CN113906050B - 抗EphA4抗体 - Google Patents
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Abstract
提供了一种抗EphA4抗体，其可以结合EphA4并增强EphA4的裂解，以及提供了包含作为活性成分的所述抗体的药物组合物。获得了一种对EphA4具有结合亲和力并可以增强EphA4的裂解的小鼠抗EphA4抗体，并且鉴定出所述小鼠抗EphA4抗体的互补决定区(CDR)的序列。随后，通过产生所述小鼠抗EphA4抗体的人源化抗体获得了目的抗EphA4抗体。
Description
技术领域
本发明涉及与EphA4结合的抗体、编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述载体的细胞、产生所述抗体的方法以及包含所述抗体的药物组合物。
背景技术
EphA4是受体酪氨酸激酶家族的成员。肝配蛋白A型和B型被称为EphA4的配体，并且当EphA4与肝配蛋白(肝配蛋白是EphA4的配体)结合时，诱导去黏附信号。迄今为止，已经提出EphA4参与阿尔茨海默病(在下文中也称为“AD”)的病理(非专利文献1-4)，并且据报道抑制EphA4与肝配蛋白之间的结合拯救了淀粉样β(Aβ)(1-42)低聚物介导的神经传递功能障碍(专利文献1)。在AD中，认为过度磷酸化tau形成的聚集体(神经原纤维缠结)参与神经细胞的死亡(非专利文献5)，并且还已经报道，抑制tau磷酸化抑制突触消失的神经变性(非专利文献6和非专利文献7)，以及改善记忆缺陷或认知功能障碍(非专利文献8-11)。有报道表明CDK5的激活是tau磷酸化的原因(非专利文献12和非专利文献13)。表达已经在家族性额颞叶痴呆(rTg4510小鼠)中发现的P301L突变的基因修饰小鼠是AD模型小鼠，与AD相似，tau高度磷酸化和tau在神经元细胞中异常积累在小鼠中发现。在rTg4510小鼠中，神经纤维缠结(AD的病理特征)形成并通过脑萎缩和神经元的缺失引起认知功能障碍(非专利文献14和非专利文献5)。
EphA4在海马体或大脑皮层中大量表达，并且其通过基质金属蛋白酶(MMP)、ADAM(去整合素和金属蛋白酶)和γ选择酶被神经活性依赖性地裂解。众所周知，EphA4的这种裂解反应稳定了棘突，其是神经功能的关键结构(非专利文献15)。据报道，棘突的密度在AD中降低(非专利文献16)，并且由于还在AD中在NFT阶段V和VI证实了EphA4裂解片段的减少，认为EphA4的裂解反应参与AD的病理(非专利文献17)。
尽管KYL肽和化合物1等被称为现有的EphA4抑制药物(专利文献2、非专利文献18和非专利文献19)，但还没有关于具有增强EphA4的裂解活性的抗体的报道。
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发明内容
发明欲解决的问题
本披露的目的是提供一种抗EphA4抗体，其可以结合EphA4并增强EphA4的裂解，以及提供包含作为活性成分的所述抗体的药物组合物。
解决问题的手段
作为解决以上问题的广泛研究的结果，本发明的诸位发明人获得了小鼠抗EphA4单克隆抗体(其可以结合EphA4并增强EphA4的裂解)，并产生了所述抗体的人源化抗体，从而完成完整的目的抗体。
本披露涵盖以下特征。
(1)一种抗EphA4抗体，其中
所述抗EphA4抗体包含重链和轻链，并且包含：
(a)由在SEQ ID NO.44中所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；
(b)由在SEQ ID NO.27中所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；
(c)由在SEQ ID NO.28中所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；
(d)由在SEQ ID NO.29中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；
(e)由在SEQ ID NO.30中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；以及
(f)由在SEQ ID NO.31中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
(2)根据(1)所述的抗EphA4抗体，其中所述抗EphA4抗体是人源化的。
(3)根据(1)或(2)所述的抗EphA4抗体，其中所述抗EphA4抗体特异性结合EphA4并增强EphA4的裂解。
(4)根据(1)-(3)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中所述抗EphA4抗体特异性结合EphA4并抑制EphA4和肝配蛋白之间的结合。
(5)根据(1)-(4)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
所述重链的可变区由SEQ ID NO.45中所示的氨基酸序列组成，并且
所述轻链的可变区由SEQ ID NO.46中所示的氨基酸序列组成。
(6)根据(1)-(5)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
所述重链的恒定区和所述轻链的恒定区包含来源于人抗体的氨基酸序列。
(7)根据(6)所述的抗EphA4抗体，其中
所述重链的恒定区是人IgG的恒定区。
(8)根据(7)所述的抗EphA4抗体，其中
所述人IgG的恒定区是人IgG2的恒定区。
(9)根据(8)所述的抗EphA4抗体，其中
所述人IgG2的恒定区包含SEQ ID NO.47中所示的氨基酸序列。
(10)根据(6)-(9)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
所述轻链的恒定区是人Igκ的恒定区。
(11)根据(10)所述的抗EphA4抗体，其中
所述人Igκ的恒定区包含SEQ ID NO.48中所示的氨基酸序列。
(12)一种抗EphA4抗体，其中
所述抗EphA4抗体包含重链和轻链，
所述重链包含SEQ ID NO.59中所示的氨基酸序列，并且
所述轻链包含SEQ ID NO.60中所示的氨基酸序列。
(13)根据(12)所述的抗EphA4抗体，其中
所述重链的C末端赖氨酸缺失。
(14)一种抗EphA4抗体，其中
所述抗EphA4抗体包含重链和轻链，
所述重链包含SEQ ID NO.59中所示的氨基酸序列，
所述轻链包含SEQ ID NO.60中所示的氨基酸序列，并且
所述重链的C末端赖氨酸缺失。
(15)一种分离的核酸，其编码根据(1)-(14)中任一项所述的抗EphA4抗体。
(16)一种载体，其包含根据(15)所述的核酸。
(17)一种宿主细胞，其包含根据(16)所述的载体。
(18)一种产生抗EphA4抗体的方法，所述方法包含培养根据(17)所述的宿主细胞的步骤。
(19)一种药物组合物，其包含根据(1)-(14)中任一项所述的抗EphA4抗体。
(20)一种根据(19)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。
(21)根据(19)或(20)所述的药物组合物，其用于治疗阿尔茨海默病。
(22)根据(1)-(14)中任一项所述的抗EphA4抗体，其用于在治疗阿尔茨海默病中使用。
(23)一种用于治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据(1)-(14)中任一项所述的抗EphA4抗体。
(24)根据(1)-(14)中任一项所述的抗EphA4抗体用于制造用于治疗阿尔茨海默病的药物组合物的用途。
(25)根据(19)或(20)所述的药物组合物，其用于治疗tau蛋白病变。
(26)根据(1)-(14)中任一项所述的抗EphA4抗体，其用于在治疗tau蛋白病变中使用。
(27)一种用于治疗tau蛋白病变的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据(1)-(14)中任一项所述的抗EphA4抗体。
(28)根据(1)-(14)中任一项所述的抗EphA4抗体用于制造用于治疗tau蛋白病变的药物组合物的用途。
(29)根据(25)-(28)中任一项所述的药物组合物、抗EphA4抗体、治疗方法、或用途，其中所述tau蛋白病变是阿尔茨海默病或具有tau病理学的额颞叶变性。
(30)根据(29)所述的药物组合物、抗EphA4抗体、治疗方法、或用途，其中所述tau蛋白病变是阿尔茨海默病。
(31)根据(29)所述的药物组合物、抗EphA4抗体、治疗方法、或用途，其中所述tau蛋白病变是具有tau病理学的额颞叶变性。
(32)根据(31)所述的药物组合物、抗EphA4抗体、治疗方法、或用途，其中所述具有tau病理学的额颞叶变性是进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、嗜银颗粒痴呆、神经原纤维缠结型老年性痴呆或皮克氏病。
(33)根据(32)所述的药物组合物、抗EphA4抗体、治疗方法、或用途，其中所述具有tau病理学的额颞叶变性是进行性核上性麻痹。
(34)根据(32)所述的药物组合物、抗EphA4抗体、治疗方法、或用途，其中所述具有tau病理学的额颞叶变性是皮质基底节变性。
(35)根据(32)所述的药物组合物、抗EphA4抗体、治疗方法、或用途，其中所述具有tau病理学的额颞叶变性是嗜银颗粒痴呆。
(36)根据(32)所述的药物组合物、抗EphA4抗体、治疗方法、或用途，其中所述具有tau病理学的额颞叶变性是神经原纤维缠结型老年性痴呆。
(37)根据(32)所述的药物组合物、抗EphA4抗体、治疗方法、或用途，其中所述具有tau病理学的额颞叶变性是皮克氏病。
发明效果
本披露提供可以结合EphA4并增强EphA4的裂解的抗EphA4抗体、编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述载体的细胞、产生所述抗体的方法以及包含作为活性成分的所述抗体的药物组合物。
附图说明
图1显示了抗EphA4单克隆抗体(抗体A)针对小鼠和人EphA4的结合亲和力。
图2显示了采用海马神经元的抗EphA4单克隆抗体(抗体A)的EphA4裂解增强活性。
图3显示了抗EphA4单克隆抗体(抗体A)的小鼠EphA4-小鼠配体结合抑制活性。
图4显示了抗EphA4单克隆抗体(抗体A)的人EphA4-人配体结合抑制活性。
图5显示了抗EphA4单克隆抗体(抗体A)针对每个人Eph受体的选择性。
图6显示了抗EphA4单克隆抗体(抗体A)针对每个小鼠Eph受体的选择性。
图7显示了抗EphA4单克隆抗体(抗体A)针对小鼠、大鼠、猴和人EphA4的反应性。
图8显示了抗EphA4单克隆抗体(抗体A)针对人EphA4胞外区(ECD)、配体结合结构域(LBD)、纤连蛋白III型结构域1(FN1)和纤连蛋白III型结构域2(FN2)的反应性。
图9显示了抗EphA4单克隆抗体(抗体A)对增加海马神经元中棘突的数目的作用。
图10显示了抗EphA4单克隆抗体在体内抑制tau磷酸化的作用。
图11A显示了横轴上EphA4配体结合结构域(EphA4-LBD)的氨基酸和纵轴上抗体A-Fab的结构区。黑块显示了存在相互作用的组合的交点。
图11B显示了EphA4配体结合结构域(EphA4-LBD)的表面结构。在图11B中，结合区含有的氨基酸名称和残基数目显示在对应的位置处，并且结合抗体A-Fab的H链和L链的CDR显示在带状模型中。
图12显示了人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)针对人EphA4的亲和性。
图13显示了海马神经元中人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)的EphA4裂解增强活性。
图14显示了人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)的人EphA4-人配体结合抑制活性。
图15显示了人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)的小鼠EphA4-小鼠配体结合抑制活性。
图16显示了人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)针对人Eph受体的选择性。
图17显示了人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)针对小鼠Eph受体的选择性。
图18显示了人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)针对小鼠、大鼠、猴和人EphA4的反应性。
图19显示了人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)针对人EphA4胞外区(ECD)、配体结合结构域(LBD)、纤连蛋白III型结构域1(FN1)和纤连蛋白III型结构域2(FN2)的反应性。
图20显示了人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)对增加海马神经元中棘突的数目的作用。
图21显示了海马神经元中人源化抗人EphA4单克隆抗体(抗体B)的人EphA4裂解增强活性。
图22显示了人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体A)经由MMP和ADAM对增加海马神经元中棘突的数目的作用。
图23显示了人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)在体内抑制tau磷酸化的作用。
具体实施方式
本文使用的SEQ ID NO.说明或编码的区域如下：
本披露涉及结合EphA4的抗EphA4抗体。
根据本披露所述的抗EphA4抗体是可以识别并结合EphA4的抗体，并且如下所述，所述抗体可以是完整的抗体，或可以是合成抗体(如重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体等)，只要其具有与EphA4的结合亲和性。本文的EphA4可理解为指人源性、小鼠源性、大鼠源性和猴源性EphA4。人源性、小鼠源性、大鼠源性和猴源性EphA4可从登记了序列信息的公共数据库(如美国国家生物技术信息中心(United States National Center for BiotechnologyInformation)提供的Genbank)获得，或者EphA4基因序列信息可以通过基于密切相关动物物种的EphA4碱基序列信息设计引物并且然后从所需动物物种中提取的RNA进行克隆而获得。例如，人、小鼠、大鼠和猴EphA4的碱基序列信息分别以Genbank登录号NM_004438.5、NM_007936.3、NM_001162411.1和NM_001260870.1登记在数据库中。
在一个方面，抗EphA4抗体是特异性结合EphA4的抗体。“特异性结合”的术语是相关技术领域中的普通技术人员众所周知的术语，并且用于确定抗体或其抗原结合片段与抗原或表位之间特异性结合的方法也众所周知。在一个实施例中，“特异性结合”被理解为当与其他靶分子结合时相比，抗EphA4抗体可通过具有更高结合亲和力和结合活性的免疫反应更迅速和/或持续较长时间段的与EphA4结合。这并不意味着特异性结合EphA4的抗体不与其他靶分子结合。在另一个实施例中，“特异性结合”可由具有针对EphA4的至少约10-7M、或至少约10-8M、或至少约10-9M或更低的KD的抗体所示。此外，在另一个进一步的实施例中，“特异性结合”被理解为通过免疫反应与EphA4结合，但基本上不与Eph受体的其他家族分子结合。
在一个方面，抗EphA4抗体是结合EphA4的胞外区的抗体。在一个实施例中，抗EphA4抗体是与EphA4的胞外区的配体结合结构域(LBD)结合的抗体。
在一个实施例中，抗EphA4抗体可以特异性结合EphA4并增强EphA4的裂解。在特定实施例中，抗EphA4抗体可以特异性结合EphA4并通过基质金属蛋白酶(MMP)或ADAM(去整合素和金属蛋白酶)增强EphA4胞外结构域的裂解。
在一个实施例中，所述抗EphA4抗体可以特异性结合EphA4并抑制EphA4和其配体肝配蛋白之间的结合。
在另一个实施例中，抗EphA4抗体可以特异性结合EphA4并增加海马神经元中的棘突数目或稳定海马神经元中的棘突。
在一个实施例中，本披露涵盖抗EphA4抗体，其可以特异性结合人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4和猴EphA4中的至少一种并抑制与其配体的结合。在另一个实施例中，本披露涵盖抗EphA4抗体，其可以特异性结合人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4和猴EphA4中的两种或更多种并抑制与其配体的结合。在另一个进一步的实施例中，本披露涵盖抗EphA4抗体，其可以特异性结合人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4和猴EphA4中所有并抑制与其配体的结合。
对于用于测量抗EphA4抗体的抗原结合特性(如结合亲和力和跨物种反应性)的方法，可以采用本领域的普通技术人员在相关技术领域中众所周知的方法。例如结合亲和力可使用BiacoreTM生物传感器、KinExA生物传感器、闪烁接近分析法、ELISA、ORIGEN免疫测定法(IGEN公司)、流式细胞仪、荧光消光、荧光转移、酵母显示和/或免疫染色进行测定，但并不限定于这些。抗EphA4抗体针对EphA4和其配体之间的结合的中和活性可使用BiacoreTM生物传感器、ELISA和/或流式细胞仪进行测定，但并不限定于这些。
根据本披露所述的抗EphA4抗体可以是单克隆抗体，只要其结合EphA4。
根据本披露所述的抗EphA4抗体可以为如IgG、IgA或IgM(或其亚类)等任何类别，并不限于特定类别。根据重链(可以称为H链)的恒定区的抗体氨基酸序列，将免疫球蛋白分成不同类别。有五种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步细分为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等亚类(同种型)。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链的恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。此外，抗体的轻链(可以称为L链)的类型为λ链和κ链。根据本披露所述的抗EphA4抗体可以是IgG抗体，例如可以是IgG1抗体或IgG2抗体等。此外，根据本披露的抗EphA4抗体在一些情况下可以呈单体、二聚体或多聚体的形式。
根据本披露的抗体的可变区可意指抗体轻链的可变区和/或抗体重链的可变区，并且抗体的恒定区可意指抗体轻链的恒定区和/或抗体重链的恒定区。重链和轻链的可变区各自由通过也称为互补决定区的三个CDR连接的四个框架区(FR)组成。各链中的CDR通过FR而保持邻近，并与另一链中的CDR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。用于确定CDR的技术包括但不限于，例如(1)基于跨物种序列变异性的方法(如Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列],第5版,1991,National Institutes of Health[国立卫生研究院]，马里兰州贝塞斯达)；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶结构研究的方法(Al-lazikani等人,1997J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]273:927-948)。也可将这些方法、或其他方法组合而使用。
本文中的单克隆抗体可以意指从基本上一致的抗体群体获得的抗体。换句话说，在群体中含有的单独的抗体是相同的，除了可能以少量存在的天然的突变之外。单克隆抗体是针对单一抗原位点，并且极具特异性。此外，与靶向不同抗原或不同表位的典型的多克隆抗体相反，每种单克隆抗体靶向抗原的单个表位。修饰语“单克隆”表示从基本上一致的抗体群体获得的抗体的特性，并且不应被理解为限于需要通过特定方法来产生抗体的方式。
根据本披露的抗EphA4抗体可以是小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。嵌合抗体是例如将非人(如小鼠或大鼠)抗体的可变区与人抗体的恒定区融合的抗体，例如可以指可变区来源于非人抗体且恒定区来源于人抗体的抗体。人源化抗体是例如将非人抗体的互补决定区(CDR(也可以称为高变区))引入人抗体的抗体，并且例如可以指CDR来源于非人抗体且其余抗体区来源于人抗体的抗体。请注意，嵌合抗体与人源化抗体的界限并非必须明确，并且抗体可以处于可称为嵌合抗体或人源化抗体的状态。此外，在嵌合抗体或人源化抗体中，来源于人抗体的抗体区(FR，恒定区)并非必须全部由来源于人抗体的氨基酸组成，并且可以包含来自非人抗体的一个或多个氨基酸，只要其可以正常用于人类受试者中。人源化抗体的一个实施例是其中CDR来源于啮齿动物抗体并且其余抗体区来源于人抗体的抗体。人源化抗体的一个特定实施例是其中CDR来源于小鼠抗体并且其余抗体区来源于人抗体的抗体。在这些实施例中，CDR可以包含来源于非啮齿动物抗体的一个或多个氨基酸或来源于非小鼠抗体的一个或多个氨基酸，并且除CDR以外的抗体区可以包含来源于非人抗体的一个或多个氨基酸。此处，“多个”是但不限于2-20个，或2-15个(如14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个)或氨基酸序列中氨基酸数目的10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内或1％以内。人源化可以用CDR移植的方法(Kontermann和Dubel,Antibody Engineering[抗体工程],Springer LabManual[施普林格实验室手册](2001)和Tsurushita等人,Methods[方法]36:69-83(2005))来进行，并且进一步，还可以通过用相关技术领域中众所周知的方法(参见例如Jones等人,Nature[自然]321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature[自然]332:323-327(1988)；和Verhoeyen等人,Science[自然]239:1534-1536(1988))将CDR序列取代为人抗体中的对应的序列来进行。
为了降低抗原性，在制备人源化抗体后，选择轻链和重链中的人可变区的使用可能是重要的。根据“最佳适配”法，啮齿动物抗体的可变区序列针对已知人FR序列的整个文库而筛选。接下来，接受与啮齿动物序列最接近的人序列作为人源化抗体的人FR。参见例如Sims等人,J.Immunol.[免疫学杂志]151:2296-2308(1993)和Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987)。在另一种方法中，使用来源于轻链或重链的特定亚组的所有人抗体中共有的序列的特定框架。几种不同的人源化抗体可以使用相同的框架。参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Set USA[美国国家科学院院刊]89:4285-4289(1992)和Presta等人,J.Immunol.[免疫学杂志]151:2623-2632(1993)。
此外，通常理想的是人源化抗体保留对抗原的高结合亲和力以及其他优选的生物特性。为此，根据一种方法，通过采用亲本序列和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和多种概念性人源化产物的步骤而制备人源化抗体。通常，三维免疫球蛋白模型可以使用并且是本领域的普通技术人员已知的。可以使用说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的有前景的三维构象的计算机程序。对这些展示的研究允许对残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用进行分析，即对影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基进行分析。使用此方法，可从接受体和输入序列中选择FR残基并组合使用，以实现理想的抗体特性，如增加与单个或多个靶抗原(如EphA4或其片段)的结合亲和力。
当然，在上文例示的嵌合或人源化抗体中具有适当改变(如抗体的修饰、或抗体的氨基酸序列的部分取代、添加和/或缺失)同时保持所述抗体的功能(或者为了添加或改善所述抗体的功能)的抗体也涵盖在根据本披露的抗EphA4抗体中。更具体地，为了修饰抗体的效应子功能而改变恒定区的氨基酸序列的抗体也包括在本披露的范围内。例如，为了降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性等，具有将人IgG2抗体234位(Eu编号)的缬氨酸(Val)取代为丙氨酸(Ala)并且具有将237位的甘氨酸(Gly)取代为丙氨酸(Ala)的抗体也包括在本披露的范围内。进而，具有根据本披露的抗EphA4抗体的CDR序列的抗体结合位点连同与不同抗原结合的抗原结合位点的双特异性抗体(Kontermann(2012),mAbs 4,182-97)也包括在本披露的范围中。
根据本披露的抗EphA4抗体可以根据需要进行修饰。抗EphA4抗体的修饰可以是以下修饰，所述修饰改变(a)如片层或螺旋构象等在待修饰区中的氨基酸序列的三维结构；(b)靶位点的分子的电荷或疏水性状态；或者(c)修饰对侧链体积维持的影响，或者可以是不会明显观察到这些变化的修饰。
根据本披露的抗EphA4抗体的修饰可以例如通过组成氨基酸残基的取代、缺失、添加等实现。
本文中的氨基酸以其最广泛的含义使用，不仅包括如丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)等天然氨基酸，也包括如氨基酸变体和衍生物等非天然氨基酸。本领域的普通技术人员自然会理解，鉴于此广泛的定义，例如L-氨基酸；D-氨基酸；如氨基酸变体和氨基酸衍生物等经化学修饰的氨基酸；在体内非蛋白质组分的氨基酸，如正亮氨酸、β-丙氨酸和鸟氨酸；以及具有本领域的普通技术人员众所周知的氨基酸特性的经化学合成的化合物等被包括为本说明书的氨基酸。非天然氨基酸的实例可以包括，例如α-甲基氨基酸(如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸(如D-天冬氨酸和D-谷氨酸)、组氨酸样氨基酸(如2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸)、在侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)以及侧链中的羧酸官能基氨基酸被磺酸基取代的氨基酸(如磺基丙氨酸)。
天然存在的氨基酸残基可以例如基于一般的侧链特性而分为以下几组：
(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Asn、Gln、Cys、Ser、Thr；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及
(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。
构成抗体的氨基酸序列的非保守性取代可以通过将属于这些组之一的氨基酸与属于另一组的氨基酸交换来进行。更具保守性的取代可以通过将属于这些组之一的氨基酸与同一组中的另一氨基酸交换来进行。类似地，也可以适当地进行氨基酸序列的缺失或取代。
构成抗体的氨基酸的修饰可以是例如通过碳水化合物的糖基化或翻译后修饰，例如乙酰化或磷酸化。抗体可以在其恒定区中的保守位置进行糖基化。抗体的糖基化通常为N-连接的或O-连接的。N-连接的意指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的结合。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)为用于将碳水化合物部分酶促地添加到天冬酰胺侧链的识别序列。当这些三肽序列中的一个存在于抗体中时，存在潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化可以为N-乙酰基半乳胺糖、半乳糖或木糖与羟基氨基酸(如丝氨酸或苏氨酸)的结合，并且在一些情况下可以为与5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸的结合。本领域的普通技术人员可以根据目的，适当选择糖基化条件(如用生物学方法进行糖基化时，宿主细胞或细胞培养基的类型、pH等)。
根据本披露的抗EphA4抗体可进一步基于本领域的普通技术人员众所周知的常见技术知识，通过其他修饰方法单独地或组合地进行修饰。
根据本披露的抗EphA4抗体可以通过本领域的普通技术人员众所周知的方法产生。例如，可以通过将编码根据本披露的抗EphA4抗体的核酸整合到表达载体、将表达载体引入宿主细胞并培养宿主细胞来产生抗体。因此，本披露涵盖编码抗EphA4抗体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述载体的宿主细胞以及包含培养宿主细胞的步骤的产生抗EphA4抗体的方法。
编码根据本披露的抗EphA4抗体的核酸可以具有编码信号序列的DNA，或者可以具有在编码重链可变区的DNA和编码轻链可变区的DNA的5'末端编码信号序列的DNA。信号序列是存在于蛋白质的N-末端的氨基酸残基，所述氨基酸残基是分泌蛋白或整合膜蛋白在核糖体上合成后通过脂质双层所必需的，并且在本披露中，只要其是具有此功能的序列，不受特别限制。可以包含在根据本披露的抗EphA4抗体中的信号序列可以包括来源于人、小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、马、鸟、狗、猫、酵母等的信号序列。具体地，在本披露中，包含由SEQ IDNO.12或16表示的氨基酸序列的肽可以被包括为与重链有关的信号序列，并且包含由SEQID NO.14或18表示的氨基酸序列的肽可以被包括为与轻链有关的信号序列。此外，只要其在功能上是等同的，信号序列可以具有由SEQ ID NO.12或16表示的氨基酸序列和由SEQ IDNO.14或18表示的氨基酸序列中的一个或多个(如2个、3个、4个或5个)氨基酸的取代、添加和/或缺失。
根据本披露的抗EphA4抗体可以根据本领域的普通技术人员众所周知的方法分离或纯化。
本文“分离的”或“纯化的”意指从天然的状态人工地进行分离或纯化。如果分子或组合物天然存在，当它发生改变或自原来的环境中移除或两者时为“分离的”或“纯化的”。分离或纯化方法的实例包括但不限于电泳、分子生物学、免疫学或色谱方法等，具体地离子交换色谱、疏水色谱、反相HPLC色谱、等电聚焦或碱提法等。
在一个实施例中，抗EphA4抗体包含以下CDR：
(a)由在SEQ ID NO.44中所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；
(b)由在SEQ ID NO.27中所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；
(c)由在SEQ ID NO.28中所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；
(d)由在SEQ ID NO.29中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；
(e)由在SEQ ID NO.30中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；以及
(f)由在SEQ ID NO.31中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
在一个实施例中，抗EphA4抗体是人源化抗体或嵌合抗体，并且在特定实施例中是人源化抗体。
在另一个实施例中，抗EphA4抗体包含重链和轻链，所述重链的可变区包含SEQ IDNO.45中所示的氨基酸序列，并且所述轻链的可变区包含SEQ ID NO.46中所示的氨基酸序列。注意，在本实施例中，重链的可变区和/或轻链的可变区可以包含在SEQ ID NO.45中所示的氨基酸序列中和/或在SEQ ID NO.46中所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。此处，“多个”没有限制，只要其保留对EphA4的结合亲和力并增强EphA4的裂解，并且是2-15个或2-10个(如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个)，或氨基酸序列中氨基酸数目的10％以内，如9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内或1％以内。
在一个实施例中，抗EphA4抗体的重链包含人IgG2的恒定区。
在特定实施例中，人IgG2的恒定区包含SEQ ID NO.47的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗EphA4抗体的轻链包含人Igκ的恒定区。
在特定实施例中，人Igκ的恒定区包含SEQ ID NO.48的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗EphA4抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:59中所示的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。
例如，在另一个实施例中，出于减少抗体产生细胞产生的抗体的不均匀性等原因(美国专利申请公开号2010/0297697或Liu H等人,MAbs.2014年9月-10月；6(5):1145-1154)，抗EphA4抗体的重链C末端(羧基末端)位置处的赖氨酸缺失。在本披露中，具有重链的C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体还包括通过遗传修饰缺失重链的C末端赖氨酸的抗EphA4抗体或通过羧肽酶等翻译后裂解重链的C末端赖氨酸的抗EphA4抗体等。此外，在本披露中，重链的C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体不仅包括具有在两条重链中缺失C末端赖氨酸的抗EphA4抗体，还包括仅在一条重链中缺失C末端赖氨酸的抗EphA4抗体。
在一个方面，本披露涉及编码抗EphA4抗体的分离的核酸。编码抗EphA4抗体的分离的核酸是指编码抗EphA4抗体的重链和/或轻链的一个或多个核酸分子。在一个实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体的重链。在另一个实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体的轻链。在另一个进一步的实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体的重链和轻链。根据本披露的核酸还包括编码抗EphA4抗体重链的第一核酸分子和编码抗EphA4抗体轻链的第二核酸分子。
在另一方面，本披露涉及包含编码抗EphA4抗体的分离的核酸的载体。根据本披露的载体是指包含编码抗EphA4抗体的分离的核酸的一个或多个载体。在一个实施例中，根据本披露的载体是包含编码抗EphA4抗体重链的核酸和编码抗EphA4抗体轻链的核酸的载体。在另一个实施例中，根据本披露的载体是包含编码抗EphA4抗体的重链和轻链的核酸的载体。在另一个进一步的实施例中，根据本披露的载体包含编码抗EphA4抗体重链的核酸的第一载体和编码抗EphA4抗体轻链的核酸的第二载体。根据本披露的载体可以是但不限于质粒、粘粒、病毒、噬菌体等。例如，作为病毒载体，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒载体等也包括在根据本披露的载体中。
在又另一方面，包含根据本披露的载体的宿主细胞和包含培养所述宿主细胞步骤的产生抗EphA4抗体的方法也包括在本披露中。根据本披露的宿主细胞可以是但不限于大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞等。在一个实施例中，产生抗EphA4抗体的方法包括培养宿主细胞的步骤和从宿主细胞(或宿主细胞的培养基)回收分泌的抗EphA4抗体的步骤。
在一个方面，本披露涉及包含抗EphA4抗体的药物组合物。根据本披露的药物组合物可以根据已知方法(如日本药典(JP)、美国药典(USP)或欧洲药典(EP)中描述的方法等)制造。
根据本披露的抗EphA4抗体可用于治疗阿尔茨海默病。换句话说，在其他方面，本披露涵盖用于治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括向患有阿尔茨海默病的受试者施用治疗有效量的抗EphA4抗体的步骤。此外，在其他方面，本披露涵盖抗EphA4抗体用于制造用于阿尔茨海默病的治疗药物的用途。在其他方面，本披露涵盖用于在治疗阿尔茨海默病中使用的抗EphA4抗体。
根据本披露的抗EphA4抗体可用于治疗tau蛋白病变。换句话说，在其他方面，本披露涵盖用于治疗tau蛋白病变的方法，所述方法包括向患有tau蛋白病变的受试者施用治疗有效量的抗EphA4抗体的步骤。此外，在其他方面，本披露涵盖抗EphA4抗体用于制造用于tau蛋白病变的治疗药物的用途。在其他方面，本披露涵盖用于在治疗tau蛋白病变中使用的抗EphA4抗体。本披露的tau蛋白病变包括阿尔茨海默病或具有tau病理学的额颞叶变性(FTLD-tau)。此外，具有tau病理学的额颞叶变性包括进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、嗜银颗粒痴呆(AGD)、神经原纤维缠结型老年性痴呆(SD-NFT)、皮克氏病(PiD)等。
根据本披露的抗EphA4抗体可以在治疗方法中单独地或与其他药剂或组合物组合地使用。例如，根据本披露的抗EphA4抗体可以与另一种药剂同时或不同时施用。这样的组合疗法包括组合施用(两种或更多种药剂包括在相同或不同的配制品中)和分开施用(如同时或顺序)。当分开施用两种或更多种药剂时，根据本披露的抗EphA4抗体的施用可以在伴随治疗方法之前或之后进行。
施用根据本披露的药物组合物的受试者并无限定，并且可以用于例如人或非人哺乳动物(如猴、小鼠、大鼠、兔、牛、马和山羊)。
向受试者施用根据本披露的药物组合物的方法(如施用途径、剂量、每天施用次数和施用时间)并无限定，并且可以由本领域的普通技术人员(如医生)根据受试者的健康状态、疾病的程度、组合使用的药剂的类型等适当地决定。
本领域的普通技术人员应认识到，只要技术上不矛盾，本发明可以在本文中所述的所有方面中的任何一个或多个适当地组合以实施本发明。此外，本领域的普通技术人员应当认识到，只要技术上不矛盾，则应该优选的是将本文中所述的所有优选或有利的方面适当地组合以实施本发明。
本文中所引用的文献的全部披露应被认为通过引用而明确地引用在本文中，并且本领域的普通技术人员可以根据本文的上下文在不脱离本发明的精神和范围的情况下通过引用这些文献作为本说明书的一部分来理解这些文献中相关的披露内容。
本文中所引用的文献仅是为了披露本申请的申请日前的相关技术而提供，不应解释为诸位发明人由于先前发明或任何其他理由而承认不具有先行于所述披露内容的权利。所有这些文献的全部描述是基于诸位申请人可获取的信息，并且不以任何方式构成承认这些描述内容正确。
本文所用的术语是用于描述特定的实施例，并非意在限定本发明。
除非上下文明确地表明以另外的方式理解，本文所使用的术语“包含(comprise)”意指存在所描述的项目(例如组分、步骤、要素或数字)，不排除存在其他项目(例如组分、步骤、要素和数字)。术语“由......组成(consist of)”涵盖以术语“由......组成(consistof)”和/或“基本上由......组成(consist essentially of)”所描述的方面。
如本文所使用的术语“中和活性”意指抑制EphA4与其配体之间的结合的活性，和/或抑制人体内由于EphA4与其配体结合而诱导的细胞的信号转导或分子表达应答或功能改变的活性。
除非另外定义，本文所使用的全部术语(包括技术术语及科学术语)具有与本发明所属的技术领域的普通技术人员广泛理解的含义相同的含义。除非另有明确定义，本文所使用的术语应解释为具有与本文和相关技术领域中的含义一致的含义，不应解释为具有理想化或过于正式的含义。
例如第一和第二的术语是用于表达各种要素，并且应该认识到这些要素不受这些术语本身的限定。这些术语仅用于将要素与其他要素区分，例如可于不脱离本发明的范围的情况下将第一要素记为第二要素，同样地，将第二要素记为第一要素。
除非明确指出，本文中用以表示组分含量或数值范围等的数值应理解为以术语“约”修饰。例如，“4℃”，除非明确指出，否则理解为意指“约4℃”，并且显而易见的是，本领域的普通技术人员可以依照技术常识和本文段落的含义合理地理解其范围。
除非上下文明确地表示其他含义，当在本文的说明书和权利要求书中使用时，应认识到以单数形式表示的各方面只要技术上不矛盾也可以是复数形式，反之亦然。
现在将参考实例更详细地描述本发明。然而，本发明可以通过各种方面来体现，不应解释为限于本文中所描述的实例。相关技术领域的本领域的普通技术人员可于不变更本发明的精神或范围的情况下伴随各种修饰、添加、缺失、取代等而实施本发明。
实例
参考实例1：抗EphA4单克隆抗体的制备
(A)小鼠抗EphA4单克隆抗体的制备
为了制备与小鼠EphA4(登录号NP_031962.2，SEQ ID NO.1)结合的单克隆抗体，通过以下步骤制备含有融合至小鼠EphA4的胞外区(位置20-547)(SEQ ID NO.2)的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)和组氨酸标签的蛋白(在下文被称为“小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白，”SEQ ID NO.3)。
首先，使用来源于小鼠的脑总RNA通过RT-PCR扩增编码小鼠EphA4的信号序列(SEQID NO.4)和胞外区(SEQ ID NO.2)的DNA序列，并克隆到具有编码SEAP和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/生命技术公司)的Sal I/Not I位点。然后，将编码小鼠EphA4的信号序列和胞外区、SEAP和组氨酸标签的DNA序列通过Gateway系统(英杰公司/生命技术公司)的LR反应转移至pcDNA 3.1_rfcB载体以构建pcDNA 3.1-小鼠EphA4胞外区-SEAP-His表达载体。通过TransIT-LT1(宝生物公司(TAKARA))，将构建的pcDNA 3.1-小鼠EphA4胞外区-SEAP-His表达载体转染到HEK293EBNA细胞(英杰公司/生命技术公司)。孵育(5％CO2，37℃)6天后，回收培养上清。用Protino柱(MACHEREY-NAGEL)从回收的培养上清中纯化小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白(SEQ ID NO.3)。
将二十微克的小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白与同量的TiterMax Gold佐剂(TiterMax USA)或GERBU佐剂(GERBU Biotechnik GmbH)混合，皮下注射至Balb/c小鼠的足垫。然后，在第3天、第7天和第10天，类似地给予小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白。此处，TiterMax Gold佐剂(TiterMax USA)只在第10天使用，并且GERBU佐剂(GERBU BiotechnikGmbH)在第3天、第7天和第10天使用。在第13天处死小鼠，回收周围淋巴结以制备淋巴结细胞。将制备的淋巴结细胞和P3U1骨髓瘤细胞(由京都大学捐赠)于GenomeONE-CF(石原产业株式会社)的存在下以5:1的比率融合。将融合细胞在96孔塑料板中培养。孵育(5％CO2，37℃)7天后，回收培养上清。
采用获得的培养上清，选取针对小鼠、大鼠和人EphA4具有反应性的孔。
用ELISA和蛋白评估针对小鼠、大鼠和人EphA4的反应性(所述蛋白具有融合到小鼠EphA4的胞外区、大鼠EphA4的胞外区(位置20-547)(Genbank登录号NP_001155883.1)，或人类EphA4(Genbank登录号NP_004429.1，SEQ ID NO.5)的胞外区(位置20-547)(SEQ IDNO.6)的人IgG1的Fc区域和组氨酸标记(在下文分别被称为“小鼠EphA4胞外区-Fc-His蛋白”、“大鼠EphA4胞外区-Fc-His蛋白”或“人类EphA4胞外区-Fc-His蛋白”))。
小鼠、大鼠或人EphA4胞外区-Fc-His蛋白通过以下步骤制备。最初，构建pcDNA3.1-小鼠、大鼠或人EphA4胞外区-Fc-His表达载体。首先，使用来源于小鼠、大鼠或人的脑的总RNA通过RT-PCR扩增编码小鼠、大鼠或人EphA4信号序列和胞外区的DNA序列，并克隆到具有编码Fc和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/生命技术公司)的Sal I/Not I位点。然后，将编码小鼠、大鼠或人EphA4的信号序列和胞外区、Fc和组氨酸标签的DNA序列通过Gateway系统(英杰公司/生命技术公司)的LR反应转移至pcDNA3.1_rfcB载体以构建pcDNA 3.1-小鼠、大鼠、人EphA4胞外区-Fc-His表达载体。用TransIT-LT1(宝生物公司)，将这些构建的表达载体转染到HEK293 EBNA细胞(英杰公司/生命技术公司)。孵育(5％CO2，37℃)6天后，回收培养上清。
ELISA采用小鼠、大鼠或人EphA4胞外区-Fc-His蛋白按照以下步骤进行。将抗人IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories))涂布到96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1x封闭ACE(Dainippon Seiyaku)将孔在室温下封闭一小时。用0.02％Tween 20/PBS洗涤三次后(Nacalai Tesque公司)，将包含小鼠、大鼠或人EphA4胞外区-Fc-His蛋白的培养上清添加到每孔中(终浓度1nM)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将融合细胞的培养上清添加到每孔中。在室温下孵育一小时并洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司(Sigma))溶液添加到每孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的终止溶液(2N H2SO4，瓦科纯化工公司(Wako Pure Chemical))添加到每孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))读取450nm处的吸光度。
通过有限稀释法从通过以上步骤选取出的孔中克隆杂交瘤，并最终获得表达具有针对小鼠、大鼠和人EphA4的结合活性的小鼠抗EphA4抗体的杂交瘤克隆。
培养获得的杂交瘤克隆，从培养上清中用蛋白A(通用医疗集团(GE Healthcare))纯化小鼠抗EphA4单克隆抗体。
(B)EphA4裂解增强活性的评价
按照以下步骤进行大鼠海马神经元的制备。在妊娠的第18天，从大鼠取出胎鼠(日本查尔斯河实验室(Charles River Laboratories Japan))，并切开头部取出脑。在立体显微镜下切出海马区，放入消化液(137mM NaCl(瓦科纯化工公司)、5mM KCl(瓦科纯化工公司)、7mM Na2HPO4(瓦科纯化工公司)、25mM Hepes(同仁化学研究所(DOJINDO))、0.5mg/mLDNA酶(西格玛公司)和0.25％胰蛋白酶(生命技术公司))中，在37℃下振荡10分钟。去除溶液，添加20％胎牛血清/Hanks缓冲液(西格玛公司)。将溶液去除，用Hanks缓冲液洗涤两次后，将海马组织移液到Hanks缓冲液中以制备细胞悬液。将细胞接种到96孔培养皿中(福尔肯公司(Falcon))，所述培养皿已用包含聚L-赖氨酸的培养液(神经元基础培养基(生命技术公司)，1 x B-27补充剂(生命技术公司)和0.5mM L-谷氨酰胺(生命技术公司))涂布。
按照以下步骤，采用海马神经元进行EphA4裂解增强活性的评估。用抗EphA4单克隆抗体(67nM)和γ选择酶抑制药物化合物E(50nM，恩佐生命科学公司(Enzo LifeSciences))处理接种到96孔培养皿(福尔肯公司)中的大鼠海马神经元。十六小时后，用PBS(瓦科纯化工公司)洗涤，将SDS样品缓冲液(利姆里样品缓冲液(Laemmli sample buffer)(伯乐公司(Bio-Rad))和5％2-巯基乙醇(伯乐公司))添加以回收的细胞，并将其煮沸5分钟。用该样品进行SDS-PAGE，用抗EphA4单克隆抗体(亚诺法公司(Abnova))进行蛋白质印迹，定量带的强度，计算EphA4 C末端片段/EphA4全长的值。
获得了具有增强EphA4(抗体A)裂解的活性的小鼠抗EphA4单克隆抗体。用单克隆抗体分型试剂盒(Serotec公司)测定抗体A的同种型为：对于重链IgG1，对于轻链κ。
(C)抗体A的序列分析
通过5'-RACE(cDNA末端的5'-快速扩增)方法扩增编码抗体A的信号序列以及重链和轻链可变区的DNA序列。使用RNeasy试剂盒(凯杰公司(QIAGEN))由杂交瘤制备总RNA，并利用DNA酶(凯杰公司，无RNA酶的DNA酶组)处理。用cDNA合成试剂盒(宝生物公司)从总RNA制备双链cDNA。向cDNA上添加通过寡DNA ad29S(ACATCACTCCGT)(SEQ ID NO.7)和寡DNAad29AS(ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAG CGTAGCT)(SEQ ID NO.8)的退火获得的5'衔接子。扩增获得的cDNA，其中5'正向引物(5'-PCR4引物，AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG(SEQ ID NO.9))和3'反向引物(GCCAGTGGATAGACTGATGG(SEQID NO.10)用于扩增小鼠IgG重链，且GATGGATACAGTTGGTGCAGC(SEQ ID NO.11)用于扩增小鼠Igκ轻链)。将扩增的cDNA插入pCR2.1载体(英杰公司/生命技术公司)中。用ABI 3130XL对抗体A的基因序列进行分析。作为本分析鉴定的抗体A基因序列编码的氨基酸序列，重链信号序列为SEQ ID NO.12所示的序列，重链可变区为SEQ ID NO.13所示的序列，轻链信号序列为SEQ ID NO.14所示的序列，并且轻链可变区是SEQ ID NO.15所示的序列。作为编码抗体A基因序列的核苷酸序列，重链信号序列为SEQ ID NO.16所示序列，重链可变区为SEQ IDNO.17所示序列，轻链信号序列为SEQ ID NO.18所示序列，并且轻链可变区是SEQ ID NO.19所示的序列。
使用以下步骤获得抗体A的重链和轻链的全长序列。使用RNeasy试剂盒(凯杰公司(QIAGEN))由杂交瘤制备总RNA，并利用DNA酶(凯杰公司，无RNA酶的DNA酶组)处理。用RNA-PCR试剂盒(宝生物公司)从总RNA制备逆转录产物。采用获得的逆转录产物为模板，用5’正向引物(GCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTGTCCTGGTGCTGCTCC(引物ID 7455)(SEQ ID NO.20)用于重链的扩增，GCGAAGCTTGCCGCCACCATGGACATGAGGGTTCCTGCTCACG(引物ID 7453)(SEQ IDNO.21)用于轻链的扩增)和3'反向引物(GCGGAATTCATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC(引物ID7257)(SEQ ID NO.22)用于重链的扩增，CGCGAATTCACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC(引物ID 7249)(SEQ ID NO.23)用于轻链的扩增)对编码抗体A重链和轻链的基因序列用PCR扩增，并分别克隆到pEE6.4和pEE12.4载体(龙沙集团(Lonza))中。使用ABI3130XL对基因序列进行分析。作为本分析鉴定的抗体A基因序列编码的氨基酸序列，重链恒定区序列为SEQ IDNO.24所示的序列，并且轻链恒定区序列为SEQ ID NO.25所示的序列。
抗体A的CDR用以下方法测定。根据Kabat编号系统使用Abysis软件(UCL)对抗体A的氨基酸序列进行编号。基于此编号，根据用于CDR鉴定的Kabat定义来做出决定。抗体A的CDR的氨基酸序列如表1所示。
[表1]抗体A的CDR的氨基酸序列
| 名称 | 序列 |
| 重链CDR1 | RYGVH(SEQ ID NO.26) |
| 重链CDR2 | VIWRGGSTDYNAAFMS(SEQ ID NO.27) |
| 重链CDR3 | ESLFGVYYDYGYYSMDY(SEQ ID NO.28) |
| 轻链CDR1 | RASQEISGYLS(SEQ ID NO.29) |
| 轻链CDR2 | AASTLDS(SEQ ID NO.30) |
| 轻链CDR3 | LQYASYPLT(SEQ ID NO.31) |
参考实例2：抗EphA4单克隆抗体针对小鼠和人EphA4的结合亲和力
抗体A针对小鼠和人EphA4的结合亲和力通过表面等离子体共振(SPR方法)采用Biacore T200(通用医疗集团)测定。首先，将抗His抗体(通用医疗集团，28-9950-56)固定到感测片CM5上。通过采用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶联法固定，采用乙醇胺用于封闭(感测片和固定试剂均来自通用医疗集团)。用固定缓冲液(10mM乙酸钠，pH 4.5)将其稀释至3.5μg/mL，并根据附于BiacoreT200的方案固定在感测片上。用运行缓冲液HBS-EP(通用医疗集团，BR-1001-88)稀释小鼠或人EphA4细胞外区-SEAP-His10，并将溶液送至流动池中120秒进行捕获(捕获量约10RU)。随后，用HBS-EP将抗体A连续稀释至100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6和0nM范围，加入至感测片120秒，依次观察加入时(结合期，120秒)和加入完成后(解离期，600秒)的结合反应曲线。每次观察完成后，加入4M MgCl2(60秒，瓦科纯化工公司)以再生感测片。采用系统附带的BIA评价软件，通过1:1结合模型对得到的结合反应曲线进行拟合分析，计算出针对小鼠和人EphA4的结合亲和力(KD＝kd/ka)。
抗体A针对小鼠和人EphA4的结合亲和力(KD值)分别为1.32x10-9M和1.19x10-9M(图1)。其他针对小鼠和人EphA4的结合参数在程度上几乎相同。因此，认为抗体A对小鼠和人的EphA4具有相同程度的结合亲和力。
参考实例3：抗EphA4单克隆抗体在海马神经元中的EphA4裂解增强活性
对于抗体A，按照以下步骤，采用海马神经元进行EphA4裂解增强活性的评估。用抗体A(2.0，6.7和20nM)和γ选择酶抑制药物化合物E(50nM，恩佐生命科学公司)处理接种于96孔培养皿(福尔肯公司)的大鼠海马神经元。二十四小时后，用PBS(瓦科纯化工公司)洗涤，将SDS样品缓冲液(利姆里样品缓冲液(伯乐公司)和5％2-巯基乙醇(伯乐公司))添加以回收的细胞，并将其煮沸5分钟。用该样品进行SDS-PAGE，用抗EphA4单克隆抗体(亚诺法公司)进行蛋白质印迹，定量带的强度，计算EphA4 C末端片段/EphA4全长的值。
抗体A浓度依赖性地增强在海马神经元中的EphA4裂解反应(图2)。
参考实例4：抗-EphA4单克隆抗体的小鼠EphA4-小鼠配体结合抑制活性
对于抗体A，按照以下步骤进行小鼠EphA4与小鼠配体结合的抑制活性的评估。将抗碱性磷酸酶抗体(赛默科技公司(Thermo SCIENTIFIC))涂布在96孔板(Nunc公司)的孔中。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司(DS Pharma Biomedical))将孔在室温下封闭一小时。用0.02％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤三次后，将小鼠EphA4细胞外区-SEAP-His蛋白添加到孔中(最终浓度10nM)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将配体和抗体A(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000和3000nM)添加到孔中。应注意生物素化的小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合体(R&D系统公司(R&D Systems)，终浓度6nM)和生物素化小鼠肝配蛋白B2-Fc嵌合体(R&D系统公司，终浓度2.5nM)被用作配体。在室温下孵育一小时并洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(通用医疗集团)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育2分钟。将等量的终止溶液(1N H2SO4，瓦科纯化工公司)添加到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
抗体A浓度依赖性地抑制小鼠EphA4与小鼠配体的结合，针对小鼠肝配蛋白A1和肝配蛋白B2结合的IC50值分别为约5.9nM和3.1nM(图3)。因此，表明抗体A强烈抑制小鼠EphA4与配体的结合。
参考实例5：抗-EphA4单克隆抗体的人EphA4-人配体结合抑制活性
对于抗体A，按照以下步骤评估人EphA4与人配体结合的抑制活性。将抗碱性磷酸酶抗体(赛默科技公司)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔中。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.05％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤三次后，将人EphA4细胞外区-SEAP-His蛋白添加到孔中(最终浓度10nM)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将配体和系列稀释的抗体A(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000和3000nM)添加到孔中。应注意生物素化的人肝配蛋白A5-Fc嵌合体(R&D系统公司，终浓度0.7nM)和生物素化人肝配蛋白B3-Fc嵌合体(R&D系统公司，终浓度2.3nM)被用作配体。在室温下孵育一小时并洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(通用医疗集团)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育2-5分钟。将等量的终止溶液(1NH2SO4，瓦科纯化工公司)添加到孔中，并用酶标仪(分子器件公司(MolecularDevices)或珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
抗体A浓度依赖性地抑制人EphA4与人配体的结合，针对人肝配蛋白A5和肝配蛋白B3结合的IC50值分别为约2.8nM和1.4nM(图4)。因此，表明抗体A也强烈抑制人EphA4与人配体的结合。
参考实例6：抗EphA4单克隆抗体针对人Eph受体的选择性
按照参考实例1中所述的制备小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白的方法，用来源于组织的总RNA通过RT-PCR扩增编码每个人Eph受体(EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、和EphB6)的信号序列和胞外区的DNA序列，并克隆到含有编码SEAP和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/生命技术公司)中。然后，将编码每个人Eph受体的信号序列和胞外区、SEAP和组氨酸标签的DNA序列通过Gateway系统(英杰公司/生命技术公司)的LR反应转移至pcDNA 3.1_rfcB载体，以构建表达具有与每个人Eph受体的胞外区融合的SEAP和His标签的蛋白(称为“Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白”)的载体(称为“Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白表达载体”)。
然后，用Expi293表达系统(吉布科公司(Gibco)/赛默飞世尔公司(ThermoFisher))将每个人-SEAP-His蛋白表达载体的Eph受体胞外区引入Expi293F细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)。培养(5％CO2，37℃，120rpm)5天后，回收培养上清，并将其在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清用0.45μm滤器过滤(密理博公司(Millipore))。
对于抗体A，按照以下步骤评估人Eph受体的结合活性。
将兔抗6-His抗体(贝斯实验室(Bethyl Laboratories))涂布到96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.05％Tween20/PBS(赛默科技公司)洗涤三次后，将人-SEAP-His蛋白(终浓度1nM)的每个Eph受体胞外区接种到每个孔中，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将人IgG溶液(100μg/mL，三菱药物公司(Mitsubishi Pharma Corporation))和抗体A(10μg/mL)添加到孔中，并将其在室温下孵育一小时。添加辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，并在确认适量着色后，添加等量的终止溶液(1NH2SO4，瓦科纯化工公司)到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
在人类Eph受体家族中，抗体A仅对人类EphA4具有特异性结合活性(图5)。
参考实例7：抗EphA4单克隆抗体针对小鼠Eph受体的选择性
按照根据参考实例1制备EphA4胞外区-Fc-His蛋白的方法，用来源于组织的总RNA通过RT-PCR扩增编码每个小鼠Eph受体(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、和EphB6)的信号序列和胞外区的DNA序列，并克隆到具有编码人IgG1的Fc区和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/生命技术公司)中。然后，将编码每个小鼠Eph受体的信号序列和胞外区、Fc和组氨酸标签(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、和EphB6)的DNA序列通过Gateway系统(英杰公司/生命技术公司)的LR反应转移至pcDNA 3.1_rfcB载体，以构建每个小鼠Eph受体的胞外区-Fc-His蛋白表达载体。在小鼠EphA2-Fc-His蛋白胞外区表达载体的构建中，用来源于组织的总RNA通过RT-PCR扩增编码小鼠EphA2的信号序列和胞外区的DNA序列，并克隆到含有编码Fc和组氨酸标签的DNA序列的pcDNA 3.1载体中以构建小鼠EphA2胞外区-Fc-His蛋白表达载体。
然后，用Expi293表达系统(吉布科公司/赛默飞世尔公司)将每个小鼠Eph受体胞外区-Fc-His蛋白表达载体引入Expi293F细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)。培养(5％CO2，37℃，120rpm)5天后，回收培养上清，并将其在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清用0.45μm滤器过滤(密理博公司)。
对于抗体A，按照以下步骤评估小鼠Eph受体的结合活性。
将兔抗6-His抗体(贝斯实验室)涂布到96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.05％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤三次后，将每个小鼠Eph受体胞外区-Fc-His蛋白(终浓度1nM)接种在每个孔中，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将人IgG溶液(100μg/mL，西格玛公司)和抗体A(10μg/mL)添加到孔中，并将其在室温下孵育一小时。添加辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，并在确认适量着色后，添加等量的终止溶液(1NH2SO4，瓦科纯化工公司)到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
在小鼠Eph受体家族中，抗体A仅对小鼠EphA4具有特异性结合活性(图6)。
参考实例8：抗EphA4单克隆抗体针对小鼠、大鼠、猴和人EphA4的反应性
按照以下步骤制备小鼠、大鼠、猴和人EphA4胞外区-Fc-His蛋白。首先，按照根据参考实例1制备EphA4胞外区-Fc-His蛋白的方法，构建猴EphA4胞外区-Fc-His蛋白表达载体。用于载体构建的猴EphA4的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，并且其胞外区如SEQ IDNO.33所示。采用猴EphA4胞外区-Fc-His蛋白表达载体以及参考实例1中所述的小鼠、大鼠和人EphA4胞外区-Fc-His蛋白表达载体制备各种EphA4胞外区-Fc-His蛋白。
对于抗体A，按照以下步骤评估与各种EphA4胞外区的结合活性。
将驴抗人IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)涂布到96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.05％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤三次后，将小鼠、大鼠、猴和人EphA4胞外区-Fc-His蛋白(终浓度1nM)接种于孔中，并将此在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将人IgG溶液(100μg/mL，三菱药物公司)和抗体A(0、0.00013、0.00064、0.0032、0.016、0.08、0.4、2和10μg/mL)添加到孔中，并将其在室温下孵育一小时。添加辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，并在确认适量着色后，添加等量的终止溶液(1NH2SO4，瓦科纯化工公司)到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
抗体A在所有小鼠、大鼠、猴和人EphA4中具有等同的结合活性(图7)。
参考实例9：抗EphA4单克隆抗体针对人EphA4胞外区、配体结合结构域、纤连蛋白
III型结构域1、纤连蛋白III型结构域2的反应性
按照以下步骤制备具有人EphA4胞外区(ECD)、配体结合结构域(LBD)、纤连蛋白III型结构域1(FN1)或纤连蛋白III型结构域2(FN2)与麦芽糖结合蛋白(MBP)和组氨酸标签融合的蛋白质(在下文被称为“人EphA4胞外区-MBP-His蛋白、”“人EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白”、“人EphA4纤连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白”和“人EphA4纤连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白”)。最初，构建了pcDNA 3.4人EphA4胞外区、配体结合结构域、纤连蛋白III型结构域1或纤连蛋白III型结构域2-MBP-His表达载体。首先，通过PCR扩增人EphA4的信号序列(SEQ ID NO.34)或前原胰蛋白酶的信号序列(SEQ ID NO.35)及编码人EphA4各结构域的DNA序列，并克隆到具有编码MBP和组氨酸标签的DNA序列的pcDNA 3.4载体(英杰公司/生命技术公司)中，以构建人EphA4胞外区-MBP-His蛋白、人EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白、人EphA4纤连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白，以及人EphA4纤连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白表达载体。用于载体构建的人EphA4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其胞外区如SEQ ID NO.36所示，配体结合结构域如SEQ ID NO.37所示，纤连蛋白III型结构域1如SEQ ID NO.38所示，并且纤连蛋白III型结构域2如SEQ ID NO.39所示。以上表达载体用Expi293表达系统(赛默科技公司)转染到Expi293F细胞(赛默科技公司)中。4天后，回收培养上清，并通过0.45μm滤器(密理博公司)。用直链淀粉树脂(NEB)进行粗纯化，并将缓冲液用Zeba旋转脱盐柱(赛默科技公司)取代为PBS(瓦科纯化工公司)。将单体级分用Superdex 200 10/300(通用医疗集团)进行了差异纯化。
对于抗体A，按照以下步骤评估与人EphA4中各种结构域的结合活性。
将兔抗6-His抗体(贝斯实验室)涂布到96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.02％Tween 20/PBS(Nacalai Tesque公司)洗涤两次后，将人EphA4胞外区-MBP-His蛋白、人EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白、人EphA4纤连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白和人EphA4纤连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白(终浓度10nM)接种于孔中，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将抗体A(终浓度10nM)添加到孔中，并将其在室温下孵育一小时。添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG Fcγ片段抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤五次后，将TMB溶液(KPL)添加到孔中，并在确认适量着色后，添加等量的终止溶液(2N H2SO4，瓦科纯化工公司)到孔中。用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
抗体A对人EphA4胞外区(ECD)和配体结合结构域(LBD)具有结合活性(图8)。对纤连蛋白III型结构域1(FN1)和纤连蛋白III型结构域2(FN2)无反应。因此，发现抗体A特异性结合人EphA4胞外区的配体结合结构域。
参考实例10：抗EphA4单克隆抗体对增加海马神经元中棘突的数目的作用
如在以上参考实例1(B)中所述制备大鼠海马神经元。采用核转染(Nucleofector)(龙沙集团)将EGFP基因引入大鼠海马神经元，与未引入基因的大鼠海马神经元混合，并接种于含有涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片(松浪玻璃工业(Matsunami Glass Industries))的24孔板(福尔肯公司)中。
按照以下步骤采用大鼠海马神经元进行棘突计数。将接种于24孔板(福尔肯公司)(含有涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片(松浪玻璃工业))中的培养第13天的引入EGFP的大鼠海马神经元用对照抗体(小鼠IgG1；百进生技公司(BioLegend))或抗体A(6.7和20nM)处理24小时。然后将盖玻片转移至2％PFA(瓦科纯化工公司)/4％蔗糖(瓦科纯化工公司)/PBS中，并将其静置20分钟以固定细胞。在去除固定液并用PBS洗涤细胞三次后，添加0.25％TritonX-100(瓦科纯化工公司)/PBS，并进行细胞透化15分钟。去除溶液，将盖玻片转移至2％BSA(西格玛公司)/0.25％Triton X-100/Opti-MEM(吉布科公司)中，并封闭一小时，然后允许抗GFP抗体(Nacalai Tesque公司)反应1.5小时。去除第一抗体溶液并用PBS洗涤三次后，允许第二抗体反应一小时。去除第二抗体溶液并用PBS洗涤三次后，添加Prolong Gold抗荧光衰减封片剂(antifade reagent)(分子探针公司(Molecular probes))进行封片，并用LSM800(蔡司公司(ZEISS))进行观察。上述实验进行三次，并且对于每次实验，从两个盖玻片中提取神经元，用图像分析软件(Bitplane)计数每个树突上的棘突，并计算每个神经元每10μm的棘突数目。
抗体A增加了海马神经元中的棘突数目(图9)。此结果显示抗体A具有稳定海马神经元中棘突的活性。
参考实例11：抗EphA4单克隆抗体对于抑制体内tau磷酸化的作用
按照以下步骤采用tau转基因小鼠(rTg4510)评估抑制体内tau磷酸化的作用。Tau转基因小鼠(rTg4510)从20至26周龄每周皮下施用抗体A或对照抗体两次，所述对照抗体通过常规方法以每次100mg/kg(10mL/kg)的剂量用二硝基苯酚(小鼠抗二硝基苯酚抗体)进行免疫制备。最后一次施用后3.5天，用2％异氟醚(英特威公司(Intervet))和三种类型麻醉药物(4.0mg/kg的咪达唑仑(安斯泰来制药(Astellas Pharma)、0.3mg/kg的美托咪定(日本全药工业株式会社)和5.0mg/kg的Vetorphale(明治制果药业(Meiji Seika Pharma)))的混合进行麻醉，用含有3单位/mL肝素(味之素公司(Ajinomoto))和1％磷酸酶抑制剂混合物(Nacalai Tesque公司)的PBS(瓦科纯化工公司)在麻醉下进行灌注，并切除脑半球。在4℃固定收集的脑半球，同时在2％的多聚甲醛(TAAB)/0.1M磷酸盐缓冲液(瓦科纯化工公司)中振荡过夜。脑半球被20％蔗糖(瓦科纯化工公司)/0.1M磷酸盐缓冲液(瓦科纯化工公司)并且随后25％蔗糖/0.1M磷酸盐缓冲液(瓦科纯化工公司)取代，并且然后包埋在组织-TekO.C.T.化合物(樱花精密技术日本公司(Sakura Finetek Japan))/25％蔗糖中并用液氮冷冻。切片用恒冷箱CM1860(莱卡公司(Leica))以7μm的厚度产生，粘附在载玻片(武土纯药公司(Muto Pure Chemicals))上，用冷空气风干，并且然后放入密封袋中，并在-80℃下储存。将用于免疫染色的载玻片解冻，用冷空气风干，并且然后用PBS(瓦科纯化工公司)洗涤，浸入1％BSA(西格玛公司)/10％正常驴血清(杰克逊免疫研究实验室)/0.5％Triton X-100(瓦科纯化工公司)/PBS溶液中，并进行一小时的封闭，之后允许抗磷酸化tau抗体AT8(Fujirebio Europe N.V.公司)在常温下反应过夜。用PBS洗涤三次后，允许第二抗体反应一小时。用PBS洗涤三次后，将Prolong Gold抗荧光衰减封片剂(分子探针公司)置于载玻片上并封片，并用LSM700(ZEISS)进行观察。用图像分析软件ImageJ测量海马CA1辐射层AT8阳性信号面积，并计算AT8阳性信号面积针对总面积的比例。
抗体A降低了海马CA1区磷酸化tau的信号(图10)。此结果显示抗体A具有抑制tau转基因小鼠(rTg4510)中tau病理学进展的活性。
参考实例12：通过X射线结晶结构分析对EphA4配体结合结构域(EphA4-LBD)进行
的表位作图
按照以下步骤制备抗体A-Fab。将101.1mg的抗体A溶解于0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，所述缓冲液包含30mM L-半胱氨酸和浓度为15mg/mL的2mM EDTA。在此抗体溶液中，以1/200的量向抗体中添加木瓜蛋白酶(西格玛公司)，并在37℃下酶消化18小时。将抗体A酶消化液用PBS透析，并通过离心去除沉淀(产生的沉淀再溶解于PBS中，并与离心上清混合)。然后，为了去除抗体A-Fab以外的杂质，进行以下步骤。
1)通过蛋白A柱纯化
将酶消化溶液应用于用PBS平衡的2mL ProSep vA高容量(密理博公司)中，并回收通过级分和PBS洗涤级分。
2)采用抗人IgG Fcγ抗体的亲和纯化
根据此琼脂糖的手册，制备了具有与NHS激活的Sepharose 4FF(通用医疗集团)共价结合的抗人IgG Fcγ抗体(杰克逊免疫研究实验室)的亲和柱。将以上1)中回收的溶液充入此亲和柱，并回收其通过溶液和PBS洗涤溶液。
3)凝胶过滤纯化
用超滤膜浓缩以上2)中获得的通过级分。将Superose 12(通用医疗集团)用PBS平衡，应用浓缩的样品并进行分离和纯化。用SDS-PAGE分析一部分分离和纯化的级分，并回收和合并包含高纯度抗体A-Fab的级分。以这种方式纯化的样品被设置为抗体A-Fab。
为了制备抗体A-Fab与抗原EphA4-LBD的复合物，制备了EphA4-LBD(Qin H.等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],283:29473-29484(2008))。混合0.68μmol的EphA4-LBD(200μM，3.4mL)和0.45μmol的抗体A-Fab(300μM，1.5mL)，使EphA4-LBD具有针对抗体A-Fab约为1.5倍的摩尔比。然后，将混合的溶液应用于HILOAD 26/60 Superdex 75制备级(通用医疗集团)，并用色谱缓冲液(25mM Tris/HCl(pH 7.5)，100mM NaCl)洗脱。用SDS-PAGE分析包含复合物的级分，收集具有高纯度的级分并浓缩至约40.8mg/mL，并将其用于结晶。
复合物的结晶是通过坐滴蒸气扩散方法与自动结晶设备Hydra II Plus OneSystem(美捷科技有限公司(Matrix Technologies Corp.,Ltd.))进行。将MRC-2(分子尺寸)用作板。储液的组合物为100mM HEPES(pH 7.5)、10％聚乙二醇8000和8％乙二醇，并将此储液与以上复合物溶液混合，使体积比为1:1以生成结晶液滴。将生成的结晶板在20℃下静置。
在以上条件下结晶后，得到了具有空间群P212121的晶体，晶格常数并且/>对获得的晶体进行了辐射光X射线入射，得到了/>的衍射数据。通过HKL2000(HKL研究公司(HKL ResearchInc.))处理衍射数据，并通过分子取代方法进行相位测定。将包括在CCP4软件套件(Collaborative computational project number 4[协同计算项目编号4],[CCP4]版本6.5.0,Acta Cryst.[晶体学报]D 67:235-242(2011))中的程序PHASER(版本2.5.0,McCoyA.J.等人,J.Appl.Cryst.[应用晶体学杂志]40:658-674(2007))用于分子取代方法。采用EphA4-LBD的结晶结构(PDBID:3CKH)和IgG的Fab区的结晶结构(PDBID:2VXT(L链)和1FGN(H链))作为分子取代方法的搜索模型。用COOT程序(Emsley P.等人,Acta Cryst.[晶体学报]D 60:2126-2132n(2004))构建分子模型，以拟合由测定的相获得的电子密度，并用REFMAC程序(Murshudov G.N.,Acta Cryst.[晶体学报]D 53:240-255(1997))进行结构精化。
通过结构计算(R＝0.212，Rfree＝0.258)，获得了分辨率的复合物的结晶结构。
用计算化学系统MOE 2018.0101(化学计算集团公司(Chemical Computing GroupInc.))中配备的相互作用检测工具分析获得的抗体A-Fab/EphA4-LBD复合物的晶体结构，并鉴定EphA4-LBD上与抗体A-Fab直接接触的氨基酸残基(图11A)。鉴定的氨基酸残基为Glu51、Gly52、Ile59、Gln71、Cys73、Asn74、Val75、Met76、Glu77、Thr104、Arg106、Leu111、Pro112、Met115、Arg162、Met164、Cys191、Ala193和Val195。图11B显示了用Maestro(版本11.0，薛定谔股份有限公司(Schrodinger,LLC))生成的EphA4-LBD的表面结构。其结果是，本发明的诸位发明人得出结论，这些氨基酸残基存在的区域是EphA4-LBD中的抗体A-Fab结合区。
实例1：抗体A的人源化抗体的制备
人源化抗EphA4抗体的制备
设计人源化抗体的可变区。基于抗体A的框架区(FR)的高同源性，在人抗体的FR中，选择IGHV3-33*03(SEQ ID NO.42)和JH6(SEQ ID NO.43)(对于重链)以及IGKV1-17*01(SEQ ID NO.40)和JK4(SEQ ID NO.41)(对于轻链)作为人源化抗体的FR。然后采用小鼠抗体A的3D结构预测模型预测FR中与CDR氨基酸相互作用的氨基酸，这些氨基酸与重链CDR1(SEQ ID NO.44、27、28和29-31)中具有Y32F突变的抗体A的CDR一起移植，并将HK2-42(SEQID NO.45)设计为人源化抗体重链可变区并将L1-8(SEQ ID NO.46)设计为人源化抗体轻链可变区。移植的CDR的氨基酸序列示于表2中，并且核酸序列示于表3中。
采用人IgG2的恒定区(SEQ ID NO.47)作为重链恒定区。采用人Igκ(SEQ IDNO.48)作为轻链恒定区。将包含编码人源化抗体的氨基酸序列的基因序列的表达载体(pcDNA 3.4)用Expi293表达系统(吉布科公司/赛默飞世尔公司)转染到Expi293F细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)中。作为编码人源化抗体的氨基酸序列的基因序列，分别地，采用SEQ ID NO.55中所示的核酸序列作为重链可变区，采用SEQ ID NO.56中所示的核酸序列作为轻链可变区，采用SEQ ID NO.57中所示的核酸序列作为重链恒定区并且采用SEQ IDNO.58中所示的核酸序列作为轻链恒定区。人源化抗体重链全长的氨基酸序列(不包括信号序列)为SEQ ID NO.59中所示的氨基酸序列，轻链全长的氨基酸序列(不包括信号序列)为SEQ ID NO.60中所示的氨基酸序列。编码人源化抗体的重链全长的核酸序列为SEQ IDNO.61中所示的核酸序列，并且编码轻链全长的核酸序列为SEQ ID NO.62中所示的核酸序列。回收上清，并用MabSelectSuRe(通用医疗集团)纯化抗体A的人源化抗体(抗体B)。
[表2]
抗体B的CDR的氨基酸序列
| 名称 | 序列 |
| 重链CDR1 | RFGVH(SEQ ID NO.44) |
| 重链CDR2 | VIWRGGSTDYNAAFMS(SEQ ID NO.27) |
| 重链CDR3 | ESLFGVYYDYGYYSMDY(SEQ ID NO.28) |
| 轻链CDR1 | RASQEISGYLS(SEQ ID NO.29) |
| 轻链CDR2 | AASTLDS(SEQ ID NO.30) |
| 轻链CDR3 | LQYASYPLT(SEQ ID NO.31) |
[表3]
抗体B的CDR的核酸序列
实例2：人源化抗EphA4单克隆抗体针对人EphA4的亲和力
实例1中获得的抗体B针对人EphA4的结合亲和力通过表面等离子体共振(SPR方法)采用Biacore T200(通用医疗集团)测定。首先，抗His抗体(通用医疗集团，28-9950-56)被固定在感测片CM5上。通过采用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶联法固定，采用乙醇胺用于封闭(感测片和固定试剂均来自通用医疗集团)。用固定缓冲液(10mM乙酸钠，pH 4.5)将其稀释至3.5μg/mL，并根据附于Biacore T200的方案固定在感测片上。用运行缓冲液HBS-EP(通用医疗集团，BR-1001-88)稀释人EphA4细胞外区-SEAP-His10，并将溶液送至流动池中120秒进行捕获(捕获量约10RU)。随后，用HBS-EP将抗体B连续稀释至100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6和0nM范围，加入至感测片120秒，依次观察加入时(结合期，120秒)和加入完成后(解离期，600秒)的结合反应曲线。每次观察完成后，加入4MMgCl2(60秒，瓦科纯化工公司)以再生感测片。采用系统附带的BIA评价软件，通过1:1结合模型对得到的结合反应曲线进行拟合分析，计算出针对人EphA4的亲和力(KD＝kd/ka)。
抗体B针对人EphA4的结合亲和力(KD值)为1.34x10-9M(图12)。这表明，抗体B与抗体A(人源化前的抗体)显示了几乎等同的亲和力。
实例3：人源化抗EphA4单克隆抗体在海马神经元中的EphA4裂解增强活性
对于在实例1中获得的抗体B，按照以下步骤，采用海马神经元进行EphA4裂解增强活性的评估。
用抗体B(2.0，6.7和20nM)和γ选择酶抑制药物化合物E(50nM，恩佐生命科学公司)处理接种于96孔培养皿(福尔肯公司)的大鼠海马神经元。二十四小时后，用PBS(瓦科纯化工公司)洗涤，将SDS样品缓冲液(利姆里样品缓冲液(伯乐公司)和5％2-巯基乙醇(伯乐公司))添加以回收的细胞，并将其煮沸5分钟。用该样品进行SDS-PAGE，用抗EphA4单克隆抗体(亚诺法公司)进行蛋白质印迹，定量带的强度，计算EphA4 C末端片段/EphA4全长的值。
抗体B浓度依赖性地增强在海马神经元中的EphA4裂解反应(图13)
实例4：人源化抗EphA4单克隆抗体的人EphA4-人配体结合抑制活性
对于实例1中获得的抗体B，按照以下步骤评估人EphA4与人配体结合的抑制活性。将抗碱性磷酸酶抗体(赛默科技公司)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔中。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.05％Tween20/PBS(赛默科技公司)洗涤三次后，将人EphA4胞外区-SEAP-His蛋白(终浓度10nM)接种到孔中，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将配体和系列稀释的抗体B(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000和3000nM)添加到孔中。应注意生物素化的人肝配蛋白A5-Fc嵌合体(R&D系统公司，终浓度0.7nM)和生物素化人肝配蛋白B3-Fc嵌合体(R&D系统公司，终浓度2.3nM)被用作配体。在室温下孵育一小时并洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(通用医疗集团)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育2-5分钟。将等量的终止溶液(1N H2SO4，瓦科纯化工公司)添加到孔中，并用酶标仪(分子器件公司或珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
抗体B浓度依赖性地抑制人EphA4与人配体的结合，针对人肝配蛋白A5和肝配蛋白B3结合的IC50值分别为约4.9nM和1.6nM。因此，发现抗体B强烈抑制人EphA4与人配体之间的结合，并且显示出与抗体A(人源化前的抗体)几乎等同的抑制活性(图14)。
实例5：人源化抗EphA4单克隆抗体的小鼠EphA4-小鼠配体结合抑制活性
对于实例1中获得的抗体B，按照以下步骤评估小鼠EphA4与小鼠配体结合的抑制活性。将抗碱性磷酸酶抗体(赛默科技公司)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔中。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.02％Tween20/PBS(赛默科技公司)洗涤三次后，将小鼠EphA4细胞外区-SEAP-His蛋白添加到孔中(最终浓度10nM)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将配体和系列稀释的抗体B(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000和3000nM)添加到孔中。应注意生物素化的小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合体(R&D系统公司(R&D Systems)，终浓度6nM)和生物素化小鼠肝配蛋白B2-Fc嵌合体(R&D系统公司，终浓度2.5nM)被用作配体。在室温下孵育一小时并洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(通用医疗集团)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育2分钟。将等量的终止溶液(1N H2SO4，瓦科纯化工公司)添加到孔中，并用酶标仪(分子器件公司或珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
抗体B浓度依赖性地抑制小鼠EphA4与小鼠配体的结合，针对小鼠肝配蛋白A1和肝配蛋白B2结合的IC50值分别为约8.7nM和4.2nM。因此，发现抗体B强烈抑制小鼠EphA4与小鼠配体之间的结合，并且显示出与抗体A(人源化前的抗体)几乎等同的抑制活性(图15)。
实例6：人源化抗EphA4单克隆抗体针对人Eph受体的选择性
与参考实例1中所述的用于制备小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白的方法类似，用来源于组织的总RNA通过RT-PCR扩增编码每个人Eph受体(EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、和EphB6)的信号序列和胞外区的DNA序列，并克隆到含有编码SEAP蛋白和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/生命技术公司)中。然后，将编码每个人Eph受体的信号序列和胞外区、SEAP蛋白和组氨酸标签的DNA序列通过Gateway系统(英杰公司/生命技术公司)的LR反应转移至pcDNA3.1_rfcB载体，以构建表达具有与每个人Eph受体的胞外区融合的SEAP蛋白和His标签的蛋白(称为“Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白”)的载体(称为“Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白表达载体”)。
然后，用Expi293表达系统(吉布科公司/赛默飞世尔公司)将每个人Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白表达载体中的每一种引入Expi293F细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)。孵育(5％CO2，37℃)五天后，回收培养上清，并将其在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清用0.45μm滤器过滤(密理博公司)。
对于实例1中获得的抗体B，按照以下步骤评估人Eph受体的结合活性。
将兔抗6-His抗体(贝斯实验室)涂布到96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.05％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤三次后，将人Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白(终浓度1nM)中的每一种接种到每个孔中，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将人IgG溶液(100μg/mL，三菱药物公司)和抗体B(10μg/mL)添加到孔中，并将其在室温下孵育一小时。添加辣根过氧化物酶标记的驴抗人IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，并在确认适量着色后，添加等量的终止溶液(1NH2SO4，瓦科纯化工公司)到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
发现抗体B与抗体A(人源化前的抗体)类似，在人Eph受体家族中特异性地与人EphA4结合(图16)。
实例7：人源化抗EphA4单克隆抗体针对小鼠Eph受体的选择性
按照根据参考实例1制备EphA4胞外区-Fc-His蛋白的方法，用来源于组织的总RNA通过RT-PCR扩增编码每个小鼠Eph受体(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、和EphB6)的信号序列和胞外区的DNA序列，并克隆到具有编码人IgG1的Fc区和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/生命技术公司)中。然后，将编码小鼠的每个Eph受体(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)的信号序列和胞外区、Fc和组氨酸标签的DNA序列通过Gateway系统(英杰公司/生命技术公司)的LR反应转移至pcDNA 3.1_rfcB载体，以构建小鼠Eph受体胞外区-Fc-His蛋白表达载体中的每一种。在小鼠EphA2胞外区-Fc-His蛋白表达载体的构建中，用来源于组织的总RNA通过RT-PCR扩增编码小鼠EphA2的信号序列和胞外区的DNA序列，并克隆到含有编码Fc和组氨酸标签的DNA序列的pcDNA3.1载体中以构建小鼠EphA2胞外区-Fc-His蛋白表达载体。
然后，用Expi293表达系统(吉布科公司/赛默飞世尔公司)将小鼠Eph受体胞外区-Fc-His蛋白表达载体中的每一种引入Expi293F细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)。培养(5％CO2，37℃，120rpm)5天后，回收培养上清，并将其在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清用0.45μm滤器过滤(密理博公司)。
对于抗体B，按照以下步骤评估小鼠Eph受体的结合活性。
将兔抗6-His抗体(贝斯实验室)涂布到96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.05％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤三次后，将小鼠Eph受体胞外区-Fc-His蛋白(终浓度1nM)中的每一种接种到每个孔中，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将人IgG溶液(100μg/mL，西格玛公司)和抗体B(10μg/mL)添加到孔中，并将其在室温下孵育一小时。添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗人κ轻链抗体(IBL)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，并在确认适量着色后，添加等量的终止溶液(1N H2SO4，瓦科纯化工公司)到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
在小鼠Eph受体家族中，抗体B仅对小鼠EphA4具有特异性结合活性(图17)。
实例8：人源化抗EphA4单克隆抗体针对小鼠、大鼠、猴和人EphA4的反应性
对于抗体B，按照以下步骤评估与各种EphA4的结合活性。
将抗碱性磷酸酶抗体(赛默科技公司)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔中。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.05％Tween20/PBS(赛默科技公司)洗涤三次后，将小鼠、大鼠、猴和人EphA4胞外区-SEAP-His蛋白(终浓度1nM)接种于孔中，并将此在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将人IgG溶液(100μg/mL，三菱药物公司)和抗体B(0、0.00013、0.00064、0.0032、0.016、0.08、0.4、2和10μg/mL)添加到孔中，并将其在室温下孵育一小时。添加辣根过氧化物酶标记的驴抗人IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，并在确认适量着色后，添加等量的终止溶液(1NH2SO4，瓦科纯化工公司)到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
抗体B在所有小鼠、大鼠、猴和人EphA4中具有等同的结合活性(图18)。
实例9：人源化抗EphA4单克隆抗体针对人EphA4胞外区、配体结合结构域、纤连蛋
白III型结构域1、纤连蛋白III型结构域2的反应性
对于实例1中获得的抗体B，按照以下步骤评估与人EphA4中各种结构域的结合活性。
将兔抗6-His抗体(贝斯实验室)涂布到96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1％封闭ACE(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭一小时。用0.02％Tween 20/PBS(Nacalai Tesque公司)洗涤两次后，将人EphA4胞外区-MBP-His蛋白、人EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白、人EphA4纤连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白和人EphA4纤连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白(终浓度10nM)接种于孔中，并将其在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将抗体B(终浓度10nM)添加到孔中，并将其在室温下孵育一小时。添加辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG Fcγ片段抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育一小时。洗涤五次后，将TMB(KPL)溶液添加到孔中，并在确认适量着色后，添加等量的终止溶液(2NH2SO4，瓦科纯化工公司)到孔中。用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
抗体B对人EphA4胞外区(ECD)和配体结合结构域(LBD)具有结合活性(图19)。对纤连蛋白III型结构域1(FN1)和纤连蛋白III型结构域2(FN2)无反应。因此，发现抗体B特异性结合人EphA4胞外区的配体结合结构域。
实例10：人源化抗EphA4单克隆抗体对增加海马神经元中棘突的数目的作用
如在参考实例1(B)中所述制备大鼠海马神经元。采用核转染(龙沙集团)将EGFP基因引入大鼠海马神经元，并接种于含有涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片(松浪玻璃工业)的24孔板(福尔肯公司)中。
按照以下步骤采用大鼠海马神经元进行棘突计数。将接种于24孔板(福尔肯公司)(含有涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片(松浪玻璃工业))中的培养第13天的引入EGFP的大鼠海马神经元用对照抗体(人IgG2；西格玛公司)或抗体B(6.7和20nM)处理24小时。然后将盖玻片转移至2％PFA(瓦科纯化工公司)/4％蔗糖(瓦科纯化工公司)/PBS中，并将其静置20分钟以固定细胞。在去除固定液并用PBS洗涤细胞三次后，添加0.25％Triton X-100(瓦科纯化工公司)/PBS，并进行细胞透化15分钟。去除溶液，将盖玻片转移至2％BSA(西格玛公司)/0.25％Triton X-100/OPTI-MEM(吉布科公司)中，并封闭一小时，然后允许抗GFP抗体(Nacalai Tesque公司)反应1.5小时。去除第一抗体溶液并用PBS洗涤三次后，允许第二抗体反应一小时。去除第二抗体溶液并用PBS洗涤三次后，添加Prolong Gold抗荧光衰减封片剂(分子探针公司)进行封片，并用LSM800(蔡司公司)进行观察。上述实验进行三次，并且对于每次实验，从两个盖玻片中提取神经元，用图像分析软件(Bitplane)计数每个树突上的棘突，并计算每个神经元每10μm的棘突数目。
抗体B增加了海马神经元中的棘突数目(图20)。此结果显示抗体B具有稳定海马神经元中棘突的活性。
实例11：人源化抗EphA4单克隆抗体的人EphA4裂解增强活性
对于实例1中获得的抗体B，按照以下步骤评估对人EphA4的裂解增强活性。
如在参考实例1(B)中所述制备大鼠海马神经元。采用核转染(龙沙集团)将人EphA4-HA蛋白表达载体引入大鼠海马神经元，并接种于涂有聚-L-赖氨酸的96孔培养皿(福尔肯公司)中。用抗体B(6.7、20和67nM)和γ选择酶抑制药物化合物E(50nM，恩佐生命科学公司)处理接种的大鼠海马神经元。大约二十四小时后，用PBS(瓦科纯化工公司)洗涤，将SDS样品缓冲液(利姆里样品缓冲液(伯乐公司)和5％2-巯基乙醇(伯乐公司))添加以回收的细胞，并将其煮沸5分钟。用该样品进行SDS-PAGE，用大鼠抗HA单克隆抗体(罗氏公司(Roche))进行蛋白质印迹，定量带的强度，计算EphA4 C末端片段/EphA4全长的值。
抗体B增强海马神经元中人EphA4裂解反应(图21)。
实例12：针对人源化抗EphA4单克隆抗体对增加海马神经元中棘突的数目的作用，
MMP和ADAM的参与
如在参考实例1(B)中所述制备大鼠海马神经元。采用核转染(龙沙集团)将EGFP基因引入一部分大鼠海马神经元，并接种于含有涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片(松浪玻璃工业)的24孔板(福尔肯公司)中。
按照以下步骤采用大鼠海马神经元进行棘突计数。将接种于24孔板(福尔肯公司)(含有涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片(松浪玻璃工业))中的培养第13天的引入EGFP的大鼠海马神经元用对照抗体(人IgG2；西格玛公司)或抗体B(20nM)以及DMSO(西格玛公司)或MMP和ADAM抑制剂GM6001(2.5μM，MedChemExpress公司)处理24小时。然后将盖玻片转移至2％PFA(瓦科纯化工公司)/4％蔗糖(瓦科纯化工公司)/PBS中，并将其静置20分钟以固定细胞。在去除固定液并用PBS洗涤细胞三次后，添加0.25％Triton X-100(瓦科纯化工公司)/PBS，并进行细胞透化15分钟。去除0.25％Triton X-100/PBS，将盖玻片转移至2％BSA(西格玛公司)/0.25％Triton X-100/OPTI-MEM(吉布科公司)中，并封闭一小时，然后允许抗GFP抗体(Nacalai Tesque公司)反应1.5小时。去除第一抗体溶液并用PBS洗涤三次后，允许第二抗体反应一小时。去除第二抗体溶液并用PBS洗涤三次后，添加Prolong Gold抗荧光衰减封片剂(分子探针公司)进行封片，并用LSM800(蔡司公司)进行观察。上述实验进行三次，并且对于每次实验，从两个盖玻片中提取神经元，用图像分析软件(Bitplane)计数每个树突上的棘突，并计算每个神经元每10μm的棘突数目。
通过用GM6001同时处理，抑制了通过抗体B对海马神经元中棘突数目的增加(图22)。此结果显示抗体B具有经由MMP和ADAM在海马神经元中稳定棘突的活性。
实例13：人源化抗EphA4单克隆抗体对于抑制体内tau磷酸化的作用
按照以下步骤采用tau转基因小鼠(rTg4510)评估抑制体内tau磷酸化的作用。Tau转基因小鼠(rTg4510)从20至26周龄用抗体B以100mg/kg(10mL/kg)的剂量每周皮下施用两次。将PBS(瓦科纯化工公司)以10mL/kg皮下施用于对照组。最后一次施用后3.5天，用2％-2.5％异氟醚吸入麻醉药物(英特威公司)和三种类型麻醉药物(4.0mg/kg的咪达唑仑(安斯泰来制药、0.3mg/kg的美托咪定(日本全药工业株式会社)和5.0mg/kg的Vetorphale(明治制果药业公司))的混合麻醉小鼠，用含有3单位/mL肝素(味之素公司)和1％磷酸酶抑制剂混合物(Nacalai Tesque公司)的PBS(瓦科纯化工公司)在麻醉下进行灌注，并切除小鼠脑半球。在4℃固定收集的脑半球，同时浸入2％的多聚甲醛(TAAB)/0.1M磷酸盐缓冲液(瓦科纯化工公司)中振荡过夜。脑半球被10％蔗糖(瓦科纯化工公司)/0.1M磷酸盐缓冲液(瓦科纯化工公司)并且随后20％蔗糖/0.1M磷酸盐缓冲液(瓦科纯化工公司)取代，并且然后包埋在组织-Tek O.C.T.化合物(樱花精密技术日本公司)/20％蔗糖中并采用液氮冷却的铝块冷冻。用恒冷箱CM1860(莱卡公司)产生7μm厚的脑半球切片。将切片粘附在涂有硅烷的载玻片(武土纯药公司)上，用冷空气风干，并且然后放入密封袋中，并在-80℃下储存。将用于免疫染色的载玻片从-80℃取出，用冷空气风干，并且然后用PBS(瓦科纯化工公司)洗涤，浸入1％BSA(西格玛公司)/10％正常驴血清(杰克逊免疫研究实验室)/0.5％Triton X-100(瓦科纯化工公司)/PBS溶液中，并进行一小时的封闭，之后允许抗磷酸化tau抗体AT8(Fujirebio Europe N.V.公司)在常温下反应过夜。用PBS洗涤三次后，允许第二抗体反应一小时。用PBS洗涤三次后，将Prolong Gold抗荧光衰减封片剂(分子探针公司)置于载玻片上并封片，并用LSM700(ZEISS)进行观察。用图像分析软件Metamorph测量海马CA1辐射层AT8阳性信号面积，并计算AT8阳性信号面积针对总面积的比例。
抗体B降低了海马CA1区磷酸化tau的信号(图23)。此结果显示抗体B具有抑制tau转基因小鼠(rTg4510)中tau病理学进展的活性。
Claims (16)
1.一种抗EphA4抗体，其中
所述抗EphA4抗体包含重链和轻链，并且包含：
(a)由在SEQ ID NO.44中所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；
(b)由在SEQ ID NO.27中所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；
(c)由在SEQ ID NO.28中所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；
(d)由在SEQ ID NO.29中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；
(e)由在SEQ ID NO.30中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；以及
(f)由在SEQ ID NO.31中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗EphA4抗体，其中所述抗EphA4抗体是人源化的。
3.根据权利要求1或2所述的抗EphA4抗体，其中
所述重链的可变区由SEQ ID NO.45中所示的氨基酸序列组成，并且
所述轻链的可变区由SEQ ID NO.46中所示的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1或2所述的抗EphA4抗体，其中
所述重链的恒定区和所述轻链的恒定区包含来源于人抗体的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的抗EphA4抗体，其中
所述重链的恒定区是人IgG的恒定区。
6.根据权利要求5所述的抗EphA4抗体，其中
所述人IgG的恒定区是人IgG2的恒定区。
7.根据权利要求6所述的抗EphA4抗体，其中
所述人IgG2的恒定区包含SEQ ID NO.47中所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求4所述的抗EphA4抗体，其中
所述轻链的恒定区是人Igκ的恒定区。
9.根据权利要求8所述的抗EphA4抗体，其中
所述人Igκ的恒定区包含SEQ ID NO.48中所示的氨基酸序列。
10.一种抗EphA4抗体，其中
所述抗EphA4抗体包含重链和轻链，
所述重链由SEQ ID NO.59中所示的氨基酸序列组成，并且
所述轻链由SEQ ID NO.60中所示的氨基酸序列组成。
11.根据权利要求10所述的抗EphA4抗体，其中
所述重链的C末端赖氨酸缺失。
12.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的抗EphA4抗体。
13.一种载体，其包含根据权利要求12所述的核酸。
14.一种宿主细胞，其包含根据权利要求13所述的载体。
15.一种产生抗EphA4抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求14所述的宿主细胞的步骤。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的抗EphA4抗体。
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