CN113840842A

CN113840842A - 利用双特异性抗EGFR/c-Met抗体的联合疗法和患者分层

Info

Publication number: CN113840842A
Application number: CN202080017112.1A
Authority: CN
Inventors: S·摩尔; S·维贾亚勒格文
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2021-12-24
Also published as: WO2020174370A2; MX2021010265A; JOP20210233A1; US20230130600A1; US12215161B2; CA3131654A1; WO2020174370A3; PH12021552030A1; EP3931224A4; JP2022521610A; EP3931224A2; AU2020229467A1; BR112021016149A2; JP2024153659A; IL285718A; JP7703448B2; KR20210132117A; JP2025084739A; MA55089A; US20200270351A1

Abstract

本发明涉及利用双特异性抗EGFR/c‑Met抗体的联合疗法和患者分层。

Description

利用双特异性抗EGFR/c-Met抗体的联合疗法和患者分层

技术领域

本发明涉及利用双特异性抗EGFR/c-Met抗体的联合疗法和患者分层。

序列表

本申请包含经由EFS-Web提交的序列表，其全部内容以引用方式并入本文。2020年2月13日创建的ASCII文本文件命名为JBI6051WOPCT1ST25.txt，大小为19千字节。

背景技术

EGFR和c-Met两者在癌症中的单独作用已充分确立，使这些靶标对联合疗法具有吸引力。两种受体通过相同的存活和抗凋亡途径(ERK和AKT)发信号；因此，联合抑制这一对可限制补偿路径激活的可能性，从而改善总体功效。

复发或对现有治疗剂的抗性是常见的。因此，需要改进的治疗剂或治疗剂和患者分层生物标志物的组合来开发对疾病诸如EGFR或c-Met阳性癌症更有效的治疗。

发明内容

本公开提供了一种治疗患有表达EGFR或c-Met的癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者联合施用治疗有效量的分离的双特异性抗表皮生长因子受体(EGFR)/肝细胞生长因子受体(c-Met)抗体与增强所述受试者的巨噬细胞活性的药剂。

本公开还提供了一种诊断和治疗对用双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应的患有表达EGFR或c-Met的癌症的受试者的方法，其包括：提供来自所述受试者的生物样本；测量来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平；当来自所述生物样本的所述巨噬细胞或单核细胞水平高于阈值时，诊断对用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应的患有所述表达EGFR或c-Met的癌症的所述受试者；以及向被诊断为对用所述抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应的所述受试者施用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体或提供所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体的施用。

本公开还提供了一种用双特异性抗EGFR/c-Met抗体治疗疑似患有或患有表达EGFR或c-Met的癌症的受试者的方法，其包括：确定所述受试者具有高于阈值的巨噬细胞或单核细胞水平；以及向被确定为具有高于所述阈值的巨噬细胞或单核细胞水平的所述受试者施用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体或提供所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体的施用。

本公开还提供了一种预测患有表达EGFR或c-Met的癌症的受试者对用双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗的响应的方法，其包括提供来自所述受试者的生物样本；测量来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平；当来自所述生物样本的所述巨噬细胞或单核细胞水平高于阈值时，将所述受试者预测为响应者。

本公开还提供了一种治疗对用双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应的患有表达EGFR或c-Met的癌症的受试者的方法，其包括：提供来自所述受试者的生物样本；测量来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平；当来自所述生物样本的所述巨噬细胞或单核细胞水平高于阈值时，用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体治疗所述受试者。

本公开还提供一种确定患有表达EGFR或c-Met的癌症的受试者是否对用双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应并且决定是否治疗所述受试者的方法，其包括：提供来自所述受试者的生物样本；测量来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平；当来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平高于阈值时，将患有所述表达EGFR或c-Met的癌症的所述受试者诊断为对用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应，或者当来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平低于所述阈值时，将患有所述表达EGFR或c-Met的癌症的所述受试者诊断为对用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗没有响应；以及向被诊断为对用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应的所述受试者施用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体，或者避免向被诊断为对用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗没有响应的所述受试者施用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体。

附图说明

图1示出了在存在PBMC的情况下在指定的JNJ-372浓度下在培养物中长达120小时内JNJ-372介导的对NucLight Red标记的NCI-H1975细胞的增殖的抑制，如使用NucLightRed细胞计数/mm²所测量的。

图2示出了在不存在PBMC的情况下在指定的JNJ-372浓度下在培养物中长达120小时内JNJ-372介导的对NucLight Red标记的NCI-H1975细胞的增殖的作用，如使用NucLightRed细胞计数/mm²所测量的。

图3示出了在存在PBMC的情况下JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma、JNJ-372.NF或同种型对照介导的对NucLight Red标记的NCI-H1975细胞的增殖的抑制。在不存在PBMC的情况下或通过同种型对照或通过Fc效应子沉默JNJ-372.IgG2sigma不抑制增殖。在存在PBMC的情况下培养的JNJ-372.NF部分地抑制增殖。Iso：同种型对照；IgG2s：JNJ-372.IgG2sigma；EGFRxMet NF：JNJ-372.NF。

图4示出了在存在PBMC的情况下在培养48小时后JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma、JNJ-372.NF或同种型对照介导的NucLight Red标记的NCI-H1975细胞的凋亡。在不存在PBMC的情况下或通过同种型对照或Fc效应子沉默JNJ372.IgG2sigma不诱导凋亡。在存在PBMC的情况下培养的JNJ-372.NF部分地介导凋亡。Iso：同种型对照；IgG2s：JNJ-372.IgG2sigma；EGFRxMet NF：JNJ-372.NF。

图5示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其示出了用同种型对照或JNJ-372处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养4、24、48或72小时的NCI-H1975样本中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白质，如图所示。PBMC的存在增强了JNJ-372介导的EGFR和c-Met蛋白的下调以及pEGFR的抑制。

图6示出了用同种型对照或JNJ-372处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养4、24、48或72小时的NCI-H1975样本中的EGFR的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)，如图所示。PBMC的存在增强了JNJ-372介导的EGFR的下调。

图7示出了用同种型对照或JNJ-372处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养4、24、48或72小时的NCI-H1975样本中的pEGFR(pY1173)的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)，如图所示。PBMC的存在增强了JNJ-372介导的pEGFR的下调。

图8示出了用同种型对照或JNJ-372处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养4、24、48或72小时的NCI-H1975样本中的c-Met的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)，如图所示。PBMC的存在增强了JNJ-372介导的c-Met的下调。

图9示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其示出了用同种型对照或JNJ-372处理并在存在或不存在来自七个不同供体的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975样本中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白质，如图所示。

图10示出了用同种型对照或JNJ-372处理并在存在或不存在来自七个不同供体的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975样本中的EGFR的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)，如图所示。

图11示出了用同种型对照或JNJ-372处理并在存在或不存在来自七个不同供体的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975样本中的pEGFR(pY1173)的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)，如图所示。

图12示出了用同种型对照或JNJ-372处理并在存在或不存在来自七个不同供体的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975样本中的c-Met的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)，如图所示。

图13示出了每个供体的PBMC样本中的单核细胞百分比(％)与在存在PBMC的情况下JNJ-372对EGFR抑制的变化百分比(％)(相对于无PBMC的相对倍数变化)之间的相关性，如通过NCI-H1975细胞中EGFR蛋白质的量(归一化为上样对照肌动蛋白)所测量。

图14示出了每个供体的PBMC样本中的单核细胞百分比(％)与在存在PBMC的情况下JNJ-372对pEGFR Y1173抑制的变化百分比(％)(相对于无PBMC的相对倍数变化)之间的相关性，如通过NCI-H1975细胞中pEGFR蛋白质的量(归一化为上样对照肌动蛋白)所测量。

图15示出了每个供体的PBMC样本中的单核细胞百分比(％)与在存在PBMC的情况下JNJ-372对c-Met抑制的变化百分比(％)(相对于无PBMC的相对倍数变化)之间的相关性，如通过NCI-H1975细胞中c-Met蛋白质的量(归一化为上样对照肌动蛋白)所测量。

图16示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其检测了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在来自一个供体的NK细胞耗尽的PBMC或单核细胞耗尽的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975细胞中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白水平，如图所示。

图17示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在来自一个供体的NK细胞耗尽的PBMC或单核细胞耗尽的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975细胞中的EGFR的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)。

图18示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在来自一个供体的NK细胞耗尽的PBMC或单核细胞耗尽的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975中的pEGFR(pY1173)的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)。

图19示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在来自一个供体的NK细胞耗尽的PBMC或单核细胞耗尽的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975中的c-Met的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)。

图20示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其检测了在存在或不存在来自同一供体的PBMC、分离的NK细胞、分离的单核细胞、MCSF分化的M1巨噬细胞或GMCSF分化的M1巨噬细胞的情况下在用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理48小时的NCI-H1975细胞中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白水平，如图所示。

图21示出了在存在或不存在从同一供体分离的PBMC、单核细胞、MCSF分化的M1巨噬细胞或GMCSF分化的M1巨噬细胞的情况下在用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理48小时的NCI-H1975细胞中的EGFR的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)。

图22示出了在存在或不存在从同一供体分离的PBMC、单核细胞、MCSF分化的M1巨噬细胞或GMCSF分化的M1巨噬细胞的情况下在用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理48小时的NCI-H1975细胞中的pEGFR(pY1173)的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)。

图23示出了在存在或不存在从同一供体分离的PBMC、单核细胞、MCSF分化的M1巨噬细胞或GMCSF分化的M1巨噬细胞的情况下在用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理48小时的NCI-H1975细胞中的c-Met的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)。

图24示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其检测了用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理并在存在M1巨噬细胞(M1)或M2a巨噬细胞(M2a)的情况下培养的NCI-H1975细胞中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白水平，如图所示。ISO：同种型对照，372：JNJ-372，IgG2sigma：JNJ-372.IgG2sigma。

图25示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其检测了用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理并在存在或不存在M2c巨噬细胞(M2c)的情况下培养48小时的NCI-H1975细胞中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白蛋白质水平，如图所示。ISO：同种型对照，372：JNJ-372，IgG2sigma：JNJ-372.IgG2sigma。

图26示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其检测了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养的SNU-5细胞中的EGFR、c-Met、pEGFR和pMet蛋白水平，如图所示。

图27示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养48小时的SNU-5细胞中的EGFR的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)，如图所示。

图28示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养48小时的SNU-5细胞中的pEGFR(pY1173)的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)，如图所示。

图29示出了在存在或不存在JNJ-372、同种型对照或PBMC的情况下培养48小时的SNU-5细胞培养样本中的c-Met的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)，如图所示。

图30示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养48小时的SNU-5细胞中的pMet(pY1234/1235)的相对量(归一化为上样对照肌动蛋白)，如图所示。

图31示出了用10mg/kg同种型对照(n＝8)、JNJ-372(n＝8)或JNJ-372.IgG2sigma(图中的IgG2σ)(n＝8)处理皮下注射H1975细胞系的异种移植肿瘤3周(BIW)的肿瘤体积。在第24天计算％TGI。

图32示出了用媒介物(PBS)(n＝8)、5mg/kg JNJ-372(n＝8)或JNJ-372.IgG2sigma(图中的IgG2σ)(n＝8)处理皮下注射SNU5细胞系的异种移植肿瘤3周(BIW)的肿瘤体积。在第34天计算％TGI。所有数据均表示为每个处理组内的平均值±S.E.M。

图33示出了在存在从同一供体分离的PBMC、NK细胞或单核细胞的情况下分别以25:1、5:1和5:1的E:T比率用JNJ-372处理加载有BATDA的H1975细胞2小时，并通过铕释放法测量ADCC裂解。

图34示出了肿瘤相关的巨噬细胞的数量，其使用在两个剂量的10mg/kg同种型、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma处理(n＝5只小鼠/处理)后24小时分离的H1975肿瘤样本的多色流式细胞术分析来检查用抗小鼠CSF1R抗体耗尽后肿瘤内巨噬细胞(CD45+CD11b+Ly6G-Ly6C-F4/80+)的百分比(％)。

图35示出了联合抗小鼠CSF1R或其同种型对照(每周三次)用10mg/kg JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型(n＝8只小鼠/处理组)处理3周(BIW)以耗尽巨噬细胞的皮下注射H1975细胞系的异种移植肿瘤的肿瘤体积。在第21天计算％TGI，并且在第17天通过双因素方差分析计算***，P值<0.0001(当研究中所有组均具有所有小鼠时)。

图36示出了柱状图，其表示在存在PBMC的情况下在用JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma处理4小时后由H1975细胞产生的所示趋化因子和细胞因子相对于同种型的相对倍数变化。

图37示出了柱状图，其表示在存在PBMC的情况下在用JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma处理72小时后由H1975细胞产生的所示趋化因子和细胞因子相对于同种型的相对倍数变化。

图38示出了在存在PBMC(E:T＝10:1)(从左侧开始前5个柱)、NK细胞(从左侧开始第6-10个柱)或单核细胞(从右侧开始前5个柱)的情况下以5:1的效应子:靶标比率(E:T＝5:1)用所示剂量范围的JNJ-372处理4小时的H1975细胞中MCP-1产量的相对倍数相对于未处理的变化。

图39示出了来自基于MSD的细胞因子分析的剂量响应曲线，该分析测量了在存在PBMC、NK细胞或单核细胞的情况下用JNJ-372处理H1975细胞后MCP-3水平的倍数变化(与未处理对照相比)。灰色虚线表示未处理对照的值。

图40示出了在存在PBMC(E:T＝10:1)(从左侧开始前5个柱)、NK细胞(从左侧开始第6-10个柱)或单核细胞(从右侧开始前5个柱)的情况下以5:1的效应子:靶标比率(E:T＝5:1)用所示剂量范围的JNJ-372处理4小时的H1975细胞中IL1-RA(图中所示的ILRA)产量的相对倍数相对于未处理的变化。

图41示出了来自基于MSD的细胞因子分析的剂量响应曲线，该分析测量了在存在PBMC、NK细胞或单核细胞的情况下用JNJ-372处理H1975细胞后MIP-1β水平的倍数变化(与未处理的对照相比)。灰色虚线表示未处理对照的值。

图42示出了来自基于MSD的细胞因子分析的剂量响应曲线，该分析测量了在存在M1巨噬细胞(M1 macs)的情况下用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma(图中的IgG2σ)或同种型对照处理H1975细胞后MIP-1β水平的倍数变化(与未处理对照相比)。灰色虚线表示未处理对照的值。

图43示出了来自基于MSD的细胞因子分析的剂量响应曲线，该分析测量了在存在M2巨噬细胞(M2 macs)的情况下用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma(图中的IgG2σ)或同种型对照处理H1975细胞后MIP-1β水平的倍数变化(与未处理对照相比)。灰色虚线表示未处理对照的值。

图44示出了来自基于MSD的细胞因子分析的剂量响应曲线，该分析测量了在存在M1巨噬细胞(M1 macs)的情况下用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma(图中的IgG2σ)或同种型对照处理H1975细胞后MIP-1α水平的倍数变化(与未处理对照相比)。灰色虚线表示未处理对照的值。

图45示出了来自基于MSD的细胞因子分析的剂量响应曲线，该分析测量了在存在M2巨噬细胞(M2 macs)的情况下用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma(图中的IgG2σ)或同种型对照处理H1975细胞后MIP-1α水平的倍数变化(与未处理对照相比)。灰色虚线表示未处理对照的值。

图46示出了来自基于流式细胞术的胞啃作用(trogocytosis)测定的剂量响应曲线，该测定测量了在用标记的同种型、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma(图中的IgG2σ)调理H1975细胞3小时后CD11b阳性M1巨噬细胞内AF488标记的百分比(％)。用JNJ-372而不是同种型或IgG2处理诱导了M1巨噬细胞的剂量依赖性胞啃作用。

图47示出了来自基于流式细胞术的胞啃作用测定的剂量响应曲线，该测定测量了在用标记的同种型、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma(图中的IgG2σ)调理H1975细胞3小时后CD11b阳性M2巨噬细胞内AF488标记的百分比(％)。用JNJ-372而不是同种型或IgG2处理诱导了M2巨噬细胞的剂量依赖性胞啃作用。

图48示出了来自高含量共聚焦显微镜检查的代表性图像，其示出了与用AF647标记的JNJ-372(上图)或JNJ-372.IgG2sigma(下图)调理11分钟或44分钟后的H1975NucLight Red细胞的共培养物(E:T比率＝5:1)中用FITC-CD11b(标记巨噬细胞质膜)和Hoechst(标记细胞核)标记的M2巨噬细胞的胞啃作用。白色箭头示出了通过AF647标记的JNJ-372抗体从靶细胞转移到M2巨噬细胞所测量的吞噬事件。JNJ-372.IgG2sigma没有明显的胞啃作用。比例尺＝20μm。M：巨噬细胞；T：H1975细胞。

图49(WOPCT1灰度图)示出了来自高含量共聚焦显微镜检查的代表性图像，其示出了与用AF647标记的JNJ-372(上图)或JNJ-372.IgG2sigma(下图)调理77分钟或110分钟后的H1975 NucLight Red细胞的共培养物(E:T比率＝5:1)中用FITC-CD11b(标记巨噬细胞质膜)和Hoechst(标记细胞核)标记的M2巨噬细胞的胞啃作用。白色箭头示出了通过AF647标记的JNJ-372抗体从靶细胞转移到M2巨噬细胞所测量的吞噬事件。JNJ-372.IgG2sigma没有明显的胞啃作用。比例尺＝20μm。M：巨噬细胞；T：H1975细胞。

具体实施方式

定义

本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。

应当理解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。

虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。

当提供一个列表时，除非另行指出，否则应当理解，该列表中的每个单独元素和该列表的每种组合都是单独的实施方案。例如，作为“A、B或C”呈现的实施方案的列表将被理解为包括实施方案“A”、“B”、“C”、“A或B”、“A或C”、“B或C”或者“A、B或C”。

如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。

多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

过渡术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”旨在暗示它们在专利用语中的公认含义；即，(i)“包括”与“包含”、“含有”或“其特征在于”同义，并且是包括端值在内或末端开放的，并且不排除附加的、未列出的要素或方法步骤；(ii)“由……组成”排除权利要求书未指定的任何要素、步骤或成分；以及(iii)“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤“以及本质上不影响受权利要求书保护的发明的基本及新颖特征的材料或步骤”。还提供了以短语“包括”(或其等同形式)描述的实施方案，如以“由……组成”和“基本上由……组成”独立描述的那些实施方案。

“共同施用”、“与……一起施用”、“与……联合施用”、“与……联合”等涵盖向单个患者施用所选择的治疗剂或药物，并且旨在包括其中通过相同或不同的施用途径或者在相同或不同的时间施用治疗剂或药物的治疗方案。

“分离的”是指已与分子在其中产生的系统(诸如重组细胞)的其他组分基本上分开和/或从这些组分中纯化出来的分子(诸如合成多核苷酸、多肽、载体或病毒)的同质群体，以及已经受至少一个纯化或分离步骤的蛋白质的同质群体。“分离的”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的分子，并且涵盖分离至更高纯度(诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度)的分子。

疾病或障碍诸如癌症的“治疗”是指实现以下项中的一者或多者：降低障碍的严重程度和/或减少其持续时间，抑制所治疗障碍的特征性症状的恶化，限制或防止先前患有障碍的受试者中障碍的复发，或者限制或防止先前有障碍的症状的受试者中症状的复发。

疾病或障碍的“预防”意指预防障碍在受试者中发生。

“诊断”是指确定受试者是否患有给定疾病或病症或者是否可能在将来发展成给定疾病或病症或者是否可能响应先前诊断的疾病或病症的治疗(即根据响应治疗的可能性对患者群体进行分层)的方法。诊断通常由医师基于待诊断的疾病的一般指南或指示受试者可能响应特定治疗的其他标准来执行。

“响应”、“响应性”或“可能响应”是指任何类型的改善或阳性响应，诸如一种或多种症状的减轻或改善、疾病程度的减弱、疾病状态的稳定(即，未恶化)、疾病传播的预防、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和以及缓解(不论是部分缓解还是全部缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。

“新诊断的”是指已被诊断患有表达EGFR或c-Met的癌症但尚未接受多发性骨髓瘤治疗的受试者。

“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效的治疗剂或治疗剂的组合的示例性指标包括例如改善患者的健康。

“难治性”是指对治疗没有响应的疾病。难治性疾病可在治疗之前或开始时对治疗具有抗性，或者难治性疾病可在治疗期间变得具有抗性。

“复发”是指在先前用治疗剂治疗后改善一段时间之后疾病或疾病的迹象和症状的再现。

“受试者”包括任何人或非人动物。“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于该值是如何测量或确定的，即测量系统的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其他地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内、或多至5％的范围(无论哪个更大)。

“癌症”是指趋于以不受控制的方式增殖(并且在一些情况下，转移(扩散)到患者身体的其他区域)的细胞的异常生长。

“表达EGFR或c-Met的癌症”是指具有可检测的EGFR或c-Met表达或者具有EGFR或c-Met突变或扩增的癌症。EGFR或c-Met表达、扩增和突变状态可以使用已知方法检测，诸如测序、荧光原位杂交、免疫组织化学、流式细胞术或蛋白质印迹。

“表皮生长因子受体”或“EGFR”指具有GenBank登录号NP_005219中所示的氨基酸序列的人EGFR(也称为HER1或ErbB1(Ullrich等人,Nature 309:418-425,1984))，以及其天然存在的变体。

如本文所用，“肝细胞生长因子受体”或“c-Met”是指具有GenBank登录号NP_001120972中所示的氨基酸序列的人c-Met及其天然变体。

“双特异性抗EGFR/c-Met抗体”或“双特异性EGFR/c-Met抗体”是指具有特异性结合EGFR的第一结构域和特异性结合c-Met的第二结构域的双特异性抗体。特异性结合EGFR和c-Met的结构域通常为VH/VL对，并且双特异性抗EGFR/c-Met抗体在结合EGFR和c-Met方面是一价的。

“特异性结合”或“结合”是指抗体以比对其他抗原更高的亲和力结合抗原或抗原内的表位。通常，抗体以约5×10^-8M或更小(例如，约1×10^-9M或更小、约1×10^-10M或更小、约1×10^-11M或更小或者约1×10^-12M或更小)的平衡解离常数(K_D)结合抗原或抗原内的表位，通常K_D比抗体结合非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的K_D小至少一百倍。解离常数可使用已知方案来测量。然而，结合至抗原或抗原内的表位的抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp)的相同抗原具有交叉反应性。单特异性抗体结合一个抗原或一个表位，而双特异性抗体结合两个不同的抗原或两个不同的表位。

“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片段，多特异性抗体诸如双特异性、三特异性或四特异性抗体，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体，结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH区和VL区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(CDR)并间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

“互补决定区”(CDR)是结合抗原的抗体区域。CDR可使用各种描绘来定义，诸如Kabat(Wu等人，(1970)J Exp Med 132:211-50)(Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)、Chothia(Chothia等人，(1987)J Mol Biol 196:901-17)、IMGT(Lefranc等人，(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77)和AbM(Martin和Thornton，(1996)J Bmol Biol 263:800-15)。描述了各种描绘和可变区编号之间的对应关系(参见例如Lefranc等人，(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77；Honegger和Pluckthun，(2001)J MolBiol 309:657-70；国际免疫遗传学(IMGT)数据库；Web资源，http://www_imgt_org)。可用程序(诸如UCL Business PLC的abYsis)可用于描绘CDR。除非说明书中另有明确地说明，否则如本文所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括由任何上述方法(Kabat、Chothia、IMGT或AbM)定义的CDR。

免疫球蛋白可根据重链恒定结构域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。

“抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子的结合抗原的部分。抗原结合片段可以是合成的、可酶促获得的或经遗传工程改造的多肽，并且含有VH、VL、VH和VL、Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段、由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)、鲨鱼可变IgNAR结构域、驼峰化VH结构域、由模拟抗体的CDR诸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3以及LCDR1、LCDR2和/或LCDR3的氨基酸残基组成的最小识别单元。VH和VL结构域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH和VL结构域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL结构域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804和WO1992/01047中所述。

“单克隆抗体”是指从抗体分子的基本上同质的群体获得的抗体，即，除了可能熟知的改变诸如从抗体重链移除C端赖氨酸或翻译后修饰诸如氨基酸异构化或脱酰胺、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，诸如双特异性的、单价的、二价的或多价的。

“人源化抗体”是指其中至少一个CDR来源于非人物种并且至少一个框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含置换，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。

“人抗体”是指当施用于人受试者时被优化以具有最小限度的免疫应答的抗体。人抗体的可变区来源于人免疫球蛋白序列。如果人抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也来源于人免疫球蛋白序列。如果人抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统获得，则该人抗体包含“来源于”人起源序列的重链可变区和轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。由于用于获得人抗体和人免疫球蛋白基因座的系统之间的差异，体细胞突变的引入或有意将置换引入框架或CDR中或两者，因此“人抗体”与在人中表达的免疫球蛋白相比通常包含氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可包含由人框架序列分析得到的共有框架序列(例如Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296:57-86中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如Shi等人，(2010)J Mol Biol397:385-96和国际专利公开WO2009/085462中所述)。“人抗体”的定义中不包括至少一个CDR来源于非人物种的抗体。

“重组体”是指当将来自不同来源的片段连接以产生重组DNA、抗体或蛋白质时，通过重组手段制备、表达、形成或分离的DNA、抗体和其他蛋白质。

“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的抗体。双特异性抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pantroglodytes))的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。

“多特异性”是指特异性结合两个或更多个不同抗原或者同一抗原内的两个或更多个不同表位的抗体。多特异性抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如猕猴或黑猩猩)的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。

“巨噬细胞”表示骨髓来源的细胞。巨噬细胞是大型白血细胞，主要出现在结缔组织中和血流中或驻留在组织或肿瘤微环境中。它们通过吞噬作用摄取外来颗粒和传染性微生物，并且具有抗原呈递能力。来源于前体的未激活巨噬细胞根据局部组织环境经历特异性分化。它们响应于组织(诸如受损细胞、激活淋巴细胞或微生物产物)内的环境线索，以分化成不同的功能表型。例如，血液中的单核细胞可以在炎症或侵害期间进入组织，并且根据局部微环境极化为M1或M2表型。M1巨噬细胞表型的特征在于产生高水平的促炎细胞因子、能够介导对病原体的抗性、杀微生物特性强、产生较高的反应性氮和氧中间体、促进Th1应答以及杀死病原体和肿瘤细胞。相比之下，M2巨噬细胞的特征在于其参与寄生虫控制、组织重构、免疫调节、肿瘤促进和有效的吞噬活性。M2巨噬细胞进一步细分为四种不同的亚型，称为M2a、M2b、M2c和M2d。“巨噬细胞”包括所有巨噬细胞亚型。

“单核细胞”是指属于参与一线防御机制的白血细胞类型的CD14⁺CD34^-单核白细胞，并且被认为能够分化成树突状细胞或巨噬细胞前体。单核细胞通常在血液系统中移动。响应于外部刺激信号，单核细胞分泌许多免疫调控细胞因子，移动到组织中的感染部位或肿瘤部位，并且分化成巨噬细胞。具体地，单核细胞表达升高水平的CD14表面抗原标志物，并且可表达至少一种选自CD64、CD93、CD180、CD328、CD329或花生凝集素蛋白(PNA)的生物标志物。

“增强”或“诱导”是指与对照相比时巨噬细胞的一种或多种功能或活性增强超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或者以统计学显著的方式增强(例如，在存在或不存在增强巨噬细胞活性的药剂的情况下增强)。

“增强巨噬细胞活性”是指一种或多种巨噬细胞活性的增强，诱导单核细胞的表型变化和/或单核细胞到巨噬细胞的巨噬细胞分化，或者激活未激活的巨噬细胞。

“巨噬细胞活性”是指任何巨噬细胞功能，诸如吞噬作用、抗原呈递、IL-12、IL-1、TNFα的产生或者炎性趋化因子(诸如CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL3、CCL4、CCL11、CCL17、CCL22)的产生。

“增强巨噬细胞活性的药剂”可以是小分子、肽、低聚肽、多肽、蛋白质、抗体、合成结合分子、适体、RNA分子、DNA分子、低聚物、聚合物、脂质或脂质体。增强巨噬细胞功能的示例性药剂包括细胞因子、趋化因子、模式识别受体配体、激素、肾上腺素能和胆碱能激动剂、脂肪酸、磷脂、免疫球蛋白或其部分、免疫球蛋白的Fc结构域、脂多糖(LPS)、toll样受体(TLR)配体、组胺和过氧化物酶体增殖物激活的受体配体。

“胞啃作用”是指以细胞膜的一部分从供体细胞转移到受体细胞为特征的过程。典型的受体细胞包括巨噬细胞和单核细胞。另外的受体细胞包括NK细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞和中性粒细胞。胞啃作用介导的细胞膜的一部分的转移可包括膜蛋白(例如EGFR或c-Met)或抗体-抗原复合物(其中抗体与细胞表面分子结合)的转移。抗体介导的胞啃作用可经由抗体的Fc部分与受体细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)结合而发生。

“抗EGFR/c-Met抗体介导的胞啃作用”是指由与供体细胞膜EGFR和/或c-Met结合的抗EGFR/c-Met抗体介导的细胞膜的包含EGFR和/或c-Met的部分从供体细胞到受体细胞的胞啃作用。

“阈值”是指为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者群体的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第30百分位数值或以上的巨噬细胞或单核细胞水平。

“激动剂”是指当与细胞蛋白质结合时诱导由蛋白质的天然配体诱导的至少一种反应或活性的分子。当至少一种反应或活性被诱导的程度比不存在激动剂(例如，阴性对照)时诱导的至少一种反应或活性高至少约20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时，或当与不存在激动剂时的诱导相比诱导在统计学上是显著的时，所述分子是激动剂。

“拮抗剂”或“抑制剂”是指当与细胞蛋白质结合时抑制由蛋白质的天然配体诱导的至少一种反应或活性的分子。当至少一种反应或活性被抑制的程度比不存在拮抗剂(例如，阴性对照)时抑制的至少一种反应或活性多至少约20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时，或当与不存在拮抗剂时的抑制相比抑制在统计学上是显著的时，所述分子是拮抗剂。

“PD-(L)1轴抑制剂”是指抑制PD-1下游信号传导的分子。PD-(L)1轴抑制剂可以是结合PD-1、PD-L1或PD-L2的分子。

“生物样本”是指从受试者分离的类似流体、细胞或组织的集合，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本是生物流体，诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜液、心包液、腹膜液、腹腔液和其他体腔液、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液(例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等)、组织活检物、肿瘤组织活检物、肿瘤组织样本、细针抽吸物、手术切除组织、器官培养物或细胞培养物。

如本申请中所用，“低岩藻糖”或“低岩藻糖含量”是指岩藻糖含量在约1％-15％之间的抗体。

如本文所用，“正常岩藻糖”或“正常岩藻糖含量”是指岩藻糖含量约超过50％、通常约超过80％或超过85％的抗体。

本公开的方法

JNJ-61186372(JNJ-372)是美国专利9,593,164中描述的一种IgG1抗EGFR/c-Met双特异性抗体。早期的研究表明，JNJ-372通过三种不同的机制抑制肿瘤生长和进展：通过阻断配体与每种受体结合来抑制配体诱导的激活，通过降解来使受体失活，以及通过ADCC和ADCP进行Fc效应子介导的对表达EGFR-和c-Met-的肿瘤的杀伤(Moores等人,CancerResearch76(13),2016；2016年5月23日在线公布；DOI:10.1158/0008-5472)。

本发明至少部分地基于如下令人惊讶的发现：JNJ-372 Fc相互作用不仅介导ADCC和ADCP，而且还增强JNJ-372介导的对EGFR/c-Met信号传导的抑制，并且单核细胞或巨噬细胞对于通过胞啃作用进行JNJ-372介导的抗肿瘤作用是充分且必需的。

不希望受任何理论的束缚，基于本文所公开的令人惊讶的结果，可预期患者血液中的单核细胞水平可能与其肿瘤中的巨噬细胞水平正相关，这可预测对JNJ-372的更好响应。类似地，可预期通过IHC或免疫基因标记检测的巨噬细胞水平升高或者FcγRI或FcγRIIIa水平升高的肿瘤组织样本将通过提供更多的免疫细胞相互作用而更好地响应JNJ-372。另外，基于本文所述的结果，可预期增强与JNJ-372联合使用的巨噬细胞活性的处理将增加JNJ-372的总体功效。例如，用GM-CSF处理将驱动循环单核细胞分化成肿瘤相关的巨噬细胞，这可增加JNJ-372功效。用抗CD47疗法处理可阻断巨噬细胞的负抑制，从而激活它们增强JNJ-372活性。类似地，抑制PD-(L)1轴、抑制HDAC或使CD11b激动可转移肿瘤相关的巨噬细胞的极化，使得它们更具活性，因而将与JNJ-372处理协同作用以增强肿瘤杀伤。

这种新机制的确定为基于患者在血液或肿瘤样本中的相对或绝对单核细胞和/或巨噬细胞量来选择可能对JNJ-372更具响应性的患者进行治疗提供了基础，并为与JNJ-372联合使用增强巨噬细胞活性的分子的联合治疗方法提供了基础。

本公开提供了一种治疗患有表达EGFR或c-Met的癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者联合施用治疗有效量的分离的双特异性表皮生长因子受体(EGFR)/肝细胞生长因子受体(c-Met)抗体与增强所述受试者的巨噬细胞活性的药剂。

巨噬细胞或单核细胞的“水平”可以是定性的(例如，存在或不存在)或定量的(例如，绝对细胞数、相对数、来自总细胞计数的百分比(％)或视野中阳性细胞％)。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞不存在于生物样本中。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平高于在来自健康受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的平均值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第30百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第35百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第40百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第45百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第50百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第60百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第65百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第70百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第75百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第80百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第85百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第90百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第95百分位数值。在一些实施方案中，巨噬细胞或单核细胞的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的约第100百分位数值。

还可相对于来自健康受试者的生物样本中巨噬细胞或单核细胞的水平来比较患有表达EGFR或c-Met的癌症的受试者中巨噬细胞或单核细胞的水平。当与来自健康受试者的生物样本中巨噬细胞或单核细胞的水平相比时，巨噬细胞或单核细胞的水平升高可例如为约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍或约10倍。

可使用免疫组织化学，分别使用CD68、iNOS(诱导型一氧化氮合酶)和CD163作为巨噬细胞(一般为M1巨噬细胞或M2巨噬细胞)的标志物，并且评估阳性染色面积的百分比并与非肿瘤组织进行比较，从例如得自患有表达EGFR或c-Met的肿瘤的受试者的肿瘤组织活检物中鉴定巨噬细胞(参见例如Almatoodi等人，Cancer Micreoenvironment 9:1-11,2016，其中描述了相对于腺癌、鳞状细胞癌或大细胞癌，CD68的阳性染色的面积％在非肿瘤中增加2倍)。可使用免疫基因标记从例如得自患有表达EGFR或c-Met的肿瘤的受试者的肿瘤组织活检物中鉴定巨噬细胞。

可使用荧光细胞分选并使用单核细胞标记物CD14从来自患有表达EGFR或c-Met的肿瘤的受试者的血液样本中鉴定单核细胞。

在一些实施方案中，生物样本是血液样本。

在一些实施方案中，生物样本是肿瘤组织活检物。

类似地，FcγRI或FcγRIIIa的水平可用于通过提供更多的免疫细胞相互作用来预测患者对JNJ-372的反应。

在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平高于在来自健康受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的平均值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第30百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第35百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第40百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第45百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第50百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第60百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第65百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第70百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第75百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第80百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第85百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第90百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第95百分位数值。在一些实施方案中，FcγRI或FcγRIIIa的水平为在来自患有EGFR或c-Met阳性癌症的受试者的生物样本中观察到的FcγRI或FcγRIIIa的水平的约第100百分位数值。

FcγRI或FcγRIIIa的水平可使用免疫组织化学在肿瘤组织样本(诸如新鲜冷冻或石蜡包埋的肿瘤组织切片)上测量。FcγRI或FcγRIIIa的水平可表示为显微镜视野内FcγRI或FcγRIIIa细胞的百分比(％)。FcγRI或FcγRIIIa的水平也可作为免疫基因标记面板的一部分或作为单个基因使用从肿瘤组织样本分离的RNA在基因表达水平上测量。

在一些实施方案中，双特异性抗EGFR/c-Met抗体包含

结合EGFR的第一结构域，该第一结构域包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区1(HCDR1)、SEQ ID NO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:4的轻链互补决定区1(LCDR1)、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；以及结合c-Met的第二结构域，该第二结构域包含SEQ ID NO:7的HCDR1、SEQ ID NO:8的HCDR2、SEQ ID NO:9的HCDR3、SEQ IDNO:10的LCDR1、SEQ ID NO:11的LCDR2和SEQ ID NO:12的LCDR3。

在一些实施方案中，结合EGFR的第一结构域包含SEQ ID NO:13的重链可变结构域(VH)和SEQ ID NO:14的轻链可变结构域(VL)；并且结合c-Met的第二结构域包含SEQ IDNO:15的VH和SEQ ID NO:16的VL。

在一些实施方案中，双特异性抗EGFR/c-Met抗体是IgG1同种型。IgG1恒定结构域内存在一些变异(例如熟知的同种异型)，其中变异位于位置214、356、358、422、431、435或436(根据EU编号的残基编号)(参见例如IMGT Web资源；IMGT组库(IG和TR)；蛋白质和等位基因；同种异型)。双特异性抗EGFR/c-Met抗体可以是任何IgG1同种异型，诸如G1m17、G1m3、G1m1、G1m2、G1m27或G1m28。

在一些实施方案中，双特异性抗EGFR/c-Met抗体包含SEQ ID NO:17的第一重链(HC1)、SEQ ID NO:18的第一轻链(LC1)、SEQ ID NO:19的第二重链(HC2)和SEQ ID NO:20的第二轻链(LC2)。

在一些实施方案中，增强巨噬细胞活性的药剂是GM-CSF、CD47拮抗剂、抗CD47抗体、HDAC抑制剂、PD-(L)1轴抑制剂或CD11b激动剂。

在一些实施方案中，增强巨噬细胞活性的药剂是GM-CSF。

在一些实施方案中，增强巨噬细胞活性的药剂是抗CD47拮抗剂。

在一些实施方案中，增强巨噬细胞活性的药剂是抗CD47抗体。

在一些实施方案中，增强巨噬细胞活性的药剂是HDAC抑制剂。

在一些实施方案中，增强巨噬细胞活性的药剂是PD-(L)1轴抑制剂。

在一些实施方案中，增强巨噬细胞活性的药剂是CD11b激动剂。

在一些实施方案中，HDAC抑制剂是HDAC2抑制剂。

示例性CD47拮抗剂是CD47配体-Fc融合体，诸如SIRPα-Fc融合体，诸如TTI621和抗CD47抗体。

示例性抗CD47抗体是Hu5F9-G4、TI-061、TTI-622、AO-176、IBI-188、ALX-148、SRF-231、CC-90002和国际申请公布WO2016/081423中公开的抗CD47抗体。

示例性HDAC抑制剂是伏立诺他、罗米地辛、西达本胺、帕比司他、贝立司他、普拉司他、艾贝司他、恩替司他、伐地司他、GSK-2879552、瑞可林司他、伊阿德司他、多马司他、瑞米诺司他、AZD-9468、纳那替诺司他、CG-200745、莫西司他、INCB-59872、IMG-7289、替诺斯汀、RDN-929、YM-753、HG-146、NBM-BMX、TAK-418、塞利德司他、CKD-504、CKD-506、CC-90011、KA-2507和西他司他。

示例性PD-(L)1轴抑制剂是结合PD-1的抗体(诸如纳武单抗

派姆单抗

信迪利单抗、西米普利单抗

的黎波里单抗(tripolibamab)、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗、卡瑞利珠单抗、多塔利单抗、杰诺单抗或西利单抗)或结合PD-L1的抗体(诸如PD-L1抗体是恩沃利单抗、阿替利珠单抗

度伐鲁单抗

和阿维鲁单抗

)。

市售抗体可经由授权分销商或药房购买。小分子的氨基酸序列结构可以见于由CAS登记公司提交的USAN和/或INN。

在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症与野生型EGFR、EGFR激活突变、EGFR基因扩增、循环HGF的水平升高、野生型c-Met、c-Met激活突变、c-Met基因扩增或突变体KRAS相关联。

可与癌症相关联的示例性EGFR激活突变包括引起EGFR的至少一种生物活性增加(诸如酪氨酸激酶活性升高、受体同源二聚体和异源二聚体形成、配体结合增强等)的点突变、缺失突变、插入突变、倒置或基因扩增。突变可以位于EGFR基因或与EGFR基因相关联的调控区域的任何部分中，并且包括外显子18、19、20或21中的突变或激酶结构域中的突变。EGFR激活突变的其他示例在本领域中是已知的(参见例如美国专利公布US2005/0272083)。关于EGFR和其他ErbB受体(包括受体同源二聚体和异源二聚体、受体配体、自磷酸化位点和参与ErbB介导的信号传导的信号传导分子)的信息在本领域中是已知的(参见例如Hynesand Lane,Nature Reviews Cancer 5:341-354,2005)。

在一些实施方案中，EGFR激活突变是L718Q、G719A、G719X(X为任何氨基酸)、L861X(X为任何氨基酸)、L858R、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、V765M、C797S、L858P或T790M置换；E746-A750的缺失；R748-P753的缺失；M766与A767之间Ala(A)的插入；S768与V769之间Ser、Val和Ala(SVA)的插入；P772与H773之间Asn和Ser(NS)的插入；D761与E762之间、A763与Y764之间、Y764与Y765之间、M766与A767之间、A767与V768之间、S768与V769之间、V769与D770之间、D770与N771之间、N771与P772之间、P772与H773之间、H773与V774之间、V774与C775之间一个或多个氨基酸的插入；或EGFR外显子20中的一个或多个缺失或一个或多个插入。

示例性c-Met激活突变包括引起c-Met蛋白的至少一种生物活性增加(诸如酪氨酸激酶活性升高、受体同源二聚体和异源二聚体形成、配体结合增强等)的点突变、缺失突变、插入突变、倒置或基因扩增。突变可以位于c-Met基因或与该基因相关联的调控区的任何部分中，诸如突变在c-Met的激酶结构域中。示例性c-Met激活突变是在残基位置N375、V13、V923、R175、V136、L229、S323、R988、S1058/T1010和E168处的突变。用于检测EGFR和c-Met突变或基因扩增的方法是熟知的。

在一些实施方案中，突变体KRAS具有G12V、G12C或G12A置换。

在一些实施方案中，受试者患有新诊断的表达EGFR或c-Met的癌症。

在一些实施方案中，患有新诊断的表达EGFR或c-Met的癌症的受试者具有一个或多个EGFR外显子20突变。外显子20突变(一个或多个氨基酸的插入)通常对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)具有抗性(参见例如国际专利公布WO2018/094225)。

在一些实施方案中，受试者对用先前抗癌疗法进行的治疗具有抗性或已获得对用先前抗癌疗法进行的治疗的抗性。

在一些实施方案中，先前抗癌疗法是化学疗法、靶向抗癌疗法或激酶抑制剂。

在一些实施方案中，激酶抑制剂是EGFR、c-Met、HER2、HER3、HER4、VEGFR或AXL的抑制剂。

在一些实施方案中，激酶抑制剂是埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、奥希替尼(osimertinib)、拉泽替尼(lazertinib)、波齐替尼(poziotinib)、克里替尼(criotinib)、卡博替尼(cabozantinib)、卡马替尼(capmatinib)、阿昔替尼(axitinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、瑞格非尼(regorafenib)、帕唑帕尼(pazopanib)、索拉非尼(sorafenib)或舒尼替尼(sunitinib)。

在一些实施方案中，受试者对EGFR抑制剂具有抗性或已获得对EGFR抑制剂的抗性。癌症可获得其抗性的示例性EGFR抑制剂是抗EGFR抗体西妥昔单抗

帕尼单抗

马妥珠单抗、尼妥珠单抗、小分子EGFR抑制剂埃罗替尼

吉非替尼

EKB-569(培利替尼，不可逆EGFR TKI)、泛ErbB和其他受体酪氨酸激酶抑制剂、拉帕替尼(EGFR和HER2抑制剂)、培利替尼(EGFR和HER2抑制剂)、凡德他尼(ZD6474、ZACTIMA^TM、EGFR、VEGFR2和RET TKI)、PF00299804(达克替尼、不可逆泛ErbB TKI)、CI-1033(不可逆泛erbB TKI)、阿法替尼(BIBW2992、不可逆泛ErbBTKI)、AV-412(双重EGFR和ErbB2抑制剂)、EXEL-7647(EGFR、ErbB2、GEVGR和EphB4抑制剂)、CO-1686(不可逆突变体选择性EGFR TKI)、AZD9291(不可逆突变体选择性EGFR TKI)和HKI-272(来那替尼，不可逆EGFR/ErbB2抑制剂)。

可使用各种定性和/或定量方法来确定受试者是否对用抗癌疗法进行的治疗具有抗性或者已产生或易于产生对这种治疗的抗性。可与对抗癌疗法的抗性相关联的症状包括患者的健康状况下降或停滞、肿瘤的尺寸增加、肿瘤生长的下降受到遏制或减慢和/或体内癌细胞从一个位置扩散到其他器官、组织或细胞。与癌症相关联的各种症状的重建或恶化也可以是以下指征：受试者已产生或易于产生对抗癌疗法的抗性，诸如厌食症、认知功能障碍、抑郁症、呼吸困难、疲劳、激素失调、中性粒细胞减少症、疼痛、周围神经病变和性功能障碍。与癌症相关联的症状可根据癌症的类型而变化。例如，与宫颈癌相关联的症状可包括异常出血、异常大量阴道分泌物、与正常月经周期无关的盆腔疼痛、排尿期间膀胱疼痛或疼痛以及在正常月经期之间、性交、冲洗或盆腔检查之后出血。与肺癌相关联的症状可包括持续性咳嗽、咳血、呼吸短促、喘息胸痛、食欲不振、体重无故减轻以及疲劳。肝癌的症状可包括食欲不振和体重减轻、腹痛(尤其是可能延伸到背部和肩部的腹部右上部分)、恶心和呕吐、全身无力和疲劳、肝脏增大、腹部肿胀(腹水)以及皮肤和眼白黄变(黄疸)。肿瘤学技术人员可很容易地鉴定与特定癌症类型相关联的症状。

在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、咽癌、鼻癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、舌癌、食管癌、阴道癌、宫颈癌、脾癌、睾丸癌、胃癌、胸腺癌、结肠癌、甲状腺癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)或者散发性或遗传性乳头状肾细胞癌(PRCC)。

在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是上皮细胞癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是肺癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是肺腺癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是小细胞肺癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是肛门癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是肾癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是膀胱癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是头颈癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是咽癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是鼻癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是皮肤癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是口腔癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是舌癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是食管癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是阴道癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是宫颈癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是脾癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是睾丸癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是胃癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是胸腺癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是结肠癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是甲状腺癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是肝癌。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，表达EGFR或c-Met的癌症是散发性或遗传性乳头状肾细胞癌(PRCC)。

在一些实施方案中，NSCLC包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。在一些实施方案中，NSCLC的细胞具有上皮表型。在一些实施方案中，NSCLC已获得对用一种或多种EGFR抑制剂进行治疗的抗性。

在NSCLC中，EGFR基因中的特定突变与对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的高响应率(70-80％)相关联。外显子19中的5个氨基酸缺失或EGFR中的点突变L858R与EGFR-TKI敏感性相关联(Nakata and Gotoh,Expert Opin Ther Targets 16:771-781,2012)。这些突变使得配体非依赖性激活EGFR激酶活性。激活EGFR突变发生在10-30％的NSCLC患者中，并且在东亚洲人、妇女、从不吸烟者和腺癌组织学患者中明显更常见(Janne andJohnson Clin Cancer Res 12(14Suppl):4416s-4420s,2006)。EGFR基因扩增也与EGFR-TKI治疗之后的响应强烈相关(Cappuzzo等人,J Natl Cancer Inst 97:643-55,2005)。EGFR外显子20插入已与EGFR TKI抗性相关联。

虽然大多数具有EGFR突变的NSCLC患者最初响应EGFR TKI治疗，但实际上所有患者都获得阻止持久响应的抗性。50-60％的患者由于EGFR的激酶结构域中的第二位点突变(T790M)而获得抗性。变得对EGFR酪氨酸激酶抑制剂具有抗性的所有肿瘤中几乎60％会增加c-Met表达、扩增c-Met基因或增加其唯一已知的配体HGF(Turke等人，Cancer Cell,17:77-88,2010)。

在一些实施方案中，受试者对于CD16的位置158处的苯丙氨酸是纯合的，或者对于CD16的位置158处的缬氨酸和苯丙氨酸是杂合的。

对于CD16的位置158处的苯丙氨酸是纯合的受试者具有FcγRIIIa-158F/F基因型。对于CD16的位置158处的缬氨酸和苯丙氨酸是杂合的受试者具有FcγRIIIa-158F/V基因型。CD16也称为Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)或低亲和力免疫球蛋白γFc区受体III-A同种型。已证实FcγRIIIa蛋白残基位置158处的缬氨酸/苯丙氨酸(V/F)多态性会影响FcγRIIIa对人IgG的亲和力。与FcγRIIIa-158V/V相比，具有FcγRIIIa-158F/F或FcγRIIIa-158F/V多态性的受体展示出减弱的Fc接合及因此减轻的ADCC。人N-连接的低聚糖上不含或含少量岩藻糖提高了抗体诱导ADCC的能力，这是由于抗体与人FcγRIIIa(CD16)的结合得以改善(Shields等人，J Biol Chem 277:26733-40,2002)。

在一些实施方案中，双特异性抗EGFR/c-Met抗体具有约1％至约10％之间的降低的岩藻糖含量。具有降低的岩藻糖含量的双特异性抗EGFR/c-Met抗体在治疗具有FcγRIIIa-158F/F或FcγRIIIa-158F/V基因型的患者时可能更有效。可以使用常规方法分析患者的FcγRIIIa多态性。

可以使用据报道能引起具有双分枝复合物型Fc低聚糖的相对较高去岩藻糖基化抗体成功表达的不同方法来制备岩藻糖含量降低的抗体，诸如控制培养物渗透压(Konno等人,Cytotechnology 64:249-65,2012)、应用变体CHO细胞系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人,J Biol Chem 277:26733-26740,2002)、应用变体CHO细胞系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人,MAbs；2(4),2010；Epub ahead of print；PMID:20562582)、应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人,J Biol Chem 278:3466-3473,2003)、引入特异性针对α1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人,BiotechnolBioeng88:901-908,2004)、或共表达β-1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II或有效的α-糖苷酶I抑制剂、几夫碱(Ferrara等人,J Biol Chem281:5032-5036,2006,Ferrara等人,Biotechnol Bioeng 93:851-861,2006；Xhou等人,Biotechnol Bioeng99:652-65,2008)。

在一些实施方案中，受试者进一步施用第三抗癌疗法。

在一些实施方案中，第三抗癌疗法是化学疗法、靶向抗癌疗法或激酶抑制剂。

在一些实施方案中，激酶抑制剂是EGFR、c-Met、HER2、HER3、HER4、VEGFR或AXL的抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂是EGFR的抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂是c-Met的抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂是HER2的抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂是HER3的抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂是HER4的抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂是VEGFR的抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂是AXL的抑制剂。

在一些实施方案中，激酶抑制剂是埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、阿法替尼、奥希替尼、拉泽替尼、波齐替尼、克里替尼、卡博替尼、卡马替尼、阿昔替尼、乐伐替尼、尼达尼布、瑞格非尼、帕唑帕尼、索拉非尼或舒尼替尼。

在一些实施方案中，激酶抑制剂是埃罗替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是吉非替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是拉帕替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是凡德他尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是阿法替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是奥希替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是拉泽替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是波齐替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是克里替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是卡博替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是卡马替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是阿昔替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是乐伐替尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是尼达尼布。在一些实施方案中，激酶抑制剂是瑞格非尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是帕唑帕尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是索拉非尼。在一些实施方案中，激酶抑制剂是舒尼替尼。

可在本公开的方法中与双特异性抗EGFR/c-Met抗体联合施用的抗癌疗法包括本领域技术人员已知的化学治疗剂药物或其他抗癌治疗剂中的任何一种或多种。化学治疗剂是可用于治疗癌症的化学化合物，并且包括生长抑制剂或其它细胞毒性剂，并且包括烷基化剂、抗代谢药、抗微管抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂等。化学治疗剂的示例包括：烷基化剂，诸如噻替哌和环磷酰胺

烷基磺酸盐，诸如白消安、硫丹和嗪消安；氮丙啶，诸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、麦曲多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；氮芥(nitrogenmustards)，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-FU；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙；地磷酰胺(defofamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitrarine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；

雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2′,2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；新型紫杉类或紫杉烷家族的成员，诸如紫杉醇(

多西他赛

)及其类似物；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；去甲长春碱；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；受体酪氨酸激酶和/或血管生成的抑制剂，包括索拉非尼

舒尼替尼

帕唑帕尼(VOTRIENT^TM)、托西尼布(PALLADIA^TM)、凡德他尼(ZACTIMA^TM)、西地尼布

瑞格非尼(BAY73-4506)、阿昔替尼(AG013736)、来他替尼(CEP-701)、埃罗替尼

吉非替尼

阿法替尼(BIBW 2992)、拉帕替尼

来那替尼(HKI-272)等，以及以上物质中任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素药，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬

和抗雄激素药，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及以上中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。其它常规的细胞毒性化学化合物如在Wiemann等人，1985年，Medical Oncology(Calabresi等人编辑)，第10章，McMillan Publishing中所公开的那些，也适用于本发明的方法。

施用

双特异性抗EGFR/c-Met抗体和巨噬细胞激活剂可以混合物形式一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受试者。

在一些实施方案中，双特异性抗EGFR/c-Met抗体在施用巨噬细胞激活剂之前施用。

在一些实施方案中，双特异性抗EGFR/c-Met抗体在施用巨噬细胞激活剂之后施用。

在一些实施方案中，双特异性抗EGFR/c-Met抗体与施用巨噬细胞激活剂同时施用。

在一些实施方案中，双特异性抗EGFR/c-Met抗体在施用第三抗癌剂之前施用。

在一些实施方案中，双特异性抗EGFR/c-Met抗体在施用第三抗癌剂之后施用。

在一些实施方案中，双特异性抗EGFR/c-Met抗体与施用第三抗癌剂同时施用。

施用双特异性抗EGFR/c-Met抗体和巨噬细胞激活剂或第三抗癌疗法之间的时间长度可为几分钟(诸如约1、2、5、10、30或660分钟)或若干小时(诸如约2、4、6、10、12、24或36小时)或诸如约2、4、7、14、21、28、35、42、49、56天或更长。

双特异性抗EGFR/c-Met抗体和巨噬细胞激活剂或第三抗癌剂可在药学上可接受的载体中施用。“载体”是指本发明抗体与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，0.4％盐水和0.3％甘氨酸可用于配制双特异性抗EGFR/c-Met抗体。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。对于固体口服制剂诸如粉末、胶囊和片剂，合适的载体和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂等。固体口服制剂还可包覆有诸如糖的物质或包有肠溶衣，以调节主要的吸收位点。对于肠胃外施用，载体可包括无菌水，并且可添加其他赋形剂以增加溶解度或防腐性。注射用混悬剂或溶液剂也可以利用水基载体连同合适的添加剂来制备。包含其它人蛋白(例如，人血清白蛋白)在内的合适的媒介物和制剂在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版，Troy,D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006，第5部分，PharmaceuticalManufacturing，第691-1092页(特别参见第958-989页)中有所描述。

组合物可根据需要包含药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。药物制剂中双特异性抗EGFR/c-Met抗体和巨噬细胞激活剂的浓度可从按重量计小于约0.5％通常到至少约1％到多达15％、20％、30％、40％或50％变化，并且可根据所选择的具体施用方式主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等来选择。包含固体形式的药物组合物可包含约0.1mg至约2000mg(诸如约1mg、约5mg、约10mg、约25mg、约50mg、约100mg、约150mg、约200mg、约300mg、约500mg、约600mg或约1000mg)的活性成分。

施用方式可以是将抗体递送至宿主的任何合适的途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部、经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)，使用片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒形式的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中；或技术人员所理解的本领域熟知的其他方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：瘤内、胃肠外、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。

用于本公开的方法中的双特异性抗EGFR/c-Met抗体的产生

可以用于本公开的方法中的示例性抗EGFR/c-Met抗体是JNJ-372。JNJ-273以如下氨基酸序列为特征：

EGFR结合臂

>SEQ ID NO:1(HCDR1，EGFR结合臂)

TYGMH

>SEQ ID NO:2(HCDR2，EGFR结合臂)

VIWDDGSYKYYGDSVKG

>SEQ ID NO:3(HCDR3，EGFR结合臂)

DGITMVRGVMKDYFDY

>SEQ ID NO:4(LCDR1，EGFR结合臂)

RASQDISSALV

>SEQ ID NO:5(LCDR2，EGFR结合臂)

DASSLES

>SEQ ID NO:6(LCDR3，EGFR结合臂)

QQFNSYPLT

>SEQ ID NO:7(HCDR1，c-Met结合臂)

SYGIS

>SEQ ID NO:8(HCDR2，c-Met结合臂)

WISAYNGYTNYAQKLQG

>SEQ ID NO:9(HCDR3，c-Met结合臂)

DLRGTNYFDY

>SEQ ID NO:10(LCDR1，c-Met结合臂)

RASQGISNWLA

>SEQ ID NO:11(LCDR2，c-Met结合臂)

AASSLLS

>SEQ ID NO:12(LCDR3，c-Met结合臂)

QQANSFPIT

>SEQ ID NO:13(VH，EGFR结合臂)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS

>SEQ ID NO:14(VL，EGFR结合臂)

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK

>SEQ ID NO:15(VH，c-Met结合臂)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGYTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTLVTVSS

>SEQ ID NO:16(VL，c-Met结合臂)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIK

>SEQ ID NO:17HC1

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

>SEQ ID NO:18LC1

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

>SEQ ID NO:19HC2

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGYTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

>SEQ ID NO:20LC2

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

可公开获得的其他双特异性抗EGFR/c-Met抗体也可用于本公开的方法中，只要它们在与JNJ-372比较时表现出类似的特性即可，如美国专利9,593,164中所述。可用于本公开的方法中的双特异性抗EGFR/c-Met抗体也可通过将可公开获得的EGFR结合VH/VL结构域和c-Met结合VH/VL结构域组合并测试所得双特异性抗体的特性来产生，如美国专利9,593,164中所述。

用于本公开的方法中的双特异性抗EGFR/c-Met抗体可例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成在体外无细胞环境中或使用共表达形成具有不同特异性的两个抗体半分子的异源二聚体。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3结构域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键被还原。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3结构域通过解离-缔合而释放和重新形成。可将Fab臂的CH3结构域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有各自结合不同的表位(即EGFR上的表位和c-Met上的表位)的两个Fab臂或半分子的双特异性抗体。例如，本发明的双特异性抗体可使用国际专利公布WO2011/131746中所述的方法产生。在IgG1抗体的情况中，可使用一条重链中的突变F405L和另一条重链中的K409R。对于IgG2抗体，可使用具有F405L和R409K置换的野生型IgG2和IgG2抗体。对于IgG4抗体，可使用具有F405L和R409K置换的野生型IgG4和IgG4抗体。为了产生双特异性抗体，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体工程化以在Fc区中具有前述突变，在足以允许铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下将抗体一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH7.0或pH7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。

用于本公开的方法中的双特异性抗EGFR/c-Met抗体也可使用诸如钮扣(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电匹配(Chugai,Amgen,NovoNordisk,Oncomed)、LUZ-Y(Genentech)、Strand Exchange工程化Domain body(SEEDbody)(EMD Serono)和Biclonic(Merus)的设计产生。

在“钮扣”策略(参见，例如国际公开WO 2006/028936)中，在人IgG中形成CH3结构域的交界的选定氨基酸可在影响CH3结构域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3取代对(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。

除利用“钮扣”策略促进Fab壁交换之外，CrossMAb技术还利用一个半臂中的CH1/CL结构域更换，以确保所得的双特异性抗体正确的轻链配对(参见例如美国专利8,242,247)。

可使用其他交换策略如下产生本发明的全长双特异性抗体：在双特异性抗体的一个或两个臂中，在重链与轻链之间或重链之内交换可变结构域或恒定结构域、或这两种结构域。这些交换包括例如VH-CH1与VL-CL、VH与VL、CH3与CL以及CH3与CH1，如在国际专利公布WO2009/080254、WO2009/080251、WO2009/018386和WO2009/080252中有所描述。

还可使用其他策略，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在第二CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布US2010/0015133、美国专利公布US2009/0182127/美国专利公布US2010/028637或美国专利公布US2011/0123532中所述。在其他策略中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公开US2012/0149876或美国专利公布US2013/0195849中所述。

SEEDbody技术可用于产生本发明的双特异性抗体。SEEDbodies在其恒定域中具有所选择的经IgA残基取代的IgG残基，以促进异源二聚化，如在美国专利US20070287170中有所描述。

通常使用标准方法以DNA水平到分子水平(诸如抗体的恒定域)上进行突变。

本发明现将结合以下具体的、非限制性实施例进行描述。

材料和方法

PBMC以及从PBMC分离NK细胞和单核细胞

外周血单核细胞(PBMC)和分离的免疫细胞(NK细胞和单核细胞)购自Hemacare。PBMC按照IRB批准的健康人类供体的cGMP和cGTP收集指南从HemaCare的FDA注册的收集中心收集的白细胞中分离。外周血单核细胞(PBMC)通过密度梯度离心纯化，并以冷冻保存的形式购自HemaCare，并储存在液氮中直到使用。

对于一些供体，将白细胞分成3路，以从同一供体白细胞中分离PBMC、NK细胞和单核细胞。使用CD56阴性选择分离NK细胞，并且使用CD14阴性选择分离单核细胞。分离的NK细胞和单核细胞以冷冻保存的形式购自Hemacare，并且储存在液氮中直到使用。

单核细胞分化为M1、M2a和M2c巨噬细胞

将单核细胞(购自Hemacare)在补充有10％FBS的XVIVO 15培养基中解冻，并铺在组织培养物处理过的T75烧瓶中。在第0天，将单核细胞铺在具有50ng/mL M-CSF(目录号216-MC-025/CF，购自R&D systems)的培养基中，以获得Mo巨噬细胞。为了使M0巨噬细胞极化为M2a巨噬细胞，在第5天，将培养基更换为50ng/mL M-CSF和20ng/mL IL-4(目录号204-IL-020/CF，购自R&D systems)和20ng/mL IL-13(目录号213-ILB-025/CF，购自R&Dsystems)并孵育48小时。为了使M0巨噬细胞极化为M2c巨噬细胞，在第5天，将培养基更换为50ng/mL M-CSF和20ng/mL IL-10(目录号217-IL-025/CF，购自R&D systems)并孵育48小时。为了获得M1巨噬细胞，在第6天，将培养基更换为50ng/mL M-CSF和100ng/mL IFN-g(目录号285-IF-100/CF，购自R&D systems)并孵育24小时。然后使用Accutase从烧瓶中移除分化的M1、M2a和M2c巨噬细胞并将其用于测定。

从PBMC中耗尽NK细胞和单核细胞

使用来自STEMCell Technologies的EasySep Human CD56阳性选择试剂盒II(目录号17855)进行NK细胞的耗尽，并且使用来自STEMCell Technologies的EasySep HumanCD14阳性选择试剂盒II(目录号17858)进行单核细胞的耗尽。将PBMC(购自Hemacare)在具有10％FBS的X-VIVO-15培养基中解冻并对其计数。将PBMC(1千万个细胞/耗尽)以1亿个细胞/mL的所需浓度重悬于EasySep缓冲液中。按照制造商的方案进行NK细胞和单核细胞的耗尽。简而言之，添加50μl相应的抗体选择混合物，并在室温下孵育10分钟。将磁性颗粒涡旋30秒，并将50μl添加到PBMC+抗体混合物中。将其在室温下孵育3分钟，并使用EasySep缓冲液补足至2.5ml。然后将管置于EasySep Magnet(目录号18000，来自STEMCellTechnologies)中，并孵育3分钟。然后将上清液小心地转移到新管中。将磁分离步骤重复两次，以获得NK细胞耗尽和单核细胞耗尽的PBMC。使用流式细胞术(如下所述)验证耗尽，然后将这些PBMC用于Simple Western测定以检测EGFR和Met蛋白质水平。

测定PBMC内的免疫细胞组成

将PBMC(购自Hemacare)在具有10％FBS的X-VIVO-15培养基中解冻并对其计数。计数后，将细胞以约300,000至400,000个/孔铺板(一式三份)，并将板在4℃下以1500rpm旋转3分钟。弃去上清液，并用150μl/孔的DPBS洗涤细胞。如上所述，再次旋转板得到粒料。通过将150μL DMSO添加到活/死细胞染色内容物中来制备Near IR-活/死细胞染色(LifeTechnologies，目录号L10119)的原液。然后通过将50μl原液添加到10ml DPBS中来制备工作溶液。然后将50ul工作溶液添加到板的每个孔中并重悬。将板在室温下在黑暗中(用箔覆盖)孵育30分钟。在孵育结束时，将板在4℃和1500rpm下旋转5分钟。然后通过添加150μl/孔，用FACS/染色缓冲液(BD#554657)洗涤细胞。根据计算将用于多色流式细胞仪面板的抗体制备成混合物，并以25μl/孔添加。用于面板中的抗体包括CD19(FITC)、CD56(BV711)、Cd11b(BUV395)、CD14(PE-cy7)、CD3(BV605)、CD4(BV785)、CD8(PerCP-cy5.5)、CD25(PE)和PD-1(APC)。将板在室温下在黑暗中孵育30分钟。根据计算使用补偿珠和来自上述面板的单通道抗体制备补偿面板，并在室温下在黑暗中孵育30分钟。将所有板在4℃下以1500rpm旋转5分钟，并用150μL FACS缓冲液洗涤两次。将测定板重悬于150μl FACS缓冲液中，并将补偿板重悬于200ul FACS缓冲液中。使板在Fortessa上运行，其中使用来自补偿珠板的单通道控制值设定补偿。然后在施加补偿的情况下以1.5μl/sec的流速运行测定板。然后将数据导出并在FLOWJo中分析，其中进行适当的门控以获得PBMC内每个单独免疫细胞群的百分比。

增殖和凋亡测定

HCI-H1975细胞(本文也称为H1975细胞)从ATCC获得，并将其在补充有10％HiFBS、1X NEAA、1X丙酮酸钠的RPMI(Invitrogen，目录号72400-047)中培养。对于使用Incucyte的增殖和凋亡测定，将H1975细胞用Incucyte NucLight Red慢病毒试剂(目录号4476，来自Essen Biosciences)感染，并用1μg/ml嘌呤霉素选择以生成H1975 NucRed细胞。将这些细胞铺在补充有10％HI FBS、1X NEAA、1X丙酮酸钠的RPMI-无酚红培养基中，以用于实验。

使用Invitrogen细胞解离缓冲液解离H1975-NucRed细胞(因为胰蛋白酶使细胞表面受体/分子崩解)并对其计数。将细胞以1200rpm离心5分钟，并移除上清液。然后将沉淀物重悬于适当体积的无酚红培养基中。将NucRed细胞(靶细胞)以12,500个细胞/孔铺在经组织培养物处理的黑色平底板中的100μl酚红培养基中，并在37℃和5％CO₂下孵育过夜。第二天，将PBMC(购自HemaCare)在具有10％FBS的X-VIVO-10培养基中解冻并对其计数。将PBMC以125,000个细胞/孔的浓度在50μl中稀释，以获得10:1的效应物:靶标(E:T)比率。将Incucyte膜联蛋白V Green试剂(目录号4642，购自Essen Biosciences)重悬于100μl培养基中，并用于对100孔或196孔板进行染色。将稀释的膜联蛋白试剂添加到PBMC或培养基中。将50ul PBMC/培养基(具有膜联蛋白)添加到测定板的适当孔中。然后将治疗性抗体以1:5进行系列稀释，并根据计算以4X浓度进行制备，并且将50μl所需抗体添加到测定板的适当孔中。然后将测定板置于Incucyte S3中的适当狭槽中，并在扫描之前在Incucyte中平衡20分钟。以4个图像/孔/扫描每4小时对板进行扫描，直至120小时，以确定随时间推移的靶细胞增殖和凋亡。使用过程定义对靶细胞(NucRed)荧光和膜联蛋白(绿色)荧光进行定量，并计算总NucRed H1975面积(μm²/孔)，其表示靶细胞增殖。还计算了总绿色NucRed H1975面积(um2/孔)，其表示靶细胞凋亡。根据该分析，使用Graphpad Prism计算曲线下面积(AUC)，并且生成非线性剂量响应曲线。

Simple Western用于检测EGFR、c-Met、pEGFR和pMet蛋白质水平

H1975细胞和SNU-5细胞从ATCC获得，并在补充有10％Hi FBS、1X NEAA、1X丙酮酸钠的RPMI(Invitrogen，目录号72400-047)中培养。使用细胞解离缓冲液解离H1975细胞，并且将每种细胞悬浮液置于50mL锥形管中并计数。在SNU-5(悬浮细胞系)的测定中，将细胞悬浮液转移到50mL锥形管中并计数。将细胞在4℃下以1300rpm沉淀5分钟，并重悬于适当体积的RPMI培养基中。将靶细胞以100,000个细胞/孔的浓度铺在6孔板中并孵育过夜。第二天，将PBMC(购自HemeCare)在具有10％FBS的X-VIVO-15培养基中解冻并对其计数。将PBMC稀释并以1,000,000个细胞/孔的浓度铺板，以获得10:1的E:T比率。当使用各个免疫细胞诸如NK细胞、单核细胞或巨噬细胞时，将它们稀释并以500,000个细胞/孔的浓度铺板，以获得5:1的E:T比率。然后根据计算以2X浓度制备治疗性抗体，并将1.5mL所需抗体添加到测定板的适当孔中。将板孵育48小时(对于大多数测定)或不同的时间点。

在孵育期结束时，将100μl新鲜制备的裂解缓冲液添加到每个孔中并在冰上孵育5分钟。使用10mL RIPA缓冲液(ThermoFisher；目录号89901)与1片磷酸酶抑制剂PhosSTOP(Sigma；目录号4906837001)和1片蛋白酶抑制剂cOmplete^TM(Mini，不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物)(Sigma；目录号04693159001)制备裂解缓冲液。使用刮板器，将裂解物转移到2mlEppendorf管中，并在冰上孵育30分钟，偶尔涡旋。将裂解物在4℃下以13,200rpm离心25分钟，并将上清液转移到新管中。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(目录号23227，得自ThermoFisher)按照制造商的方案测定裂解物的蛋白质浓度。使用Pierce牛血清白蛋白标准预稀释标准物(目录号23208，得自ThermoFisher)获得测定的标准曲线。简而言之，将25μl预稀释的标准物一式三份地添加96孔平底板上，并将25μl样本(以1:5稀释)一式两份地添加到该平底板上。每个孔添加200ul制备的BCA工作试剂。将板在板振荡器上轻轻混合1分钟，并在用箔覆盖的情况下在37℃下孵育30分钟。孵育后，使板在室温下冷却5分钟，然后使用SpectraMAX分光光度计在562nm处测量蛋白质定量。

为了使用PeggySue执行基于毛细管的电泳，将12-230kDa Peggy Sue分离模块(目录号SM-S001，购自Protein Simple)单独与均购自Protein Simple的抗兔检测模块(目录号DM-001)和抗小鼠二抗(目录号042-205)使用。制备样本、抗体和试剂，并根据制造商的方案进行基于毛细管的电泳。简而言之，使用2个标准包装的组分来制备生物素酰化阶梯和5X主混合物。使用来自BCA蛋白质测定的值，根据计算，使用0.1X样本缓冲液将蛋白质裂解物稀释至0.25mg/ml的浓度。将4份制备的裂解物与1份5X荧光主混合物混合，以获得0.2mg/mL的最终浓度。使用PCR热循环仪使样本和生物素酰化阶梯在95℃下变性5分钟。使用抗体稀释剂按以下方式稀释用于测定的一抗：EGFR(目录号2646，来自Cell SignalingTechnologies)，以1:50稀释；pEGFR(目录号AF1095，来自R&D Systems)，以1:50稀释；c-Met(目录号3148，来自Cell Signaling Technologies)，以1:50稀释；pMet(目录号3077，来自Cell Signaling Technologies)，以1:50稀释；以及上样对照肌动蛋白(目录号4970，来自Cell Signaling Technologies)，以1:200稀释或(目录号4947，来自Cell SignalingTechnologies)，以1:100稀释。根据板布局将阶梯、样本、一抗和二抗、分离和堆叠基质添加到384孔Peggy Sue板中。将板在室温下以2500rpm旋转5分钟，然后将其加载到机器上。使用SW软件的Compass分析数据。基于所关注蛋白质的分子量确定峰，并计算每个样本中每种蛋白质的曲线下面积(AUC)。然后将所关注蛋白质的光密度测定值归一化为每个样本的上样对照肌动蛋白，然后归一化为未处理对照，以获得随处理的相对变化。

共聚焦成像胞啃作用测定

收获分化的巨噬细胞，并将其以1,00,000个细胞/孔铺在CellCarrier96ultra板(Perkin-Elmer；目录号6055302)上过夜。使用粘附和非粘附靶细胞两者进行测定。对于粘附靶细胞的测定，将H1975 NucLight Red细胞以20,000个/孔铺板，粘附4小时，然后用标记的Ab混合物在4℃下处理1小时。对于非粘附靶细胞的测定，将靶细胞单独用AF647标记的JNJ-372或对照Ab染色。所有实时成像研究都以5:1的E:T比率进行。标记抗体混合物由抗CD11b(BD Pharmingen；目录号557701)、抗CD14(BD Pharmingen；目录号562689)和1:8000Hoechst33342(Biotium；目录号40046)构成。使用60x水浸物镜在Perkin-ElmerPhenix Opera上以11分钟的间隔获得图像，并使用Columbus进行分析。

ADCC测定

将PBMC在测定前一天在补充有10％热灭活FBS(GIBCO，目录号16140)的X-VIVO 10培养基(Lonza，目录号04-380Q)中解冻，并在标准孵育条件(37℃，5％CO₂，95％湿度)下静置过夜。在测定当天，将NCI-H1975靶细胞与DELFIA BATDA试剂(PerkinElmer Inc.，目录号C136-100)一起加载30分钟，洗涤3次，并重悬于RPMI培养基中。将PBMC和加载BATDA的靶细胞连同增加浓度的测试抗体以25:1的效应子与靶细胞比率添加到96孔U形底板中。将含有2％Triton X-100(EMD Millipore，目录号648463)的RPMI培养基或RPMI培养基添加到对照孔中，以分别测量自发和最大TDA释放。将板孵育2小时，之后取出20uL上清液并与200μLDELPHIA Europium溶液(Perkin Elmer，目录号C135-100)混合。在室温下孵育15分钟后，使用EnVision 2104多标记读板机(PerkinElmer，目录号2104-0010)测量相对荧光单位(RFU)。将裂解百分比计算为(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)X100。

单核细胞分化为M1、M2a和M2c巨噬细胞

将单核细胞(Hemacare)在XVIVO-15培养基中解冻，并用50ng/mL M-CSF(R&Dsystems；目录号216-MC-025/CF)分化6天，以获得M0巨噬细胞。为了获得M1巨噬细胞，在第5天，将M0巨噬细胞用50ng/mL M-CSF和100ng/mL IFN-γ(R&D systems；目录号285-IF-100/CF)极化48小时。为了获得M2巨噬细胞，在第5天，将M0巨噬细胞用20ng/mL IL-4(R&Dsystems；目录号204-IL-020/CF)和IL-13(R&D systems；目录号213-ILB-025/CF)(对于M2a巨噬细胞)或20ng/mL IL-10(R&D systems；目录号217-IL-025/CF)(对于M2c巨噬细胞)极化48小时。

体内研究

将H1975细胞系皮下植入6-8周龄的雌性BALB/c裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1^nu/Crl,Charles River Laboratories,Wilmington,MA)中。当肿瘤平均为72±8.7mm³时，在研究期间每周施用腹膜内抗mCSF-1R抗体(400μg/小鼠)三次，在化合物给药开始前五天开始，以促进巨噬细胞耗尽。在第5天(平均肿瘤体积＝102±36.6mm³)，将它们通过腹膜内给药10mg/kg同种型对照Ab、JNJ-372或EGFR/cMet IgG2σAb每周处理两次。在两次化合物给药后，对肿瘤取样以监测巨噬细胞浸润。对于SNU5肿瘤模型研究，将SNU5细胞皮下植入7-8周龄的雌性CB17/SCID小鼠(HFK Bio-Technology Co.Ltd.,Beijing,China)中。当肿瘤平均为155±21.4mm³时，将小鼠用腹膜内磷酸盐缓冲盐水(PBS)、JNJ-372(5mg/kg)或EGFR-cMet IgG2σ抗体(5mg/kg)每周处理两次，持续三周。对于这两项研究，每周记录肿瘤测量值和体重两次。使用计算[1-(T/C)]*100，在最后一天计算肿瘤生长抑制(TGI)，其中>80％对照小鼠保持研究。所有体内实验均按照强生机构动物护理和使用委员会(Johnson InstitutionalAnimal Care and Use Committee)以及实验动物护理和使用指南(Guide for Care andUse of Laboratory Animals)进行。

基于流式细胞术确定肿瘤相关的巨噬细胞

从小鼠身上切下肿瘤，称重，将其切成2-4mm的片，置于含有2.5mL RPMI的C形管(Miltenyi，目录号130-093-237)中并保持在冰上。根据制造商的说明书，重构人肿瘤解离试剂盒(Miltenyi，目录号130-095-929)中包含的冻干酶，并制备2X酶混合物，并且使用制造方案“h_tumor_01”在GentleMACS Octo解离器(Miltenyi，目录号130-095-937)上解离肿瘤，之后在37℃下孵育两轮30分钟。将解离的细胞在FACS染色缓冲液(BD Pharmingen，目录号554657)中洗涤两次，并使其通过Falcon 40μm细胞滤网(Corning，352340)。将细胞在以1:1000在FACS缓冲液中稀释的GolgiPlug(BD，目录号555029)中孵育，并在37℃下孵育3小时，洗涤两次，并重悬于100μL抗体染色混合物中。抗体混合物由抗CD45(目录号103138)、抗F4/80(目录号123137)、抗Ly6G(目录号127639)、抗MHCII(目录号107612)、抗EpCAM(目录号324214)、抗PD1(目录号135231)、抗PD-L1(目录号393606)、来自BioLegend的抗CD206(目录号141729)、来自Becton-Dickinson的抗CD11b(目录号563553)和抗Ly6C(目录号561237)、来自Invitrogen的抗iNOS(目录号25-5920-82)和可固定活/死细胞染色剂(目录号L10119)组成。将细胞与细胞外表面标志物抗体在4℃下避光孵育30分钟，用PBS洗涤两次，并重悬于含有可固定活/死细胞染色剂的PBS中，在4℃下孵育30分钟，并用FACS缓冲液(BDPharmingen；目录号554657)洗涤两次。根据制造商的说明书(Invitrogen，目录号88-8824-00)固定/透化细胞，将其与内部靶抗体一起在4℃下孵育30分钟，用FACS缓冲液洗涤2次，并重悬于200μL中，以在BD LSR Fortessa上进行分析。使用UltraComp eBead(用于抗体；Invitrogen，目录号01-2222-42)和ArC胺反应性小珠(用于可固定活/死细胞，Invitrogen，目录号A10346)进行补偿。对所有标志物进行FMO控制。为了确定肿瘤相关的巨噬细胞耗尽，将巨噬细胞定义为CD45⁺CD11b⁺Ly6C^-Ly6G^-F4/80⁺。

MSD多重测定和统计分析

对于PBMC、NK细胞和单核细胞实验，将NCI-H1975细胞置于96孔板中，并使其在37℃和5％CO₂下孵育过夜。第二天，分别以10:1、5:1和5:1的比率添加PBMC、单核细胞或NK细胞。对于巨噬细胞实验，如前所述分化单核细胞，使用StemPro Acutase(Gibco，目录号A11105-01)对其进行解离，并将其铺到96孔板中，并使其在37℃和5％CO₂下孵育过夜。第二天，以5:1的E:T比率添加NCI-H1975细胞。将细胞用不同浓度的同种型对照、JNJ-61186372或IgG2Sigma处理，并在37℃和5％CO₂下孵育4小时、24小时、48小时和/或72小时。在指定的时间，将板在室温下以1200rpm旋转10分钟。移出上清液，并使用MesoScale Discovery(MSD)U-plex和V-plex格式根据制造商的说明书对其进行评估，以用于相应的细胞因子测定。简而言之，对于U-plex板，在测定前一天，根据制造商的方案将板用抗体和接头包被，并在4℃下在轨道式振荡器上孵育过夜。在实验当天，将U-plex或V-plex板用MSD洗涤缓冲液洗涤3次，并将上清液、标准物和校准物添加到板中并根据制造商的方案运行。在MSDSector仪器上读板并使用GTS Spotfire进行分析，以使用标准曲线获得每种细胞因子的计算水平(以pg/ml计)。

根据所计算的浓度，针对每种处理、细胞类型和孵育时间，通过梯形方法计算曲线下面积(AUC)，以便比较响应的大小。如果观察值低于检测下限，则排除响应数据，并且仅在8个剂量浓度有至少6个有效观察值时才计算AUC。然后生成热图以示出所有细胞因子和条件下的数据可用性(没有数据、没有足够的数据或可计算的AUC数据)。然后使用孵育时间产生对数转化的AUC的热图，并且限于在H1975+PBMC细胞类型中具有至少一个可测量AUC的细胞因子。使用统计软件R版本3.5.0中的包热图2(R Core Team 2018；R：用于统计计算的语言和环境；http://www.R-project.org/)产生所有热图。最后，在每种条件下计算JNJ-372和IgG2σ处理相对于同种型的相对变化，并使用Graphpad Prism生成柱状图或剂量曲线。

实施例1.JNJ-372介导的对肿瘤细胞的抗增殖和凋亡作用由Fc与免疫细胞的相互作用驱动。

为了评估Fc相互作用对JNJ-372的三种抗肿瘤机制的作用，通过使用标准克隆方法将JNJ-372野生型IgG1替换为效应子沉默IgG2sigma(与野生型IgG2相比，IgG2sigma包含V234A G237A P238S H268A V309L A330S P331S突变)来将JNJ-372工程化为Fc效应子沉默分子(JNJ-372.IgG2sigma)。将工程化的效应子沉默抗体称为JNJ-372.IgG2sigma(或一些图中的IgG2s)。JNJ-372是在掺有低水平(<9％)的岩藻糖以增强与FcγRIII/CD16和ADCC的结合的细胞系中产生的。因此，作为另一个对照，JNJ-372也在掺有正常岩藻糖水平的CHO细胞中表达；将该分子称为JNJ-372.NF(NF：正常岩藻糖)。使用NCI-H1975细胞(ATCC目录号CRL-5908)评估肿瘤细胞杀伤；该细胞系表达突变型L858R/T790M EGFR和野生型c-Met。

将表达NCI-H1975 NucLight Red的细胞用同种型对照JNJ-372、JNJ-372.IgG2s或JNJ-372.NF处理，并在存在或不存在PBMC的情况下以10:1的效应子:靶标比率培养，并且在共培养开始后5天评估NCI-H1975细胞的增殖。PBMC的存在增强了JNJ-372以剂量依赖性方式随时间抑制肿瘤细胞增殖的能力(图1)，而JNJ-372在不存在测试浓度的PBMC的情况下不抑制增殖(图2)。

为了确认PBMC上的Fc接合是该作用的原因，将表达H1975 NucLight Red的细胞用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma和JNJ-372.NF处理，并在存在或不存在PBMC的情况下以10:1的E:T比率培养4、24、48、72或96小时，之后评估H1975细胞的增殖和凋亡。PBMC的存在增强了JNJ-372在24、48、72和96小时诱导的剂量依赖性抗增殖作用和剂量依赖性凋亡(通过膜联蛋白阳性测定)。同种型或JNJ-372.IgG2sigma中未观察到这些作用或作用很小。图3示出了在培养72小时后在存在或不存在PBMC的情况下同种型对照JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或JNJ-372.NF介导的对H1975细胞增殖的抑制的剂量响应。图4示出了在培养48小时后在存在或不存在PBMC的情况下同种型对照JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或JNJ-372.NF介导的凋亡的剂量响应。与JNJ-372相比，JNJ-372.NF对增殖(图3)和凋亡(图4)具有部分作用，这表明FcγRIII起作用，但不完全是Fc相互作用介导的作用的原因。

在测定中，使用来自七个不同供体的PBMC，效应子:靶标比率为10:1。六个供体的NCI-H1975增殖测定中的IC₅₀值和％最大杀伤在表1中示出。来自一个供体的PBMC没有作用。在从不同供体获得的PBMC中观察到IC₅₀和％最大杀伤的可变性。

表1.

实施例2.JNJ-372介导的EGFR和c-Met蛋白的下调及其在EGFR突变型肿瘤细胞系中的下游信号传导由Fc与免疫细胞的相互作用介导

免疫细胞(PBMC)的存在增强了JNJ-372介导的EGFR和c-Met蛋白的下调及对其磷酸化的抑制。

将NCI-H1975细胞用10μg/mL同种型或JNJ-372处理，并在存在或不存在来自一个供体的PBMC的情况下以10:1的E:T比率培养4、24、48或72小时，并测量EGFR、c-Met和pEGFR(pY1173)的量。将肌动蛋白用作上样对照。PBMC的存在增强了在所测试的所有时间点JNJ-372介导的EGFR、c-Met和pEGFR(pY1173)的下调。图5示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其示出了用同种型对照或JNJ-372处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养的样本中的EGFR和c-Met蛋白质以及pEGFR，如图所示。图6示出了每个样本中EGFR的相对量。图7示出每个样本中pEGFR pY1173的相对量。图8示出每个样本中c-Met的相对量。将样本归一化为每个样本中存在的上样对照肌动蛋白的量，然后归一化为对照(未处理)样本。

测试来自七个供体的PBMC增强JNJ-372介导的对EGFR和c-Met蛋白水平以及pEGFR的抑制的能力。在供体PBMC之间观察到变化。来自供体1、3、4和6的PBMC在增强JNJ-372介导的作用方面是最有效的。图9示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的SimpleWestern)的图像，其示出了用同种型对照或JNJ-372处理并在存在或不存在来自七个不同供体的PBMC的情况下培养的样本中的EGFR和c-Met蛋白质以及pEGFR，如图所示。图10示出了每个样本中EGFR的相对量。图11示出每个样本中pEGFR pY1173的相对量。图12示出每个样本中c-Met的相对量。将样本归一化为每个样本中存在的上样对照肌动蛋白的量，然后归一化为对照(未处理)样本。

实施例3.单核细胞或巨噬细胞的存在对于Fc介导的JNJ-372对EGFR和c-Met信号传导的抑制作用的增强是足够且必要的。

使用多色流式细胞术评估来自实施例2中所用的七个不同供体的PBMC内的免疫细胞组成，以了解各种PBMC样本增强JNJ-372下调EGFR和c-Met信号传导能力的能力变化。检测了供体之间各种免疫细胞百分比的可变性(数据未示出)。利用7个供体中的每一个中的各种免疫细胞百分比和每种供体PBMC介导EGFR/pEGFR/Met下调的能力来进行相关性分析。在NK细胞、B细胞或T细胞与PBMC增强EGFR、pEGFR或c-Met的下调的能力之间未观察到相关性(数据未示出)。然而，鉴定了PBMC中的％单核细胞与PBMC增强EGFR蛋白水平的下调的能力之间(图13)、PBMC中的％单核细胞与PBMC增强pEGFR的下调的能力之间(图14)以及PBMC中的％单核细胞与PBMC增强c-Met蛋白质水平的下调的能力之间(图15)存在正相关性。这表明JNJ-372介导的信号下调需要PBMC中有较高的单核细胞百分比。

将来自一个供体的PBMC中的NK细胞或单核细胞耗尽，并评估NK细胞或单核细胞耗尽的PBMC对JNJ-372介导的EGFR和c-Met途径的下调的影响。将H1975细胞用10μg/mL同种型对照或JNJ-372处理，并在存在或不存在来自一个供体的NK细胞耗尽的PBMC或单核细胞耗尽的PBMC的情况下以10:1的E:T比率培养48小时。与之前的结果一致，PBMC的存在增强了H1975细胞系中JNJ-372介导的EGFR、pEGFR和c-Met的下调。虽然NK细胞的耗尽仅具有边际效应，但PBMC中单核细胞的耗尽显著逆转了PBMC增强JNJ-372介导的信号下调的能力。图16示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其检测了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在来自一个供体的NK细胞耗尽的PBMC或单核细胞耗尽的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975细胞中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白水平，如图所示。图17示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在来自一个供体的NK细胞耗尽的PBMC或单核细胞耗尽的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975中的EGFR的相对量。图18示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在来自一个供体的NK细胞耗尽的PBMC或单核细胞耗尽的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975中的pEGFR(pY1173)的相对量。图19示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在来自一个供体的NK细胞耗尽的PBMC或单核细胞耗尽的PBMC的情况下培养48小时的NCI-H1975中的c-Met的相对量。将样本归一化为每个样本中存在的上样对照肌动蛋白的量，然后归一化为对照(未处理)样本。

为了进一步评估骨髓腔室的作用，评估了从一个PBMC供体分离的单核细胞或M1巨噬细胞对JNJ-372 Fc相互作用驱动的EGFR/c-Met下调的作用。M1巨噬细胞通过使单核细胞以两种方式即M-CSF和GM-CSF分化而获得，以评估任何潜在差动效应。将H1975细胞用10μg/mL同种型、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma处理，并在存在或不存在来自一个供体的PBMC的情况下以10:1(对于PBMC)或5:1(对于各种免疫细胞(单核细胞、NK细胞、MCSF M1或GMCSFM1巨噬细胞)的E:T比率培养48小时。PBMC的存在增强了JNJ-372介导的EGFR、pEGFR和c-Met蛋白的下调。虽然NK细胞没有显著效果，但来自相同PBMC供体的分离的单核细胞或M1巨噬细胞(由M-CSF或GM-CSF分化)显著增强了JNJ-372介导的信号下调的能力。这表明骨髓谱系对于Fc相互作用和PBMC介导的JNJ-372信号下调的增强是足够的。图20示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其检测了在存在或不存在来自同一供体的PBMC、分离的单核细胞、分离的NK细胞、MCSF分化的M1巨噬细胞或GMCSF分化的M1巨噬细胞的情况下在用JNJ-372或同种型对照处理48小时的NCI-H1975细胞中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白水平，如图所示。图21示出了在存在或不存在从同一供体分离的PBMC、NK细胞、单核细胞、MCSF M1巨噬细胞或GMCSF M1巨噬细胞的情况下在用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理48小时的NCI-H1975细胞中的EGFR的相对量，如图所示。图22示出了在存在或不存在从同一供体分离的PBMC、NK细胞、单核细胞、MCSF M1巨噬细胞或GMCSF M1巨噬细胞的情况下在用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理48小时的NCI-H1975细胞中的pEGFR(pY1173)的相对量，如图所示。图23示出了在存在或不存在从同一供体分离的PBMC、NK细胞、单核细胞、MCSF M1巨噬细胞或GMCSF M1巨噬细胞的情况下在用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理48小时的NCI-H1975细胞中的c-Met的相对量，如图所示。将样本归一化为每个样本中存在的上样对照肌动蛋白的量，然后归一化为对照(未处理)样本。

随后评估了不同巨噬细胞亚型在JNJ-372 Fc相互作用驱动的EGFR/c-Met下调中的作用。将来源于一个供体的单核细胞分化成M1、M2a和M2c巨噬细胞，并评估它们增强JNJ-372介导的EGFR/c-Met下调的能力。将H1975细胞用10μg/mL同种型、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma处理并在存在或不存在通过从一个供体分化而获得的M1、M2a或M2c巨噬细胞的情况下以5:1的E:T比率培养48小时。M1、M2a和M2c的存在均显著增强了JNJ-372介导的EGFR、pEGFR和c-Met蛋白的下调。图24示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其检测了用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理并在存在M1巨噬细胞(M1)或M2a巨噬细胞(M2a)的情况下培养的NCI-H1975细胞中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白水平，如图所示。图25示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其检测了用JNJ-372、JNJ-372.IgG2sigma或同种型对照处理并在存在或不存在M2c巨噬细胞(M2c)的情况下培养48小时的NCI-H1975细胞中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白水平，如图所示。

实施例4.JNJ-372介导的EGFR和c-Met蛋白的下调及其下游信号传导由c-Met扩增的肿瘤细胞系中的Fc相互作用介导

将SNU-5(c-Met扩增细胞系)细胞用10μg/mL、JNJ-372或同种型对照处理，并在存在或不存在来自一个供体的PBMC的情况下以10:1的E:T比率培养48小时。PBMC的添加增强了JNJ-372下调EGFR、pEGFR、c-Met和p-Met的能力。图26示出了来自基于毛细管的电泳(使用PeggySue进行的Simple Western)的图像，其检测了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养的SNU-5细胞中的EGFR、c-Met和pEGFR蛋白水平，如图所示。图27示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养的SNU-5细胞中的EGFR的相对量，如图所示。图28示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养的SNU-5细胞中的pEGFR(pY1173)的相对量，如图所示。图29示出了在存在或不存在JNJ-372、同种型对照或PBMC的情况下培养48小时的SNU-5细胞培养样本中的c-Met的相对量，如图所示。图30示出了用JNJ-372或同种型对照处理并在存在或不存在PBMC的情况下培养的SNU-5细胞中的pMet(pY1234/1235)的相对量，如图所示。将样本归一化为每个样本中存在的上样对照肌动蛋白的量，然后归一化为对照(未处理)样本。

实施例5.JNJ-372 Fc与FcγR的相互作用介导体内肿瘤生长抑制

然后使用H1975和SNU5细胞系异种移植模型在体内评估Fc/FcγR相互作用的作用和相关性。

将NCI-H1975细胞系皮下植入6-8周龄的雌性BALB/c裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1^nu/Crl,Charles River Laboratories,Wilmington,MA)中。当肿瘤平均为72±8.7mm³时，在研究期间每周施用腹膜内抗mCSF-1R抗体(400μg/小鼠)三次，在化合物给药开始前五天开始，以促进巨噬细胞耗尽。在第5天，当肿瘤平均为102±36.6mm³时，将它们通过腹膜内给药同种型对照Ab(10mg/kg)、JNJ-372(10mg/kg)或JNJ-372.IgG2sigma(10mg/kg)每周处理两次。在两次化合物给药后，从一群小鼠中对肿瘤取样以监测巨噬细胞浸润。将SNU5细胞系皮下植入7-8周龄的雌性CB17/SCID小鼠(HFK Bio-Technology Co.Ltd.,Beijing,China)中。当肿瘤平均为155±21.4mm³时，将小鼠用腹膜内磷酸盐缓冲盐水(PBS)、JNJ-372(5mg/kg)或JNJ-372.IgG2sigma(5mg/kg)每周处理两次，持续三周。对于这两项研究，在每项研究的持续时间内每周记录肿瘤测量值和体重两次。使用计算[1-(T/C)]*100，在最后一天计算肿瘤生长抑制(TGI)，其中>80％对照小鼠保持研究。所有体内实验均按照强生机构动物护理和使用委员会(Johnson Institutional Animal Care and Use Committee)以及实验动物护理和使用指南(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)进行。

在H1975模型中，与同种型对照相比，JNJ-372处理引起了75％的肿瘤生长抑制(TGI)(图31)。然而，JNJ-372.IgG2sigma的效果明显更低，TGI仅为30％(图31)。类似地，JNJ-372处理在MET扩增的SNU5模型中在减少肿瘤生长方面是高度有效，TGI为96％，而JNJ-372.IgG2sigma处理是无效的(TGI为-17％)(图32)。在这些肿瘤模型的任一个中，用抗体处理均未观察到对小鼠体重的影响(图32)。

实施例6.Fc相互作用诱导NK细胞介导的ADCC，但不诱导CDC

检查了JNJ-372诱导不同Fc效应子功能的能力。在存在来自七个不同供体的PBMC的情况下，使用Europium释放测定法测量JNJ-372诱导的ADCC。抗体介导的H1975细胞裂解在供体之间是可变的，其中一些供体表现出约60-70％的ADCC活性，而其他供体不具有可测量的ADCC活性(数据未示出)。为了评估Fc/FcγR接合的贡献，将H1975细胞在存在来自2个供体的PBMC的情况下用同种型对照、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma进行处理。虽然JNJ-372诱导了剂量依赖性ADCC，但用同种型对照或JNJ-372.IgG2sigma处理未观察到细胞死亡(数据未示出)。为了确定PBMC内负责JNJ-372诱导的ADCC的免疫细胞亚型，评估了在存在PBMC的情况下相对于在存在来自同一供体的分离的NK细胞或分离的单核细胞的情况下引发的ADCC裂解。PBMC和NK细胞两者(而不是分离的单核细胞)均诱导了JNJ-372依赖性ADCC裂解(图33)，这表明NK细胞负责JNJ-372诱导的ADCC活性。对H1975和H292 NSCLC细胞系用JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma未观察到可测量的CDC活性(数据未示出)，这表明JNJ-372不诱导针对这些NSCLC细胞系的CDC。

实施例7.巨噬细胞对JNJ-372介导的体内肿瘤细胞杀伤的作用

为了检测巨噬细胞在体内的作用，使用所测量的抗-CSF1R抗体和JNJ-372功效耗尽携带H1975异种移植肿瘤的小鼠中的肿瘤相关的巨噬细胞。与未处理的相比，用抗CSF1R抗体处理显示出TAM显著减少(**，P<0.002)，巨噬细胞从11-15％消耗至约2％(图34)。然后将动物用同种型对照、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma处理3周，在任何组中均未观察到小鼠体重减轻(数据未示出)。如前所述，与非CSF1R抗体处理的肿瘤中的同种型对照(***，p<0.0001)或JNJ-372.IgG2sigma处理(**，p＝0.004)相比，用JNJ-372处理显示出显著更高的抗肿瘤功效(图35)。引人注目的是，肿瘤相关的巨噬细胞的耗尽(抗CS1R处理的)使TGI从72.8％显著降低到38.5％(***，p<0.0001)(图35)，这表明巨噬细胞在体内介导JNJ-372的抗肿瘤功效中起关键作用。

这些结果表明巨噬细胞对于体内抗肿瘤功效是必需的。

实施例8.JNJ-372 Fc与免疫细胞的相互作用诱导抗体依赖性细胞因子和趋化因子释放(ADCR)

已知治疗性抗体的Fc区与免疫细胞上的FcγR的相互作用可诱导趋化因子和细胞因子(ADCR)分泌(Kinder等人,mAbs 7:494-504,2015)。利用71-plex MSD细胞因子组来评估在存在或不存在PBMC的情况下用同种型对照、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma处理4小时或72小时后分泌的趋化因子和细胞因子。在若干分泌的细胞因子中以处理依赖性和时间点依赖性方式观察到不同的差异；所测试的71个细胞因子中的32个和71个细胞因子中的42个分别在4小时和72小时具有可靠可测量的响应(AUC)。集中于处理之间差异>1.5倍的细胞因子的进一步分析表明，与H1975+PBMC的共培养物中的同种型对照或JNJ-372.IgG2sigma相比，在处理后4小时(图36)和72小时(图37)，在JNJ-372处理后分别上调十三个和七个细胞因子。许多改变的细胞因子属于趋化细胞因子家族(CC趋化因子)(图6B—MIP1β、MCP-1、MCP-3、Eotaxin、Eotaxin-2)，已知这些趋化细胞因子充当先天免疫细胞、单核细胞和巨噬细胞的化学引诱剂(Graves等人,Crit Rev Oral Biol Med 6:109-18,1995；Uguccioni等人，Eur J Immunol 25:64-8,1995；Balkwill,Nat Rev Cancer 4:540-50,2004)。

为了进一步评估这些细胞因子并检查各种免疫细胞在其分泌中的作用，选择23个细胞因子(基于其功能或在JNJ-372处理后的改变)，并在存在PBMC以及从同一供体分离的各种免疫细胞的情况下用同种型、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma抗体处理后进行评估。热图分析显示了细胞因子表达模式随各种免疫细胞的明显变化，其中CC趋化因子是JNJ-372处理后在所有免疫细胞中最频繁上调的家族。在存在PBMC的情况下对差异>1.5倍的细胞因子的更集中分析显示了JNJ-372处理后上调的模式对PBMC、单核细胞和巨噬细胞而不是NK细胞具有特异性。例如，在存在PBMC或单核细胞的情况下但没有用同种型或JNJ-372.IgG2sigma或在存在NK细胞的情况下，用JNJ-372处理引起MCP-1(图38)和MCP-3(图39)的水平的剂量依赖性增加。在存在PBMC和单核细胞而不是NK细胞的情况下，在用JNJ-372处理后，IL1-RA(已知其由单核细胞和巨噬细胞响应于激活刺激而分泌(Janson等人，JImmunol 147:4218-23,1991；Arend等人，Ann Rheum Dis 59 Suppl 1:i60-4,2000))以剂量依赖性方式增加(图40)。此外，在存在免疫细胞的情况下，在JNJ-372处理而不是在同种型对照或JNJ-372.IgG2sigma处理后，观察到MIP1β水平的剂量依赖性增加(图41)。在与M1和M2巨噬细胞的共培养物中用JNJ-372处理后，MIP家族蛋白MIP1α和MIP1β两者也上调，观察到M2c巨噬细胞中MIP1β的倍数变化量级更高。图42示出了在存在M1巨噬细胞的情况下培养的H1975细胞中MIP-1β水平的剂量响应曲线。图43示出了在存在M2巨噬细胞的情况下培养的H1975细胞中MIP-1β水平的剂量响应曲线。图44示出了在存在M1巨噬细胞的情况下培养的H1975细胞中MIP-1α水平的剂量响应曲线。图45示出了在存在M2巨噬细胞的情况下培养的H1975细胞中MIP-1α水平的剂量响应曲线。

为了评估分泌的趋化因子对EGFR/cMet下调的影响，将在存在或不存在PBMC的情况下用同种型对照、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma处理4小时或72小时的H1975细胞的条件培养基转移到未处理的H1975细胞上，并评估EGFR和cMet途径的变化。在存在条件培养基的情况下，未在任一时间点观察到EGFR、pEGFR和cMet蛋白质水平的可测量下调(数据未示出)。这表明分泌的细胞因子和趋化因子不足以诱导增强的EGFR/cMet下调，因为这需要抗体介导的肿瘤细胞与免疫细胞之间的直接接触。

实施例9.JNJ-372 Fc与单核细胞和巨噬细胞的相互作用诱导胞啃作用(ADCT)

使用基于流式细胞术的测定法(测量结合在靶细胞上的标记抗体到效应细胞(巨噬细胞)中的转移)评估另一个关键Fc效应子功能即胞啃作用(ADCT)。将H1975 NucLightRed细胞用AF488标记的同种型、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma进行调理，与M1或M2c巨噬细胞共培养，并评估AF488+巨噬细胞的百分比。标记的JNJ-372以剂量依赖性方式转移到M1(图46)和M2c(图47)巨噬细胞两者，而在CD11b+巨噬细胞中未检测到同种型对照标记的抗体，也未检测到JNJ-372.IgG2sigma标记的抗体(数据未示出)。没有检测到明显的NucLightRed+巨噬细胞，表明没有吞噬作用。这表明胞啃作用是该测定中的主要机制。

为了目视确认JNJ-372诱导的巨噬细胞胞啃作用，进行了缩时显微镜检查，其中用CD11b/CD14抗体混合物和Hoechst染色剂显示细胞核来使巨噬细胞可视化，并且通过H1975靶细胞的NucLight Red+细胞核来鉴定所述靶细胞。将H1975靶细胞用AF647标记的同种型、JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma抗体进行调理，与M1或M2c巨噬细胞共培养，并获得高含量共聚焦图像。在与用标记的JNJ-372调理过的靶细胞共培养后，在M1和M2巨噬细胞内观察到AF647+斑点(JNJ-372)的离散积聚，而用标记的同种型或JNJ-372.IgG2sigma处理未观察到积聚。如在之前的测定中，在这些测定中观察到最小的吞噬作用，表明JNJ-372下调受体的主要机制是胞啃作用。图48示出了在培养11分钟和44分钟时来自高含量共聚焦显微镜检查的代表性图像。图49示出了在培养77分钟和110分钟时来自高含量共聚焦显微镜检查的代表性图像。

接下来研究了单核细胞进行胞啃作用的能力。与巨噬细胞类似，与JNJ-372(AF647标记的)调理过的靶细胞共培养的单核细胞显示出标记的JNJ-372抗体特异性转移到单核细胞中(数据未示出)。最后，为了模拟肿瘤微环境内的抗体相互作用，将M1或M2c巨噬细胞和H1975靶细胞与AF647标记的同种型的共培养物用JNJ-372或JNJ-372.IgG2sigma抗体处理。在这些条件下，同种型对照仅与M1和M2c巨噬细胞结合，JNJ-372.IgG2sigma仅与靶细胞结合，而JNJ-372与靶细胞和巨噬细胞两者结合(数据未示出)，从而证实了每种抗体的结合特异性。在共培养条件下也容易观察到JNJ-372介导的胞啃作用，这通过将标记的JNJ-372抗体而不是同种型或JNJ-372.IgG2sigma抗体明显转移到巨噬细胞中来测量。

总之，这些发现表明，JNJ-372通过其与巨噬细胞和单核细胞上的Fcγ受体相互作用来诱导胞啃作用。

讨论

本文所述的实验证实了EGFR/cMet双特异性抗体JNJ-372具有促成其抗肿瘤功效的多种Fc依赖性机制。除了诱导NK细胞介导的ADCC之外，JNJ-372与免疫细胞上的Fcγ受体的相互作用还介导了受体酪氨酸激酶EGFR和cMet及其经由胞啃作用磷酸化的形式的下调。这种新型Fc功能由单核细胞和巨噬细胞促进，这也是体内抗肿瘤功效所需的。

已证实，JNJ-372与免疫细胞的Fc相互作用是体外抗增殖和凋亡作用以及体内抗肿瘤功效所需的。考虑到在48小时或更久时间观察到最大的抗增殖作用并且ADCC在体外较早(约2至4小时(29))发生，推测ADCC对整体肿瘤细胞杀伤的贡献可能最小。虽然在所评估的细胞系中未观察到CDC活性，但已知NSCLC细胞系表达补体抑制蛋白CD46、CD55和CD59(Varsano等人，Clin Exp Immunol 113:173-82,1998)。这表明，虽然JNJ-372在所测试的细胞中不诱导CDC，但双特异性抗体可能能够在其他细胞系或肿瘤类型中诱导CDC活性。最后，虽然之前已报道了JNJ-372在体外诱导ADCP(Moores等人，Cancer Res 76:3942-53,2016)，但在本研究中，在用于基于流动和共聚焦显微镜的吞噬测定的条件下，观察到最小ADCP甚至未观察到ADCP。这些结果表明，JNJ-372通过多种作用机制起作用，并且这些Fc效应子功能中的每一种的贡献可能因患者而异。

还证实了JNJ-372诱导ADCR，并且对JNJ-372上调的细胞因子的功能的探索表明大多数属于称为趋化因子的趋化细胞因子家族、特别是CC趋化因子(Graves等人,Crit RevOral Biol 6:109-18,1995；Balkwill,Nat Rev Cancer 4:540-50,2004)。CC趋化因子由两个关键亚家族构成，即单核细胞化学引诱蛋白(MCP)和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)，已知这两种蛋白充当先天免疫细胞诸如单核细胞和巨噬细胞的化学引诱剂(Uguccioni等人，Eur JImmunol 25:64-8,1995；Loetscher等人，FASEB J 8:1055-60,1994)。已经表明MCP家族成员MCP-1(CCL2)和MCP-3(CCL7)可增加炎性单核细胞和CD8+T淋巴细胞的募集(Uguccioni等人，Eur J Immunol 25:64-8,1995；Loetscher等人，FASEB J 8:1055-60,1994；Jia等人，JImmunol 180:6846-53,2008)。还报道了MCP-1和MIP1β(CCL4)可诱导单核细胞和巨噬细胞募集到NSCLC的肿瘤微环境(TME)中(Uguccioni等人，Eur J Immunol 25:64-8,1995；Arenberg等人，Cancer Immunol Immunother 49:63-70,2000)。

虽然这些细胞因子可将免疫细胞引诱到TME中并激活它们，但抗体介导的细胞-细胞接触和胞啃作用诱导的必要性表明JNJ-372 Fc相互作用介导EGFR和cMet信号传导的下调的机制是经由单核细胞或巨噬细胞介导的胞啃作用进行的。最近的若干报道表明，通过胞啃作用将Her2受体类似地转移到免疫细胞如巨噬细胞和中性粒细胞会导致治疗性抗体调理过的肿瘤细胞死亡(Velmurugan等人，Mol Cancer Ther 15:1879-89,2016；Matlung等人，Cell Rep 23:3946-59,2018)。这表明，虽然之前认为胞啃作用是抗体诸如利妥昔单抗的抗性机制，但其也可以充当Fc效应子功能来介导抗肿瘤作用(Taylor and Lindofer,Blood 125:762-6,2015；Pham等人，PLoS One 6:e14498,2011)。

总之，JNJ-372被证实显示出多种不同的作用机制，其中若干种Fc依赖性和Fc非依赖性功能有助于其抗肿瘤活性。体外和体内模型表明，JNJ-372与单核细胞和巨噬细胞上的FcγR的相互作用是EGFR/Met下调和抗肿瘤功效所必需的，这表明这些免疫细胞的水平可预测JNJ-372在临床环境中的功效。

Claims

1.一种治疗患有表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者联合施用治疗有效量的分离的双特异性抗表皮生长因子受体(EGFR)/肝细胞生长因子受体(c-Met)抗体与增强所述受试者的巨噬细胞活性的药剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体包含

a)结合EGFR的第一结构域，其中所述第一结构域包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区1(HCDR1)、SEQ ID NO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:4的轻链互补决定区1(LCDR1)、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；以及

b)结合c-Met的第二结构域，其中所述第二结构域包含SEQ ID NO:7的HCDR1、SEQ IDNO:8的HCDR2、SEQ ID NO:9的HCDR3、SEQ ID NO:10的LCDR1、SEQ ID NO:11的LCDR2和SEQID NO:12的LCDR3。

3.根据权利要求2所述的方法，其中

a)所述结合EGFR的第一结构域包含SEQ ID NO:13的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:14的轻链可变区(VL)；并且

b)所述结合c-Met的第二结构域包含SEQ ID NO:15的VH和SEQ ID NO:16的VL。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体是IgG1同种型。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体包含SEQ ID NO:17的第一重链(HC1)、SEQ ID NO:18的第一轻链(LC1)、SEQ ID NO:19的第二重链(HC2)和SEQ ID NO:20的第二轻链(LC2)。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述增强巨噬细胞活性的药剂是GM-CSF、抗CD47抗体、HDAC2抑制剂、PD-(L)1轴抑制剂或CD11b激动剂。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述表达EGFR或c-Met的癌症与野生型EGFR、EGFR激活突变、EGFR基因扩增、循环HGF的水平升高、野生型c-Met、c-Met激活突变、c-Met基因扩增或突变体KRAS相关联。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述EGFR激活突变包括：L718Q、G719A、G719X(X为任何氨基酸)、L861X(X为任何氨基酸)、L858R、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、V765M、C797S、L858P或T790M置换；E746-A750的缺失；R748-P753的缺失；M766与A767之间Ala(A)的插入；S768与V769之间Ser、Val和Ala(SVA)的插入；P772与H773之间Asn和Ser(NS)的插入；D761与E762之间、A763与Y764之间、Y764与Y765之间、M766与A767之间、A767与V768之间、S768与V769之间、V769与D770之间、D770与N771之间、N771与P772之间、P772与H773之间、H773与V774之间、V774与C775之间一个或多个氨基酸的插入；EGFR外显子20中的一个或多个缺失；或EGFR外显子20中的一个或多个插入；或它们的任何组合。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述突变体KRAS包含G12V、G12C、G12A或G12D置换，或它们的任何组合。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述受试者患有新诊断的表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述受试者对用先前抗癌疗法进行的治疗具有抗性或已获得对用先前抗癌疗法进行的治疗的抗性。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述先前抗癌疗法是化学疗法、靶向抗癌疗法或激酶抑制剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述激酶抑制剂是EGFR、c-Met、HER2、HER3、HER4、VEGFR或AXL的抑制剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述激酶抑制剂是埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、阿法替尼、奥希替尼、拉泽替尼、波齐替尼、克里替尼、卡博替尼、卡马替尼、阿昔替尼、乐伐替尼、尼达尼布、瑞格非尼、帕唑帕尼、索拉非尼或舒尼替尼。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症是上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、咽癌、鼻癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、舌癌、食管癌、阴道癌、宫颈癌、脾癌、睾丸癌、胃癌、胸腺癌、结肠癌、甲状腺癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)或者散发性或遗传性乳头状肾细胞癌(PRCC)。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种抗癌疗法。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种抗癌疗法包括化学疗法、靶向抗癌疗法或激酶抑制剂。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述激酶抑制剂是EGFR、c-Met、HER2、HER3、HER4、VEGFR或AXL的抑制剂。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述激酶抑制剂是埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、阿法替尼、奥希替尼、拉泽替尼、波齐替尼、克里替尼、卡博替尼、卡马替尼、阿昔替尼、乐伐替尼、尼达尼布、瑞格非尼、帕唑帕尼、索拉非尼或舒尼替尼。

20.一种诊断和治疗对用双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应的患有表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症的受试者的方法，所述方法包括：

a)提供来自所述受试者的生物样本；

b)测量来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平；

c)当来自所述生物样本的所述巨噬细胞或单核细胞水平高于阈值时，诊断对用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应的患有表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症的受试者；以及

d)向被诊断为对用所述抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应的所述受试者施用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体或提供所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体的施用。

21.一种用双特异性抗EGFR/c-Met抗体治疗疑似患有或患有表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症的受试者的方法，所述方法包括：

a)确定所述受试者具有高于阈值的巨噬细胞或单核细胞水平；以及

b)向被确定为具有高于所述阈值的巨噬细胞或单核细胞水平的所述受试者施用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体或提供所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体的施用。

22.一种预测患有表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症的受试者对用双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗的响应的方法，所述方法包括：

a)提供来自所述受试者的生物样本；

b)测量来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平；

c)当来自所述生物样本的所述巨噬细胞或单核细胞水平高于阈值时，将所述受试者预测为响应者。

23.一种治疗对用双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应的患有表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症的受试者的方法，所述方法包括

a)提供来自所述受试者的生物样本；

b)测量来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平；

c)当来自所述生物样本的所述巨噬细胞或单核细胞水平高于阈值时，用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体治疗所述受试者。

24.一种确定患有表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症的受试者是否对用双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应并且决定是否治疗所述受试者的方法，所述方法包括：

a)提供来自所述受试者的生物样本；

b)测量来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平；

c)当来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平高于阈值时，将患有表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症的所述受试者诊断为对用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应，或者当来自所述生物样本的巨噬细胞或单核细胞水平低于所述阈值时，将患有表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症的所述受试者诊断为对用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗没有响应；以及

d)向被诊断为对用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗有响应的所述受试者施用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体，或者避免向被诊断为对用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体进行治疗没有响应的所述受试者施用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体。

25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体包含

a)结合EGFR的第一结构域，其中所述第一结构域包含SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ IDNO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:4的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ IDNO:6的LCDR3；以及

26.根据权利要求25所述的方法，其中

a)所述结合EGFR的第一结构域包含SEQ ID NO:13的VH和SEQ ID NO:14的VL；并且

27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体是IgG1同种型。

28.根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体包含SEQ ID NO:17的HC1、SEQ ID NO:18的LC1、SEQ ID NO:19的HC2和SEQ ID NO:20的LC2。

29.根据权利要求20-28中任一项所述的方法，其中所述阈值为在来自患有EGFR、c-Met或EGFR和c-Met阳性癌症的受试者群体的生物样本中观察到的巨噬细胞或单核细胞的第30百分位数值或以上。

30.根据权利要求20-29中任一项所述的方法，其中所述生物样本是血液样本。

31.根据权利要求20-29中任一项所述的方法，其中所述生物样本是肿瘤组织活检物。

32.根据权利要求20-31中任一项所述的方法，其中表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症与野生型EGFR、EGFR激活突变、EGFR基因扩增、循环HGF的水平升高、野生型c-Met、c-Met激活突变、c-Met基因扩增或突变体KRAS或它们的任何组合相关联。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述EGFR激活突变包括：L718Q、G719A、G719X(X为任何氨基酸)、L861X(X为任何氨基酸)、L858R、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、V765M、C797S、L858P或T790M置换；E746-A750的缺失；R748-P753的缺失；M766与A767之间Ala(A)的插入；S768与V769之间Ser、Val和Ala(SVA)的插入；P772与H773之间Asn和Ser(NS)的插入；D761与E762之间、A763与Y764之间、Y764与Y765之间、M766与A767之间、A767与V768之间、S768与V769之间、V769与D770之间、D770与N771之间、N771与P772之间、P772与H773之间、H773与V774之间、V774与C775之间一个或多个氨基酸的插入；EGFR外显子20中的一个或多个缺失；或EGFR外显子20中的一个或多个插入；或它们的任何组合。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述突变体KRAS包含G12V、G12C或G12A置换。

35.根据权利要求20-34中任一项所述的方法，其中所述受试者疑似患有或患有新诊断的表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症。

36.根据权利要求20-34中任一项所述的方法，其中所述受试者对用先前抗癌疗法进行的治疗具有抗性或已获得对用先前抗癌疗法进行的治疗的抗性。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述先前抗癌疗法是化学疗法、靶向抗癌疗法或激酶抑制剂。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述激酶抑制剂是EGFR、c-Met、HER2、HER3、HER4、VEGFR或AXL的抑制剂。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述激酶抑制剂是埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、阿法替尼、奥希替尼、拉泽替尼、波齐替尼、克里替尼、卡博替尼、卡马替尼、阿昔替尼、乐伐替尼、尼达尼布、瑞格非尼、帕唑帕尼、索拉非尼或舒尼替尼。

40.根据权利要求20-39中任一项所述的方法，其中表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症是上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、咽癌、鼻癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、舌癌、食管癌、阴道癌、宫颈癌、脾癌、睾丸癌、胃癌、胸腺癌、结肠癌、甲状腺癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)或者散发性或遗传性乳头状肾细胞癌(PRCC)。

41.根据权利要求20-40中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体与增强所述受试者的巨噬细胞活性的药剂联合施用。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述增强所述受试者的巨噬细胞活性的药剂是GM-CSF、CD47拮抗剂、抗CD47抗体、HDAC2抑制剂、PD-(L)1轴抑制剂或CD11b激动剂。

43.根据权利要求20-42中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种抗癌疗法。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种抗癌疗法包括化学疗法、靶向抗癌疗法或激酶抑制剂。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述激酶抑制剂是EGFR、c-Met、HER2、HER3、HER4、VEGFR或AXL的抑制剂。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述激酶抑制剂是埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、阿法替尼、奥希替尼、拉泽替尼、波齐替尼、克里替尼、卡博替尼、卡马替尼、阿昔替尼、乐伐替尼、尼达尼布、瑞格非尼、帕唑帕尼、索拉非尼或舒尼替尼。

47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体具有约15％或更低的岩藻糖含量。

48.一种诱导EGFR或c-Met或EGFR和c-Met从供体细胞到受体细胞的胞啃作用的方法，所述方法包括使所述供体细胞与双特异性抗EGFR/c-Met抗体接触足以诱导从所述供体细胞到所述受体细胞的胞啃作用的时间。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述供体细胞是表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌细胞。

50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述受体细胞是巨噬细胞或单核细胞。

51.根据权利要求48-50中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体包含

a)结合EGFR的第一结构域，其中所述第一结构域包含SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ IDNO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:4的轻链互补决定区1(LCDR1)、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；以及

52.根据权利要求51所述的方法，其中

53.根据权利要求48-52中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体是IgG1同种型。

54.根据权利要求48-53中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体包含SEQ ID NO:17的HC1、SEQ ID NO:18的LC1、SEQ ID NO:19的HC2和SEQ ID NO:20的LC2。

55.根据权利要求49-54中任一项所述的方法，其中所述表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌细胞与野生型EGFR、EGFR激活突变、EGFR基因扩增、循环HGF的水平升高、野生型c-Met、c-Met激活突变、c-Met基因扩增或突变体KRAS相关联。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述EGFR激活突变包括：L718Q、G719A、G719X(X为任何氨基酸)、L861X(X为任何氨基酸)、L858R、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、V765M、C797S、L858P或T790M置换；E746-A750的缺失；R748-P753的缺失；M766与A767之间Ala(A)的插入；S768与V769之间Ser、Val和Ala(SVA)的插入；P772与H773之间Asn和Ser(NS)的插入；D761与E762之间、A763与Y764之间、Y764与Y765之间、M766与A767之间、A767与V768之间、S768与V769之间、V769与D770之间、D770与N771之间、N771与P772之间、P772与H773之间、H773与V774之间、V774与C775之间一个或多个氨基酸的插入；EGFR外显子20中的一个或多个缺失；或EGFR外显子20中的一个或多个插入；或它们的任何组合。

57.根据权利要求55所述的方法，其中所述突变体KRAS包含G12V、G12C或G12A置换。

58.根据权利要求48-56中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在体外进行。

59.根据权利要求48-56中任一项所述的方法，其中所述接触步骤包括向受试者施用所述双特异性抗EGFR/c-Met抗体。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述受试者患有表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症。

61.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述受试者患有新诊断的表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌症。

62.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述受试者对用先前抗癌疗法进行的治疗具有抗性或已获得对用先前抗癌疗法进行的治疗的抗性。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述先前抗癌疗法是化学疗法、靶向抗癌疗法或激酶抑制剂。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述激酶抑制剂是EGFR、c-Met、HER2、HER3、HER4、VEGFR或AXL的抑制剂。

65.根据权利要求63所述的方法，其中所述激酶抑制剂是埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、阿法替尼、奥希替尼、拉泽替尼、波齐替尼、克里替尼、卡博替尼、卡马替尼、阿昔替尼、乐伐替尼、尼达尼布、瑞格非尼、帕唑帕尼、索拉非尼或舒尼替尼。

66.根据权利要求49-65中任一项所述的方法，其中所述表达EGFR、c-Met或EGFR和c-Met的癌细胞来源于上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、NSCLC、肺腺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、咽癌、鼻癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、舌癌、食管癌、阴道癌、宫颈癌、脾癌、睾丸癌、胃癌、胸腺癌、结肠癌、甲状腺癌、肝癌、HCC或者散发性或遗传性乳头状肾细胞癌PRCC。

67.根据权利要求59-66中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种抗癌疗法。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述一种或多种抗癌疗法包括化学疗法、靶向抗癌疗法或激酶抑制剂。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述激酶抑制剂是EGFR、c-Met、HER2、HER3、HER4、VEGFR或AXL的抑制剂。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述激酶抑制剂是埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、阿法替尼、奥希替尼、拉泽替尼、波齐替尼、克里替尼、卡博替尼、卡马替尼、阿昔替尼、乐伐替尼、尼达尼布、瑞格非尼、帕唑帕尼、索拉非尼或舒尼替尼。