I)为：
其中，各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-2烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；q为0或1；
Rf为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、C(O)ORh、C(O)NRhRh、S(O)2Re、或S(O)2NRhRh；其中各个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、或C(O)NRhRh；其中Re和Rh的定义如权利要求1中所述。
8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，所述的Rf选自下组：氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、或S(O)2Re；其中各个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、或C(O)NRhRh；其中Re和Rh的定义同上所述。
9.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，式(I)为：
其中，R4为氢、卤素、C1-2烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；
Rf为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、或S(O)2Re；其中各个烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、或C(O)NRhRh；其中Re和Rh的定义如权利要求1中所述。
10.如权利要求2-4任一所述的化合物，其特征在于，式(I)为：
其中，R4为氢、卤素、C1-2烷基、NRhRh、或NRhC(O)Re；
Rf为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、芳基、杂芳基、C(O)Re、或S(O)2Re；其中各个烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地且各自独立地被1-3个各自独立地选自下组的取代基取代：卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基、CN、NO2、ORh、SRh、NRhRh、C(O)Re、C(O)ORh、或C(O)NRhRh；其中Re和Rh的定义如权利要求1中所述。
11.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，式(I)为：
其中，R4为氢、卤素、C1-2烷基；
s和t各自独立为1、2、或3；
A为NRk、或O、；其中Rk为氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、羟基取代的C1-4烷基、C1-4烷氧基取代的C1-4烷基、二(C1-4烷基)胺基取代的C1-4烷基、C3-6环烷基、3-至9-元杂环基、C(O)Re、C(O)ORh、或C(O)NRhRh；其中各个Re各自独立地选自下组：氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C2-4烯基、C1-4烷氧基取代的C2-4烯基、二(C1-4烷基)胺基取代的C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、或3-至8-元杂环基；Rg和Rh的定义如权利要求1中所述。
12.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的各个Re各自独立地选自下组的基团：氢、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基取代的C1-4烷基、C2-4烯基、C1-4烷氧基取代的C2-4烯基、羟基取代的C2-4烯基、二(C1-4烷基)胺基取代的C2-4烯基、3-至6-元杂环基取代的C2-4烯基、C2-4炔基、C3-8环烷基、3-至8-元杂环基。
13.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，各个R4各自独立为氢、氘、卤素、C1-2烷基、或NHC(O)CH＝CH2。
14.一种选自下组的化合物：
其中，“*”表示手性中心，在没有标明是R或S的情况下，带“*”的化合物表示可以是消旋体，也可以是R构型，或者是S构型。
15.如权利要求1所述的式(I)化合物、其光学异构体或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于：
(a)制备治疗与蛋白激酶活性或表达量相关的疾病的药物；
(b)制备蛋白激酶靶向抑制剂；和/或
(c)体外非治疗性地抑制蛋白激酶的活性；
其中，所述的蛋白激酶选自下组：EGFR、ALK、HPK1，或其组合。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的蛋白激酶为EGFR(C797S)。
17.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：(i)有效量的如权利要求1所述的式I化合物，或其光学异构体，药学上可接受的盐；和(ii)药学上可接受的载体。
18.一种式(I)化合物的制备方法，其特征在于，所述的化合物为IIIf或IIIg所示的结构，且所述的方法包括步骤：
用式4-D1化合物与式1-A2反应，得到式4-D2-1或4-D2-2化合物；
在钯催化剂存在下，用式4-D2-1或式4-D2-2化合物与Me4Sn进行反应，得到式4-D3-1或式4-D3-2化合物；
用式4-D3-1或式4-D3-2化合物进行还原反应，得到式4-D4-1或式4-D4-2化合物；
用式Ib化合物与式4-D4-1化合物或式4-D4-2化合物进行反应，得到式IIIf化合物或IIIg化合物；
其中，各个基团的定义如权利要求1-14任一中所述。
19.一种式(I)化合物的制备方法，其特征在于，所述的化合物为IIIi所示的结构，且所述的方法包括步骤：
用式5-E2化合物与式Ib化合物进行反应，得到式IIIh化合物；
用式IIIh化合物与式5-E3化合物进行还原胺化反应，得到式IIIi化合物；
其中，各个基团的定义如权利要求1-14任一中所述。
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